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भ्रूण ऊतक-व्युत्पन्न एंटरोइड्स में उपकला पारगम्यता का परीक्षण

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/64108
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 2
1Morsani College of Medicine, University of South Florida, 2Department of Pediatrics, Morsani College of Medicine, University of South Florida, 3Department of Molecular Pharmacology and Physiology, Morsani College of Medicine, University of South Florida

Summary

यह प्रोटोकॉल भ्रूण आंतों के ऊतकों से एक त्रि-आयामी आंतों के मॉडल, एंटरोइड्स की स्थापना का विवरण देता है। मॉडल लक्षण वर्णन के लिए उपकला बायोमार्कर के इम्यूनोफ्लोरोसेंट इमेजिंग का उपयोग किया गया था। फ्लोरोसेंट डेक्सट्रान के रिसाव द्वारा मापी गई खुराक-निर्भर तरीके से माइक्रोइंजेक्शन तकनीक का उपयोग करके लिपोपॉलेसेकेराइड, एक जीवाणु एंडोटॉक्सिन का एपिकल एक्सपोजर एपिथेलियल पारगम्यता को प्रेरित करता है।

Abstract

मानव भ्रूण ऊतक-व्युत्पन्न एंटरोइड्स प्रीटरम शिशुओं में आंतों की चोटों का अध्ययन करने के लिए एक आशाजनक इन विट्रो मॉडल के रूप में उभर रहे हैं। एंटरोइड्स ध्रुवीयता का प्रदर्शन करते हैं, जिसमें एक एपिकल सीमा, तंग जंक्शन और विकास मीडिया के संपर्क में आने वाली एक बेसोलेटरल बाहरी परत के साथ एक लुमेन शामिल होता है। आंतों की चोटों के परिणामों में म्यूकोसल सूजन और बढ़ी हुई पारगम्यता शामिल है। कमजोर अपरिपक्व मानव विषयों में आंतों की पारगम्यता का परीक्षण अक्सर संभव नहीं होता है। इस प्रकार, प्रीटरम शिशुओं में आंतों की चोटों का अध्ययन करने के लिए एक इन विट्रो भ्रूण ऊतक-व्युत्पन्न आंतों के मॉडल की आवश्यकता होती है। एंटरोइड्स का उपयोग तंग जंक्शन प्रोटीन द्वारा विनियमित उपकला पारगम्यता में परिवर्तन का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। एंटरोइड्स में, आंतों की स्टेम कोशिकाएं सभी उपकला कोशिका प्रकारों में अंतर करती हैं और माउस सारकोमा कोशिकाओं द्वारा स्रावित तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पर एक त्रि-आयामी संरचना बनाती हैं। इस लेख में, हम भ्रूण आंतों के ऊतकों से एंटरोइड ्स स्थापित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीकों का वर्णन करते हैं, इम्यूनोफ्लोरोसेंट इमेजिंग के साथ एंटरॉइड तंग जंक्शन प्रोटीन की विशेषता और उपकला पारगम्यता का परीक्षण करते हैं। चूंकि ग्राम-नकारात्मक प्रमुख बैक्टीरियल डिस्बिओसिस आंतों की चोट के लिए एक ज्ञात जोखिम कारक है, इसलिए हमने एंटरोइड्स में पारगम्यता को प्रेरित करने के लिए ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया द्वारा उत्पादित एक एंडोटॉक्सिन लिपोपॉलेसेकेराइड (एलपीएस) का उपयोग किया। फ्लोरेसिन-लेबल डेक्सट्रान को एंटरोइड लुमेन में माइक्रोइंजेक्शन किया गया था, और पैरासेल्युलर पारगम्यता में परिवर्तन को मापने के लिए संस्कृति मीडिया में लीक हुए सीरियल डेक्सट्रान सांद्रता को मापा गया था। प्रयोग से पता चला कि एलपीएस के लिए एपिकल एक्सपोजर एक एकाग्रता-निर्भर तरीके से उपकला पारगम्यता को प्रेरित करता है। ये निष्कर्ष इस परिकल्पना का समर्थन करते हैं कि ग्राम-नकारात्मक प्रमुख डिस्बिओसिस अपरिपक्व शिशुओं में आंतों की चोट के तंत्र में योगदान देता है।

Introduction

अपरिपक्व शिशुओं को लगातार और लंबे समय तक सूजन के संपर्क में लाया जाता है जो उन्हें आंतों की चोट के लिए बढ़ते जोखिम में डालता है जिसके परिणामस्वरूप दीर्घकालिक विकलांगता या मृत्युहो जाती है। इस क्षेत्र में अनुसंधान को कमजोर अपरिपक्व शिशुओं पर प्रयोगों का संचालन करने की सीमित क्षमता से चुनौती दी जाती है। इसके अलावा, उपयुक्त मॉडल की कमी ने समय से पहले आंतों के वातावरण के व्यापक अध्ययन मेंबाधा डाली है। मौजूदा इन विट्रो और विवो मॉडल समय से पहले मानव आंतों के वातावरण का व्यापक रूप से प्रतिनिधित्व करने में विफल रहे हैं। विशेष रूप से, एकल उपकला भ्रूण कोशिका लाइनें तंग जंक्शनों का निर्माण नहीं कर सकती हैं, और पशु मॉडल मानव अपरिपक्व शिशुओं की तुलना में विभिन्न भड़काऊ और प्रतिरक्षात्मक प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन करते हैं। आंतों के क्रिप्ट स्टेम कोशिकाओं के प्रसार और भेदभाव में एक प्राथमिक मार्ग के रूप में डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग की खोज और नोवेल एलजीआर 5 + ऊतक स्टेम कोशिकाओं के साथ, आंतों के ऊतक-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स जैसे एंटरोइड्स और कोलोनोइड्स को इन विट्रो मॉडल 3,4,5 के रूप में स्थापित किया गया था। इस तकनीक का उपयोग करके, तीन आयामी (3 डी) एंटरॉइड मॉडल बनाना और उपयोग करना संभव है जो आंतों के वातावरण 6,7 के उपकला प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए पूरे ऊतक या आंत की बायोप्सी से विकसितहोते हैं।

संस्कृति में उगाई जाने वाली विशिष्ट आंतों की कोशिका लाइनों के विपरीत, एंटरोइड्स तंग जंक्शन प्रोटीन 8 से जुड़े लुमेन के साथ ध्रुवीयता प्रदर्शित करतेहैं। यह विकास मीडिया में बेसोलेटरल सीमा के संपर्क में आने की अनुमति देता है, साथ ही एपिकल सीमा का आकलन करने के लिए ल्यूमिनल माइक्रोइंजेक्शन भी करता है। इसके अलावा, एंटरोइड्स मानव उपकला 9,10 के समान आनुवंशिक, शारीरिक और प्रतिरक्षाविज्ञानी विशेषताओं को प्रदर्शित करते हैं। भ्रूण ऊतक-व्युत्पन्न एंटरोइड उपकला समारोह पर समयपूर्वता की भूमिका की परीक्षा के लिए अनुमति देते हैं। एंटरोइड्स की अनूठी विशेषताएं प्रीटरम आंतों के वातावरण से अधिक निकटता से मिलती-जुलती हो सकतीहैं। ऊतक-व्युत्पन्न एंटरोइड्स का उपयोग एक मोनोलेयर रूप के रूप में तंग जंक्शन अखंडता के लिए परीक्षण करने के लिए या एक ठोस तहखाने झिल्ली प्रोटीन मिश्रण में एम्बेडेड 3 डी संरचनाओं के रूप में किया जा सकता है। यदि एपिकल एक्सपोजर वांछित है तो बाद के रूप के लिए एक माइक्रोइंजेक्शन तकनीक की आवश्यकता होती है। एंटरॉइड मॉडल में उपकला प्रतिक्रियाओं के माप में आरएनए अनुक्रमण द्वारा जीन अभिव्यक्ति, एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसे (एलिसा) द्वारा बायोमार्कर, या उन्नत इमेजिंग तकनीक शामिल हैं। यहां प्रस्तुत तकनीक फ्लोरोमेट्री के साथ सकल पारगम्यता को मापने के लिए एक और व्यवहार्य विकल्प प्रदान करती है।

अपरिपक्व शिशुओं में आंतों की चोट में एक बहुक्रियात्मक रोगजनन होता है जिसमें आंत माइक्रोबियल समुदाय का असंतुलन शामिल होता है। एंटरोइड्स प्रीटरम आंतों के रोगों के कुछ पहलुओं का अध्ययन करने के लिए उत्कृष्ट मॉडल प्रदान कर सकते हैं जैसे कि नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस जिसमें उपकला कार्य शामिल हैं। एंटरोइड्स मानव भ्रूण आंत10 के समान विशेषताओं को प्रदर्शित करते हैं। बेसोलेटरल एक्सपोजर के रूप में संस्कृति मीडिया में ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया द्वारा उत्पादित एक एंडोटॉक्सिन लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) के लिए एंटरोइड्स को उजागर करना जीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है जिससे सूजन और आंतोंकी पारगम्यता बढ़ सकती है। इस अध्ययन का उद्देश्य एलपीएस जैसे जीवाणु उत्पादों के एपिकल एक्सपोजर के बाद सकल उपकला पारगम्यता में परिवर्तन का मूल्यांकन करना है। परिणाम आंतों की चोट के रोगजनन में शामिल माइक्रोब-एपिथेलियल इंटरैक्शन में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। सकल पारगम्यता का परीक्षण करने के लिए डिज़ाइन की गई विधि के लिए माइक्रोइंजेक्शन सेटअप और कौशल की आवश्यकता होती है।

Protocol

मानव ऊतक संग्रह को वाशिंगटन संस्थागत समीक्षा बोर्ड विश्वविद्यालय (अध्ययन आईडी: अध्ययन 380 और सीआर आईडी: सीआर 3603) द्वारा अनुमोदित किया गया था और जन्म दोष अनुसंधान प्रयोगशाला द्वारा किया गया था। जन्म दोष अनुसंधान प्रयोगशाला को यूनिस कैनेडी श्राइवर नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ चाइल्ड हेल्थ एंड ह्यूमन डेवलपमेंट से एनआईएच पुरस्कार संख्या 5आर 24एचडी000836 द्वारा समर्थित किया गया था। नमूने सहमति से प्रतिभागियों से एकत्र किए गए थे और डी-आइडेंटिफाइड और बिना किसी स्वास्थ्य जानकारी के भेजे गए थे। छोटी आंत के नमूनों को बर्फ-ठंडे डलबेको के फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (डीपीबीएस) में संग्रहीत किया गया था और रात भर प्राप्त प्रयोगशाला में भेजा गया था।

1. अभिकर्मक तैयारी

नोट: अभिकर्मकों और कैटलॉग संख्याओं की सूची के लिए सामग्री की तालिका देखें; अनुशंसित वॉल्यूम 6-वेल प्लेट के लिए हैं जब तक कि अन्यथा उल्लेख न किया जाए।

  1. ऊतकों या एंटरोइड्स के संपर्क में आने वाले सभी प्लास्टिकवेयर और युक्तियों को कोट करने के लिए 50 मिलीलीटर फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में 50 मिलीग्राम बीएसए पाउडर को 100 μg / mL के साथ एक व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक प्रिमोसिन के साथ घोलकर 0.1% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) तैयार करें।
    1. बीएसए के साथ कोट करने के लिए, युक्तियों को कवर करने के लिए पर्याप्त बीएसए के साथ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में गैर-फ़िल्टर किए गए पाइप टिप्स रखें, पेट्री डिश की सतह को कवर करने के लिए बीएसए के 1-2 एमएल जोड़ें, या उपयोग से पहले कमरे के तापमान पर कम से कम 20-30 मिनट के लिए बीएसए के साथ 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब भरें।
  2. डीपीबीएस के 50 एमएल को 100 μg/mL प्रिमोसिन और 50 μg/mL gentamicin के साथ मिलाकर DPBS मीडिया तैयार करें। इस मीडिया को 2.5 μg / mL एम्फोटेरिसिन के साथ और बिना तैयार करें।
  3. 2 एमएल ऑर्गेनॉइड ग्रोथ मीडियम, 100 μg/mL प्रिमोसिन, 10 μM Y27632, और 2.5 μM CHIR99021 को मिलाकर एंटरॉइड ग्रोथ मीडिया तैयार करें। रोजाना ताजा मीडिया बनाएं और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में गर्म करें।
    नोट: Y27632 के लिए कमजोर पड़ने का कारक 1: 250 है। CHIR99021 के लिए, 1:4000 कमजोर पड़ने को प्राप्त करने के लिए गर्म मीडिया में CHIR स्टॉक समाधान को 1:100 तक पतला करें और फिर एंटरॉइड ग्रोथ मीडिया में 1:40 तक पतला करें।
  4. स्टॉक बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स 10 μM Y27632 और 2.5 μM CHIR99021 में जोड़कर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स मिश्रण तैयार करें। 6-वेल प्लेट के एक कुएं के लिए 8 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीन एकाग्रता पर अंतिम तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स मिश्रण का कुल 285 μL बनाएं।
    नोट: बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स को तरल रूप में रहने के लिए बर्फ-ठंडा होना चाहिए और गर्म तापमान पर जम जाएगा। स्टॉक बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स की प्रोटीन एकाग्रता समीकरण का उपयोग करके 8 मिलीग्राम / एमएल अंतिम प्रोटीन एकाग्रता बनाने के लिए आवश्यक मात्रा निर्धारित करती है:
    आयतन 1 × एकाग्रता 1 = आयतन 2 × एकाग्रता 2
  5. पीबीएस में 32% स्टॉक पीएफए को 1: 8 तक पतला करके 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) तैयार करें, और कमरे के तापमान पर स्टोर करें। एंटरोइड्स के प्रत्येक कुएं को ठीक करने के लिए 0.5 एमएल बनाएं।
  6. पीबीएस में 5% बकरी सीरम और 0.5% ट्राइटन एक्स -100 जोड़कर ब्लॉकिंग बफर तैयार करें। प्रति अच्छी तरह से पहले एंटीबॉडी के लिए 1 एमएल और प्रति कुएं अतिरिक्त एंटीबॉडी के लिए 0.5 एमएल तैयार करें।
    नोट: द्वितीयक एंटीबॉडी के मेजबान के रूप में एक ही प्रजाति के सीरम का उपयोग करें
  7. प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी तैयार करें, प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए निर्माता द्वारा अनुशंसित एकाग्रता पर बफर को अवरुद्ध करने में पतला।
  8. पीबीएस में 1 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान से 1:200 तक पतला करके 5 μg / mL Dmidino-2-phenylindole (DAPI) तैयार करें। दाग वाले एंटरोइड्स के प्रति कुएं में 0.5 एमएल बनाएं।
  9. पीबीएस में 70% ग्लिसरॉल तैयार करें और माइक्रोस्कोप स्लाइड पर एंटरोइड्स को बढ़ाने के लिए 0.5 एमएल बनाएं।
  10. पीबीएस में 25 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान को 1: 5 अनुपात से पतला करके 5 मिलीग्राम / एमएल डेक्सट्रान-एफआईटीसी (फ्लोरेसिन-आइसोथियोसाइनेट) तैयार करें। माइक्रोइंजेक्शन के लिए 20 μL बनाएं।
  11. पीबीएस में एलपीएस पाउडर को 5 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान में पुनर्गठित करके लिपोपॉलेसेकेराइड (एलपीएस) और डेक्सट्रान-एफआईटीसी तैयार करें। पीबीएस में एलपीएस और डेक्सट्रान के स्टॉक समाधान को 0.1 मिलीग्राम / एमएल और 0.5 मिलीग्राम / एमएल एलपीएस और 5 मिलीग्राम / एमएल डेक्सट्रान-एफआईटीसी तक पतला करें। माइक्रोइंजेक्शन के लिए 20 μL बनाएं।
  12. आसुत जल में ईजीटीए पाउडर को घोलकर और हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) का उपयोग करके पीएच को लगभग 8 तक समायोजित करके 0.2 एम का स्टॉक समाधान बनाकर एथिलीन ग्लाइकोल-बिस (β-एमिनोइथाइल ईथर)-एन, एन, एन'-टेट्राएसिटिक एसिड (ईजीटीए) तैयार करें। 1:100 कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करके संस्कृति मीडिया में 2 एमएम की परीक्षण एकाग्रता तैयार करें।

2. नमूना संग्रह

  1. एक बार नमूने प्राप्त होने के बाद, नमूना संग्रह के 24 घंटे के भीतर उपकला कोशिका अलगाव और चढ़ाना करें।

3. पूरे नमूनों से तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में आंतों के उपकला कोशिका चढ़ाना

नोट: यह प्रक्रिया मिशिगन विश्वविद्यालय12,13,14 में ट्रांसलेशनल ऊतक मॉडलिंग प्रयोगशाला से संशोधित प्रोटोकॉल का पालन करती है। उच्च डब्ल्यूएनटी कारक के साथ विकास मीडिया का उपयोग एंटरोइड स्थापना के लिए लगातार परिणाम देता है। एक बार एंटरोइड्स स्थापित हो जाने के बाद, माइक्रोइंजेक्शन के लिए एंटरोइड्स को गोलाकार आकार में चलाने के लिए एक उच्च डब्ल्यूएनटी कारक के साथ एक ही मीडिया का उपयोग करें।

  1. आंत के खंडों को एम्फोटेरिसिन के साथ बर्फ-ठंडे डीपीबीएस के साथ 60 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और बर्फ पर 20 मिनट के लिए भिगोएं। जब ऊतक भिगोता है, तो छोटी आंत के क्षेत्रों (ग्रहणी, जेजुनम, या इलियम) की पहचान करें और बल और कैंची के साथ संयोजी ऊतक और रक्त वाहिकाओं को हटा दें। एपिथेलियम को बाधित किए बिना एक छोटी 23-25 जी सुई और 3 एमएल सिरिंज का उपयोग करके आवश्यकतानुसार लुमेन सामग्री को धो लें।
  2. एक स्केलपेल का उपयोग करके आंत के खंडों को 3-5 मिमी टुकड़ों में काटें और 1-2 टुकड़े (6-वेल प्लेट के एक कुएं में चढ़ाना के लिए) 35 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश में रखें जिसमें बर्फ पर 0.5-1 एमएल ऑर्गेनॉइड विकास माध्यम होता है।
  3. माइक्रो कैंची और फोर्सेस को विच्छेदित करने का उपयोग करके, आंतों की ट्यूब को अनुदैर्ध्य रूप से काट लें। 10x स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत प्रावरणी से उपकला कोशिकाओं को खुरचने के लिए फोर्स टिप का उपयोग करें। प्रावरणी को हटा दें और कोशिकाओं के झुरमुट को तोड़ने के लिए पकवान को घुमाएं।
  4. 8 मिलीग्राम / एमएल मैट्रिक्स प्रोटीन एकाग्रता पर 285 μL घोल बनाने के लिए बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स मिश्रण में 5-10 μL की वृद्धि पर कोशिकाओं और मीडिया को स्थानांतरित करने के लिए 20 μL पिपेट कट टिप का उपयोग करें। बर्फ पर बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स में कोशिकाओं को 200 μL कट टिप का उपयोग करके मिलाने के लिए धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइप करें।
  5. सेल बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स मिक्स की पांच 50 μL स्ट्रिप्स को एक गर्म फोम ईंट पर रखे गए पूर्व-गर्म 6-वेल प्लेट के एक कुएं में रखें। बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स को पॉलीमराइज और कठोर करने की अनुमति देने के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. ठोस तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स स्ट्रिप्स के कुएं में एंटरॉइड विकास मीडिया के 2 एमएल जोड़ें और सेल कल्चर इनक्यूबेटर के अंदर वापस रखें। एंटरॉइड विकास को बढ़ावा देने के लिए मीडिया को दैनिक रूप से बदलें। रोजाना 10x उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत आंतों के स्टेम सेल भेदभाव की जांच करें।
  7. 10-14 दिनों के बाद, एंटरोइड घनत्व के आधार पर एंटरोइड्स को 12-वेल या 6-वेल प्लेट के एक कुएं में पास करें। हर दूसरे दिन मीडिया को बदलना शुरू करें और हर 5-7 दिनों में 1: 2 के अनुपात में पास करें क्योंकि एंटरोइड ्स पनपने लगते हैं।
    1. उन कोशिकाओं को हटा दें जो मार्ग के दौरान तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स परत के साथ एंटरोइड्स में अंतर नहीं करते हैं। यदि आवश्यक हो, तो 80% विकास मीडिया, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), और 10% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में फ्रीज करके कम मार्ग के साथ एंटरोइड्स का जमे हुए स्टॉक बनाएं।

4. एंटरोइड्स का इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला होना

नोट: फिक्सिंग और धुंधला होने की प्रक्रिया में 3 दिन लगते हैं। इस प्रोटोकॉल में, हमने एक संशोधित प्रोटोकॉल15 का उपयोग करके नाभिक (डीएपीआई), उपकला मार्कर (विलीन, सीडीएक्स 2), लाइसोजाइम, म्यूसिन और तंग जंक्शन प्रोटीन (क्लाउडिन 2, क्लॉडिन 3, ऑक्लुडिन, ज़ोनुला ऑक्लुडेन -1) के लिए तय और दाग दिया। फ्लोरोसेंट छवियों को एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा लिया गया था।

  1. फिक्सिंग
    नोट: यह प्रक्रिया आमतौर पर एंटरॉइड मार्ग या ठंड प्रक्रिया के रूप में एक ही समय में की जाती है।
    1. एंटरॉइड प्लेट को बर्फ पर रखें। विकास मीडिया को हटा दें और ठंडे डीपीबीएस के साथ धीरे से 2x धो लें।
    2. तय और दागदार होने वाले एंटरोइड्स की पहचान करें। उन्हें 200 μL कट टिप के साथ सावधानीपूर्वक पाइप करके या 1 μL इनऑकुलेटिंग लूप का उपयोग करके 12-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें। यदि अलग-अलग एंटीबॉडी के साथ धुंधला होना है तो अलग-अलग कुओं में एंटरोइड्स रखें।
    3. एंटरोइड्स को बाधित किए बिना जितना संभव हो उतना तरल निकालें। 4% पीएफए का 0.5 एमएल जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स से एंटरोइड्स के अलगाव की सुविधा के लिए कभी-कभी प्लेट को घुमाएं।
    4. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स से एंटरोइड्स की टुकड़ी निर्धारित करने के लिए पूरी तरह से जांच करें। एंटरोइड्स को बाधित किए बिना तरल पीएफए को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें और छोड़ दें। पीएफए और किसी भी अवशिष्ट तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को हटाने के लिए पीबीएस 3 एक्स से धोएं
      नोट: स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत तरल को एस्पिरेट करना एंटरोइड्स से बचने के लिए सहायक हो सकता है। फिक्स्ड एंटरोइड्स को पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. अवरुद्ध
    1. एंटरोइड्स को बाधित किए बिना, 200 μL पिपेट के साथ अवशिष्ट पीबीएस को सावधानीपूर्वक हटा दें। ब्लॉकिंग बफर के 0.5 एमएल जोड़ें और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. 200 μL पिपेट के साथ ब्लॉकिंग बफर को हटा दें और छोड़ दें, एंटरोइड्स को बाधित करने से बचने के लिए सावधान रहें।
  3. एंटीबॉडी धुंधला होना
    1. एंटरोइड्स के साथ प्रत्येक कुएं में बफर को अवरुद्ध करने में प्राथमिक एंटीबॉडी के 500 μL जोड़ें। प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए और लाइसोजाइम के लिए, कमजोर पड़ने वाला कारक 1: 100 है, सीडीएक्स 2 के लिए कमजोर पड़ने वाला कारक 1: 100 है, और विलीन के लिए कमजोर पड़ने वाला कारक 1: 50 है। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. अगले दिन, एंटीबॉडी समाधान को हटा दें और पीबीएस के साथ 3x धो लें। प्रत्येक धोने के लिए 10-15 मिनट इनक्यूबेशन समय दें।
    3. चरण 4.3.1.-4.3.2 दोहराएँ। 1: 400 के कमजोर पड़ने वाले कारक के साथ द्वितीयक एंटीबॉडी के लिए।
    4. पीबीएस में 5 μg/mL पर DAPI का 500 μL जोड़ें और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, पीबीएस के साथ 3x धो लें, और प्रत्येक धोने के लिए 10-15 मिनट इनक्यूबेशन समय दें
  4. बढ़ता हुआ
    1. जितना संभव हो उतना पीबीएस हटा दें। दाग वाले एंटरोइड्स को 70% ग्लिसरॉल 1x के साथ धोएं।
    2. एंटरोइड्स को प्लेट से 1 μL इनोकुलेटिंग लूप या कट 200 μL टिप का उपयोग करके उठाएं और ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर 70% ग्लिसरॉल के साथ माउंट करें।
    3. एंटरोइड्स की 3 डी संरचना को संरक्षित करने के लिए, नीचे ग्लास स्लाइड और कवरस्लिप के बीच 0.5-1 मिमी स्थान सुनिश्चित करें। ग्लास स्लाइड और कवरस्लिप के बीच एक जगह बनाने के लिए पतली सिलिकॉन रबर शीट या ग्लास कवरस्लिप के कट-आउट का उपयोग करें। एंटरोइड्स को अब कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ चित्रित किया जा सकता है।

5. एंटरोइड्स के माइक्रोइंजेक्शन की तैयारी

नोट: माइक्रोइंजेक्शन प्रोटोकॉल संसाधनों और सेटिंग को फिट करने के लिए हिल एट अल .16 से एक संशोधित प्रोटोकॉल है। तैयारी के कुछ चरणों को कुछ दिन पहले पूरा करने की आवश्यकता है।

  1. माइक्रोइंजेक्शन सेटअप सेट करना
    1. प्रयोगों के उद्देश्य के आधार पर माइक्रोइंजेक्टर उपकरण को या तो बायोसेफ्टी कैबिनेट के अंदर या एक साफ काउंटर पर स्थापित करें, निम्नानुसार: देखने के लिए एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप, माइक्रोस्कोप के बगल में एक भारी स्टैंड पर लगे एक्स-, वाई-और जेड-अक्ष नियंत्रण नॉब्स के साथ एक माइक्रोमैनिपुलेटर, माइक्रोमैनिपुलेटर आर्म पर लगा एक माइक्रोपाइपेट धारक, माइक्रोपाइपेट धारक को जोड़ने वाला एक माइक्रोइंजेक्टर ट्यूबिंग और तीन-तरफा स्टॉपकॉक के साथ एक सिरिंज, फिर एक वायवीय पंप, और पंप से जुड़े एक दीवार वायु स्रोत (चित्रा 1)।
    2. प्रायोगिक उपयोग से पहले और बाद में 70% इथेनॉल के साथ माइक्रोइंजेक्शन उपकरण को कीटाणुरहित करें। वांछित भौतिक विनिर्देशों को फिट करने के लिए माइक्रोस्कोप और माइक्रोमैनिपुलेटर की स्थिति का परीक्षण करें, जिसमें अक्ष नॉब्स को स्थानांतरित करना शामिल है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि माइक्रोपिपेट लक्षित नमूने तक पहुंच सके।
  2. माइक्रोपिपेट की तैयारी
    नोट: इन चरणों को पहले से करें।
    1. माइक्रोपिपेट्स में ग्लास केशिका ट्यूबों को खींचने के लिए माइक्रोपिपेट पुलर का उपयोग करें।
    2. स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत, माइक्रोपिपेट को क्षैतिज माइक्रोपिपेट धारक (चित्रा 2) पर रखें, युक्तियों पर ध्यान केंद्रित करें, और माइक्रोस्कोप के आईपीस के माध्यम से देखते हुए माइक्रो कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करके युक्तियों को काटें। प्रत्येक प्रयोग के लिए एक समान टिप आकार पर लगभग 10-15 माइक्रोपिपेट्स तैयार करें।
    3. 0.5-1 μL तरल खींचकर टिप आकार का परीक्षण करें और गणना करें कि मात्रा को खाली करने के लिए कितने पंपों की आवश्यकता है। प्रयोग के लिए उपयुक्त आकार खोजने के लिए कई टिप आकारों का परीक्षण करें। एक उपयुक्त टिप आकार प्रति पंप लगभग 10-30 एनएल मात्रा निकालता है।
    4. युक्तियों को नुकसान पहुंचाए बिना कटे हुए ग्लास माइक्रोपिपेट्स को एक साफ बॉक्स या ट्यूब में स्टोर करें।
      नोट: प्री-कट माइक्रोपिपेट्स व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं।
  3. एंटरॉइड की तैयारी
    1. बर्फ पर ज्यादातर बड़े और गोलाकार एंटरोइड्स की एक प्लेट रखें। पुराने विकास माध्यम को ताजा माध्यम से बदलें।
    2. धीरे से एक सेल लिफ्टर के साथ प्लेट से तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स डॉट्स को अलग करें। एंटरोइड्स को परेशान किए बिना तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को तोड़ने के लिए बर्फ पर जेल डॉट्स को एक तरफ से दूसरी तरफ घुमाएं।
    3. एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत कटे हुए 20 μL पिपेट टिप के साथ लगभग 10-15 गोलाकार एंटरोइड्स का चयन करें और 8 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीन एकाग्रता मिश्रण के 285 μL बनाने के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में जोड़ें।
    4. एंटरोइड्स को तोड़े बिना मिलाने के लिए 200 μL टिप के साथ धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइप करें। एक गोल 35 मिमी x 10 मिमी सेल कल्चर पेट्री डिश या समान आयामों वाले एक के केंद्र में पांच 50 μL जेल डॉट्स प्लेट करें।
    5. जमने के लिए 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एंटरोइड जेल डॉट्स को इनक्यूबेट करें। फिर, पकवान में ताजा विकास माध्यम का 1 एमएल जोड़ें। स्थिरीकरण के लिए कम से कम 2-3 दिनों के लिए एंटरोइड्स को इनक्यूबेट करें और जब तक एंटरोइड्स 0.5-1 μL के उचित आकार तक नहीं पहुंच जाते।
      नोट: एंटरोइड्स तक आसान पहुंच के लिए कम दीवार और विकास माध्यम की कम मात्रा के लिए एक छोटा व्यास वाला पकवान होना महत्वपूर्ण है।
  4. डेक्सट्रान-एफआईटीसी और परीक्षण सामग्री का माइक्रोइंजेक्शन
    1. तीन-तरफा स्टॉपकॉक को वायवीय पंप पर बंद करें। इंजेक्शन सामग्री के साथ माइक्रोपिपेट भरें, इस मामले में डेक्सट्रान-एफआईटीसी एलपीएस के साथ या बिना।
    2. पारदर्शी फिल्म की एक पट्टी के साथ कवर एक पेट्री डिश तैयार करें। फिल्म पर इंजेक्शन सामग्री के दो से चार 1 μL डॉट्स रखें।
    3. माइक्रोपिपेट की नोक को तरल के अंदर लेकिन स्टीरियो माइक्रोस्कोप के विज़ुअलाइज़ेशन के तहत फिल्म के ऊपर चलाने के लिए माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करें। माइक्रोपिपेट में इंजेक्ट की गई सामग्री को वापस लेने के लिए धीरे से सिरिंज पर खींचें।
    4. माइक्रोपिपेट को 2-4 μL इंजेक्शन सामग्री के साथ भरें और माइक्रोपिपेट के सिरे पर किसी भी हवा को हटाने के लिए सिरिंज पर धक्का दें। यह सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोपिपेट में इंजेक्शन सामग्री कॉलम का निरीक्षण करें कि कोई एयर पॉकेट नहीं है। माइक्रोपिपेट के अंदर वापस ली गई इंजेक्शन सामग्री की मात्रा रिकॉर्ड करें।
      नोट: डेक्सट्रान-एफआईटीसी के कारण तरल हरे रंग में दिखाई देता है।
    5. वायवीय पंप से जुड़े वायु स्रोत को चालू करें, जो लगभग 60 पीएसआई का वायु दबाव प्रदान करता है। पंप चालू करें और पंप की अवधि 10-15 एमएस पर सेट करें। पंप से माइक्रोपिपेट तक लाइन खोलने के लिए स्टॉपकॉक को सिरिंज पर चालू करें।
      नोट: लंबी पंप अवधि प्रति पंप अधिक सामग्री जारी करने की अनुमति देती है। इंजेक्शन की मात्रा के अनुमान के लिए पूरे प्रयोग के लिए समान टिप आकार के साथ एक ही पंप अवधि और माइक्रोपिपेट्स का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
    6. सेल कल्चर इनक्यूबेटर से एंटरोइड्स को हटा दें और माइक्रोइंजेक्शन के बाद प्रकाश जोखिम को सीमित करने के लिए व्यंजनों को एक कवर कंटेनर में गर्म फोम ईंट के शीर्ष पर रखें।
    7. पेट्री डिश को स्टीरियो माइक्रोस्कोप के नीचे एंटरोइड्स के साथ रखें और माइक्रोपाइपेट की नोक को क्षैतिज सतह पर लगभग 35 ° -45 ° कोण पर रखने के लिए माइक्रोमैनिपुलेटर नॉब्स को स्थानांतरित करें (चित्रा 3)। इसके लिए पहले से कुछ अभ्यास की आवश्यकता होती है।
    8. माइक्रोस्कोप के तहत प्रत्येक पेट्री डिश में एंटरोइड्स की कल्पना करें और मैप करें ताकि प्रति डिश लगभग 3-5 गोलाकार एंटरोइड्स को इंजेक्ट करने की योजना बनाई जा सके।
    9. एक बार जब माइक्रोपिपेट की नोक तरल सतह के करीब होती है, तो लक्षित एंटरॉइड की ओर टिप को आगे बढ़ाने के लिए माइक्रोस्कोप आईपीस में देखें।
    10. सटीक धीमी गति का उपयोग करके जेड-अक्ष नॉब को आगे बढ़ाकर माइक्रोपिपेट टिप के साथ एंटरॉइड को पंचर करें। एक बार जब नोक एंटरॉइड सतह से गुजरती है, तो एंटरॉइड दीवार दब जाएगी और वापस आ जाएगी, जिस बिंदु पर प्रगति बंद हो जानी चाहिए।
    11. एक पैर से पंप पेडल पर टैप करें और एंटरॉइड को हरे रंग के डेक्सट्रान-एफआईटीसी समाधान से भरें जब तक कि यह थोड़ा विस्तारित न हो जाए। पंप की मात्रा और डेक्सट्रान एकाग्रता की गणना करने के लिए पंपों की संख्या रिकॉर्ड करें।
    12. माइक्रोइंजेक्शन खत्म करने के बाद माइक्रोपिपेट की नोक को वापस लें और अगले एंटरॉइड पर जाएं। अभ्यास के साथ, प्रक्रिया सुचारू रूप से चल सकती है।
      1. यदि टिप टूट जाती है, तो इसे एक समान टिप आकार के साथ किसी अन्य माइक्रोपिपेट से बदलें। एक ही एक्सपोजर समूह में सभी एंटरोइड्स के लिए इंजेक्टेड सामग्री की पर्याप्त मात्रा खींचें और क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए इंजेक्शन सामग्री के बीच माइक्रोपिपेट बदलें।
    13. प्रकाश जोखिम से बचने के लिए इंजेक्शन वाले एंटरोइड डिश को कवर के नीचे रखें।
  5. डेक्सट्रान-एफआईटीसी संग्रह और माप
    1. माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रिया के बाद, तुरंत संस्कृति मीडिया को हटा दें। किसी भी अवशिष्ट डेक्सट्रान-एफआईटीसी को हटाने के लिए ताजा विकास मीडिया 2x के साथ धोएं। ताजा मीडिया जोड़ें और समय 0 पोस्ट माइक्रोइंजेक्शन के रूप में समय रिकॉर्ड करें।
      नोट: माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रिया को बाधित किए बिना इस चरण को पूरा करने के लिए आपको दूसरे व्यक्ति की आवश्यकता हो सकती है।
    2. एक अपारदर्शी 0.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में 200 μL संस्कृति मीडिया एकत्र करें और फिर हटाए गए संस्कृति मीडिया को 1 घंटे, 2 घंटे, 4 घंटे, 6 घंटे, 8 घंटे, 10 घंटे और 12 घंटे पोस्ट माइक्रोइंजेक्शन पर ताजा विकास मीडिया की समान मात्रा के साथ बदलें।
      नोट: प्रयोग के आधार पर समय अंतराल भिन्न हो सकता है। बेसोलेटरल एक्सपोजर के साथ, प्रतिस्थापन मीडिया में एक ही एकाग्रता पर एक्सपोजर होना चाहिए।
    3. एकत्रित संस्कृति मीडिया को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और 24 घंटे के भीतर डेक्सट्रान एकाग्रता को मापें। अन्य विश्लेषणों के लिए बचे हुए मीडिया को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। संस्कृति मीडिया संग्रह के अंत में, यदि आवश्यक हो, तो आरएनए निष्कर्षण या इमेजिंग के लिए एंटरोइड्स की कटाई करें।
    4. प्रतिदीप्ति माइक्रोप्लेट रीडर के साथ डेक्सट्रान-एफआईटीसी सांद्रता को मापें। सीरियल कमजोर पड़ने का उपयोग करके और चित्रा 4 में दिखाए गए रैखिक प्रतिगमन रेखा को फिट करके प्रत्येक प्लेट के लिए एक मानक वक्र का निर्माण करें।
    5. डेक्सट्रान युक्त संस्कृति मीडिया की हटाई गई मात्रा के लिए अवशोषण को सही करें जिसे डेक्सट्रान के बिना ताजा विकास मीडिया के साथ बदल दिया गया था: संस्कृति मीडिया के 2 एमएल में से 200 μL को हटाने की मात्रा 10% है।
      2 घंटे पर सही अवशोषण = (1 घंटे x 10% पर अवशोषण) + 2 घंटे पर मापा अवशोषण
      पहले सही माध्यम के अवशोषण में सुधार की आवश्यकता नहीं है। फिर, मानक वक्र समीकरण का उपयोग करके सही अवशोषण मूल्य से डेक्सट्रान एकाग्रता की गणना करें।
    6. सामान्यीकरण के लिए, प्रत्येक पेट्री डिश के लिए पंपों की कुल संख्या से डेक्सट्रान एकाग्रता को विभाजित करें और फिर प्रति डिश पंपों की सबसे बड़ी कुल संख्या से गुणा करें।
      नोट: सभी एक्सपोज़र तीन प्रतियों में किए जाते हैं (प्रति डिश 3-5 माइक्रोइंजेक्टेड एंटरोइड्स के साथ प्रति एक्सपोज़र तीन पेट्री डिश)। तीन प्रतियों के औसत मूल्यों की तुलना छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके एक्सपोज़र के बीच की जाती है।

Representative Results

हमने मिशिगन विश्वविद्यालय ट्रांसलेशनल ऊतक मॉडलिंग प्रयोगशाला12 में हमारे सहयोगियों द्वारा प्रदान किए गए संशोधित प्रोटोकॉल के बाद दान किए गए इलियम भ्रूण ऊतक से एक एंटरॉइड सेल लाइन स्थापित की। एंटरॉइड सेल लाइन ने माइकोप्लाज्मा संक्रमण के लिए नकारात्मक परीक्षण किया। एंटरोइड्स ने विल्लिन, सीडीएक्स 2, लाइसोजाइम, म्यूसिन, क्लॉडिन, ऑक्लुडिन और ज़ोनुला-ऑक्लुडेन 1 (चित्रा 5) के लिए सकारात्मक दाग दिया, जो उनकी छोटी आंत उपकला उत्पत्ति की पुष्टि करता है। एंटरोइड्स को पीबीएस में 5 मिलीग्राम / एमएल पर 4 केडीए डेक्सट्रान-एफआईटीसी के साथ माइक्रोइंजेक्शन किया गया था (चित्रा 6)। परीक्षण एक्सपोजर अलग-अलग सांद्रता, 0.1 मिलीग्राम / एमएल और 0.5 मिलीग्राम / एमएल पर एलपीएस थे, जिन्हें एपिकल एक्सपोजर के लिए डेक्सट्रान-एफआईटीसी के साथ मिलाया गया था। एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, हमने 2 एमएम ईजीटीए का उपयोग किया और इसे डेक्सट्रान के 4 घंटे के बाद कल्चर मीडिया में जोड़ा। ईजीटीए एक कैल्शियम चेलेटर है जो तंग जंक्शनों की पारगम्यता को बढ़ाता है। नकारात्मक नियंत्रणों को अकेले पीबीएस में डेक्सट्रान-एफआईटीसी के साथ माइक्रोइंजेक्ट किया गया था। बेसोलेटरल एक्सपोजर के लिए, सीरियल कल्चर मीडिया संग्रह के लिए प्रतिस्थापन मीडिया में एक्सपोज़र की समान एकाग्रता थी (यानी, 2 एमएम ईजीटीए)। परिणाम नकारात्मक नियंत्रण, पीबीएस की तुलना में ईजीटीए के अलावा संस्कृति मीडिया में डेक्सट्रान एकाग्रता में स्पष्ट वृद्धि दिखाते हैं। एलपीएस के एपिकल एक्सपोजर ने एकाग्रता-निर्भर तरीके से लगभग 8 घंटे बाद एक्सपोजर शुरू होने वाले डेक्सट्रान की उच्च पारगम्यता को प्रेरित किया (चित्रा 7)।

Figure 1
चित्रा 1: माइक्रोइंजेक्टर सेटअप। सेटअप में एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप, एक भारी स्टील बेस प्लेट पर एक चुंबकीय स्टैंड पर लगाया गया माइक्रोमैनिपुलेटर, तीन-तरफा स्टॉपकॉक के साथ सिरिंज से जुड़ा एक माइक्रोपिपेट धारक और एक वायवीय पंप शामिल है। दीवार की हवा की आपूर्ति हवा का दबाव प्रदान करती है, जिसे पंप द्वारा एक सुसंगत पंप मात्रा उत्पन्न करने के लिए विनियमित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: क्षैतिज माइक्रोपिपेट धारक। यह प्लास्टिक प्लेटफ़ॉर्म टिप काटने के लिए ग्लास केशिका ट्यूब को खींचने के बाद माइक्रोपिपेट को पकड़ने के लिए डिज़ाइन किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: माइक्रोपिपेट पोजिशनिंग। पेट्री डिश के बीच में स्थित एंटरोइड्स को इंजेक्ट करने के लिए 35 ° -45 ° का कोण आदर्श है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: डेक्सट्रान मानक वक्र। वक्र का निर्माण डुप्लिकेट में डेक्सट्रान के 10 सीरियल कमजोर पड़ने के फ्लोरोसेंट अवशोषण के साथ किया गया था। प्रतिगमन समीकरण उत्पन्न करने के लिए एक रैखिक प्रतिगमन रेखा फिट की गई थी। त्रुटि पट्टियाँ SEM हैं। कृपया इस आरेख का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एंटरोइड्स के फ्लोरोसेंट बायोमार्कर। न्यूक्लियस स्टेन के लिए DAPI नीला है। निम्नलिखित बायोमाकर्स दिखाए गए हैं: (ए) विलिन, (बी) सीडीएक्स 2, (सी) लाइसोजाइम, (डी) म्यूसिन, (ई) क्लॉडिन, (एफ) ऑक्लुडिंग, और (जी) ज़ोनुला-ऑक्लुडेन 1। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: विभिन्न चरणों में एंटरोइड्स। (A) 7-10 दिन की उम्र में एक एंटरॉइड छोटा और मोटी दीवार वाला होता है। (बी) एक एंटरॉइड जो एक बड़े आकार, एक लुमेन और एक थिंक वॉल के साथ माइक्रोइंजेक्शन के लिए तैयार है, और (सी) फ्लोरोसेंट डेक्सट्रान-एफआईटीसी माइक्रोइंजेक्शन के 2 दिन बाद एंटरॉइड के अंदर है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्र 7: डेक्सट्रान-एफआईटीसी पोस्ट माइक्रोइंजेक्शन की पारगम्यता। (ए) पीबीएस की तुलना में ईजीटीए को जोड़ने के बाद मीडिया में मापा डेक्सट्रान का स्तर अधिक था। (ख) माइक्रोइंजेक्टेड 05 एमजी/एमएल एलपीएस ने इंजेक्शन के बाद 8 घंटे से शुरू होने वाले माइक्रोइंजेक्टेड 0.1 एमजी/एमएल एलपीएस की तुलना में एंटरॉइड लुमेन से मीडिया में डेक्सट्रान के अधिक रिसाव को प्रेरित किया। * पी-मान 0.05 <, त्रुटि पट्टियाँ एसईएम, एन = 3 हैं, महत्व की गणना करने के लिए एक छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यह प्रोटोकॉल भ्रूण आंतों के ऊतकों से एंटरोइड्स की स्थापना का विवरण देता है, साथ ही इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधलापन और उपकला पारगम्यता परीक्षण के साथ मॉडल लक्षण वर्णन भी करता है। एंटरोइड्स की पारगम्यता का परीक्षण एक माइक्रोइंजेक्शन तकनीक और संस्कृति मीडिया में लीक डेक्सट्रान-एफआईटीसी एकाग्रता के सीरियल टाइम कोर्स माप का उपयोग करके किया गया था। इस प्रोटोकॉल की नवीनता एपिकल एक्सपोजर है जो संस्कृति मीडिया 7 में बेसोलेटरल एक्सपोजर की तुलना में मानव आंतों के शरीर विज्ञान से अधिक निकटता सेमिलता जुलता है। पिछले अध्ययनों में, हिल एट अल ने सीरियल इमेजिंग और समय16 के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना का उपयोग किया। एरेस एट अल ने एक उपकला मॉडल के बेसोलेटरल झिल्ली को एलपीएस में उजागर किया और फिर सेलुलर जीन अभिव्यक्ति पैटर्न7 की तुलना की। इसकी तुलना में, हम परीक्षण किए गए अभिकर्मकों के एपिकल एक्सपोजर का उपयोग करते हैं और फिर संस्कृति मीडिया में लीक डेक्सट्रान की सीरियल सांद्रता को मापकर सकल पारगम्यता में संभावित परिवर्तनों की जांच करते हैं। हमारी विधि सेलुलर एमआरएनए एकत्र करके संस्कृति मीडिया और जीन अभिव्यक्ति में उपकला कोशिकाओं द्वारा उत्पादित साइटोकिन्स के सीरियल तुलनात्मक विश्लेषण की भी अनुमति देती है। एलपीएस का उपयोग आमतौर पर पशु और इन विट्रो मॉडल में आंतों की चोट का अध्ययन करने के लिए किया जाता है क्योंकि इसकी पारगम्यता और सूजन को प्रेरित करने की क्षमता 7,17 है। जब इस मॉडल में एलपीएस का परीक्षण किया गया था, तो उपकला पारगम्यता को एक्सपोजर एकाग्रता द्वारा विभेदित किया गया था। इस प्रोटोकॉल को विभिन्न सूक्ष्म इंजेक्शन सामग्री और परिणाम माप का उपयोग करके अन्य रोग विकृति का अध्ययन करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों में भ्रूण की आंतों के ऊतकों से एंटरोइड्स स्थापित करना, एंटरॉइड लक्षण वर्णन और माइक्रोइंजेक्शन तकनीक शामिल हैं। इस अध्ययन की अखंडता सटीक सेल नमूनाकरण पर निर्भर करती है। शारीरिक स्थलों और रक्त वाहिकाओं का उपयोग करना छोटी आंतों की कोशिकाओं के चयन को सुनिश्चित करने के लिए सहायक है। भ्रूण आंतों की स्टेम कोशिकाओं के मजबूत विकास और भेदभाव के कारण, स्टेम कोशिकाओं को अन्य उपकला कोशिकाओं से अलग करने के लिए एक व्यापक प्रक्रिया आवश्यक नहीं है। एंटरोइड्स स्थापित होने के बाद, प्रोटीन और सेल मार्करों के लिए धुंधला करके मॉडल की विशेषताओं की पुष्टि करना महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में, एंटरोइड्स को विलिन और सीडीएक्स 2 का उपयोग करके एंटरोसाइट्स के लिए दाग दिया गया था, लाइसोजाइम का उपयोग करके पनेथ कोशिकाओं, और म्यूसिन का उपयोग करके गोब्लेट कोशिकाओं, सभी कोशिकाएं जो छोटी आंत उपकला 18,19,20 के भीतर पाई जाती हैं। पारंपरिक एकल सेल लाइनों के विपरीत जो एक सेल प्रकार प्रदर्शित करते हैं, एंटरोइड आंतों के पूर्वज स्टेम कोशिकाओं से सभी सेल प्रकार स्थापित करतेहैं। इस प्रोटोकॉल के धुंधला हिस्से को रुचि के विशिष्ट सेलुलर मार्करों के लिए संशोधित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल की विश्वसनीयता के लिए महत्वपूर्ण माइक्रोइंजेक्शन तकनीक है। माइक्रोपिपेट युक्तियों की स्थिरता को डेक्सट्रान-एफआईटीसी समाधान का उपयोग करके प्रति पंप मात्रा को मापकर और माइक्रोस्कोप के तहत युक्तियों के व्यास की कल्पना करके सत्यापित किया जा सकता है। संदूषण के जोखिम के कारण, एक ही माइक्रोपिपेट का उपयोग एक से अधिक जोखिम के लिए नहीं किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, एंटरोइड्स का आकार और विकास उनके विकास मीडिया की सामग्री से प्रभावित हो सकता है। हमने पाया कि फूलगोभी के आकार के एंटरोइड्स के बजाय गोलाकार ने माइक्रोइंजेक्शन के लिए बेहतर मॉडल प्रदान किए। गोलाकार आकार मीडिया21 में एक अधिक डब्ल्यूएनटी कारक द्वारा प्रेरित किया जा सकता है।

यह प्रोटोकॉल काफी हद तक विविधताओं को कम करने के लिए माइक्रोइंजेक्शन में कलाकार के कौशल पर निर्भर करता है, खासकर समय-संवेदनशील माप में। सुसंगत तकनीकों के साथ एक ही अनुभवी कलाकार होने से भिन्नताओं को कम किया जा सकता है, आनुवंशिक भिन्नता से बचने के लिए एक ही सेल मूल का उपयोग करके, परिपक्वता पूर्वाग्रह को दूर करने के लिए एक ही मार्ग पर परीक्षण करके, और समान सेल भेदभाव के लिए एक ही प्रकार के मीडिया में कोशिकाओं को बढ़ाकर। विकास मीडिया के घटक विवो वातावरण के बजाय विट्रो में स्टेम कोशिकाओं के अलग-अलग भेदभाव को प्रेरित कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, विवो में, लाइसोजाइम गर्भकालीन विकास के 22-24 सप्ताह तक व्यक्त नहीं किया जाता है जब पनेथ कोशिकाएं बनती हैंऔर कार्यात्मक हो जाती हैं। हालांकि, हम 10 सप्ताह के भ्रूण आंतों से स्थापित हमारे एंटरोइड्स में लाइसोजाइम का पता लगाने में सक्षम थे। यह विधि माइक्रोइंजेक्शन के लिए आवश्यक उच्च तकनीकी कौशल के कारण एक समय में परीक्षण किए गए एक्सपोज़र की संख्या को सीमित कर सकती है। माइक्रोइंजेक्शन पंचर छेद से डेक्सट्रान रिसाव पारगम्यता के आकलन को प्रभावित कर सकता है। इस प्रभाव को खत्म करने के लिए, माइक्रोइंजेक्शन के तुरंत बाद ट्रिपल वॉश को प्रक्रिया से अवशिष्ट डेक्सट्रान को हटाने की सिफारिश की जाती है। मीडिया में डेक्सट्रान एकाग्रता को माइक्रोइंजेक्शन के बाद 4-6 घंटे के लिए प्रति घंटा मापा जाना चाहिए। इंजेक्शन के बाद 2-4 घंटे के भीतर डेक्सट्रान एकाग्रता में महत्वपूर्ण वृद्धि वाले प्रयोगों को अंतिम विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए।

इस विधि के कई फायदे हैं। ट्रांसवेल पर एंटरॉइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर की तुलना में इसे कम लागत और कम संसाधनों की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, आंत रोगाणुओं और उपकला के बीच प्रारंभिक बातचीत का अध्ययन करने के लिए जीवित बैक्टीरिया या वायरस जैसे अन्य एक्सपोजर में इसका विस्तार किया जा सकता है। एंटरॉइड के संलग्न लुमेन विकास मीडिया 13 के संदूषण के बिना माइक्रोइंजेक्टेड लाइव बैक्टीरिया की स्थिर वृद्धि को बनाए रखसकते हैं। मोनोलेयर के विकास मीडिया और इनक्यूबेशन ऑक्सीजन के संपर्क में आने के विपरीत, संलग्न लुमेन एक तंग, पृथक स्थान है। एक संलग्न लुमेन विकास मीडिया और एक ल्यूमिनल ऑक्सीजन सामग्री के लिए कोई संचार नहीं करने की अनुमति देता है जो जीवितजीवाणु विकास के साथ समय के साथ कम होता है।

भ्रूण आंतों के ऊतकों का उपयोग वयस्क आंतों के स्टेम कोशिकाओं या पशु मॉडल 7 की तुलना में अपरिपक्व शिशुओं के आंतों के उपकला को अधिक सटीक रूप सेदर्शाता है। इसके अलावा, एंटरोइड्स की ध्रुवीयता एपिकल और बेसोलेटरल एक्सपोजर और माप23 दोनों के लिए अनुमति देती है। एंटरोइड्स कम ऑक्सीकरण एकाग्रता के साथ एक संलग्न लुमेन बनाते हैं, जो आंतों की ऑक्सीकरण एकाग्रता की अधिक बारीकी सेनकल करता है। अधिक तकनीकी रूप से उन्नत प्रोटोकॉल16 के विपरीत, सकल मीडिया माप का उपयोग इस तकनीक की अधिक पहुंच की अनुमति देता है। प्रयोग से पता चला कि उपकला रिसाव एलपीएस के एपिकल एक्सपोजर से प्रेरित हो सकता है और एकाग्रता-निर्भर है। चूंकि यह विधि डेक्सट्रान की लीक एकाग्रता में परिवर्तन की जांच करती है, इसलिए यह तंग जंक्शनों में सकल कार्यात्मक परिवर्तनों का पता लगाने के लिए उपयोगी है। मैसेंजर आरएनए संग्रह और उजागर एंटरोइड्स का अनुक्रमण और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण सकल कार्यात्मक परिवर्तनों के विश्लेषण का पूरक हो सकता है। यह मॉडल एक प्रणाली में आंतों के उपकला अखंडता का अध्ययन करता है जो अत्यधिक अपरिपक्व वातावरण जैसा दिखता है और इस प्रकार, अपरिपक्व आंतों की चोटों और अन्य रोग विकृति की बेहतर समझ हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Disclosures

सभी लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम भ्रूण के ऊतकों को साझा करने के लिए वाशिंगटन विश्वविद्यालय में जन्म दोष अनुसंधान प्रयोगशाला में डॉ इयान ग्लास और कर्मियों को धन्यवाद देते हैं। हम मिशिगन विश्वविद्यालय में ट्रांसलेशनल ऊतक मॉडलिंग प्रयोगशाला में डॉ माइकल डेम और डॉ जेसन स्पेंस को भी पूरी प्रक्रिया में उनके अंतहीन समर्थन और मार्गदर्शन के लिए धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin 250 uL/mL Gibco 15-290-026
Anti-CDX-2 [CDX2-88] 0.5mL concentrated Mouse, IgG, monoclonal Biogenex MU392A-5UC
Anti-Claudin 2 antibody (ab53032) abcam ab53032
Anti-Claudin 3 antibody (ab15102) abcam ab15102
Anti-LYZ antibody produced in rabbit Millipore Sigma HPA066182-100UL
Anti-Mucin 2/MUC2 Antibody (F-2): sc-515032 Santa Cruz sc-515032
Anti-Villin, Clone VIL1/4107R 0.5mL concentrated Rabbit, IgG, monoclonal Biogenex NUA42-5UC
Bovine Serum Albumin (BSA) Millipore Sigma A8806
Cell culture plates, CytoOne 12-well non-treated plates  USA Scientific Inc 50-754-1395
Cell culture plates, CytoOne 6-well non-treated plates  USA Scientific Inc 50-754-1560
Centrifuge with 15 mL tube buckets Eppendorf  05-413-110
CHIR 99021 Tocris Bioscience 4423
Confocal microscope  Olympus FV1200 N/A Or a similar microscope
Conical centrifuge tubes, 15 ml Falcon 05-527-90
Cover glass for microscope slides Fisher Scientific 12-544-DP
Disposable scalpels Mopec 22-444-272
Dmidino-2-phenylindole (DAPI) Solution (1 mg/mL) Fisher Scientific 62248
Dulbecco's Phosphate-buffered Saline (DPBS, 1X) Fisher Scientific AAJ67802K2
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt (EGTA) Millipore Sigma E8145-10G
Fluorescein isothiocyanate dextran (Dextran-FITC) 4 kDa Millipore Sigma 46944
Fuorescence microplate reader Agilent BioTek Synergy HTX
Gentamicin 50 mg/mL Gibco 15-750-060
Glass capillary tubes, single-barrel borosilicate, 1x0.5mm, 6" (cut in half before pulling) A-M systems 626500
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 Fisher Scientific A32742
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 Fisher Scientific A32731
Goat Serum Fisher Scientific 16210064
ImageJ software NIH N/A https://imagej.nih.gov/ij/download.html
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) Stem Cell  Technologies  06010
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 Millipore Sigma L4391-1MG
Magnetic stand World Precision Instruments  M10
Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL  Corning 354234  protein concentration > 9 mg/mL preferably
Micro forceps Fisher Scientific 13-820-078
Micro scissors Fisher Scientific 08-953-1B
Micromanipulator World Precision Instruments  M3301
Micropipette puller World Precision Instruments  SU-P1000 Or a similar equipment
Microscope slides Fisher Scientific 22-034486
Occludin Polyclonal Antibody Fisher Scientific  71-1500
Paraformaldehyde 32% aqueous solution ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES RT 15714
Petri Dishes, 35x10 mm Fisher Scientific 150318
Petri Dishes, 60x15 mm Fisher Scientific 12-565-94
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific 10010031
PicoPump foot switch World Precision Instruments 3260
Pipette tips, non-filtered, 1000 uL Fisher Scientific 21-402-47
Pipette tips, non-filtered, 20 uL Fisher Scientific 21-402-41
Pipette tips, non-filtered, 200 uL Fisher Scientific 21-236-54
Pneumatic PicoPump system World Precision Instruments SYS-PV820 or a similar picopump system
Primocin 50 mg/mL, 10x1 ml vial InvivoGen ant-pm-1
Steel base plate World Precision Instruments 5052
Stereo microscope Zeiss stemi 350 Or a similar microscope
ThermoSafe PolarPack Foam Bricks Sonoco 03-531-53
Triton X-100 Millipore Sigma T8787
Wall air supply N/A N/A
Y-27632 dihydrochloride Tocris Bioscience 1254
ZO-1 Polyclonal Antibody Fisher Scientific 61-7300

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References

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चिकित्सा अंक 184
भ्रूण ऊतक-व्युत्पन्न एंटरोइड्स में उपकला पारगम्यता का परीक्षण
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Llerena, A., Urmi, S., Amin, J.,… More

Llerena, A., Urmi, S., Amin, J., Cha, B., Ho, T. T. Testing Epithelial Permeability in Fetal Tissue-Derived Enteroids. J. Vis. Exp. (184), e64108, doi:10.3791/64108 (2022).

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