Summary
Denne protokollen beskriver etableringen av enteroider, en tredimensjonal tarmmodell, fra fosterets tarmvev. Immunfluorescerende avbildning av epitelbiomarkører ble brukt til modellkarakterisering. Apikal eksponering av lipopolysakkarider, et bakterielt endotoksin, ved bruk av mikroinjeksjonsteknikk induserte epitelpermeabilitet på en doseavhengig måte målt ved lekkasje av fluorescerende dextran.
Abstract
Humane fostervevsavledede enteroider fremstår som en lovende in vitro-modell for å studere tarmskader hos premature spedbarn. Enteroider utviser polaritet, bestående av et lumen med en apikal kant, tette kryss og et basolateralt ytre lag utsatt for vekstmedier. Konsekvensene av tarmskader inkluderer slimhinnebetennelse og økt permeabilitet. Testing av intestinal permeabilitet hos sårbare premature mennesker er ofte ikke mulig. Dermed er det nødvendig med en in vitro fostervevsavledet tarmmodell for å studere tarmskader hos premature spedbarn. Enteroider kan brukes til å teste endringer i epitelpermeabilitet regulert av tette kryssproteiner. I enteroider skiller tarmstamceller seg til alle epitelcelletyper og danner en tredimensjonal struktur på en kjellermembranmatrise utskilt av musesarkomceller. I denne artikkelen beskriver vi metodene som brukes for å etablere enteroider fra føtalt tarmvev, karakterisere de enteroide tette kryssproteinene med immunfluorescerende avbildning og teste epitelpermeabilitet. Siden gramnegativ dominant bakteriell dysbiose er en kjent risikofaktor for tarmskade, brukte vi lipopolysakkarid (LPS), et endotoksin produsert av gramnegative bakterier, for å indusere permeabilitet i enteroidene. Fluorescein-merket dextran ble mikroinjisert i enteroid lumen, og serielle dekstrankonsentrasjoner lekket inn i kulturmediet ble målt for å kvantifisere endringene i paracellulær permeabilitet. Forsøket viste at apikal eksponering for LPS induserer epitelpermeabilitet på en konsentrasjonsavhengig måte. Disse funnene støtter hypotesen om at gramnegativ dominant dysbiose bidrar til mekanismen for tarmskade hos premature spedbarn.
Introduction
Premature spedbarn blir utsatt for hyppig og langvarig betennelse som setter dem i økt risiko for tarmskade som resulterer i langvarig funksjonshemming eller død1. Forskningen på dette området utfordres av den begrensede evnen til å gjennomføre forsøk på sårbare premature barn. Videre har mangel på egnede modeller hindret den omfattende studien av det for tidlige tarmmiljøet2. Eksisterende in vitro og in vivo modeller har ikke klart å representere det for tidlige humane tarmmiljøet. Spesielt kan enkeltepitelcellelinjer ikke danne tette kryss, og dyremodeller utviser forskjellige inflammatoriske og immunologiske responser enn menneskelige premature spedbarn. Med oppdagelsen av Wnt-signalering som en primær vei i spredning og differensiering av tarmkryptstamceller og de nye Lgr5+ vevsstamceller, ble tarmvevsavledede organoider som enteroider og kolonoider etablert som in vitro-modeller 3,4,5. Ved hjelp av denne teknologien er det mulig å lage og utnytte tredimensjonale (3D) enteroidmodeller som er utviklet fra hele vev eller biopsi i tarmen for å studere epitelresponser på tarmmiljøet 6,7.
I motsetning til typiske tarmcellelinjer dyrket i kultur, utviser enteroider polaritet med et lumen forbundet med tette kryssproteiner8. Dette muliggjør eksponering for den basolaterale grensen i vekstmediet, samt luminal mikroinjeksjon for å vurdere den apikale grensen. Videre viser enteroider lignende genetiske, fysiologiske og immunologiske egenskaper som det menneskelige epitelet 9,10. Fostervevsavledede enteroider tillater undersøkelse av prematuritetens rolle på epitelfunksjonen. De unike egenskapene til enteroider kan ligne det premature tarmmiljøet nærmere9. Vevsavledede enteroider kan brukes til å teste for tett kryssintegritet som en monolagsform eller som 3D-strukturer innebygd i en størknet kjellermembranproteinblanding. En mikroinjeksjonsteknikk er nødvendig for sistnevnte form hvis en apikal eksponering er ønsket. Måling av epitelresponser i enteroidmodeller inkluderer genuttrykk ved RNA-sekvensering, biomarkører ved enzymbundet immunoassay (ELISA) eller avanserte bildebehandlingsteknikker. Teknikken som presenteres her gir et annet mulig alternativ for å måle brutto permeabilitet med fluorometri.
Tarmskade hos premature spedbarn har en multifaktoriell patogenese som inkluderer ubalansen i tarmmikrobielle samfunn. Enteroider kan gi gode modeller for å studere visse aspekter av premature tarmsykdommer som nekrotiserende enterokolitt som involverer epitelfunksjoner11. Enteroider viser lignende egenskaper som den menneskelige føtale tarmen10. Eksponering av enteroider for lipopolysakkarid (LPS), et endotoksin produsert av gramnegative bakterier, i kulturmediet som en basolateral eksponering induserer genuttrykk som kan føre til økt betennelse og tarmpermeabilitet7. Denne studien tar sikte på å evaluere endringene i brutto epitelpermeabilitet etter apikal eksponering for bakterielle produkter som LPS. Resultatene kan gi innsikt i mikrobe-epitelinteraksjonene som er involvert i patogenesen av tarmskade. Metoden designet for å teste brutto permeabilitet krever mikroinjeksjonsoppsett og dyktighet.
Protocol
Den menneskelige vevssamlingen ble godkjent av University of Washington Institutional Review Board (studie-ID: STUDY380 og CR ID: CR3603) og utført av Birth Defects Research Laboratory. Forskningslaboratoriet for fødselsskader ble støttet av NIH-prisnummer 5R24HD000836 fra Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development. Prøvene ble samlet inn fra samtykkende deltakere og sendt som avidentifisert og uten helseopplysninger. Tynntarmsprøvene ble lagret i iskald Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS) og sendt over natten til mottakslaboratoriet.
1. Forberedelse av reagens
MERK: Se materialtabellen for en liste over reagenser og katalognumre; De anbefalte volumene er for en 6-brønns plate med mindre annet er nevnt.
- Forbered 0,1% bovint serumalbumin (BSA) ved å oppløse 50 mg BSA-pulver i 50 ml fosfatbufret saltvann (PBS) med 100 μg / ml bredspektret antibiotisk primocin for å belegge alt plastvarer og tips som kommer i kontakt med vev eller enteroider.
- For å belegge med BSA, plasser ikke-filtrerte pipetspisser i et 50 ml konisk rør med nok BSA til å dekke spissene, tilsett 1-2 ml BSA for å dekke petriskåloverflaten, eller fyll 15 ml koniske rør med BSA i minst 20-30 minutter ved romtemperatur før bruk.
- Forbered DPBS-medier ved å blande 50 ml DPBS med 100 μg / ml primocin og 50 μg / ml gentamicin. Forbered dette mediet med og uten 2,5 μg/ml amfotericin.
- Forbered enteroid vekstmedier ved å blande 2 ml organoid vekstmedium, 100 μg / ml primocin, 10 μM Y27632 og 2,5 μM CHIR99021. Lag ferske medier daglig og varm dem i en cellekulturinkubator ved 37 °C.
MERK: Fortynningsfaktoren for Y27632 er 1:250. For CHIR99021 fortynner du CHIR-stamløsningen til 1:100 i varme medier og deretter til 1:40 i enteroide vekstmedier for å oppnå en fortynning på 1:4000. - Forbered kjellermembranmatriseblanding ved å legge til kjellermembranmatrisen 10 μM Y27632 og 2,5 μM CHIR99021. Lag totalt 285 μL av den endelige kjellermembranmatriseblandingen ved en 8 mg / ml proteinkonsentrasjon for en brønn av en 6-brønnplate.
MERK: Kjellermembranmatrise må være iskald for å holde seg i flytende form og vil størkne ved varmere temperaturer. Proteinkonsentrasjonen av lagerets kjellermembranmatrise bestemmer volumet som kreves for å lage en 8 mg / ml endelig proteinkonsentrasjon ved hjelp av ligningen:
Volum 1 × Konsentrasjon 1 = Volum 2 × Konsentrasjon 2 - Forbered 4% paraformaldehyd (PFA) ved å fortynne 32% lager PFA i PBS med 1: 8, og lagre ved romtemperatur. Lag 0,5 ml for hver brønn av enteroider som skal festes.
- Klargjør blokkeringsbuffer ved å tilsette 5% geiteserum og 0,5% Triton X-100 i PBS. Forbered 1 ml for det første antistoffet per brønn og 0,5 ml for det ekstra antistoffet per brønn.
MERK: Bruk serum fra samme art som verten for de sekundære antistoffene - Klargjør primære og sekundære antistoffer, fortynnet i blokkerende buffer ved konsentrasjonen anbefalt av produsenten for hvert antistoff.
- Forbered 5 μg / ml Dmidino-2-fenylindol (DAPI) ved å fortynne til 1:200 fra 1 mg / ml stamløsning i PBS. Lag 0,5 ml per brønn av fargede enteroider.
- Forbered 70% glyserol i PBS og lag 0,5 ml for montering av enteroider på mikroskop lysbilder.
- Forbered 5 mg / ml dextran-FITC (fluorescein-isotiocyanat) ved å fortynne 25 mg / ml stamløsning i PBS med et 1: 5-forhold. Lag 20 μL for mikroinjeksjon.
- Klargjør lipopolysakkarider (LPS) og dextran-FITC ved å rekonstituere LPS-pulveret i PBS til en 5 mg/ml stamløsning. Fortynnede stamløsninger av LPS og dextran i PBS til 0,1 mg/ml og 0,5 mg/ml LPS og 5 mg/ml dextran-FITC. Lag 20 μL for mikroinjeksjon.
- Klargjør etylenglykol-bis (β-aminoetyleter) -N, N, N', N'-tetraeddiksyre (EGTA) ved å lage en stamløsning på 0,2 M ved å oppløse EGTA-pulver i destillert vann og justere pH til ca. 8 ved bruk av saltsyre (HCl). Forbered en testkonsentrasjon på 2 mM i kulturmedier ved å utføre en fortynning på 1:100.
2. Prøvetaking
- Når prøvene er mottatt, utfør epitelcelleisolasjon og plating innen 24 timer etter prøveinnsamlingen.
3. Tarmepitelcellebelegg i kjellermembranmatrise fra hele prøver
MERK: Denne prosedyren følger modifiserte protokoller fra Translational Tissue Modeling Laboratory ved University of Michigan12,13,14. Bruk av vekstmedier med høy Wnt-faktor gir konsistente resultater for enteroid etablering. Når enteroidene er etablert, bruk det samme mediet med høy Wnt-faktor for å drive enteroidene til sfæriske former for mikroinjeksjon.
- Overfør tarmsegmentene til en 60 mm x 15 mm petriskål med iskald DPBS med amfotericin og suge i 20 minutter på is. Mens vevet suger, identifiser regionene (tolvfingertarmen, jejunum eller ileum) i tynntarmen og fjern bindevevet og blodkarene med tang og saks. Vask ut lumeninnholdet etter behov med en liten 23-25 G nål og en 3 ml sprøyte uten å forstyrre epitelet.
- Skjær tarmsegmentene i 3-5 mm stykker ved hjelp av en skalpell og legg 1-2 stykker (for plating i en brønn på en 6-brønnsplate) i en 35 mm x 15 mm petriskål som inneholder 0,5-1 ml organoid vekstmedium på is.
- Ved hjelp av dissekere mikrosaks og tang, kutt tarmrøret i lengderetningen. Bruk tangspissen til å skrape epitelcellene fra fascia under et 10x stereomikroskop. Fjern fascia og virvle parabolen for å bryte opp klumper av celler.
- Bruk en 20 μL pipetteskåret spiss for å overføre celler og medier i en økning på 5-10 μL til kjellermembranmatriseblandingen for å lage en 285 μL løsning ved en 8 mg / ml matriksproteinkonsentrasjon. Pipet opp og ned sakte 20x for å blande celler i kjellermembranmatrise på is ved hjelp av en 200 μL kuttspiss.
- Plasser fem 50 μL strimler av cellen kjellermembranmatriseblandingen i en brønn av en forvarmet 6-brønnplate holdt på en varm skumstein. Inkuber platen i cellekulturinkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2 i 10 minutter for å tillate kjellermembranmatrisen å polymerisere og herde.
- Tilsett 2 ml av det enteroide vekstmediet i brønnen til de størknede kjellermembranmatrisestrimlene og plasser tilbake i cellekulturinkubatoren. Endre media daglig for å øke enteroid vekst. Sjekk for intestinal stamcelledifferensiering under et 10x invertert mikroskop daglig.
- Etter 10-14 dager, pass enteroidene i en brønn av en 12-brønns eller 6-brønns plate, avhengig av enteroidtettheten. Begynn å bytte media annenhver dag og pass i et 1: 2-forhold hver 5-7 dager når enteroidene begynner å trives.
- Fjern cellene som ikke skiller seg ut i enteroider med kjellermembranmatriselaget under passasjer. Lag et frosset lager av enteroider med lav passasje ved å fryse dem i 80% vekstmedier, 10% føtalt bovint serum (FBS) og 10% dimetylsulfoksid (DMSO), om nødvendig.
4. Immunfluorescerende farging av enteroider
MERK: Prosessen med festing og farging tar 3 dager. I denne protokollen fikset og farget vi for kjerner (DAPI), epitelmarkører (villin, CDX2), lysozym, mucin og tette kryssproteiner (claudin 2, claudin 3, occludin, zonula occluden-1) ved hjelp av en modifisert protokoll15. Fluorescerende bilder ble tatt av et konfokalt mikroskop.
- Fikse
MERK: Denne prosessen gjøres vanligvis samtidig med enteroidpassasjen eller fryseprosedyren.- Legg enteroidplaten på is. Fjern vekstmediet og vask forsiktig 2x med kald DPBS.
- Identifiser enteroidene som skal festes og farges. Overfør dem til en 12-brønns plate ved å forsiktig pipettere dem med en 200 μL kuttspiss eller ved hjelp av en 1 μL inokuleringssløyfe. Plasser enteroider i separate brønner hvis farging med forskjellige antistoffer skal gjøres.
- Fjern så mye væske med en 200 μL spiss som mulig uten å forstyrre enteroider. Tilsett 0,5 ml 4% PFA og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur. Virvle platen av og til for å lette løsrivelsen av enteroidene fra kjellermembranmatrisen.
- Undersøk grovt for å bestemme løsningen av enteroider fra kjellermembranmatrisen. Aspirer forsiktig og kast væsken PFA uten å forstyrre enteroider. Vask med PBS 3x for å fjerne PFA og eventuell gjenværende kjellermembranmatrise
MERK: Aspirering av væsken under et stereomikroskop kan være nyttig for å unngå enteroider. Faste enteroider kan lagres i PBS ved 4 °C i opptil 1 måned.
- Blokkerer
- Fjern forsiktig gjenværende PBS med en 200 μL pipette uten å forstyrre enteroider. Tilsett 0,5 ml blokkeringsbuffer og inkuber i 2 timer ved romtemperatur.
- Fjern og kast blokkeringsbufferen med en pipette på 200 μL, og vær forsiktig så du ikke forstyrrer enteroidene.
- Antistofffarging
- Tilsett 500 μL primært antistoff i blokkerende buffer til hver brønn med enteroider. For primære antistoffer og for lysozym er fortynningsfaktoren 1:100, for CDX2 er fortynningsfaktoren 1:100, og for villin er fortynningsfaktoren 1:50. Inkuber ved 4 °C over natten.
- Påfølgende dag fjerner du antistoffoppløsningen og vasker 3x med PBS. Tillat 10-15 minutter inkubasjonstid for hver vask.
- Gjenta trinn 4.3.1.-4.3.2. for det sekundære antistoffet med en fortynningsfaktor på 1:400.
- Tilsett 500 μL DAPI ved 5 μg / ml i PBS og inkuber ved romtemperatur i 15 minutter. Etter inkubering, vask 3x med PBS, og la 10-15 min inkubasjonstid for hver vask
- Montering
- Fjern så mye PBS som mulig. Vask de fargede enteroider med 70% glyserol 1x.
- Løft enteroidene ut av platen ved hjelp av en 1 μL inokuleringssløyfe eller en kuttet 200 μL-spiss og monter med 70% glyserol på et glassmikroskopglass.
- For å bevare 3D-strukturen til enteroidene, sørg for et 0,5-1 mm mellomrom mellom det nederste glassglasset og dekselet. Bruk utskjæringer av tynn silikongummiplate eller glassdeksel for å skape et mellomrom mellom glassglasset og dekselet. Enteroidene kan nå avbildes med et konfokalt mikroskop.
5. Forberedelse for mikroinjeksjon av enteroider
MERK: Mikroinjeksjonsprotokollen er en modifisert protokoll fra Hill et al.16 for å passe til ressursene og innstillingen. Noen av forberedelsestrinnene må fullføres noen dager i forveien.
- Sette opp mikroinjeksjonsoppsettet
- Sett opp mikroinjektorapparatet enten inne i et biosikkerhetsskap eller på en ren teller, avhengig av formålet med forsøkene, som følger: et stereomikroskop for visning, en mikromanipulator med X-, Y- og Z-aksekontrollnobber montert på et tungt stativ ved siden av mikroskopet, en mikropipetteholder montert på mikromanipulatorarmen, et mikroinjektorrør som forbinder mikropipetteholderen og en sprøyte med en treveis stoppekran, deretter til en pneumatisk pumpe og en veggluftkilde koblet til pumpen (figur 1).
- Desinfiser mikroinjeksjonsapparatet med 70% etanol før eksperimentell bruk og etterpå. Test ut plasseringen av mikroskopet og mikromanipulatoren for å passe til de ønskede fysiske spesifikasjonene, inkludert å flytte akseknappene for å sikre at mikropipetten kan nå den målrettede prøven.
- Fremstilling av mikropipetten
MERK: Utfør disse trinnene på forhånd.- Bruk en mikropipettetrekker til å trekke glasskapillærrørene inn i mikropipettene.
- Under stereomikroskopet plasserer du mikropipetten på en horisontal mikropipetteholder (figur 2), fokuserer på spissene og klipper spissene med en mikrosaks mens du ser gjennom mikroskopokularene. Forbered omtrent 10-15 mikropipetter i en lignende spissstørrelse for hvert eksperiment.
- Test spissstørrelsen ved å trekke opp 0,5-1 μL væske og telle hvor mange pumper som trengs for å tømme volumet. Test flere tipsstørrelser for å finne riktig størrelse for eksperimentet. En passende spissstørrelse utløser omtrent 10-30 nL volum per pumpe.
- Oppbevar de kuttede glassmikropipettene i en ren boks eller et rør uten å skade spissene.
MERK: Forhåndskuttede mikropipetter er tilgjengelige kommersielt.
- Enteroid forberedelse
- Plasser en tallerken med for det meste store og sfæriske enteroider på is. Bytt ut det gamle vekstmediet med ferskt medium.
- Fjern forsiktig kjellermembranmatrisepunktene fra platen med en celleløfter. Virvle gelprikkene fra side til side på is for å bryte opp kjellermembranmatrisen uten å forstyrre enteroidene.
- Velg rundt 10-15 sfæriske enteroider med en kuttet 20 μL pipettespiss under et stereomikroskop og legg til kjellermembranmatrisen for å lage 285 μL 8 mg / ml proteinkonsentrasjonsblanding.
- Pipet forsiktig opp og ned med en kuttet 200 μL spiss for å blande enteroidene uten å bryte dem. Plate fem 50 μL gelprikker i midten av en rund 35 mm x 10 mm cellekultur Petriskål eller en med lignende dimensjoner.
- Inkuber de enteroide gelprikkene ved 37 °C i 10 minutter for å stivne. Tilsett deretter 1 ml ferskt vekstmedium til parabolen. Inkuber enteroider i minst 2-3 dager for stabilisering og til enteroidene når en passende størrelse på 0,5-1 μL.
MERK: Det er viktig å ha en tallerken med lav vegg for lettere tilgang til enteroider og en liten diameter for mindre volum av vekstmedium.
- Mikroinjeksjon av dextran-FITC og testet materiale
- Slå av treveis stoppekranen til den pneumatiske pumpen. Fyll mikropipetten med det injiserte materialet, i dette tilfellet dextran-FITC med eller uten LPS.
- Forbered en petriskål dekket med en stripe gjennomsiktig film. Plasser to til fire 1 μL prikker injisert materiale på filmen.
- Bruk mikromanipulatoren til å kjøre spissen av mikropipetten til like inne i væsken, men over filmen under visualisering av et stereomikroskop. Trekk forsiktig i sprøyten for å trekke det injiserte materialet opp i mikropipetten.
- Fyll mikropipetten med 2-4 μL injisert materiale og trykk på sprøyten for å fjerne all luft på spissen av mikropipetten. Inspiser kolonnen for injisert materiale i mikropipetten for å sikre at det ikke er luftlomme. Registrer volumet av injisert materiale som trakk seg inn i mikropipetten.
MERK: Væsken er synlig i en grønn farge på grunn av dextran-FITC. - Slå på luftkilden som er koblet til den pneumatiske pumpen, som gir et lufttrykk på ca. 60 psi. Slå på pumpen og sett pumpens varighet til 10-15 ms. Vri stoppekranen på sprøyten for å åpne linjen fra pumpen til mikropipetten.
MERK: Den lengre pumpevarigheten gjør det mulig å frigjøre mer materiale per pumpe. Det anbefales å bruke samme pumpevarighet og mikropipetter med lignende spissstørrelser for hele eksperimentet for estimering av injisert volum. - Fjern enteroider fra cellekulturinkubatoren og legg oppvasken på toppen av en varm skumstein i en dekket beholder for å begrense lyseksponeringen etter mikroinjeksjon.
- Plasser petriskålen med enteroider under stereomikroskopet og flytt mikromanipulatorknappene for å plassere tuppen av mikropipetten i omtrent 35°-45° vinkel mot den horisontale overflaten (figur 3). Dette krever litt øvelse på forhånd.
- Visualiser og kartlegg enteroidene i hver petriskål under mikroskopet for å lage en plan for å injisere rundt 3-5 sfæriske enteroider per tallerken.
- Når spissen av mikropipetten er nær væskeoverflaten, se inn i mikroskopokularene for å fremme spissen mot den målrettede enteroiden.
- Punkter enteroiden med mikropipettespissen ved å fremme z-akseknappen ved hjelp av en presis langsom bevegelse. Enteroidveggen vil trykke ned og sprette tilbake når spissen går gjennom enteroidoverflaten, og da skal fremgangen stoppe.
- Trykk på pumpepedalen med en fot og fyll enteroiden med den grønnaktige dextran-FITC-løsningen til den er litt utvidet. Registrer antall pumper for å beregne pumpet volum og dekstrankonsentrasjon.
- Trekk ut tuppen av mikropipetten etter endt mikroinjeksjon og gå til neste enteroid. Med praksis kan prosessen gå greit.
- Hvis spissen går i stykker, bytt den ut med en annen mikropipette med en lignende spissstørrelse. Trekk nok volum injisert materiale for alle enteroider i samme eksponeringsgruppe og bytt mikropipette mellom injiserte materialer for å unngå krysskontaminering.
- Plasser den injiserte enteroidskålen under dekselet for å unngå lyseksponering.
- Dextran-FITC innsamling og måling
- Etter mikroinjeksjonsprosedyren, fjern straks kulturmediet. Vask med ferske vekstmedier 2x for å fjerne eventuelle gjenværende dextran-FITC. Legg til nye medier og ta opp tiden som tid 0 etter mikroinjeksjon.
MERK: Det kan hende du trenger en annen person til å utføre dette trinnet uten å forstyrre mikroinjeksjonsprosessen. - Samle 200 μL kulturmedier i et ugjennomsiktig 0,5 ml mikrofugerør og erstatt deretter det fjernede kulturmediet med samme volum av friske vekstmedier ved 1 time, 2 timer, 4 timer, 6 timer, 8 timer, 10 timer og 12 timer etter mikroinjeksjoner.
MERK: Tidsintervallet kan variere avhengig av eksperimentet. Ved basolateral eksponering bør erstatningsmediet inneholde eksponeringen i samme konsentrasjon. - Oppbevar det innsamlede kulturmediet ved 4 °C og mål dekstrankonsentrasjonen innen 24 timer. Oppbevar restmedier ved −80 °C for andre analyser. På slutten av kulturmediesamlingen, høst enteroider for RNA-ekstraksjon eller bildebehandling, om nødvendig.
- Mål dextran-FITC-konsentrasjoner med en fluorescensmikroplateleser. Konstruer en standardkurve for hver plate ved hjelp av serielle fortynninger og ved å montere en lineær regresjonslinje som vist i figur 4.
- Korriger absorbansen for det fjernede volumet av kulturmedier som inneholder dextran som ble erstattet med friske vekstmedier uten dextran som følger: fjerning av 200 μL ut av 2 ml kulturmedier er 10 volum%.
Korrigert absorbans ved 2 timer = (absorbans ved 1 time x 10 %) + målt absorbans ved 2 timer
Absorbans av det første korrigerte mediet trenger ikke korreksjon. Deretter beregner du dekstrankonsentrasjonen fra den korrigerte absorbansverdien ved hjelp av standardkurveligningen. - For normalisering, del dekstrankonsentrasjonen med totalt antall pumper for hver petriskål, og multipliser deretter med det største totale antall pumper per tallerken.
MERK: Alle eksponeringer utføres i tre tredobler (tre petriskåler per eksponering med 3-5 mikroinjiserte enteroider per tallerken). Gjennomsnittsverdiene for triplikatene sammenlignes mellom eksponeringer ved hjelp av en Student t-test.
- Etter mikroinjeksjonsprosedyren, fjern straks kulturmediet. Vask med ferske vekstmedier 2x for å fjerne eventuelle gjenværende dextran-FITC. Legg til nye medier og ta opp tiden som tid 0 etter mikroinjeksjon.
Representative Results
Vi etablerte en enteroid cellelinje fra donert ileum fostervev etter modifiserte protokoller levert av våre samarbeidspartnere ved University of Michigan Translational Tissue Modeling Laboratory12. Enteroidcellelinjen testet negativt for mykoplasmainfeksjon . Enteroidene farget positivt for villin, CDX2, lysozym, mucin, claudin, occludin og zonula-occluden 1 (figur 5), og bekreftet deres tynntarmepitelial opprinnelse. Enteroidene ble mikroinjisert med 4 kDa dextran-FITC ved 5 mg/ml i PBS (figur 6). Testeksponeringene var LPS ved forskjellige konsentrasjoner, 0,1 mg/ml og 0,5 mg/ml, blandet med dextran-FITC for apikal eksponering. Som en positiv kontroll brukte vi 2 mM EGTA og la den til kulturmediet ved 4 timer etter mikroinjeksjon av dextran. EGTA er en kalsiumchelator som øker permeabiliteten til tette kryss. De negative kontrollene ble mikroinjisert med dextran-FITC i PBS alene. For basolateral eksponering hadde erstatningsmediene for seriell kulturmediesamling samme konsentrasjon av eksponeringen (dvs. 2 mM EGTA). Resultatene viser en klar økning i dekstrankonsentrasjonen i kulturmedier etter tilsetning av EGTA i forhold til den negative kontrollen, PBS. Apikal eksponering av LPS induserte høyere permeabilitet av dextran med start ca. 8 timer etter eksponering på en konsentrasjonsavhengig måte (figur 7).
Figur 1: Oppsett av mikroinjektor. Oppsettet inkluderer et stereomikroskop, mikromanipulator montert på et magnetisk stativ på en tung stålplate, en mikropipetteholder koblet til en sprøyte med en treveis stoppekran og en pneumatisk pumpe. Vegglufttilførselen gir lufttrykket, som reguleres av pumpen for å generere et konsistent pumpevolum. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Horisontal mikropipetteholder. Denne plastplattformen er designet for å holde mikropipetten etter å ha trukket glasskapillærrøret for kutting av spissen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Mikropipetteposisjonering. En vinkel på 35 ° -45 ° er ideell for injeksjon av enteroider plassert midt i petriskålen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Dextran standardkurve. Kurven ble konstruert med fluorescerende absorbans av 10 serielle fortynninger av dekstran i duplikater. En lineær regresjonslinje ble tilpasset for å generere en regresjonsligning. Feilfeltene er SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Fluorescerende biomarkører for enteroider. DAPI for kjerneflekk er blå. Følgende biomarkører er vist: (A) villin, (B) CDX2, (C) lysozym, (D) mucin, (E) claudin, (F) okkludering og (G) zonula-occluden 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Enteroider på forskjellige stadier . (A) En enteroid på 7-10 dager gammel er liten og med en tykk vegg. (B) En enteroid som er klar for mikroinjeksjon med en stor størrelse, en lumen og en tankevegg, og (C) fluorescerende dextran-FITC inne i en enteroid 2 dager etter mikroinjeksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Permeabilitet av dextran-FITC etter mikroinjeksjon . (A) Målte dekstrannivåer i media var høyere etter tillegg av EGTA sammenlignet med PBS. (B) Mikroinjisert 0,5 mg/ml LPS induserte større lekkasje av dekstran fra enteroidlumen til mediet enn mikroinjisert 0,1 mg/ml LPS gjorde fra 8 timer etter injeksjon. *p-verdi < 0,05, feilfelt er SEM, n = 3, en Student t-test ble brukt til å beregne signifikans. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Denne protokollen beskriver etablering av enteroider fra fosterets tarmvev, samt modellkarakterisering med immunfluorescerende farging og epitelpermeabilitetstesting. Permeabiliteten til enteroidene ble testet ved hjelp av en mikroinjeksjonsteknikk og serielle tidsforløpsmålinger av lekket dextran-FITC-konsentrasjon i kulturmediene. Nyheten i denne protokollen er den apikale eksponeringen som ligner mer på menneskelig tarmfysiologi sammenlignet med basolateral eksponering i kulturmediene7. I tidligere studier benyttet Hill og medarbeidere seriell avbildning og beregning av fluorescensintensiteten over tid16. Ares og medarbeidere eksponerte den basolaterale membranen til en epitelmodell for LPS og sammenlignet deretter det cellulære genuttrykksmønsteret7. Til sammenligning bruker vi apikal eksponering av de testede reagensene og undersøker deretter potensielle endringer i brutto permeabilitet ved å måle serielle konsentrasjoner av lekket dextran i kulturmediene. Vår metode tillater også seriell komparativ analyse av cytokiner produsert av epitelceller i kulturmedier og genuttrykk ved å samle cellulært mRNA. LPS har blitt ofte brukt til å studere tarmskade i dyre- og in vitro-modeller på grunn av sin evne til å indusere permeabilitet og betennelse 7,17. Når LPS ble testet i denne modellen, ble epitelpermeabilitet differensiert ved eksponeringskonsentrasjon. Denne protokollen kan utvides til å studere andre sykdomspatologier ved hjelp av forskjellige mikroinjiserte materialer og utfallsmålinger.
Kritiske trinn i denne protokollen inkluderer etablering av enteroider fra føtalt tarmvev, enteroid karakterisering og mikroinjeksjonsteknikk. Integriteten til denne studien avhenger av nøyaktig celleprøvetaking. Bruk av anatomiske landemerker og blodårer er nyttig for å sikre valg av små tarmceller. På grunn av den robuste veksten og differensieringen av føtale intestinale stamceller, er det ikke nødvendig med en omfattende prosedyre for å isolere stamcellene fra andre epitelceller. Etter at enteroidene er etablert, er det viktig å bekrefte egenskapene til modellen ved å fargelegge proteiner og cellemarkører. I denne protokollen ble enteroidene farget for enterocytter ved bruk av villin og CDX2, Paneth-celler som bruker lysozym og begerceller ved bruk av mucin, alle cellene som finnes i tynntarmepitelet18,19,20. I motsetning til tradisjonelle enkeltcellelinjer som viser en celletype, etablerer enteroider alle celletyper fra tarmprogenitorstamceller8. Fargedelen av denne protokollen kan endres for de spesifikke cellulære markørene av interesse. Avgjørende for påliteligheten til denne protokollen er mikroinjeksjonsteknikken. Konsistensen til mikropipettespissene kan verifiseres ved å måle volumet per pumpe ved hjelp av dextran-FITC-løsning og visualisere diameteren på spissene under mikroskopet. På grunn av risikoen for kontaminering kan ikke den samme mikropipetten brukes til mer enn én eksponering. I tillegg kan formen og veksten av enteroider påvirkes av innholdet i deres vekstmedier. Vi fant at de sfæriske snarere enn blomkålformede enteroider ga bedre modeller for mikroinjeksjon. Den sfæriske formen kan induseres av en større Wnt-faktor i media21.
Denne protokollen avhenger i stor grad av utøverens ferdigheter i mikroinjeksjon for å redusere variasjoner, spesielt i tidsfølsomme målinger. Variasjoner kan minimeres ved å ha den samme erfarne utøveren med konsistente teknikker, bruke samme celleopprinnelse for å unngå genetisk variasjon, teste ved samme passasje for å fjerne modenhetsskjevhet og dyrke cellene i samme type media for lignende celledifferensiering. Komponentene i vekstmediet kan indusere varierende differensiering av stamceller in vitro i stedet for i et in vivo miljø. For eksempel, in vivo, uttrykkes ikke lysozym før uke 22-24 av svangerskapsutviklingen når Paneth-celler dannes og blir funksjonelle22. Imidlertid var vi i stand til å oppdage lysozym i våre enteroider etablert fra 10-ukers føtale tarmer. Denne metoden kan begrense antall testede eksponeringer på en gang på grunn av den høye tekniske ferdigheten som kreves for mikroinjeksjon. Dekstranlekkasjen fra mikroinjeksjonshullet kan påvirke vurderingen av permeabilitet. For å eliminere denne effekten anbefales trippelvask umiddelbart etter mikroinjeksjonen for å fjerne gjenværende dekstran fra prosedyren. Dekstrankonsentrasjonen i media bør måles hver time i 4-6 timer etter mikroinjeksjon. Eksperimenter med signifikant økning i dekstrankonsentrasjonen innen 2-4 timer etter injeksjon bør utelukkes fra den endelige analysen.
Denne metoden har flere fordeler. Det krever lavere kostnader og færre ressurser sammenlignet med enteroid-avledede monolag på transwell. I tillegg kan den utvides til andre eksponeringer som levende bakterier eller virus for å studere den første interaksjonen mellom tarmmikrober og epitelet. Det vedlagte lumen i enteroiden kan opprettholde en stabil vekst av mikroinjiserte levende bakterier uten forurensning av vekstmediet13. I motsetning til monolaget som blir utsatt for vekstmedier og inkubasjonsoksygen, er det vedlagte lumen et tett, isolert rom. Et lukket lumen gir ingen kommunikasjon til vekstmediet og et luminalt oksygeninnhold som er lavere over tid med levende bakterievekst13.
Bruken av føtalt tarmvev viser mer nøyaktig tarmepitelet hos premature spedbarn sammenlignet med voksne intestinale stamceller eller dyremodeller7. Videre tillater polariteten til enteroider både apikale og basolaterale eksponeringer og målinger23. Enteroidene danner et lukket lumen med lavere oksygeneringskonsentrasjon, som nærmere etterligner oksygeneringskonsentrasjonen i tarmene24. I motsetning til mer teknologisk avanserte protokoller16, gir bruk av brutto mediemålinger større tilgjengelighet av denne teknikken. Forsøket viste at epitellekkasje kan induseres ved apikal eksponering for LPS og er konsentrasjonsavhengig. Siden denne metoden undersøker endringene i lekket konsentrasjon av dextran, er den nyttig for å oppdage bruttofunksjonelle endringer i tette kryss. Messenger RNA-innsamling og sekvensering av de eksponerte enteroider og western blot-analyse kan utfylle analyse av bruttofunksjonelle endringer. Denne modellen studerer tarmepitelintegritet i et system som ligner sterkt på det premature miljøet og dermed kan brukes til å få en bedre forståelse av premature tarmskader og andre sykdomspatologier.
Disclosures
Alle forfattere erklærer at de ikke har noen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Ian Glass og personalet ved Birth Defects Research Laboratory ved University of Washington for å dele fostervevet. Vi takker også Dr. Michael Dame og Dr. Jason Spence ved Translational Tissue Modeling Laboratory ved University of Michigan for deres endeløse støtte og veiledning gjennom hele prosessen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin 250 uL/mL | Gibco | 15-290-026 | |
| Anti-CDX-2 [CDX2-88] 0.5mL concentrated Mouse, IgG, monoclonal | Biogenex | MU392A-5UC | |
| Anti-Claudin 2 antibody (ab53032) | abcam | ab53032 | |
| Anti-Claudin 3 antibody (ab15102) | abcam | ab15102 | |
| Anti-LYZ antibody produced in rabbit | Millipore Sigma | HPA066182-100UL | |
| Anti-Mucin 2/MUC2 Antibody (F-2): sc-515032 | Santa Cruz | sc-515032 | |
| Anti-Villin, Clone VIL1/4107R 0.5mL concentrated Rabbit, IgG, monoclonal | Biogenex | NUA42-5UC | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Millipore Sigma | A8806 | |
| Cell culture plates, CytoOne 12-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1395 | |
| Cell culture plates, CytoOne 6-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1560 | |
| Centrifuge with 15 mL tube buckets | Eppendorf | 05-413-110 | |
| CHIR 99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
| Confocal microscope | Olympus FV1200 | N/A | Or a similar microscope |
| Conical centrifuge tubes, 15 ml | Falcon | 05-527-90 | |
| Cover glass for microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-DP | |
| Disposable scalpels | Mopec | 22-444-272 | |
| Dmidino-2-phenylindole (DAPI) Solution (1 mg/mL) | Fisher Scientific | 62248 | |
| Dulbecco's Phosphate-buffered Saline (DPBS, 1X) | Fisher Scientific | AAJ67802K2 | |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt (EGTA) | Millipore Sigma | E8145-10G | |
| Fluorescein isothiocyanate dextran (Dextran-FITC) 4 kDa | Millipore Sigma | 46944 | |
| Fuorescence microplate reader | Agilent BioTek | Synergy HTX | |
| Gentamicin 50 mg/mL | Gibco | 15-750-060 | |
| Glass capillary tubes, single-barrel borosilicate, 1x0.5mm, 6" (cut in half before pulling) | A-M systems | 626500 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | Fisher Scientific | A32742 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Fisher Scientific | A32731 | |
| Goat Serum | Fisher Scientific | 16210064 | |
| ImageJ software | NIH | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | Stem Cell Technologies | 06010 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Millipore Sigma | L4391-1MG | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL | Corning | 354234 | protein concentration > 9 mg/mL preferably |
| Micro forceps | Fisher Scientific | 13-820-078 | |
| Micro scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | Or a similar equipment |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 22-034486 | |
| Occludin Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 71-1500 | |
| Paraformaldehyde 32% aqueous solution | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | RT 15714 | |
| Petri Dishes, 35x10 mm | Fisher Scientific | 150318 | |
| Petri Dishes, 60x15 mm | Fisher Scientific | 12-565-94 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | 10010031 | |
| PicoPump foot switch | World Precision Instruments | 3260 | |
| Pipette tips, non-filtered, 1000 uL | Fisher Scientific | 21-402-47 | |
| Pipette tips, non-filtered, 20 uL | Fisher Scientific | 21-402-41 | |
| Pipette tips, non-filtered, 200 uL | Fisher Scientific | 21-236-54 | |
| Pneumatic PicoPump system | World Precision Instruments | SYS-PV820 | or a similar picopump system |
| Primocin 50 mg/mL, 10x1 ml vial | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Steel base plate | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereo microscope | Zeiss stemi 350 | Or a similar microscope | |
| ThermoSafe PolarPack Foam Bricks | Sonoco | 03-531-53 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Wall air supply | N/A | N/A | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 61-7300 |
References
- Humberg, A., et al. Preterm birth and sustained inflammation: Consequences for the neonate. Seminars in Immunopathology. 42 (4), 451-468 (2020).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Pinto, D., Gregorieff, A., Begthel, H., Clevers, H. Canonical Wnt signals are essential for homeostasis of the intestinal epithelium. Genes & Development. 17 (14), 1709-1713 (2003).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments. (97), e52483 (2015).
- Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
- Stewart, C. J., Estes, M. K., Ramani, S. Establishing human intestinal enteroid/organoid lines from preterm infant and adult tissue. Methods in Molecular Biology. 2121, 185-198 (2020).
- Finkbeiner, S. R., et al. Transcriptome-wide analysis reveals hallmarks of human intestine development and maturation in vitro and in vivo. Stem Cell Reports. 4 (6), 1140-1155 (2015).
- Senger, S., et al. Human fetal-derived enterospheres provide insights on intestinal development and a novel model to study necrotizing enterocolitis (NEC). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
- Alganabi, M., Lee, C., Bindi, E., Li, B., Pierro, A. Recent advances in understanding necrotizing enterocolitis. F1000 Research. 8, (2019).
- Dame, M. K., et al. Human colonic crypts in culture: Segregation of immunochemical markers in normal versus adenoma-derived. Laboratory Investigation. 94 (2), 222-234 (2014).
- Hill, D. R., et al. Bacterial colonization stimulates a complex physiological response in the immature human intestinal epithelium. eLife. 6, 29132 (2017).
- Tsai, Y. H., et al. A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).
- Su, K., Asbrock, N., Chu, V., Hoffmann, S., Hewitt, P. In Vitro Differentiation of Human iPS Cells Into Colon Organoids in Serum-Free Cell Culture Conditions. Technology Networks. , https://www.technologynetworks.com/cell-science/white-papers/in-vitro-differentiation-of-human-ips-cells-into-colon-organoids-in-serum-free-cell-culture-328450 (2019).
- Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
- Schoultz, I., Keita, A. V. The Intestinal Barrier and Current Techniques for the Assessment of Gut Permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
- Kumar, N., et al. The lineage-specific transcription factor CDX2 navigates dynamic chromatin to control distinct stages of intestine development. Development. 146 (5), (2019).
- Walker, R. W., Clemente, J. C., Peter, I., Loos, R. J. F. The prenatal gut microbiome: Are we colonized with bacteria in utero. Pediatric Obesity. 12, Suppl 1 3-17 (2017).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
- Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372 (2020).
- Lueschow, S. R., McElroy, S. J. The Paneth cell: The curator and defender of the immature small intestine. Frontiers in Immunology. 11, 587 (2020).
- In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. Journal of Visualized Experiments. (146), e59357 (2019).
- Dheer, R., Young, V. B. Stem-cell-derived models: Tools for studying role of microbiota in intestinal homeostasis and disease. Current Opinion in Gastroenterology. 37 (1), 15-22 (2021).
