Summary
Den nuværende protokol beskriver en rydningsteknik for risskud, som er vanskelige at forberede til interne strukturelle observationer på grund af vævets hårde, tykke eller lagdelte natur. Denne metode letter kontinuerlige og dybe fluorescensobservationer, selv hos voksne risplanter.
Abstract
Den nyligt udviklede rydningsteknologi, der eliminerer brydningsindeksmismatch og mindsker auto fluorescerende materiale, har gjort det muligt at observere plantevæv i tre dimensioner (3D), samtidig med at deres indre strukturer bevares. I ris (Oryza sativa L.), en monocot model plante og en globalt vigtig afgrøde, er clearing teknologi blevet rapporteret i organer, der er relativt lette at observere, såsom rødder og blade. Anvendelser af clearingteknologi i skyde apikal meristem (SAM) og stilke er også blevet rapporteret, men kun i begrænset omfang på grund af den dårlige penetration af clearingopløsningen (CS) i disse væv. Den begrænsede effektivitet af clearingopløsningerne i disse væv er blevet tilskrevet autofluorescens, fortykkelse og hærdning af vævene i stammen, da de vaskulære bundter og epidermis udvikler sig og lagdeler SAM med vandafvisende blade. Den nuværende protokol rapporterer optimering af en clearing tilgang til kontinuerlig og 3D observation af genekspression fra SAM / ung panik til bunden af skuddene under udvikling. Faste vævsprøver, der udtrykker en fluorescerende proteinreporter, blev trimmet i sektioner ved hjælp af en vibrerende mikroskiver. Når en passende tykkelse blev opnået, blev CS påført. Ved specifikt at målrette det centrale væv steg penetrationshastigheden og ensartetheden af CS, og den tid, der kræves for at gøre vævet gennemsigtigt, faldt. Derudover muliggjorde rydning af de trimmede sektioner observation af den interne struktur af hele optagelsen fra et makroperspektiv. Denne metode har potentielle anvendelser i dyb billeddannelse af væv af andre plantearter, der er vanskelige at rydde.
Introduction
Nyligt udviklet rydningsteknologi har gjort det muligt at observere planternes dybe væv og samtidig bevare deres indre struktur 1,2,3. I dicotmodelplanten Arabidopsis er der udført mange undersøgelser af fluorescerende proteinbilleddannelse ved hjælp af clearingteknologi for at eliminere brydningsindeksmismatch og fjerne auto-fluorescerende materialer 4,5,6. Selvom brugen af clearingteknologi 7,8 og 3D-billeddannelse ved cellulær opløsning9 er blevet rapporteret i ris (Oryza sativa L.), en monocot-modelplante og en globalt vigtig afgrøde, er disse begrænset til relativt tynde og bløde organer, såsom rødder, blade og skud apikal meristem (SAM), som er lette at observere.
Skuddet er det vigtigste organ, der udgør de overjordiske dele af vaskulære planter. I ris består skud af en række lodret stablede "phytomers", der består af aksillære knopper, blade og stammen10. På spidsen af skuddet består SAM af udifferentierede stamceller i midten. Phytomers dannes ved differentiering af celler afledt af SAM. Efter at planterne skifter fra vegetativ til reproduktiv fase, forlænges risstængler, og SAM differentieres i ungepanikler 10. Denne udviklingsændring ledsages af udsving i ekspressionen af forskellige gener i stilkene og SAM/unge panikler. For at forstå de mekanismer, der ligger til grund for celledifferentiering i forskellige væv, er det vigtigt strukturelt at observere cellemorfologien og genekspressionen i interne skudvæv. Imidlertid udgør den dybe billeddannelse af stængler (knuder og internoder) i skuddet en udfordring på grund af ineffektiviteten af rydningsløsninger til at trænge ind i vævet. Stængler gennemgår straks en hurtig volumenforøgelse fra lateral vækst efter differentiering fra SAM. Hærdningen af risknudevævene på grund af fortykkelsen af de vaskulære bundter og det vandrette komplekse led af den nodale vaskulære anastomose ud over den høje afstødning af risskud bidrager alle til at begrænse penetrationen af CS istilke 10.
Denne undersøgelse havde til formål at observere ændringer i genekspression i risskudvæv ved hjælp af en strukturel dyb fluorescensteknik. Dette arbejde optimerer en clearingprotokol for ris til kontinuerligt at observere genekspression fra SAM / ung panik til basen i en 3D-struktur snarere end på en plan overflade ved hjælp af et konfokalt lasermikroskop.
Protocol
1. Fremstilling af den fikserende opløsning
- Overfør 70 ml sterilt vand til en glasflaske og tilsæt 10 g paraformaldehyd (PFA).
FORSIGTIG: PFA er giftig; derfor anbefales det at bære handsker. - Der tilsættes 2 ml 1 N NaOH for at opløse PFA-opløsningen.
- PFA-opløsningen opløses under kontinuerlig omrøring (300-500 o/min) ved 60 °C i ca. 1 time, indtil PFA-opløsningen er gennemsigtig.
- Tilsæt steriliseret vand for at øge volumenet af PFA-opløsningen til 100 ml.
BEMÆRK: PFA-opløsningen blev tilberedt frisk før brug. Desuden kan en PFA-opløsning, der opbevares ved 4 °C, anvendes i ca. 2 måneder. - Umiddelbart før prøveudtagningen tilsættes 25 ml 60 ml HEPES (pH 7,4), 3 ml 1 ml saccharose og 2 ml sterilt vand til 20 ml 10 % PFA for at fremstille en 50 ml fikseringsopløsning.
2. Fremstilling af clearingopløsningen (CS)
- 7,5 g natriumdeoxycholat, 5 g xylitol og 12,5 g urinstof (se materialetabel) vejes og blandes i 50 ml sterilt vand.
BEMÆRK: Natriumdeoxycholatpulver blev vejet i et generelt laboratorieudkastkammer for at forhindre luftbåren dispersion. - Ingredienserne (trin 2.1) opløses ved hjælp af en magnetisk omrører til fremstilling af CS.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev der anvendt en internt forberedt clearingløsning (CS), men en kommercielt tilgængelig clearingløsning, ClearSee (se Materialetabel), kan også anvendes. - CS overføres til et 50 ml konisk rør, og det opbevares ved stuetemperatur (15-30 °C) i mørke.
BEMÆRK: CS kan opbevares i mere end 1 år.
3. Stikprøver
- Skær rødderne omhyggeligt uden at beskadige planterne. Vask planterne med vand for at fjerne snavs.
BEMÆRK: Denne metode undersøgte observationen af væv fra trebladstrinnet (LS) for at markere LS. Den nuværende undersøgelse anvendte rissorterne Nipponbare (Nip) og Taichung 65 (T65) ved 8-10 LS. - Skræl de gamle ydre blade af med hænder og pincet. Der var ca. 2-3 blade tilbage.
- Skær vævet fra SAM /ung panik til bunden med en enkeltkantet barbermaskine ved hjælp af en glidende bevægelse for at undgå at knuse cellerne (figur 1A-C). Hvis sam/ung paniklens position ikke er synlig, skal du skære den længere.
- Da risskuddets tværsnit har en oval form (figur 1D), barberes den ene side af ovalen tyndt i retning af dens lange akse med en tveægget barbermaskine (figur 1E-F).
BEMÆRK: Dette trin gjorde det lettere for den fikserende opløsning at trænge ind i prøven. En vandret skæreflade gør prøven lettere at klæbe til en vibrerende mikroskærerbakke (se Materialetabel). - Sam/ung panikkens position bekræftes ved udseendet af en hvidlig farve i prøven (figur 1G). Trim overskydende væv af.
BEMÆRK: Prøvens længde skal justeres til den maksimale længde, der kan trimmes ved hjælp af en vibrerende mikroskærer. Hvis prøven er for lang, opdeles den i flere stykker.
4. Fiksering af prøverne
- 1 ml af fikseringsopløsningen (fremstillet i trin 1) pipetteres til et 1,5 ml mikrocentrifugerør, og prøverne anbringes straks.
BEMÆRK: Sørg for, at mængden af prøve ikke overstiger 20% af volumenet af den fikserende opløsning. - Skær et stykke paraffinfilm i 2,5 cm2. Form paraffinfilmen til kugler og læg dem oven på prøverne for at forhindre dem i at flyde ud af den fikserende opløsning.
- Røret indeholdende prøven anbringes i en ekssikkator. Luk derefter låget på ekssikkatoren, og start vakuumpumpen for at trykke ydersiden af ekssikkatoren ned indtil -0,095 MPa langsomt.
- Når du har lukket ekssikkatoren ved -0,095 MPa, skal du slukke for vakuumpumpen og lade den stå i 30 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Vakuumniveauet var sådan, at bobler gradvist dukkede op i prøverne. - Åbn ekssikkatoren lidt, og vend den langsomt tilbage til atmosfærisk tryk. Reducer tørrekatorens tryk til -0,095 MPa, sluk for vakuumpumpen, og lad blandingen stå i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Åbn ekssikkatoren lidt, og vend den langsomt tilbage til atmosfærisk tryk. Hvis prøven er korrekt fastgjort, synker den ned i den fikserende opløsning. Hvis det ikke synker, skal du reducere trykket igen.
- Fjern paraffinfilmen, luk låget, og hold rørene natten over ved 4 °C.
BEMÆRK: Prøverne blev fastgjort i fikserende opløsning i mindst 2 timer. Den kan opbevares i ~ 1 uge.
5. Trimning af den faste prøve
- Fjern den overskydende fikseringsopløsning fra prøven ved hjælp af fnugfri klude.
BEMÆRK: Overskydende fikseringsopløsning forhindrer prøven i at klæbe ordentligt på bakken. - Fastgør prøven på en vibrerende mikroskivebakke med øjeblikkelig lim. Læg den på en bakke med den flade side nedad, som blev barberet af under prøveudtagningen.
BEMÆRK: På grund af risskuddets struktur skal det trimmes fra bunden mod SAM / ung panik. - Indstil trimningsbetingelserne i henhold til den faste prøve.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev trimning indstillet til THICK, 130 μm; BRED, 15 mm; FREKVENS, 15%; og SKÆREHASTIGHED, 32 mm. - Juster prøvepositionen med RVS - eller FWD-knappen og OP- eller NED-knappen . Fyld bakken med deioniseret vand, indtil alle prøverne er nedsænket. Når du har fyldt bakken, skal du trykke på START-knappen . Anbring de trimmede prøver på et glasglas med en dråbe 1x PBS.
BEMÆRK: Flyt prøvens position til den anden side efter hver trimning, da den hårde prøve slider barberbladet. - Efter kontrol af prøven, der indeholder målstedet under et stereomikroskop, overføres den trimmede prøve til en multiwell plade med 1 ml 1x PBS.
BEMÆRK: Vælg antallet af brønde i henhold til prøvens størrelse. I denne undersøgelse blev der anvendt en 12-multiwell plade.
6. Behandling med rydningsopløsningen
- Fjern 1x PBS fra multiwell-pladen, og tilsæt frisk 1x PBS. Lad den stå i 1 min.
- Fjern 1x PBS, og tilføj CS.
BEMÆRK: Mængden af CS skal være fem gange prøvevolumen. - Multiwell-pladen, der indeholder prøven, anbringes i en ekssikkator. Luk derefter låget på ekssikkatoren, og start vakuumpumpen for at trykaflaste indersiden af ekssikkatoren indtil -0,09 MPa langsomt.
- Når du har lukket ekssikkatoren ved -0,09 MPa, skal du slukke for vakuumpumpen og lade den stå i 1 time ved stuetemperatur.
- Åbn ekssikkatoren lidt, og vend den langsomt tilbage til atmosfærisk tryk.
- Hæld deioniseret vand i mellemrummet mellem brøndene for at forhindre fordampning af CS. Opbevar multiwell pladerne ved stuetemperatur i mørke til rydning.
BEMÆRK: Ryst forsigtigt multiwell-pladen hver 1-2 dag for at diffundere klorofyl og andre komponenter. - Når CS bliver grøn, skal du udskifte den med frisk opløsning.
7. Cellevægsfarvning med kemisk farvestof
- Den kalkfluorhvide opløsning (1 ml, slutkoncentration: 1 mg/ml i rydningsopløsningen, se materialetabel) ledes i en multiwellplade. Anbring prøverne i farvestofopløsningen og inkuberes i 1 time.
BEMÆRK: Farvestoffets volumen må ikke overstige 10% af volumenet af CS. - De farvede prøver vaskes i en anden multiwell-plade med 1 ml CS i mindst 1 time.
8. Observation med et konfokalt lasermikroskop
- Placer en dråbe CS på et mikroskopglas, og overfør de behandlede (med CS) prøver til diaset.
BEMÆRK: Da de behandlede prøver er bløde, skal de håndteres omhyggeligt med en pincet. - Prøven dækkes med en glasdæksel for at forhindre fordampning af CS.
BEMÆRK: CS udfældes let. - Overhold de behandlede prøver under et konfokalt lasermikroskop.
BEMÆRK: Efter observation kan de behandlede prøver returneres til CS for yderligere observationer senere.
Representative Results
For det første blev det valideret, i hvilket omfang det hårde og tykke væv fra voksne risplanter kunne gøres gennemsigtigt ved rydningsbehandlingen. Nip på 9-10 LS, som er panikdannelsesstadiet, og 12-16 mm lange væv skåret ud fra den unge panik til bunden af skuddet blev brugt. Disse prøver, herunder den unge panik, blev fastgjort i den fikserende opløsning og observeret før og efter 1-4 uger efter clearingbehandlingen (figur 2). De uklippede prøver forblev grønne og blev ikke gennemsigtige efter 4 uger eller endda efter 3 måneders behandling med clearingopløsningen (figur 2A). I prøver, der blev skrællet af alle blade, blev internoderne hvide efter 1 uges behandling med CS, selvom knuderne forblev grønne. Denne prøve blev ikke gennemsigtig efter 4 uger (figur 2B). Efter 3 måneders behandling med CS blev kun den unge panik gennemsigtig. De håndtrimmede prøver skiftede til hvide, bortset fra de ydre blade og vaskulære bundter, efter 1 uges behandling med CS. Nogle dele af bladene, unge panik og internoder blev gennemskinnelige, men blev ikke gennemsigtige efter 4 uger (figur 2C). Efter 3 måneder blev kun den unge panik og indre blade gennemsigtige. Prøverne, der blev trimmet til 130 μm tykkelse med den vibrerende mikroskiver, blev gennemskinnelige efter 1 uges behandling med CS, hvor bladene blev gennemsigtige. Efter 2 uger var prøven næsten gennemsigtig og forblev uændret efter 4 uger (figur 2D). Efter 3 måneder blev prøverne helt gennemsigtige.
Dernæst blev dybden, hvormed clearingbehandlingen tillod genekspressionsobservationer i skuddet af T65 ved 8 LS valideret. UBQpro::NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro::NGCN, se Materialetabel) udtrykte skud blev brugt. Vævsprøver blev fastgjort i den fikserende opløsning, før de blev trimmet til 130 μm tykkelse ved hjælp af en vibrerende mikroskiver. Prøverne blev derefter observeret under et konfokalt lasermikroskop (laser: 488 nm / 13%, mål: 20x, pinhole: 0,93 AU, gennemsnit: 16, detektorforstærkning: 800) med 10 μm intervaller i z-akseretningen hver uge fra 0-4 ugers behandling med CS. De repræsentative resultater er vist i figur 3. Alle tal blev justeret med samme behandling for at sammenligne fluorescensintensiteten. I knuden uden behandlingen blev der observeret svage fluorescerende signaler i en dybde på -40 μm (figur 3A). Den observerbare dybde var -60 μm efter 1 uge af CS-behandlingen og -90 μm efter 2 uger, men autofluorescens af cytoplasmaet var mærkbar i begge uger i en dybde på -20 μm. Autofluorescensen blev noget svagere efter 3 uger og var ikke længere synlig efter 4 uger. Fluorescerende signaler blev observeret i en dybde på -80 μm efter 3 uger og i en dybde på -100 μm efter 4 uger. I internoden blev fluorescerende signaler observeret i en dybde på -60 μm uden CS-behandlingen (figur 3B). Den observerbare dybde var -90 μm efter 1 uge til 3 uger af CS-behandlingen og -100 μm efter 4 uger, men autofluorescens i cytoplasmaet var mærkbar i en dybde på -20 μm efter 1 uge. Autofluorescens var ikke længere synlig efter 2 uger. I bladene blev fluorescerende signaler observeret i en dybde på -90 μm uden CS-behandlingen (figur 3C). De fluorescerende signaler blev observeret dybere i bladene end i knuderne og internoderne. De fluorescerende signaler var imidlertid svagere. De fluorescerende signaler blev tydelige efter 1 uges CS-behandling og blev observeret i en dybde på -120 μm. Efter 2 uger og 3 uger blev fluorescerende signaler observeret i en dybde på -110 μm og efter 4 uger i en dybde på -120 μm.
Endelig blev ekspressionen af transkriptionsfaktoren OsMADS1511 fusioneret med mOrange12 observeret, hvilket regulerer overgangen af SAM fra den vegetative til den reproduktive fase13. Vævsprøver fra Nip ved 10 LS med OsMADS15-mOrange blev fikseret, trimmet til 130 μm tykkelse og behandlet med CS i 2 uger. Figur 4 viser, at clearingopløsningen kunne anvendes samtidigt til at observere de fluorescerende proteiner (OsMADS15-mOrange) af naturlig genekspression og fluorescerende farvestoffarvning (calcofluor white). Hele floretet i dybder fra 0 til -130 μm blev observeret, og 3D-billedet blev rekonstrueret fra 43 z-stack-billeder med 3 μm intervaller (figur 4E).
Figur 1: Prøveudtagningsposition og forarbejdning. (A) Nip-frøplante ved 8 LS under kortdagstilstand. (B) Forstørret visning af basen. (C) En prøveudskæring fra SAM / ung panicle til basen. (D) Et ovalt tværsnit fra C (indsat). (E) Barbering af den ene side af skuddet tyndt med et blad. (F) Tyndt barberet overflade. (G) Prøve, der viser internodeforlængelse. Den hvidlige sektion angivet med pilespidserne er noder. Oversiden af den øverste knude har den unge panik. Vægtstænger: (A) 10 cm, (B-C, E-G) 1 cm, (D) 0,5 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Vævsrensning afhænger af prøvetykkelsen og CS-behandlingsperioden. (A) Uklippede prøver med delvise skud inklusive den unge panik. Maksimal tykkelse: 4 mm. (B) Alle blade skrælles af prøverne for at udsætte den unge panik. Maksimal tykkelse: 2,5 mm. yp: ung panik, i: internod; pilespidser angiver node. (C) Prøver, der var håndtrimmede til 1 mm tykkelse. (D) Prøver trimmet med den vibrerende mikroskiver til 130 μm tykkelse. Skalalinje: 5 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Dybden af fluorescensobservation afhænger af vævstype og CS-behandlingsperiode. Dyb billeddannelse af UBQpro::NGCN i (A)-noden, (B) internoden og (C) bladet. "Flet" betyder, at billederne blev smeltet sammen med DIC-billedet (Differential Interference Contrast) og alle z-stack-billeder. Billeder, hvor der ikke blev observeret fluorescens, blev markeret som "n.d." (ikke fundet). Indstillingerne for den konfokale lasermikroskopi er som følger: laser: 488 nm / 13%, mål: 20x, pinhole: 0,93 AU, gennemsnit: 16, detektorforstærkning: 800, interval: 10 μm. Skalastænger: 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Dyb fluorescensobservation af OsMADS15-mOrange. (A) DIC-billedet af Nip ved 10 LS. yp: ung panik, le: blad, nej: knude, i: internode; pilespidser angiver blomster. (B) Fluorescensbillede af OsMADS15-mOrange. Gule prikker angiver de fluorescerende proteiner af OsMADS15-mOrange ved kernen. Cellevæggen blev farvet cyan med calcofluor hvid opløsning. (C) Forstørret udsyn til den unge panik. (D) Dyb billeddannelse af floret. pa: palea, le: lemma, fm: blomstermeristem; stjerner angiver stamen primordia. Det konfokale lasermikroskop blev indstillet som følger: OsMADS15-mOrange; laser: 555 nm/13%, mål: 20x, pinhole: 0,96 AU, gennemsnit: 16, detektorforstærkning: 800, interval: 3 μm. Calcofluor hvid; laser: 405 nm/3%, mål: 20x, pinhole: 0,93 AU, gennemsnit: 16, detektorforstærkning: 470, interval: 3 μm. (E) 3D-billedet af figuren (D) konstrueret ud fra z-stack-billederne. Skalastænger: (A-B) 1 mm, (C) 500 μm, (D) 40 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Kritiske trin i protokollen
De kritiske trin i denne protokol er fiksering og trimning. Risskud har hårde, tykke eller lagdelte væv, der begrænser penetrationen af den fikserende opløsning. For at forbedre permeabiliteten af den fikserende opløsning blev den ene side af vævet tyndt barberet ved prøveudtagning, som vist i figur 1E-F. Derudover blev vakuumbehandlingerne gentaget to gange ved hjælp af højere tryk. Desuden blev prøverne fastsat natten over ved 4 °C i stedet for den sædvanlige 2 timers fiksering ved 4 °C.
Nøglepunktet i trimningstrinnet er at bestemme tykkelsen af vævene, der skal forberedes til at observere de fluorescerende proteiner, samtidig med at deres indre struktur bevares efter en kort periode med CS-behandling. Som vist i figur 2C blev de 1 mm tykke prøver, håndtrimmet så tynde som muligt, kun gennemsigtige i et begrænset antal væv, selv efter 3 måneders CS-behandling. Derfor er trimningstrinnet afgørende for dyb fluorescensobservation af voksne risskud. I denne undersøgelse blev prøverne trimmet til en tykkelse på 130 μm, som vist i figur 2D. Tykkelsen på 130 μm gjorde det muligt at rydde bladene efter 1 uges CS-behandling og hele prøven efter 2 uger. Voksne risskud ved 9-10 LS blev brugt i denne undersøgelse. Tykt, men blødere væv fra yngre risskud kan ryddes hurtigere med CS-behandlingen. Tykkelsen af prøverne og varigheden af CS-behandlingen skal justeres i henhold til vævstype, tilstand og tykkelse af den 3D-struktur, der skal observeres.
Ændringer og fejlfindingsmetoder
CS udfældes let ved lave temperaturer. Den udfældede CS kan ikke bevare de fluorescerende proteiner; derfor skal der udvises forsigtighed ved opbevaring af prøverne ved den korrekte temperatur. Derudover har både CS og fiksiv opløsning ingen antiseptisk virkning; derfor vil fluorescerende proteiner blive nedbrudt, hvis de er forurenet. Jorddyrket ris er tilbøjelig til svampevækst; Prøveudtagning og håndtering af prøver skal derfor udføres med omhu for at undgå kontaminering.
Overskydende fluorescerende farvestoffer i bufferen kan afgive baggrundsfluorescens og forstyrre mikroskopiske observationer. For eksempel blev en calcofluor hvid opløsning indeholdende Evans blå farvestof tidligere anvendt. Efter farvning i 1 time og vask i 1 time blev de fluorescerende proteiner af OsMADS15-mOrange observeret ved anvendelse af en 555 nm laser. Imidlertid kunne fluorescerende proteiner ikke observeres på grund af baggrundsfluorescensen afledt af Evans blå farvestof. Denne baggrundsfluorescens blev næsten elimineret ved at vaske prøverne i 2 timer. Desuden var de fluorescerende proteiner klarere, hvis prøverne blev efterladt natten over. Derfor blev en ren calcofluor hvid opløsning anvendt i denne undersøgelse. Baggrundsfluorescens afledt af det fluorescerende farvestof bør kontrolleres ved hjælp af forskellige laserbølgelængder før observationer.
Begrænsninger af metoden
Som vist i figur 3 blev der observeret dybe fluorescerende proteiner i prøverne, der var 130 μm tykke efter 2 ugers CS-behandling. Dette er i overensstemmelse med resultaterne vist i figur 2D, hvor den 130 μm tykke prøve blev gennemsigtig efter 2 ugers CS-behandling. Som vist i figur 3A var autofluorescens af cytoplasmaet imidlertid stadig mærkbar i knuderne efter 2 uger og blev først fuldstændigt fjernet efter 4 ugers CS-behandling. Noder har en høj celletæthed og kræver derfor længere tid at fjerne auto-fluorescerende materialer.
Som vist i figur 3C blev dybe fluorescerende proteiner observeret i bladene uden CS-behandling, men lysstyrken var svagere end i knuderne og internoderne i samme dybde på 20 μm. Efter 1 uges CS-behandling var de fluorescerende proteiner lysere. Klorofyl er rigeligt i blade og absorberer 488 nm excitationslys. De har også orange / rød autofluorescens, som kan forstyrre observationen af fluorescerende proteiner ved hjælp af en 555 nm laser. Efter 1 uges CS-behandling blev klorofyl og andre auto-fluorescerende materialer fjernet, hvilket resulterede i billeder med højt signal/støj-forhold.
De dybder, der kunne observeres i væv efter 2 uger og 4 ugers CS-behandling, var ikke signifikant forskellige, selvom de fluorescerende proteiner syntes svagere efter 4 uger (figur 3). Normalt svækkes lysstyrken af fluorescerende proteiner og autofluorescens med tiden, hvilket resulterer i et højere signal-støj-forhold. Derfor kan fluorescerende proteiner observeres tydeligere ved at justere de mikroskopiske forhold og billedbehandling. Baseret på disse resultater blev det konkluderet, at 2 ugers CS-behandling kunne lette observationen af dybe fluorescerende proteiner i betragtning af vores prøvebetingelser. Der er dog brug for 4 uger til at observere klarere billeder, der helt udelukker de auto-fluorescerende materialer.
Strukturer med stærk autofluorescens, såsom vaskulære bundter og multi-arm celler, kan ikke ryddes i CS. For at observere disse strukturer uden autofluorescens er det nødvendigt at anvende en tidsgating metode12 eller at opnå billeder ved spektroskopi af fluorescensspektret. Et to-fotonmikroskop kan være mere egnet til at observere dybere væv, hvis der observeres tykkere væv.
Metodens betydning i forhold til eksisterende og alternative metoder
Generelt er de indre strukturer af risplanter blevet observeret ved hjælp af enten kryostat eller vibratomsektion. En kryostat er velegnet til forberedelse af tynde sektioner, som giver lettere observation, men forberedelsen af prøverne og driften af udstyret er tidskrævende. Rekonstruktion af den oprindelige 3D-struktur fra tynde sektioner er også vanskelig. Vibratomet er relativt let at betjene og velegnet til fremstilling af tykke sektioner. Imidlertid tillader tykke sektioner af målvæv kun observationer af den afskårne overflade og ikke dybe væv, som lyset ikke kan nå. Af disse grunde er ingen af metoderne egnede til dybe fluorescensobservationer.
Denne undersøgelse behandlede udfordringer i dyb fluorescensobservation i risskud, såsom den begrænsede vævsindtrængning af CS og den dårlige objektopløsning under et konfokalt mikroskop ved at kombinere eksisterende metoder. Som vist i figur 4 observerede vi fluorescerende proteiner (OsMADS15-mOrange) udtrykt i de dybe væv af voksne risskud fra den unge panik til basen. Figur 4D fokuserer på blomster og viser dybe fluorescerende proteiner med 3 μm intervaller. Væv over -130 μm dybde blev observeret efter 2 ugers CS-behandling, men kun væv inden for -27 μm dybde blev observeret (data ikke vist) i buketten i samme størrelse og vækststadium uden CS-behandling. Den nuværende forbedrede protokol tillod observation ikke kun af overekspression af gener, men også naturlig genekspression i det dybe væv af voksne risskud.
Metodens betydning og potentielle anvendelse på specifikke forskningsområder
Denne protokol, som optimerer den dybe fluorescensobservation af voksne risskud, muliggør effektiv rydning af hårdt, tykt eller lagdelt væv ved at trimme unødvendigt væv og øge permeabiliteten af CS. Derudover blev tykkelsen af prøverne til analyse optimeret for at muliggøre kontinuerlig og strukturel dyb fluorescensobservation ved hjælp af et konfokalt lasermikroskop, som normalt ikke kan løse tykke eller uigennemsigtige væv.
Det er vanskeligt at sammenligne risprøver på forskellige vækststadier, fordi de fluorescerende proteiner nedbrydes over tid i fikserings- og PBS-opløsningerne. Imidlertid kan de fluorescerende proteiner i CS opbevares i mere end 5 måneder1. Den lange holdbarhed af CS er en stor fordel for dyb fluorescensobservation i ris.
For nylig er der udviklet mange clearingteknologier, der gør det muligt at observere dybe væv i 3D, samtidig med at deres interne strukturer bevares. Disse teknologier er fortsat med at udvikle sig, og nye clearingløsninger er blevet udviklet. Et godt eksempel er iTOMEI14, som muliggør effektiv klorofylfjernelse og lysere fluorescensdetektion. Et andet eksempel er ClearSeeAlpha15, som forhindrer bruning af væv under rydning af behandling og får dem til at fremstå gennemsigtige. En kombination af disse clearingløsninger med den nuværende metode kan muliggøre en mere effektiv clearing.
Det forventes, at den nuværende metode vil hjælpe med at få ny indsigt gennem dyb billeddannelse af ikke kun ris, men også andre planter.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Vi takker Dr. R. Terada, Dr. Z. Shimatani og Dr. H. Tsuji for at give os OsMADS15-mOrange frø; Dr. D. Kurihara for at give os NGCN-konstruktionen; og Dr. R. Shim for redigering af vores manuskript. Dette arbejde blev finansieret af JSPS KAKENHI (tilskudsnumre JP20H05912, 20H05778, 20H05779) og af SATREPS-programmet (nr. JPMJSA1706) fra JST og JICA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | BIO-BIK | ST-0150F | |
| 12-multiwell plate | Corning | 353043 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 352070 | |
| Calcofluor white solution | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| ClearSee | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 031-25151 | This can be made or purchased. |
| Confocal laser microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Desiccator | SANPLATEC | Custom made of acrylic. 30 cm (L), 30 cm (W), 14.5 cm (H) | |
| Glass coverslip (18 × 18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
| HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 342-01375 | |
| Microscope slide (76 × 26) | MATSUNAMI | S2441 | |
| Paraffin film | Bemis | PM-996 | |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 162-16065 | |
| Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-00013 | |
| UBQpro::NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro::NGCN) | provided by Dr. Kurihara | ||
| Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
| Vacuum pump | AS One | AS-01 | |
| Vibrating micro-slicer | DOSAKA | DTK-3000 | |
| Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |
References
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
- Hasegawa, J., et al. Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique. Plant and Cell Physiology. 57 (3), 462-472 (2016).
- Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. A versatile optical clearing protocol for deep tissue imaging of fluorescent proteins in Arabidopsis thaliana. PLoS One. 11 (8), 0161107 (2016).
- Pandey, K. B., et al. Plant roots sense soil compaction through restricted ethylene diffusion. Science. 371 (6526), 276-280 (2021).
- Ejaza, M., Bencivenga, S., Tavaresa, R., Busha, M., Sablowski, R. ARABIDOPSIS THALIANA HOMEOBOX GENE 1 controls plant architecture by locally restricting environmental responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (17), (2021).
- Smetana, O., et al. High levels of auxin signalling define the stem-cell organizer of the vascular cambium. Nature. 565 (7740), 485-489 (2019).
- Chu, T. T. H., et al. Sub-cellular markers highlight intracellular dynamics of membrane proteins in response to abiotic treatments in rice. Rice. 11 (1), 23 (2018).
- Nagaki, K., Yamaji, N., Murata, M. ePro-ClearSee: A simple immunohistochemical method that does not require sectioning of plant samples. Scientific Reports. 7, 42203 (2017).
- Sato, M., Akashi, H., Sakamoto, Y., Matsunaga, S., Tsuji, H. Whole-tissue three-dimensional imaging of rice at single-cell resolution. International Journal of Molecular Sciences. 23 (1), 40 (2022).
- Matsuo, T., Hoshikawa, K.
- Kobayashi, K., et al. Inflorescence meristem identity in rice is specified by overlapping functions of three AP1/FUL-Like MADS box genes and PAP2, a SEPALLATA MADS box gene. Plant Cell. 24 (5), 1848-1859 (2012).
- Tamaki, S., et al. FT-like proteins induce transposon silencing in the shoot apex during floral induction in rice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (8), 901-910 (2015).
- Kodama, Y. Time gating of chloroplast autofluorescence allows clearer fluorescence imaging In Planta. PLoS One. 11 (3), 0152484 (2016).
- Sakamoto, Y., et al. Improved clearing method contributes to deep imaging of plant organs. Communications Biology. 5 (1), 12 (2022).
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Nagahara, S., Higashiyama, T. ClearSeeAlpha: Advanced optical clearing for whole-plant imaging. Plant and Cell Physiology. 62 (8), 1302-1310 (2021).
