Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung von Enteroiden, einem dreidimensionalen Darmmodell, aus fetalem Darmgewebe. Immunfluoreszierende Bildgebung von epithelialen Biomarkern wurde zur Modellcharakterisierung verwendet. Die apikale Exposition von Lipopolysacchariden, einem bakteriellen Endotoxin, induzierte die epitheliale Permeabilität in einer dosisabhängigen Weise, gemessen durch das Austreten von fluoreszierendem Dextran.
Abstract
Enteroide aus menschlichem fetalem Gewebe entwickeln sich zu einem vielversprechenden In-vitro-Modell zur Untersuchung von Darmverletzungen bei Frühgeborenen. Enteroide zeigen Polarität, bestehend aus einem Lumen mit apikalem Rand, Tight Junctions und einer basolateralen äußeren Schicht, die Wachstumsmedien ausgesetzt ist. Zu den Folgen von Darmverletzungen gehören Schleimhautentzündungen und erhöhte Durchlässigkeit. Das Testen der Darmpermeabilität bei gefährdeten Frühgeborenen ist oft nicht durchführbar. Daher wird ein in vitro fetales Gewebe-abgeleitetes Darmmodell benötigt, um Darmverletzungen bei Frühgeborenen zu untersuchen. Enteroide können verwendet werden, um Veränderungen der epithelialen Permeabilität zu testen, die durch Tight-Junction-Proteine reguliert werden. In Enteroiden differenzieren sich intestinale Stammzellen in alle Epithelzelltypen und bilden eine dreidimensionale Struktur auf einer Basalmembranmatrix, die von Maussarkomzellen sezerniert wird. In diesem Artikel beschreiben wir die Methoden zur Etablierung von Enteroiden aus fetalem Darmgewebe, zur Charakterisierung der enteroiden Tight Junction-Proteine mit Immunfluoreszenzbildgebung und zum Testen der epithelialen Permeabilität. Da gramnegative dominante bakterielle Dysbiose ein bekannter Risikofaktor für Darmschäden ist, verwendeten wir Lipopolysaccharid (LPS), ein Endotoxin, das von gramnegativen Bakterien produziert wird, um die Permeabilität in den Enteroiden zu induzieren. Fluorescein-markiertes Dextran wurde mikroinjiziert in das enteroide Lumen, und serielle Dextrankonzentrationen, die in die Kulturmedien austraten, wurden gemessen, um die Veränderungen der parazellulären Permeabilität zu quantifizieren. Das Experiment zeigte, dass die apikale Exposition gegenüber LPS die epitheliale Permeabilität konzentrationsabhängig induziert. Diese Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass gramnegative dominante Dysbiose zum Mechanismus der Darmschädigung bei Frühgeborenen beiträgt.
Introduction
Frühgeborene sind häufigen und anhaltenden Entzündungen ausgesetzt, die sie einem erhöhten Risiko für Darmverletzungen aussetzen, die zu einer langfristigen Behinderung oder zum Tod führen1. Die Forschung in diesem Bereich wird durch die begrenzte Fähigkeit herausgefordert, Experimente an gefährdeten Frühgeborenen durchzuführen. Darüber hinaus hat ein Mangel an geeigneten Modellen die umfassende Untersuchung der vorzeitigen Darmumgebung behindert2. Bestehende in vitro und in vivo Modelle haben es versäumt, die vorzeitige menschliche Darmumgebung umfassend abzubilden. Insbesondere können einzelne epitheliale fetale Zelllinien keine Tight Junctions bilden, und Tiermodelle zeigen andere entzündliche und immunologische Reaktionen als menschliche Frühgeborene. Mit der Entdeckung des Wnt-Signalwegs als primärer Signalweg bei der Proliferation und Differenzierung von intestinalen Krypt-Stammzellen und den neuartigen Lgr5+-Gewebestammzellen wurden aus Darmgewebe gewonnene Organoide wie Enteroide und Kolonoide als In-vitro-Modelle etabliert 3,4,5. Mit dieser Technologie ist es möglich, dreidimensionale (3D) enteroide Modelle zu erstellen und zu verwenden, die aus dem gesamten Gewebe oder der Biopsie eines Darms entwickelt werden, um epitheliale Reaktionen auf die Darmumgebung zu untersuchen 6,7.
Im Gegensatz zu typischen Darmzelllinien, die in Kultur gezüchtet werden, zeigen Enteroide Polarität mit einem Lumen, das durch Tight-Junction-Proteine verbundenist 8. Dies ermöglicht eine Exposition gegenüber der basolateralen Grenze in den Wachstumsmedien sowie eine luminale Mikroinjektion zur Beurteilung der apikalen Grenze. Darüber hinaus zeigen Enteroide ähnliche genetische, physiologische und immunologische Eigenschaften wie das menschliche Epithel 9,10. Fetale Gewebe-abgeleitete Enteroide ermöglichen die Untersuchung der Rolle der Frühgeburtlichkeit auf die Epithelfunktion. Die einzigartigen Eigenschaften von Enteroiden können der vorzeitigen Darmumgebung näher kommen9. Gewebeabgeleitete Enteroide können verwendet werden, um die Integrität von Tight Junction als Monoschichtform oder als 3D-Strukturen, die in eine erstarrte Basalmembranproteinmischung eingebettet sind, zu testen. Für letztere Form ist eine Mikroinjektionstechnik erforderlich, wenn eine apikale Exposition gewünscht wird. Die Messung epithelialer Reaktionen in enteroiden Modellen umfasst die Genexpression durch RNA-Sequenzierung, Biomarker durch enzymgebundenen Immunoassay (ELISA) oder fortschrittliche bildgebende Verfahren. Die hier vorgestellte Technik bietet eine weitere praktikable Möglichkeit, die Bruttopermeabilität mit der Fluorometrie zu messen.
Darmverletzungen bei Frühgeborenen haben eine multifaktorielle Pathogenese, die das Ungleichgewicht der mikrobiellen Darmgemeinschaft einschließt. Enteroide können hervorragende Modelle liefern, um bestimmte Aspekte von vorzeitigen Darmerkrankungen wie nekrotisierende Enterokolitis zu untersuchen, die Epithelfunktionen betreffen11. Enteroide zeigen ähnliche Eigenschaften wie der menschliche fetale Darm10. Die Exposition von Enteroiden gegenüber Lipopolysaccharid (LPS), einem Endotoxin, das von gramnegativen Bakterien produziert wird, in den Kulturmedien als basolaterale Exposition induziert eine Genexpression, die zu einer erhöhten Entzündung und Darmpermeabilität führen kann7. Diese Studie zielt darauf ab, die Veränderungen der groben Epithelpermeabilität nach apikaler Exposition gegenüber bakteriellen Produkten wie LPS zu bewerten. Die Ergebnisse können einen Einblick in die Mikroben-Epithel-Interaktionen geben, die an der Pathogenese von Darmschäden beteiligt sind. Die Methode zur Prüfung der groben Permeabilität erfordert Mikroinjektionsaufbau und -fähigkeit.
Protocol
Die Entnahme von menschlichem Gewebe wurde vom University of Washington Institutional Review Board genehmigt (Studien-ID: STUDY380 und CR ID: CR3603) und vom Birth Defects Research Laboratory durchgeführt. Das Birth Defects Research Laboratory wurde durch die NIH-Preisnummer 5R24HD000836 des Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development unterstützt. Die Proben wurden von einwilligenden Teilnehmern gesammelt und als de-identifiziert und ohne Gesundheitsinformationen gesendet. Die Dünndarmproben wurden in eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco gelagert und über Nacht an das Empfangslabor geschickt.
1. Reagenzzubereitung
HINWEIS: Eine Liste der Reagenzien und Katalognummern finden Sie in der Materialtabelle . Die empfohlenen Volumina gelten für eine 6-Well-Platte, sofern nicht anders angegeben.
- Bereiten Sie 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) vor, indem Sie 50 mg BSA-Pulver in 50 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 100 μg/ml eines Breitbandantibiotikums Primocin auflösen, um alle Kunststoffwaren und Spitzen zu beschichten, die mit Geweben oder Enteroiden in Berührung kommen.
- Um mit BSA zu beschichten, legen Sie ungefilterte Pipettenspitzen in ein 50-ml-konisches Röhrchen mit genügend BSA, um die Spitzen abzudecken, fügen Sie 1-2 ml BSA hinzu, um die Petrischalenoberfläche abzudecken, oder füllen Sie 15-ml-konische Röhrchen mit BSA für mindestens 20-30 Minuten bei Raumtemperatur vor der Verwendung.
- Bereiten Sie DPBS-Medien vor, indem Sie 50 ml DPBS mit 100 μg/ml Primocin und 50 μg/ml Gentamicin mischen. Bereiten Sie dieses Medium mit und ohne 2,5 μg/ml Amphotericin vor.
- Bereiten Sie enteroide Wachstumsmedien vor, indem Sie 2 ml organoides Wachstumsmedium, 100 μg/ml Primocin, 10 μM Y27632 und 2,5 μM CHIR99021 mischen. Stellen Sie täglich frische Medien her und erwärmen Sie sie in einem Zellkulturinkubator bei 37 °C.
HINWEIS: Der Verdünnungsfaktor für Y27632 beträgt 1:250. Für CHIR99021 wird die CHIR-Stammlösung auf 1:100 in warmen Medien und dann auf 1:40 in enteroiden Wachstumsmedien verdünnt, um eine Verdünnung von 1:4000 zu erreichen. - Bereiten Sie die Basalmembranmatrixmischung vor, indem Sie der Grundmembranmatrix 10 μM Y27632 und 2,5 μM CHIR99021 hinzufügen. Machen Sie insgesamt 285 μL der endgültigen Basalmembranmatrixmischung bei einer Proteinkonzentration von 8 mg / ml für eine Vertiefung einer 6-Well-Platte.
HINWEIS: Die Basalmembranmatrix muss eiskalt sein, um in flüssiger Form zu bleiben, und erstarrt bei wärmeren Temperaturen. Die Proteinkonzentration der Basismembranmatrix bestimmt das Volumen, das erforderlich ist, um eine Endproteinkonzentration von 8 mg/ml zu erreichen, indem die Gleichung verwendet wird:
Band 1 × Konzentration 1 = Band 2 × Konzentration 2 - Bereiten Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) vor, indem Sie die 32% PFA in PBS um 1:8 verdünnen und bei Raumtemperatur lagern. Machen Sie 0,5 ml für jede Vertiefung der zu fixierenden Enteroide.
- Bereiten Sie den Blockierpuffer vor, indem Sie 5% Ziegenserum und 0,5% Triton X-100 in PBS hinzufügen. Bereiten Sie 1 ml für den ersten Antikörper pro Vertiefung und 0,5 ml für den zusätzlichen Antikörper pro Vertiefung vor.
HINWEIS: Verwenden Sie Serum von derselben Spezies wie der Wirt der sekundären Antikörper. - Bereiten Sie primäre und sekundäre Antikörper vor, verdünnt in Blockierpuffer in der vom Hersteller für jeden Antikörper empfohlenen Konzentration.
- 5 μg/ml Dmidino-2-phenylindol (DAPI) durch Verdünnen auf 1:200 aus 1 mg/ml Stammlösung in PBS herstellen. Machen Sie 0,5 ml pro Vertiefung gefärbte Enteroide.
- Bereiten Sie 70% Glycerin in PBS vor und stellen Sie 0,5 ml für die Montage der Enteroide auf Objektträger her.
- Hergestellt werden 5 mg/ml Dextran-FITC (Fluorescein-Isothiocyanat) durch Verdünnen der 25 mg/ml Stammlösung in PBS im Verhältnis 1:5. Machen Sie 20 μL für die Mikroinjektion.
- Lipopolysaccharide (LPS) und Dextran-FITC werden durch Rekonstitution des LPS-Pulvers in PBS zu einer 5 mg/ml Stammlösung hergestellt. Stammlösungen von LPS und Dextran in PBS auf 0,1 mg/ml und 0,5 mg/ml LPS und 5 mg/ml Dextran-FITC verdünnen. Machen Sie 20 μL für die Mikroinjektion.
- Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure (EGTA) wird hergestellt, indem eine Stammlösung von 0,2 M hergestellt wird, indem EGTA-Pulver in destilliertem Wasser gelöst und der pH-Wert unter Verwendung von Salzsäure (HCl) auf etwa 8 eingestellt wird. Eine Testkonzentration von 2 mM in Nährmedien wird durch eine Verdünnung von 1:100 hergestellt.
2. Probensammlung
- Sobald die Proben eingegangen sind, führen Sie innerhalb von 24 Stunden nach der Probenentnahme eine Epithelzellisolierung und -beschichtung durch.
3. Intestinale Epithelzellplattierung in Basalmembranmatrix aus ganzen Proben
HINWEIS: Dieses Verfahren folgt modifizierten Protokollen des Translational Tissue Modeling Laboratory an der University of Michigan12,13,14. Die Verwendung von Wachstumsmedien mit einem hohen Wnt-Faktor liefert konsistente Ergebnisse für die enteroide Etablierung. Sobald die Enteroide etabliert sind, verwenden Sie das gleiche Medium mit einem hohen Wnt-Faktor, um die Enteroide zur Mikroinjektion in sphärische Formen zu treiben.
- Die Darmsegmente in eine 60 mm x 15 mm große Petrischale mit eiskaltem DPBS mit Amphotericin geben und 20 min auf Eis einweichen. Während das Gewebe einweicht, identifizieren Sie die Regionen (Zwölffingerdarm, Jejunum oder Ileum) des Dünndarms und entfernen Sie das Bindegewebe und die Blutgefäße mit einer Pinzette und einer Schere. Waschen Sie den Lumeninhalt nach Bedarf mit einer kleinen 23-25 G Nadel und einer 3 ml Spritze aus, ohne das Epithel zu stören.
- Schneiden Sie die Darmsegmente mit einem Skalpell in 3-5 mm große Stücke und legen Sie 1-2 Stücke (zur Beschichtung in einer Vertiefung einer 6-Well-Platte) in eine 35 mm x 15 mm große Petrischale, die 0,5-1 ml organoides Wachstumsmedium auf Eis enthält.
- Schneiden Sie den Darmschlauch mit einer Mikroschere und einer Pinzette in Längsrichtung ab. Verwenden Sie die Pinzettenspitze, um die Epithelzellen unter einem 10-fachen Stereomikroskop aus der Faszie zu kratzen. Entfernen Sie die Faszie und schwenken Sie die Schale, um die Zellklumpen aufzubrechen.
- Verwenden Sie eine 20 μL Pipettenschnittspitze, um die Zellen und Medien im Schritt von 5-10 μL in die Basalmembranmatrixmischung zu übertragen, um eine 285 μL Lösung bei einer Matrixproteinkonzentration von 8 mg/ml herzustellen. Pipeten Sie langsam 20x auf und ab, um Zellen in der Basalmembranmatrix auf Eis mit einer 200 μL Schnittspitze zu mischen.
- Legen Sie fünf 50-μL-Streifen der Zell-Basalmembran-Matrixmischung in eine Vertiefung einer vorgewärmten 6-Well-Platte, die auf einem warmen Schaumstein aufbewahrt wird. Die Platte im Zellkulturinkubator bei 37 °C und 5%CO2 für 10 min inkubieren, damit die Basalmembranmatrix polymerisieren und aushärten kann.
- 2 ml des enteroiden Wachstumsmediums in die Vertiefung der erstarrten Basalmembranmatrixstreifen geben und wieder in den Zellkulturinkubator geben. Wechseln Sie die Medien täglich, um das enteroide Wachstum zu steigern. Überprüfen Sie die Differenzierung der intestinalen Stammzellen täglich unter einem 10x inversen Mikroskop.
- Nach 10-14 Tagen geben Sie die Enteroide in eine Vertiefung einer 12-Well- oder 6-Well-Platte, abhängig von der enteroiden Dichte. Beginnen Sie, die Medien jeden zweiten Tag zu wechseln und alle 5-7 Tage im Verhältnis 1: 2 zu bestehen, wenn die Enteroide zu gedeihen beginnen.
- Entfernen Sie die Zellen, die sich nicht in Enteroide differenzieren, mit der Basalmembranmatrixschicht während der Passagen. Erstellen Sie einen gefrorenen Vorrat an Enteroiden mit geringer Passage, indem Sie sie bei Bedarf in 80% Wachstumsmedien, 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) einfrieren.
4. Immunfluoreszierende Färbung von Enteroiden
HINWEIS: Der Prozess der Reparatur und Färbung dauert 3 Tage. In diesem Protokoll fixierten und färbten wir Kerne (DAPI), Epithelmarker (Villin, CDX2), Lysozym-, Mucin- und Tight-Junction-Proteine (Claudin 2, Claudin 3, Occludin, Zonula occluden-1) unter Verwendung eines modifizierten Protokolls15. Fluoreszierende Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen.
- Befestigend
HINWEIS: Dieser Vorgang wird normalerweise gleichzeitig mit der enteroiden Passage oder dem Einfrieren durchgeführt.- Legen Sie die enteroide Platte auf Eis. Entfernen Sie die Wachstumsmedien und waschen Sie sie vorsichtig 2x mit kaltem DPBS.
- Identifizieren Sie die zu fixierenden und zu färbenden Enteroide. Übertragen Sie sie auf eine 12-Well-Platte, indem Sie sie vorsichtig mit einer 200-μL-Schnittspitze oder mit einer 1-μL-Impfschlaufe pipettieren. Legen Sie Enteroide in separate Vertiefungen, wenn eine Färbung mit verschiedenen Antikörpern durchgeführt werden soll.
- Entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich mit einer 200 μL-Spitze, ohne die Enteroide zu stören. 0,5 ml 4% PFA hinzufügen und 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Schwenken Sie die Platte gelegentlich, um die Ablösung der Enteroide von der Basalmembranmatrix zu erleichtern.
- Grob untersuchen, um die Ablösung der Enteroide von der Basalmembranmatrix zu bestimmen. Saugen Sie das flüssige PFA vorsichtig ab und entsorgen Sie es, ohne die Enteroide zu stören. Mit PBS 3x waschen, um PFA und restliche Basalmembranmatrix zu entfernen
HINWEIS: Das Absaugen der Flüssigkeit unter einem Stereomikroskop kann hilfreich sein, um die Enteroide zu vermeiden. Fixierte Enteroide können in PBS bei 4 °C bis zu 1 Monat gelagert werden.
- Blockierend
- Entfernen Sie PBS-Reste vorsichtig mit einer 200-μL-Pipette, ohne die Enteroide zu stören. Fügen Sie 0,5 mL Blockierpuffer hinzu und inkubieren Sie für 2 h bei Raumtemperatur.
- Entfernen und entsorgen Sie den blockierenden Puffer mit einer 200-μL-Pipette, wobei Sie darauf achten, dass die Enteroide nicht gestört werden.
- Antikörperfärbung
- Fügen Sie 500 μL primären Antikörper im Blockierpuffer zu jeder Vertiefung mit Enteroiden hinzu. Für primäre Antikörper und für Lysozym beträgt der Verdünnungsfaktor 1:100, für CDX2 den Verdünnungsfaktor 1:100 und für Bösewicht 1:50. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Am nächsten Tag die Antikörperlösung entfernen und 3x mit PBS waschen. Lassen Sie 10-15 Minuten Inkubationszeit für jede Wäsche.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.3.1.-4.3.2. für den sekundären Antikörper mit einem Verdünnungsfaktor von 1:400.
- 500 μL DAPI bei 5 μg/mL in PBS zugeben und bei Raumtemperatur 15 min inkubieren. Nach der Inkubation 3x mit PBS waschen und 10-15 min Inkubationszeit für jede Wäsche einplanen
- Montage
- Entfernen Sie so viel PBS wie möglich. Waschen Sie die gefärbten Enteroide mit 70% Glycerin 1x.
- Heben Sie die Enteroide mit einer 1-μL-Impfschlaufe oder einer geschnittenen 200-μL-Spitze aus der Platte und montieren Sie sie mit 70% Glycerin auf einen Glasobjektträger.
- Um die 3D-Struktur der Enteroide zu erhalten, achten Sie auf einen Abstand von 0,5-1 mm zwischen dem unteren Glasobjektträger und dem Deckglas. Verwenden Sie Ausschnitte aus dünner Silikonkautschukfolie oder Glasdeckglas, um einen Raum zwischen dem Glasobjektträger und dem Deckglas zu schaffen. Die Enteroide können nun mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet werden.
5. Vorbereitung zur Mikroinjektion von Enteroiden
HINWEIS: Das Mikroinjektionsprotokoll ist ein modifiziertes Protokoll von Hill et al.16 , um den Ressourcen und der Einstellung gerecht zu werden. Einige der Vorbereitungsschritte müssen einige Tage im Voraus abgeschlossen werden.
- Einrichten des Mikroinjektions-Setups
- Stellen Sie die Mikroinjektorvorrichtung je nach Ziel der Experimente entweder in einer Biosicherheitswerkbank oder auf einer sauberen Theke wie folgt auf: ein Stereomikroskop zum Betrachten, ein Mikromanipulator mit X-, Y- und Z-Achsen-Steuernobs, der auf einem schweren Ständer neben dem Mikroskop montiert ist, ein Mikropipettenhalter am Mikromanipulatorarm, ein Mikroinjektorschlauch, der den Mikropipettenhalter verbindet, und eine Spritze mit einem Dreiwegehahn, dann an eine pneumatische Pumpe und eine Wandluftquelle, die mit der Pumpe verbunden ist (Abbildung 1).
- Desinfizieren Sie die Mikroinjektionsvorrichtung vor dem Versuch und danach mit 70% Ethanol. Testen Sie die Positionierung des Mikroskops und des Mikromanipulators, um die gewünschten physikalischen Spezifikationen zu erfüllen, einschließlich des Bewegens der Achsenknöpfe, um sicherzustellen, dass die Mikropipette die Zielprobe erreichen kann.
- Herstellung der Mikropipette
HINWEIS: Führen Sie diese Schritte im Voraus aus.- Verwenden Sie einen Mikropipettenzieher, um die Glaskapillarrohre in die Mikropipetten zu ziehen.
- Legen Sie die Mikropipette unter dem Stereomikroskop auf einen horizontalen Mikropipettenhalter (Abbildung 2), fokussieren Sie auf die Spitzen und schneiden Sie die Spitzen mit einer Mikroschere ab, während Sie durch die Mikroskopokulare schauen. Bereiten Sie für jedes Experiment etwa 10-15 Mikropipetten mit einer ähnlichen Spitzengröße vor.
- Testen Sie die Spitzengröße, indem Sie 0,5-1 μL Flüssigkeit hochziehen und zählen, wie viele Pumpen benötigt werden, um das Volumen zu entleeren. Testen Sie mehrere Spitzengrößen, um die geeignete Größe für das Experiment zu finden. Eine geeignete Spitzengröße fördert ca. 10-30 nL Volumen pro Pumpe.
- Lagern Sie die geschliffenen Glasmikropipetten in einer sauberen Box oder Röhre, ohne die Spitzen zu beschädigen.
HINWEIS: Vorgeschnittene Mikropipetten sind im Handel erhältlich.
- Enteroid-Vorbereitung
- Legen Sie eine Platte mit meist großen und kugelförmigen Enteroiden auf Eis. Ersetzen Sie das alte Wachstumsmedium durch frisches Medium.
- Trennen Sie die Basalmembranmatrixpunkte vorsichtig mit einem Zellheber von der Platte. Schwenken Sie die Gelpunkte von einer Seite zur anderen auf Eis, um die Basalmembranmatrix aufzubrechen, ohne die Enteroide zu stören.
- Wählen Sie etwa 10-15 sphärische Enteroide mit einer geschnittenen 20 μL Pipettenspitze unter einem Stereomikroskop aus und fügen Sie sie der Basalmembranmatrix hinzu, um 285 μL 8 mg / ml Proteinkonzentrationsmischung herzustellen.
- Pipeten Sie vorsichtig mit einer geschnittenen 200-μL-Spitze auf und ab, um die Enteroide zu mischen, ohne sie zu brechen. Legen Sie fünf 50 μL Gelpunkte in die Mitte einer runden 35 mm x 10 mm großen Zellkultur-Petrischale oder einer mit ähnlichen Abmessungen.
- Die enteroiden Gelpunkte bei 37 °C für 10 min inkubieren, um sich zu verfestigen. Dann fügen Sie 1 ml frisches Wachstumsmedium in die Schüssel hinzu. Inkubieren Sie die Enteroide für mindestens 2-3 Tage zur Stabilisierung und bis die Enteroide eine geeignete Größe von 0,5-1 μL erreichen.
HINWEIS: Es ist wichtig, eine Schale mit einer niedrigen Wand für einen leichteren Zugang zu den Enteroiden und einem kleinen Durchmesser für weniger Volumen des Wachstumsmediums zu haben.
- Mikroinjektion von Dextran-FITC und getestetem Material
- Schalten Sie den Dreiwegehahn zur pneumatischen Pumpe aus. Füllen Sie die Mikropipette mit dem injizierten Material, in diesem Fall Dextran-FITC mit oder ohne LPS.
- Bereiten Sie eine Petrischale vor, die mit einem Streifen transparenter Folie bedeckt ist. Legen Sie zwei bis vier 1-μL-Punkte des eingespritzten Materials auf die Folie.
- Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Spitze der Mikropipette bis knapp in die Flüssigkeit, aber über den Film unter der Visualisierung eines Stereomikroskops zu treiben. Ziehen Sie vorsichtig an der Spritze, um das injizierte Material in die Mikropipette zu ziehen.
- Füllen Sie die Mikropipette mit 2-4 μL injiziertem Material und drücken Sie auf die Spritze, um Luft an der Spitze der Mikropipette zu entfernen. Untersuchen Sie die injizierte Materialsäule in der Mikropipette, um sicherzustellen, dass keine Lufttasche vorhanden ist. Notieren Sie das Volumen des injizierten Materials, das sich in die Mikropipette zurückgezogen hat.
HINWEIS: Die Flüssigkeit ist aufgrund von Dextran-FITC in einer grünlichen Farbe sichtbar. - Schalten Sie die an die pneumatische Pumpe angeschlossene Luftquelle ein, die einen Luftdruck von ca. 60 psi bereitstellt. Schalten Sie die Pumpe ein und stellen Sie die Pumpendauer auf 10-15 ms ein. Drehen Sie den Absperrhahn an der Spritze, um die Leitung von der Pumpe zur Mikropipette zu öffnen.
HINWEIS: Durch die längere Pumpendauer kann mehr Material pro Pumpe freigesetzt werden. Es wird empfohlen, die gleiche Pumpdauer und Mikropipetten mit ähnlichen Spitzengrößen für das gesamte Experiment zur Abschätzung des injizierten Volumens zu verwenden. - Entfernen Sie die Enteroide aus dem Zellkulturinkubator und legen Sie das Geschirr auf einen warmen Schaumstoff in einem abgedeckten Behälter, um die Lichtexposition nach der Mikroinjektion zu begrenzen.
- Platzieren Sie die Petrischale mit Enteroiden unter dem Stereomikroskop und bewegen Sie die Mikromanipulatorknöpfe, um die Spitze der Mikropipette in einem Winkel von etwa 35°-45° zur horizontalen Oberfläche zu platzieren (Abbildung 3). Dies erfordert etwas Übung im Vorfeld.
- Visualisieren und kartieren Sie die Enteroide in jeder Petrischale unter dem Mikroskop, um einen Plan für die Injektion von etwa 3-5 kugelförmigen Enteroiden pro Schale zu erstellen.
- Sobald sich die Spitze der Mikropipette in der Nähe der Flüssigkeitsoberfläche befindet, schauen Sie in die Mikroskopokulare, um die Spitze in Richtung des Zielenteroids zu bewegen.
- Punktieren Sie das Enteroid mit der Mikropipettenspitze, indem Sie den Z-Achsenknopf mit einer präzisen langsamen Bewegung verschieben. Die enteroide Wand drückt und springt zurück, sobald die Spitze durch die enteroide Oberfläche geht, an welchem Punkt der Fortschritt aufhören sollte.
- Klopfen Sie mit einem Fuß auf das Pumppedal und füllen Sie das Enteroid mit der grünlichen Dextran-FITC-Lösung, bis es leicht expandiert ist. Notieren Sie die Anzahl der Pumpen, um das Fördervolumen und die Dextrankonzentration zu berechnen.
- Ziehen Sie die Spitze der Mikropipette nach Beendigung der Mikroinjektion zurück und gehen Sie zum nächsten Enteroid. Mit etwas Übung kann der Prozess reibungslos verlaufen.
- Wenn die Spitze bricht, ersetzen Sie sie durch eine andere Mikropipette mit einer ähnlichen Spitzengröße. Ziehen Sie genügend injiziertes Material für alle Enteroide in derselben Expositionsgruppe und wechseln Sie die Mikropipette zwischen den injizierten Materialien, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.
- Stellen Sie die injizierte enteroide Schale unter eine Abdeckung, um Lichteinwirkung zu vermeiden.
- Dextran-FITC Sammlung und Messung
- Entfernen Sie nach dem Mikroinjektionsverfahren sofort das Kulturmedium. 2x mit frischen Wachstumsmedien waschen, um eventuelle Dextran-FITC-Reste zu entfernen. Fügen Sie frische Medien hinzu und notieren Sie die Zeit als Zeit 0 nach der Mikroinjektion.
HINWEIS: Möglicherweise benötigen Sie eine zweite Person, um diesen Schritt durchzuführen, ohne den Mikroinjektionsprozess zu unterbrechen. - Sammeln Sie 200 μL Nährmedien in einem undurchsichtigen 0,5-ml-Mikrofugenröhrchen und ersetzen Sie dann das entfernte Nährmedium durch das gleiche Volumen an frischem Wachstumsmedium bei 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h und 12 h nach Mikroinjektionen.
HINWEIS: Das Zeitintervall kann je nach Experiment variieren. Bei einer basolateralen Exposition sollten die Ersatzmedien die Exposition in der gleichen Konzentration enthalten. - Lagern Sie die gesammelten Nährmedien bei 4 °C und messen Sie die Dextrankonzentration innerhalb von 24 h. Lagern Sie Medienreste bei −80 °C für andere Analysen. Am Ende der Nährmediensammlung ernten Sie die Enteroide für die RNA-Extraktion oder Bildgebung, falls erforderlich.
- Messen Sie die Dextran-FITC-Konzentrationen mit einem Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Lesegerät. Erstellen Sie eine Standardkurve für jede Platte unter Verwendung serieller Verdünnungen und durch Anpassung einer linearen Regressionsgeraden, wie in Abbildung 4 dargestellt.
- Korrigieren Sie die Absorption für das entfernte Volumen von Nährmedien, die Dextran enthalten, das durch frische Wachstumsmedien ohne Dextran ersetzt wurde, wie folgt: Die Entfernung von 200 μL aus 2 ml Kulturmedien beträgt 10 Vol.-%.
Korrigierte Absorption bei 2 h = (Absorption bei 1 h x 10%) + gemessene Absorption bei 2 h
Die Absorption des ersten korrigierten Mediums muss nicht korrigiert werden. Berechnen Sie dann die Dextrankonzentration aus dem korrigierten Absorptionswert unter Verwendung der Standardkurvengleichung. - Zur Normalisierung dividieren Sie die Dextrankonzentration durch die Gesamtzahl der Pumpen für jede Petrischale und multiplizieren Sie sie dann mit der größten Gesamtzahl der Pumpen pro Schale.
HINWEIS: Alle Expositionen werden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt (drei Petrischalen pro Exposition mit 3-5 mikroinjizierten Enteroiden pro Schale). Die Mittelwerte der Triplikate werden zwischen den Expositionen mit einem Student's t-Test verglichen.
- Entfernen Sie nach dem Mikroinjektionsverfahren sofort das Kulturmedium. 2x mit frischen Wachstumsmedien waschen, um eventuelle Dextran-FITC-Reste zu entfernen. Fügen Sie frische Medien hinzu und notieren Sie die Zeit als Zeit 0 nach der Mikroinjektion.
Representative Results
Wir etablierten eine enteroide Zelllinie aus gespendetem Ileum-fetalem Gewebe nach modifizierten Protokollen, die von unseren Mitarbeitern am Translational Tissue Modeling Laboratory12 der University of Michigan bereitgestellt wurden. Die enteroide Zelllinie wurde negativ auf Mykoplasmeninfektion getestet. Die Enteroide färbten sich positiv für Villin, CDX2, Lysozym, Mucin, Claudin, Occludin und Zonula-Occluden 1 (Abbildung 5), was ihren Dünndarmepithelursprung bestätigt. Die Enteroide wurden mit 4 kDa Dextran-FITC bei 5 mg/ml in PBS mikroinjiziert (Abbildung 6). Die Test-Expositionen waren LPS in verschiedenen Konzentrationen, 0,1 mg/ml und 0,5 mg/ml, gemischt mit Dextran-FITC für apikale Exposition. Als Positivkontrolle verwendeten wir 2 mM EGTA und gaben es 4 h nach der Mikroinjektion von Dextran in das Kulturmedium. EGTA ist ein Kalziumchelator, der die Durchlässigkeit von Tight Junctions erhöht. Die Negativkontrollen wurden mit Dextran-FITC allein in PBS mikroinjiziert. Für die basolaterale Exposition hatten die Ersatzmedien für die serielle Nährmediensammlung die gleiche Konzentration der Exposition (d. h. 2 mM EGTA). Die Ergebnisse zeigen einen deutlichen Anstieg der Dextrankonzentration in Kulturmedien nach Zugabe von EGTA im Vergleich zur Negativkontrolle PBS. Die apikale Exposition von LPS induzierte eine höhere Permeabilität von Dextran, beginnend etwa 8 Stunden nach der Exposition in einer konzentrationsabhängigen Weise (Abbildung 7).
Abbildung 1: Aufbau des Mikroinjektors. Der Aufbau umfasst ein Stereomikroskop, einen Mikromanipulator, der auf einem Magnetstativ auf einer schweren Stahlgrundplatte montiert ist, einen Mikropipettenhalter, der mit einer Spritze mit einem Dreiwegehahn verbunden ist, und eine pneumatische Pumpe. Die Wandluftzufuhr liefert den Luftdruck, der von der Pumpe geregelt wird, um ein gleichmäßiges Pumpenvolumen zu erzeugen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Horizontaler Mikropipettenhalter. Diese Kunststoffplattform ist so konzipiert, dass sie die Mikropipette nach dem Ziehen des Glaskapillarrohrs zum Schneiden der Spitze hält. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Positionierung der Mikropipetten. Ein Winkel von 35°-45° ist ideal für die Injektion von Enteroiden, die sich in der Mitte der Petrischale befinden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Dextran-Standardkurve. Die Kurve wurde mit fluoreszierender Absorption von 10 seriellen Verdünnungen von Dextran in Duplikaten konstruiert. Eine lineare Regressionslinie wurde angepasst, um eine Regressionsgleichung zu erzeugen. Die Fehlerbalken sind SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Fluoreszierende Biomarker von Enteroiden. DAPI für Kernfärbung ist blau. Folgende Biomarker werden gezeigt: (A) Villin, (B) CDX2, (C) Lysozym, (D) Mucin, (E) Claudin, (F) Okklusion und (G) Zonula-Occluden 1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Enteroide in verschiedenen Stadien . (A) Ein Enteroid im Alter von 7-10 Tagen ist klein und mit einer dicken Wand. (B) Ein Enteroid, das für die Mikroinjektion mit einer großen Größe, einem Lumen und einer Denkwand bereit ist, und (C) fluoreszierendes Dextran-FITC in einem Enteroid 2 Tage nach der Mikroinjektion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Permeabilität von Dextran-FITC nach Mikroinjektion . (A) Die gemessenen Dextranspiegel in den Medien waren nach der Zugabe von EGTA höher als PBS. (B) Mikroinjizierte 0,5 mg/ml LPS induzierte eine größere Leckage von Dextran aus dem enteroiden Lumen in das Medium als mikroinjizierte 0,1 mg/ml LPS ab 8 h nach der Injektion. *p-Wert < 0,05, Fehlerbalken sind SEM, n = 3, ein studentischer t-Test wurde zur Berechnung der Signifikanz verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung von Enteroiden aus fetalem Darmgewebe sowie die Modellcharakterisierung mit Immunfluoreszenzfärbung und epithelialen Permeabilitätstests. Die Permeabilität der Enteroide wurde mit einer Mikroinjektionstechnik und seriellen Zeitverlaufsmessungen der ausgetretenen Dextran-FITC-Konzentration in den Kulturmedien getestet. Die Neuheit dieses Protokolls ist die apikale Exposition, die der menschlichen Darmphysiologie im Vergleich zur basolateralen Exposition in den Kulturmedien ähnlicher ist7. In früheren Studien verwendeten Hill et al. serielle Bildgebung und Berechnung der Fluoreszenzintensität über die Zeit16. Ares et al. setzten die basolaterale Membran eines Epithelmodells LPS aus und verglichen dann das zelluläre Genexpressionsmuster7. Im Vergleich dazu verwenden wir apikale Exposition der getesteten Reagenzien und untersuchen dann mögliche Veränderungen der groben Permeabilität, indem wir serielle Konzentrationen von ausgetretenem Dextran in den Kulturmedien messen. Unsere Methode ermöglicht auch die serielle vergleichende Analyse von Zytokinen, die von Epithelzellen in Kulturmedien produziert werden, und die Genexpression durch die Sammlung zellulärer mRNA. LPS wurde häufig verwendet, um Darmverletzungen in Tier- und In-vitro-Modellen zu untersuchen, da es Permeabilität und Entzündung induzieren kann 7,17. Als LPS in diesem Modell getestet wurde, wurde die epitheliale Permeabilität durch die Expositionskonzentration unterschieden. Dieses Protokoll kann erweitert werden, um andere Krankheitspathologien mit verschiedenen mikroinjizierten Materialien und Ergebnismessungen zu untersuchen.
Kritische Schritte in diesem Protokoll umfassen die Etablierung von Enteroiden aus fetalen Darmgeweben, die Charakterisierung von Enteroiden und die Mikroinjektionstechnik. Die Integrität dieser Studie hängt von einer genauen Zellprobenahme ab. Die Verwendung anatomischer Orientierungspunkte und Blutgefäße ist hilfreich, um die Auswahl von Dünndarmzellen sicherzustellen. Aufgrund des robusten Wachstums und der Differenzierung fetaler Darmstammzellen ist ein aufwändiges Verfahren zur Isolierung der Stammzellen aus anderen Epithelzellen nicht notwendig. Nachdem die Enteroide etabliert wurden, ist es wichtig, die Eigenschaften des Modells durch Färbung für Proteine und Zellmarker zu bestätigen. In diesem Protokoll wurden die Enteroide für Enterozyten mit Villin und CDX2, Paneth-Zellen mit Lysozym und Becherzellen mit Mucin gefärbt, alle Zellen, die im Dünndarmepithel 18,19,20 gefunden werden. Im Gegensatz zu herkömmlichen Einzelzelllinien, die einen Zelltyp aufweisen, etablieren Enteroide alle Zelltypen aus den intestinalen Vorläuferstammzellen8. Der Färbeteil dieses Protokolls kann für die spezifischen zellulären Marker von Interesse modifiziert werden. Entscheidend für die Zuverlässigkeit dieses Protokolls ist die Mikroinjektionstechnik. Die Konsistenz der Mikropipettenspitzen kann überprüft werden, indem das Volumen pro Pumpe mit Dextran-FITC-Lösung gemessen und der Durchmesser der Spitzen unter dem Mikroskop visualisiert wird. Aufgrund des Kontaminationsrisikos kann dieselbe Mikropipette nicht für mehr als eine Exposition verwendet werden. Zusätzlich können Form und Wachstum der Enteroide durch den Inhalt ihrer Wachstumsmedien beeinflusst werden. Wir fanden heraus, dass die kugelförmigen und nicht die blumenkohlförmigen Enteroide bessere Modelle für die Mikroinjektion lieferten. Die sphärische Form kann durch einen größeren Wnt-Faktor im Medium21 induziert werden.
Dieses Protokoll hängt weitgehend von den Fähigkeiten des Darstellers bei der Mikroinjektion ab, um Schwankungen zu reduzieren, insbesondere bei zeitkritischen Messungen. Variationen können minimiert werden, indem derselbe erfahrene Performer mit konsistenten Techniken verwendet wird, der gleiche Zellursprung verwendet wird, um genetische Variationen zu vermeiden, an der gleichen Passage getestet wird, um Reifeverzerrungen zu beseitigen, und die Zellen in der gleichen Art von Medien für eine ähnliche Zelldifferenzierung züchtet. Die Komponenten der Wachstumsmedien können eine unterschiedliche Differenzierung von Stammzellen in vitro und nicht in einer in vivo-Umgebung induzieren. Zum Beispiel wird Lysozym in vivo erst in den Wochen 22-24 der Schwangerschaftsentwicklung exprimiert, wenn sich Paneth-Zellen bilden und funktionsfähig werden22. Wir konnten jedoch Lysozym in unseren Enteroiden nachweisen, die aus 10-wöchigen fetalen Eingeweiden etabliert wurden. Diese Methode kann die Anzahl der getesteten Expositionen gleichzeitig aufgrund der hohen technischen Fähigkeiten, die für die Mikroinjektion erforderlich sind, begrenzen. Die Dextranche aus dem Mikroinjektionsloch kann die Beurteilung der Permeabilität beeinflussen. Um diesen Effekt zu eliminieren, werden Dreifachwäschen unmittelbar nach der Mikroinjektion empfohlen, um Rest-Dextran aus dem Verfahren zu entfernen. Die Dextrankonzentration in den Medien sollte stündlich für 4-6 h nach der Mikroinjektion gemessen werden. Experimente mit einem signifikanten Anstieg der Dextrankonzentration innerhalb von 2-4 h nach der Injektion sollten von der endgültigen Analyse ausgeschlossen werden.
Diese Methode hat mehrere Vorteile. Es erfordert geringere Kosten und weniger Ressourcen im Vergleich zu enteroiden Monoschichten auf Transwell. Darüber hinaus kann es auf andere Expositionen wie lebende Bakterien oder Viren ausgeweitet werden, um die anfängliche Interaktion zwischen Darmmikroben und Epithel zu untersuchen. Das eingeschlossene Lumen des Enteroids kann ein stabiles Wachstum von mikroinjizierten lebenden Bakterien ohne Kontamination des Wachstumsmediums aufrechterhalten13. Im Gegensatz zur Monoschicht, die Wachstumsmedien und Inkubationssauerstoff ausgesetzt ist, ist das eingeschlossene Lumen ein enger, isolierter Raum. Ein geschlossenes Lumen ermöglicht keine Kommunikation mit den Wachstumsmedien und einen luminalen Sauerstoffgehalt, der mit lebendem Bakterienwachstum im Laufe der Zeit geringer ist13.
Die Verwendung von fetalem Darmgewebe bildet das Darmepithel von Frühgeborenen im Vergleich zu adulten Darmstammzellen oder Tiermodellen genauer ab7. Darüber hinaus ermöglicht die Polarität von Enteroiden sowohl apikale als auch basolaterale Belichtungen und Messungen23. Die Enteroide bilden ein geschlossenes Lumen mit niedrigerer Sauerstoffkonzentration, das die Sauerstoffkonzentration des Darms besser nachahmt24. Im Gegensatz zu technologisch fortgeschritteneren Protokollen16 ermöglicht die Verwendung von Bruttomedienmessungen eine bessere Zugänglichkeit dieser Technik. Das Experiment zeigte, dass epitheliale Leckage durch apikale Exposition gegenüber LPS induziert werden kann und konzentrationsabhängig ist. Da diese Methode die Änderungen der ausgetretenen Dextrankonzentration untersucht, ist sie nützlich, um grobe funktionelle Veränderungen in Tight Junctions zu erkennen. Die Boten-RNA-Sammlung und Sequenzierung der exponierten Enteroide und die Western-Blot-Analyse können die Analyse der groben funktionellen Veränderungen ergänzen. Dieses Modell untersucht die Integrität des Darmepithels in einem System, das der Frühgeborenenumgebung stark ähnelt und daher verwendet werden kann, um ein besseres Verständnis von vorzeitigen Darmverletzungen und anderen Krankheitspathologien zu erlangen.
Disclosures
Alle Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte offenlegen müssen.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Ian Glass und dem Personal des Birth Defects Research Laboratory an der University of Washington für die gemeinsame Nutzung des fetalen Gewebes. Wir danken auch Dr. Michael Dame und Dr. Jason Spence vom Translational Tissue Modeling Laboratory an der University of Michigan für ihre endlose Unterstützung und Anleitung während des gesamten Prozesses.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin 250 uL/mL | Gibco | 15-290-026 | |
| Anti-CDX-2 [CDX2-88] 0.5mL concentrated Mouse, IgG, monoclonal | Biogenex | MU392A-5UC | |
| Anti-Claudin 2 antibody (ab53032) | abcam | ab53032 | |
| Anti-Claudin 3 antibody (ab15102) | abcam | ab15102 | |
| Anti-LYZ antibody produced in rabbit | Millipore Sigma | HPA066182-100UL | |
| Anti-Mucin 2/MUC2 Antibody (F-2): sc-515032 | Santa Cruz | sc-515032 | |
| Anti-Villin, Clone VIL1/4107R 0.5mL concentrated Rabbit, IgG, monoclonal | Biogenex | NUA42-5UC | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Millipore Sigma | A8806 | |
| Cell culture plates, CytoOne 12-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1395 | |
| Cell culture plates, CytoOne 6-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1560 | |
| Centrifuge with 15 mL tube buckets | Eppendorf | 05-413-110 | |
| CHIR 99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
| Confocal microscope | Olympus FV1200 | N/A | Or a similar microscope |
| Conical centrifuge tubes, 15 ml | Falcon | 05-527-90 | |
| Cover glass for microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-DP | |
| Disposable scalpels | Mopec | 22-444-272 | |
| Dmidino-2-phenylindole (DAPI) Solution (1 mg/mL) | Fisher Scientific | 62248 | |
| Dulbecco's Phosphate-buffered Saline (DPBS, 1X) | Fisher Scientific | AAJ67802K2 | |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt (EGTA) | Millipore Sigma | E8145-10G | |
| Fluorescein isothiocyanate dextran (Dextran-FITC) 4 kDa | Millipore Sigma | 46944 | |
| Fuorescence microplate reader | Agilent BioTek | Synergy HTX | |
| Gentamicin 50 mg/mL | Gibco | 15-750-060 | |
| Glass capillary tubes, single-barrel borosilicate, 1x0.5mm, 6" (cut in half before pulling) | A-M systems | 626500 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | Fisher Scientific | A32742 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Fisher Scientific | A32731 | |
| Goat Serum | Fisher Scientific | 16210064 | |
| ImageJ software | NIH | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | Stem Cell Technologies | 06010 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Millipore Sigma | L4391-1MG | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL | Corning | 354234 | protein concentration > 9 mg/mL preferably |
| Micro forceps | Fisher Scientific | 13-820-078 | |
| Micro scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | Or a similar equipment |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 22-034486 | |
| Occludin Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 71-1500 | |
| Paraformaldehyde 32% aqueous solution | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | RT 15714 | |
| Petri Dishes, 35x10 mm | Fisher Scientific | 150318 | |
| Petri Dishes, 60x15 mm | Fisher Scientific | 12-565-94 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | 10010031 | |
| PicoPump foot switch | World Precision Instruments | 3260 | |
| Pipette tips, non-filtered, 1000 uL | Fisher Scientific | 21-402-47 | |
| Pipette tips, non-filtered, 20 uL | Fisher Scientific | 21-402-41 | |
| Pipette tips, non-filtered, 200 uL | Fisher Scientific | 21-236-54 | |
| Pneumatic PicoPump system | World Precision Instruments | SYS-PV820 | or a similar picopump system |
| Primocin 50 mg/mL, 10x1 ml vial | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Steel base plate | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereo microscope | Zeiss stemi 350 | Or a similar microscope | |
| ThermoSafe PolarPack Foam Bricks | Sonoco | 03-531-53 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Wall air supply | N/A | N/A | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 61-7300 |
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