Summary
Het huidige protocol beschrijft een opruimtechniek voor rijstscheuten, die moeilijk voor te bereiden zijn voor interne structurele waarnemingen vanwege de harde, dikke of gelaagde aard van de weefsels. Deze methode vergemakkelijkt continue en diepe fluorescentiewaarnemingen, zelfs in volwassen rijstplanten.
Abstract
De recent ontwikkelde clearingtechnologie die refractieve indexmismatches elimineert en auto-fluorescerend materiaal vermindert, heeft het mogelijk gemaakt om plantenweefsels in drie dimensies (3D) te observeren met behoud van hun interne structuren. In rijst (Oryza sativa L.), een eenzaadlobbige modelplant en een wereldwijd belangrijk gewas, is clearingtechnologie gemeld in organen die relatief gemakkelijk waarneembaar zijn, zoals de wortels en bladeren. Toepassingen van clearingtechnologie in shoot apicale meristeem (SAM) en stengels zijn ook gemeld, maar slechts in beperkte mate vanwege de slechte penetratie van de clearingoplossing (CS) in deze weefsels. De beperkte efficiëntie van de clearingoplossingen in deze weefsels is toegeschreven aan autofluorescentie, verdikking en verharding van de weefsels in de stengel naarmate de vasculaire bundels en epidermis zich ontwikkelen en gelaagdheid van de SAM met waterafstotende bladeren. Het huidige protocol rapporteert de optimalisatie van een clearingbenadering voor continue en 3D-observatie van genexpressie van de SAM / jonge pluim naar de basis van de scheuten tijdens de ontwikkeling. Vaste weefselmonsters die een fluorescerende eiwitverslaggever tot expressie brachten, werden in secties gesneden met behulp van een trillende microsnijmachine. Wanneer een geschikte dikte werd bereikt, werd de CS aangebracht. Door zich specifiek op het centrale weefsel te richten, nam de penetratiegraad en uniformiteit van het CS toe en nam de tijd die nodig was om het weefsel transparant te maken af. Bovendien maakte het opruimen van de bijgesneden secties de observatie van de interne structuur van de hele opname vanuit een macroperspectief mogelijk. Deze methode heeft potentiële toepassingen in diepe beeldvorming van weefsels van andere plantensoorten die moeilijk te verwijderen zijn.
Introduction
Recent ontwikkelde clearingtechnologie heeft het mogelijk gemaakt om de diepe weefsels van planten te observeren met behoud van hun interne structuur 1,2,3. In de dicot modelfabriek Arabidopsis zijn veel studies naar fluorescerende eiwitbeeldvorming uitgevoerd met behulp van clearingtechnologie om refractieve indexmismatches te elimineren en auto-fluorescerende materialen te verwijderen 4,5,6. Hoewel het gebruik van clearingtechnologie 7,8 en 3D-beeldvorming bij cellulaire resolutie9 is gemeld in rijst (Oryza sativa L.), een eenzaadlobbige modelplant en een wereldwijd belangrijk gewas, zijn deze beperkt tot relatief dunne en zachte organen, zoals wortels, bladeren en schiet apicale meristeem (SAM), die gemakkelijk waarneembaar zijn.
De scheut is het hoofdorgaan dat de bovengrondse delen van vaatplanten vormt. In rijst zijn scheuten samengesteld uit een reeks verticaal gestapelde "fytomeren", bestaande uit okselknoppen, bladeren en de stengel10. Op het puntje van de shoot bestaat de SAM uit ongedifferentieerde stamcellen in het midden. Fytomeren worden gevormd door de differentiatie van cellen afgeleid van de SAM. Nadat de planten van de vegetatieve naar de voortplantingsfase zijn overgegaan, verlengen rijststengels en differentieert de SAM in jongepluimen 10. Deze ontwikkelingsverandering gaat gepaard met fluctuaties in de expressie van verschillende genen in de stengels en SAM/jonge pluimen. Om de mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan celdifferentiatie in verschillende weefsels, is het belangrijk om structureel de celmorfologie en genexpressie in interne scheutweefsels te observeren. De diepe beeldvorming van stengels (knopen en internodes) in de scheut vormt echter een uitdaging vanwege de inefficiëntie van clearingoplossingen om het weefsel te penetreren. Stengels ondergaan onmiddellijk een snelle volumetoename van laterale groei na differentiatie van de SAM. De verharding van de rijstknoopweefsels als gevolg van de verdikking van de vasculaire bundels en de horizontale complexe schakel van de nodale vasculaire anastomose, naast de hoge afstotendheid van rijstscheuten, dragen allemaal bij aan het beperken van de penetratie van de CS in stengels10.
Deze studie was gericht op het observeren van veranderingen in genexpressie in rijstscheutweefsels met behulp van een structurele diepe fluorescentietechniek. Dit werk optimaliseert een clearingprotocol voor rijst om continu genexpressie van de SAM / jonge pluim naar de basis te observeren in een 3D-structuur, in plaats van op een plat oppervlak, met behulp van een confocale lasermicroscoop.
Protocol
1. Bereiding van de fixatieve oplossing
- Breng 70 ml steriel water over in een glazen fles en voeg 10 g paraformaldehyde (PFA) toe.
LET OP: PFA is giftig; daarom wordt het dragen van handschoenen aanbevolen. - Voeg 2 ml 1 N NaOH toe om de PFA-oplossing op te lossen.
- Los de PFA-oplossing op met continu roeren (300-500 rpm) bij 60 °C gedurende ongeveer 1 uur totdat de PFA-oplossing transparant is.
- Voeg gesteriliseerd water toe om het volume van de PFA-oplossing te verhogen tot 100 ml.
OPMERKING: De PFA-oplossing werd vers bereid voor gebruik. Bovendien kan een PFA-oplossing die bij 4 °C is opgeslagen, ongeveer 2 maanden worden gebruikt. - Voeg onmiddellijk vóór de bemonstering 25 ml 60 mM HEPES (pH 7,4), 3 ml 1 M sucrose en 2 ml steriel water toe aan 20 ml PFA om een fixatieve oplossing van 50 ml te bereiden.
2. Bereiding van de clearingoplossing (CS)
- Weeg en meng 7,5 g natriumdeoxycholaat, 5 g xylitol en 12,5 g ureum (zie materiaaltabel) in 50 ml steriel water.
OPMERKING: Natriumdeoxycholaatpoeder werd gewogen in een algemene laboratoriumtrekkamer om verspreiding via de lucht te voorkomen. - Los de ingrediënten op (stap 2.1.) met behulp van een magneetroerder om de CS te bereiden.
OPMERKING: In deze studie wordt gebruik gemaakt van een in-house bereide clearingoplossing (CS), maar een in de handel verkrijgbare clearingoplossing, ClearSee (zie Materiaaltabel), kan ook worden gebruikt. - Breng de CS over in een conische buis van 50 ml en bewaar deze bij kamertemperatuur (15-30 °C) in het donker.
OPMERKING: De CS kan langer dan 1 jaar worden bewaard.
3. Steekproeven
- Snijd de wortels voorzichtig af zonder de planten te beschadigen. Was de planten met water om het vuil te verwijderen.
OPMERKING: Deze methode bestudeerde de observatie van weefsels van het driebladige stadium (LS) tot vlag LS. De huidige studie gebruikte de rijstcultivars Nipponbare (Nip) en Taichung 65 (T65) bij de 8-10 LS. - Pel de oude buitenste bladeren af met handen en pincet. Er waren nog ongeveer 2-3 bladeren over.
- Snijd het weefsel van de SAM/jonge pluim naar de basis met een enkelzijdig scheermes met behulp van een glijdende beweging om te voorkomen dat de cellen worden verpletterd (figuur 1A-C). Als de positie van de SAM/jonge pluim niet zichtbaar is, knip deze dan langer door.
- Omdat de doorsnede van de rijstscheut een ovale vorm heeft (figuur 1D), scheert u één kant van de ovaal dun af in de richting van de lange as met een dubbelzijdig scheermes (figuur 1E-F).
OPMERKING: Deze stap maakte het gemakkelijker voor de fixatieve oplossing om het monster binnen te dringen. Een horizontaal snijoppervlak maakt het monster gemakkelijker om aan een trillende microsnijmachine (zie Materiaaltabel) te plakken. - Bevestig de positie van de SAM/jonge pluim door een witachtige kleur in het monster te zien (figuur 1G). Snijd overtollig weefsel af.
OPMERKING: De lengte van het monster moet worden aangepast aan de maximale lengte die kan worden bijgesneden met behulp van een trillende microsnijmachine. Als het monster te lang is, verdeel het dan in verschillende stukken.
4. Fixatie van de monsters
- Pipetteer 1 ml van de fixatieve oplossing (bereid in stap 1.) naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml en plaats de monsters onmiddellijk.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de hoeveelheid monster niet groter is dan 20% van het volume van de fixatieve oplossing. - Snijd een stuk paraffinefilm in 2,5 cm2. Vorm de paraffinefilm tot ballen en plaats ze bovenop de monsters om te voorkomen dat ze uit de fixatieve oplossing drijven.
- Plaats de buis met het monster in een exsiccator. Sluit vervolgens het deksel van de exsiccator en start de vacuümpomp om de binnenkant van de exsiccator langzaam onder druk te zetten tot −0,095 MPa.
- Nadat u de exsiccator op −0,095 MPa hebt gesloten, schakelt u de vacuümpomp uit en laat u deze 30 minuten op kamertemperatuur staan.
OPMERKING: Het vacuümniveau was zodanig dat er geleidelijk bellen in de monsters verschenen. - Open de exsiccator iets en breng deze langzaam terug naar atmosferische druk. Verlaag de druk van de exsiccator tot −0,095 MPa, schakel de vacuümpomp uit en laat het mengsel 30 minuten op kamertemperatuur staan.
- Open de exsiccator iets en breng deze langzaam terug naar atmosferische druk. Als het monster correct is gefixeerd, zakt het in de fixatieve oplossing. Als het niet is gezonken, verlaag dan de druk opnieuw.
- Verwijder de paraffinefilm, sluit het deksel en bewaar de buisjes een nacht op 4 °C.
OPMERKING: Monsters werden gedurende ten minste 2 uur in fixatieve oplossing gefixeerd. Het kan ~ 1 week worden bewaard.
5. Het vaste monster bijsnijden
- Verwijder de overtollige fixatieve oplossing uit het monster met pluisvrije doekjes.
OPMERKING: Overtollige fixatieve oplossing voorkomt dat het monster goed op de lade blijft plakken. - Bevestig het monster op een trillende microsnijlade met instant lijm. Leg het op een bakje met de platte kant naar beneden, dat tijdens het proeven is afgeschoren.
OPMERKING: Vanwege de structuur van de rijstscheut moet deze vanaf de basis naar de SAM / jonge pluim worden gesneden. - Stel de trimcondities in op basis van het vaste monster.
OPMERKING: In deze studie werd het trimmen ingesteld op DIK, 130 μm; BREED, 15 mm; FREQUENTIE, 15%; en SNIJSNELHEID, 32 mm. - Pas de voorbeeldpositie aan met de RVS- of FWD-knop en de knop OMHOOG of OMLAAG . Vul de bak met gedeïoniseerd water totdat alle monsters zijn ondergedompeld. Nadat u de lade hebt gevuld, drukt u op de START-knop . Plaats de bijgesneden monsters op een glazen glijbaan met een druppel van 1x PBS.
OPMERKING: Verschuif de positie van het monster naar de andere kant na elke afsnijding, omdat het harde monster het scheermesje verslijt. - Nadat u het monster met de doellocatie onder een stereomicroscoop hebt gecontroleerd, brengt u het bijgesneden monster over naar een multiwellplaat met 1 ml 1x PBS.
OPMERKING: Kies het aantal putten op basis van de grootte van het monster. In deze studie werd een 12-multiwell plaat gebruikt.
6. Behandeling met de clearingoplossing
- Verwijder de 1x PBS van de multiwell plaat en voeg verse 1x PBS toe. Laat het 1 min staan.
- Verwijder 1x PBS en voeg de CS toe.
OPMERKING: De hoeveelheid CS moet vijf keer het monstervolume zijn. - Plaats de multiwellplaat met het monster in een exsiccator. Sluit vervolgens het deksel van de exsiccator en start de vacuümpomp om de binnenkant van de exsiccator langzaam onder druk te zetten tot −0,09 MPa.
- Nadat u de exsiccator op −0,09 MPa hebt gesloten, schakelt u de vacuümpomp uit en laat u deze 1 uur op kamertemperatuur staan.
- Open de exsiccator iets en breng deze langzaam terug naar atmosferische druk.
- Giet gedeïoniseerd water in de opening tussen de putten om de verdamping van de CS te voorkomen. Bewaar de multiwell-platen bij kamertemperatuur in het donker om te worden opgeruimd.
OPMERKING: Schud de multiwellplaat voorzichtig om de 1-2 dagen om het chlorofyl en andere componenten te verspreiden. - Wanneer de CS groen wordt, vervangt u deze door een nieuwe oplossing.
7. Celwandkleuring met chemische kleurstof
- Pipetteer de calcofluorwitte oplossing (1 ml, eindconcentratie: 1 mg/ml in de opruimoplossing, zie materiaaltabel) in een multiwellplaat. Plaats de monsters in de kleurstofoplossing en incubeer gedurende 1 uur.
OPMERKING: Het volume van de kleurstof mag niet groter zijn dan 10% van het volume van de CS. - Was de gekleurde monsters in een andere multiwellplaat met 1 ml CS gedurende ten minste 1 uur.
8. Observatie met een confocale lasermicroscoop
- Plaats een druppel CS op een microscoopglaasje en breng de behandelde (met CS) monsters over op de dia.
OPMERKING: Omdat de behandelde monsters zacht zijn, moeten ze zorgvuldig worden behandeld met een pincet. - Bedek het monster met een glazen afdekplaat om verdamping van de CS te voorkomen.
OPMERKING: De CS slaat gemakkelijk neer. - Observeer de behandelde monsters onder een confocale lasermicroscoop.
OPMERKING: Na observatie kunnen de behandelde monsters worden teruggestuurd naar de CS voor verdere observaties later.
Representative Results
Ten eerste werd de mate waarin de harde en dikke weefsels van volwassen rijstplanten transparant konden worden gemaakt door de clearingbehandeling gevalideerd. Nip bij de 9-10 LS, het pluimvormingsstadium, en 12-16 mm lange weefsels uitgesneden van de jonge pluim naar de basis van de scheut werden gebruikt. Deze monsters, inclusief de jonge pluim, werden gefixeerd in de fixatieve oplossing en waargenomen voor en na 1-4 weken van de clearingbehandeling (figuur 2). De niet-getrimde monsters bleven groen en werden niet transparant na 4 weken of zelfs na 3 maanden behandeling met de clearingoplossing (figuur 2A). In monsters die van alle bladeren werden afgepeld, werden de internodes wit na 1 week behandeling met de CS, hoewel de knopen groen bleven. Dit monster werd na 4 weken niet transparant (figuur 2B). Na 3 maanden van de behandeling met de CS werd alleen de jonge pluim transparant. De met de hand getrimde monsters veranderden in wit, met uitzondering van de buitenste bladeren en vaatbundels, na 1 week behandeling met de CS. Sommige delen van de bladeren, jonge pluim en internodes werden doorschijnend maar werden na 4 weken niet transparant (figuur 2C). Na 3 maanden werden alleen de jonge pluim en de binnenste bladeren transparant. De monsters die met de trillende microsnijder tot 130 μm dikte werden bijgesneden, werden na 1 week behandeling met de CS doorschijnend, waarbij de bladeren transparant werden. Na 2 weken was het monster bijna transparant en bleef het na 4 weken onveranderd (figuur 2D). Na 3 maanden werden de monsters volledig transparant.
Vervolgens werd de diepte waarmee de clearingbehandeling genexpressiewaarnemingen mogelijk maakte in de shoot van T65 bij de 8 LS gevalideerd. De UBQpro::NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro::NGCN, zie Materiaaltabel) uitgedrukte scheuten werden gebruikt. Weefselmonsters werden gefixeerd in de fixatieve oplossing voordat ze werden bijgesneden tot 130 μm dikte met behulp van een trillende microsnijder. De monsters werden vervolgens waargenomen onder een confocale lasermicroscoop (laser: 488 nm/ 13%, objectief: 20x, gaatje: 0,93 AU, gemiddeld: 16, detectorwinst: 800) met intervallen van 10 μm in de z-asrichting elke week van 0-4 weken behandeling met de CS. De representatieve resultaten zijn weergegeven in figuur 3. Alle cijfers werden met dezelfde verwerking aangepast om de fluorescentie-intensiteit te vergelijken. In de knoop zonder de behandeling werden zwakke fluorescerende signalen waargenomen op een diepte van −40 μm (figuur 3A). De waarneembare diepte was -60 μm na 1 week van de CS-behandeling en -90 μm na 2 weken, maar autofluorescentie van het cytoplasma was merkbaar in beide weken op een diepte van -20 μm. De autofluorescentie werd na 3 weken wat zwakker en was na 4 weken niet meer zichtbaar. Fluorescerende signalen werden waargenomen op een diepte van −80 μm na 3 weken en op een diepte van −100 μm na 4 weken. In de internode werden fluorescerende signalen waargenomen op een diepte van −60 μm zonder de CS-behandeling (figuur 3B). De waarneembare diepte was -90 μm na 1 week tot 3 weken van de CS-behandeling en -100 μm na 4 weken, maar autofluorescentie in het cytoplasma was merkbaar op een diepte van -20 μm na 1 week. Autofluorescentie was na 2 weken niet meer zichtbaar. In de bladeren werden fluorescerende signalen waargenomen op een diepte van −90 μm zonder de CS-behandeling (figuur 3C). De fluorescerende signalen werden dieper in de bladeren waargenomen dan in de knopen en internodes. De fluorescerende signalen waren echter zwakker. De fluorescerende signalen werden duidelijk na 1 week CS-behandeling en werden waargenomen op een diepte van −120 μm. Na 2 weken en 3 weken werden fluorescerende signalen waargenomen op een diepte van −110 μm en, na 4 weken, op een diepte van −120 μm.
Ten slotte werd de expressie van de transcriptiefactor OsMADS1511 gefuseerd met mOrange12 waargenomen, die de overgang van SAM van het vegetatieve naar de reproductieve fase13 reguleert. Weefselmonsters van Nip op de 10 LS met OsMADS15-mOrange werden gefixeerd, bijgesneden tot 130 μm dikte en behandeld met de CS gedurende 2 weken. Figuur 4 laat zien dat de clearingoplossing gelijktijdig kan worden gebruikt om de fluorescerende eiwitten (OsMADS15-mOrange) van natuurlijke genexpressie en fluorescerende kleurstofkleuring (calcofluorwit) te observeren. De hele roos op dieptes van 0 tot −130 μm werd waargenomen en het 3D-beeld werd gereconstrueerd uit 43 z-stack beelden met intervallen van 3 μm (figuur 4E).
Figuur 1: Bemonsteringspositie en verwerking. (A) Nip-zaailing bij de 8 LS onder de kortedagconditie. (B) Vergroot zicht op de basis. (C) Een monsteruitsparing van de SAM/jonge pluim naar de basis. (D) Een ovale doorsnede van C (inzet). (E) Dun scheren van een kant van de scheut met een mes. (F) Dun geschoren oppervlak. (G) Monster met internode-rek. Het witachtige gedeelte dat door de pijlpunten wordt aangegeven, zijn knooppunten. De bovenzijde van de bovenste knoop heeft de jonge pluim. Schaalbalken: (A) 10 cm, (B-C,E-G) 1 cm, (D) 0,5 cm. Klik hier om een grotere versie van dit figuur te bekijken.
Figuur 2: Het opruimen van weefsel is afhankelijk van de dikte van het monster en de CS-behandelingsperiode. (A) Niet-getrimde monsters met gedeeltelijke scheuten, waaronder de jonge pluim. Maximale dikte: 4 mm. (B) Alle bladeren afgepeld van de monsters om de jonge pluim bloot te leggen. Maximale dikte: 2,5 mm. yp: jonge pluim, in: internode; pijlpunten geven het knooppunt aan. (C) Monsters die met de hand werden bijgesneden tot een dikte van 1 mm. (D) Monsters bijgesneden met de trillende microsnijmachine tot een dikte van 130 μm. Schaalbalk: 5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: De diepte van fluorescentiewaarneming is afhankelijk van het weefseltype en de CS-behandelingsperiode. Diepe beeldvorming van UBQpro::NGCN in het (A) knooppunt, (B) internode en (C) blad. "Samenvoegen" betekent dat de afbeeldingen zijn samengevoegd met de differentiële interferentiecontrast (DIC) -afbeelding en alle z-stack-afbeeldingen. Afbeeldingen waarin geen fluorescentie werd waargenomen, werden gemarkeerd als "n.d." (niet gedetecteerd). Instellingen van de confocale lasermicroscopie zijn als volgt: laser: 488 nm/ 13%, objectief: 20x, gaatje: 0,93 AU, gemiddeld: 16, detectorwinst: 800, interval: 10 μm. Schaalbalken: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Diepe fluorescentiewaarneming van OsMADS15-mOrange. (A) De DIC-opname van Nip bij de 10 LS. yp: jonge pluim, le: blad, nee: knoop, in: internode; pijlpunten duiden op roosjes. (B) Fluorescentiebeeld van OsMADS15-mOrange. Gele stippen geven de fluorescerende eiwitten van OsMADS15-mOrange in de kern aan. De celwand werd gekleurd cyaan met de calcofluor witte oplossing. (C) Vergroot zicht op de jonge pluim. (D) Diepe beeldvorming van de roos. pa: palea, le: lemma, fm: bloemig meristeem; sterretjes geven meeldraden primordia aan. De confocale lasermicroscoop werd als volgt ingesteld: OsMADS15-mOrange; laser: 555 nm/13%, objectief: 20x, gaatje: 0,96 AU, gemiddeld: 16, detectorversterking: 800, interval: 3 μm. Calcofluor wit; laser: 405 nm/3%, objectief: 20x, gaatje: 0,93 AU, gemiddeld: 16, detectorversterking: 470, interval: 3 μm. (E) Het 3D-beeld van de figuur (D) opgebouwd uit de z-stack beelden. Schaalbalken: (A-B) 1 mm, (C) 500 μm, (D) 40 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Kritieke stappen van het protocol
De kritieke stappen in dit protocol zijn fixatie en trimmen. Rijstscheuten hebben harde, dikke of gelaagde weefsels die de penetratie van de fixatieve oplossing beperken. Om de permeabiliteit van de fixatieve oplossing te verbeteren, werd één kant van het weefsel bij de bemonstering dun geschoren, zoals weergegeven in figuur 1E-F. Daarnaast werden de vacuümbehandelingen tweemaal herhaald met een hogere druk. Bovendien werden de monsters 's nachts gefixeerd op 4 °C in plaats van de gebruikelijke 2 uur fixatie bij 4 °C.
Het belangrijkste punt in de trimstap is het bepalen van de dikte van de weefsels die moeten worden voorbereid om de fluorescerende eiwitten te observeren met behoud van hun interne structuur na een korte periode van CS-behandeling. Zoals te zien is in figuur 2C, werden de 1 mm dikke monsters, met de hand zo dun mogelijk bijgesneden, transparant in slechts een beperkt aantal weefsels, zelfs na 3 maanden CS-behandeling. Daarom is de trimstap essentieel voor diepe fluorescentiewaarneming van volwassen rijstscheuten. In deze studie werden de monsters bijgesneden tot een dikte van 130 μm, zoals weergegeven in figuur 2D. De dikte van 130 μm maakte het mogelijk om de bladeren na 1 week CS-behandeling en het hele monster na 2 weken te verwijderen. Volwassen rijstscheuten bij de 9-10 LS werden in deze studie gebruikt. Dikke maar zachtere weefsels van jongere rijstscheuten kunnen sneller worden verwijderd met de CS-behandeling. De dikte van de monsters en de duur van de CS-behandeling moeten worden aangepast aan het weefseltype, de conditie en de dikte van de te observeren 3D-structuur.
Methoden voor wijzigingen en probleemoplossing
De CS sloeg gemakkelijk neer bij lage temperaturen. Het neergeslagen CS kan de fluorescerende eiwitten niet behouden; daarom moet voorzichtig worden omgesprongen bij het bewaren van de monsters bij de juiste temperatuur. Bovendien hebben zowel de CS als de fixatieve oplossing geen antiseptisch effect; daarom zullen fluorescerende eiwitten worden afgebroken als ze besmet zijn. In de grond gekweekte rijst is gevoelig voor schimmelgroei; daarom moeten de bemonstering en hantering van monsters met zorg worden uitgevoerd om besmetting te voorkomen.
Overtollige fluorescerende kleurstoffen in de buffer kunnen achtergrondfluorescentie afgeven en microscopische waarnemingen verstoren. Zo werd eerder een calcofluorwitte oplossing met Evans blauwe kleurstof gebruikt. Na 1 uur kleuring en wassen gedurende 1 uur werden de fluorescerende eiwitten van OsMADS15-mOrange waargenomen met behulp van een 555 nm-laser. Fluorescerende eiwitten konden echter niet worden waargenomen vanwege de achtergrondfluorescentie afgeleid van Evans blauwe kleurstof. Deze achtergrondfluorescentie werd bijna geëlimineerd door de monsters gedurende 2 uur te wassen. Bovendien waren de fluorescerende eiwitten duidelijker als de monsters 's nachts werden achtergelaten. Daarom werd in deze studie een zuivere calcofluorwitte oplossing gebruikt. Achtergrondfluorescentie afgeleid van de fluorescerende kleurstof moet vóór waarnemingen worden gecontroleerd met behulp van verschillende lasergolflengten.
Beperkingen van de methode
Zoals te zien is in figuur 3, werden diepe fluorescerende eiwitten waargenomen in de monsters die 130 μm dik waren na 2 weken CS-behandeling. Dit komt overeen met de resultaten in figuur 2D, waar het 130 μm dikke monster transparant werd na 2 weken CS-behandeling. Zoals te zien is in figuur 3A, was autofluorescentie van het cytoplasma echter na 2 weken nog steeds merkbaar in de knopen en werd het pas volledig verwijderd na 4 weken CS-behandeling. Knooppunten hebben een hoge celdichtheid en hebben daarom een langere tijd nodig om automatisch fluorescerende materialen te verwijderen.
Zoals te zien is in figuur 3C, werden diepe fluorescerende eiwitten waargenomen in de bladeren zonder CS-behandeling, maar de helderheid was zwakker dan die in de knopen en internodes op dezelfde diepte van 20 μm. Na 1 week CS-behandeling waren de fluorescerende eiwitten helderder. Chlorofyl is overvloedig aanwezig in bladeren en absorbeert 488 nm excitatielicht. Ze hebben ook oranje / rode autofluorescentie, die de observatie van fluorescerende eiwitten met behulp van een 555 nm-laser kan verstoren. Na 1 week CS-behandeling werden chlorofyl en andere auto-fluorescerende materialen verwijderd, wat resulteerde in beelden met een hoge signaal-ruisverhouding.
De diepten die na 2 weken en 4 weken CS-behandeling in weefsels konden worden waargenomen, waren niet significant verschillend, hoewel de fluorescerende eiwitten na 4 weken zwakker leken (figuur 3). Normaal gesproken verzwakt de helderheid van fluorescerende eiwitten en autofluorescentie met de tijd, wat resulteert in een hogere signaal-ruisverhouding. Daarom kunnen fluorescerende eiwitten duidelijker worden waargenomen door de microscopische omstandigheden en beeldverwerking aan te passen. Op basis van deze resultaten werd geconcludeerd dat 2 weken CS-behandeling de observatie van diepe fluorescerende eiwitten zou kunnen vergemakkelijken, gezien onze monsteromstandigheden. Er zijn echter 4 weken nodig om duidelijkere beelden te observeren die de auto-fluorescerende materialen volledig uitsluiten.
Structuren met sterke autofluorescentie, zoals vaatbundels en meerarmcellen, kunnen niet worden opgeruimd in de CS. Om deze structuren zonder autofluorescentie te observeren, is het noodzakelijk om een time-gating-methode12 te gebruiken of om beelden te verkrijgen door spectroscopie van het fluorescentiespectrum. Een microscoop met twee fotonen kan geschikter zijn voor het observeren van diepere weefsels als dikkere weefsels worden waargenomen.
Betekenis van de methode ten opzichte van bestaande en alternatieve methoden
Over het algemeen zijn de interne structuren van rijstplanten waargenomen met behulp van cryostaat- of vibratomesecties. Een cryostaat is geschikt voor het voorbereiden van dunne secties, die gemakkelijker observatie mogelijk maken, maar de voorbereiding van de monsters en de werking van de apparatuur zijn tijdrovend. Het reconstrueren van de originele 3D-structuur uit dunne secties is ook moeilijk. Het vibratoom is relatief eenvoudig te bedienen en geschikt voor het produceren van dikke delen. Dikke delen van doelweefsels laten echter alleen waarnemingen van het snijoppervlak toe en geen diepe weefsels die licht niet kan bereiken. Om deze redenen is geen van beide methoden geschikt voor diepe fluorescentiewaarnemingen.
Deze studie richtte zich op uitdagingen bij diepe fluorescentiewaarneming in rijstscheuten, zoals de beperkte weefselpenetratie van de CS en de slechte objectresolutie onder een confocale microscoop, door bestaande methoden te combineren. Zoals te zien is in figuur 4, hebben we fluorescerende eiwitten (OsMADS15-mOrange) waargenomen die tot expressie komen in de diepe weefsels van volwassen rijstscheuten van de jonge pluim naar de basis. Figuur 4D richt zich op de roos en toont diepe fluorescerende eiwitten met intervallen van 3 μm. Weefsels met een diepte van meer dan -130 μm werden waargenomen na 2 weken CS-behandeling, maar alleen de weefsels binnen -27 μm diepte werden waargenomen (gegevens niet getoond) in de roos bij dezelfde grootte en groeifase zonder CS-behandeling. Het huidige verbeterde protocol maakte observatie mogelijk, niet alleen van overexpressie van genen, maar ook natuurlijke genexpressie in de diepe weefsels van volwassen rijstscheuten.
Belang en mogelijke toepassingen van de methode in specifieke onderzoeksgebieden
Dit protocol, dat de diepe fluorescentiewaarneming van volwassen rijstscheuten optimaliseert, maakt het efficiënt opruimen van harde, dikke of gelaagde weefsels mogelijk door onnodige weefsels af te snijden en de permeabiliteit van de CS te vergroten. Bovendien werd de dikte van de monsters voor analyse geoptimaliseerd om continue en structurele diepe fluorescentiewaarneming mogelijk te maken met behulp van een confocale lasermicroscoop, die normaal gesproken geen dikke of ondoorzichtige weefsels kan oplossen.
Het is moeilijk om rijstmonsters in verschillende groeistadia te vergelijken, omdat de fluorescerende eiwitten na verloop van tijd afbreken in de fixatieve en PBS-oplossingen. De fluorescerende eiwitten in de CS kunnen echter langer dan 5 maanden worden bewaard1. De lange houdbaarheid van de CS is een groot voordeel voor diepe fluorescentiewaarneming in rijst.
Onlangs zijn er veel clearingtechnologieën ontwikkeld, waardoor het mogelijk is om diepe weefsels in 3D te observeren met behoud van hun interne structuren. Deze technologieën zijn blijven evolueren en er zijn nieuwe clearingoplossingen ontwikkeld. Een goed voorbeeld is iTOMEI14, dat efficiënte chlorofylverwijdering en helderdere fluorescentiedetectie mogelijk maakt. Een ander voorbeeld is ClearSeeAlpha15, dat het bruin worden van weefsels tijdens de clearingbehandeling voorkomt en ze transparant laat lijken. Het combineren van deze clearingoplossingen met de huidige methode kan een efficiëntere en effectievere clearing mogelijk maken.
Verwacht wordt dat de huidige methode zal helpen nieuwe inzichten te verkrijgen door middel van diepe beeldvorming van niet alleen rijst, maar ook andere planten.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
We danken Dr. R. Terada, Dr. Z. Shimatani en Dr. H. Tsuji voor het verstrekken van de OsMADS15-mOrange zaden; Dr. D. Kurihara voor het leveren van de NGCN-constructie; en Dr. R. Shim voor het redigeren van ons manuscript. Dit werk werd gefinancierd door JSPS KAKENHI (subsidienummers JP20H05912, 20H05778, 20H05779) en door het SATREPS-programma (nr. JPMJSA1706) van de JST en JICA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | BIO-BIK | ST-0150F | |
| 12-multiwell plate | Corning | 353043 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 352070 | |
| Calcofluor white solution | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| ClearSee | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 031-25151 | This can be made or purchased. |
| Confocal laser microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Desiccator | SANPLATEC | Custom made of acrylic. 30 cm (L), 30 cm (W), 14.5 cm (H) | |
| Glass coverslip (18 × 18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
| HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 342-01375 | |
| Microscope slide (76 × 26) | MATSUNAMI | S2441 | |
| Paraffin film | Bemis | PM-996 | |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 162-16065 | |
| Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-00013 | |
| UBQpro::NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro::NGCN) | provided by Dr. Kurihara | ||
| Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
| Vacuum pump | AS One | AS-01 | |
| Vibrating micro-slicer | DOSAKA | DTK-3000 | |
| Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |
References
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
- Hasegawa, J., et al. Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique. Plant and Cell Physiology. 57 (3), 462-472 (2016).
- Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. A versatile optical clearing protocol for deep tissue imaging of fluorescent proteins in Arabidopsis thaliana. PLoS One. 11 (8), 0161107 (2016).
- Pandey, K. B., et al. Plant roots sense soil compaction through restricted ethylene diffusion. Science. 371 (6526), 276-280 (2021).
- Ejaza, M., Bencivenga, S., Tavaresa, R., Busha, M., Sablowski, R. ARABIDOPSIS THALIANA HOMEOBOX GENE 1 controls plant architecture by locally restricting environmental responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (17), (2021).
- Smetana, O., et al. High levels of auxin signalling define the stem-cell organizer of the vascular cambium. Nature. 565 (7740), 485-489 (2019).
- Chu, T. T. H., et al. Sub-cellular markers highlight intracellular dynamics of membrane proteins in response to abiotic treatments in rice. Rice. 11 (1), 23 (2018).
- Nagaki, K., Yamaji, N., Murata, M. ePro-ClearSee: A simple immunohistochemical method that does not require sectioning of plant samples. Scientific Reports. 7, 42203 (2017).
- Sato, M., Akashi, H., Sakamoto, Y., Matsunaga, S., Tsuji, H. Whole-tissue three-dimensional imaging of rice at single-cell resolution. International Journal of Molecular Sciences. 23 (1), 40 (2022).
- Matsuo, T., Hoshikawa, K.
- Kobayashi, K., et al. Inflorescence meristem identity in rice is specified by overlapping functions of three AP1/FUL-Like MADS box genes and PAP2, a SEPALLATA MADS box gene. Plant Cell. 24 (5), 1848-1859 (2012).
- Tamaki, S., et al. FT-like proteins induce transposon silencing in the shoot apex during floral induction in rice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (8), 901-910 (2015).
- Kodama, Y. Time gating of chloroplast autofluorescence allows clearer fluorescence imaging In Planta. PLoS One. 11 (3), 0152484 (2016).
- Sakamoto, Y., et al. Improved clearing method contributes to deep imaging of plant organs. Communications Biology. 5 (1), 12 (2022).
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Nagahara, S., Higashiyama, T. ClearSeeAlpha: Advanced optical clearing for whole-plant imaging. Plant and Cell Physiology. 62 (8), 1302-1310 (2021).
