Summary
Le présent protocole décrit une technique de défrichage pour les pousses de riz, qui sont difficiles à préparer pour les observations structurelles internes en raison de la nature dure, épaisse ou stratifiée des tissus. Cette méthode facilite les observations de fluorescence continue et profonde, même chez les plants de riz adultes.
Abstract
La technologie de compensation récemment développée qui élimine les décalages de l’indice de réfraction et diminue les matériaux auto-fluorescents a permis d’observer les tissus végétaux en trois dimensions (3D) tout en préservant leurs structures internes. Chez le riz (Oryza sativa L.), une plante modèle monocotylédones et une culture d’importance mondiale, une technologie de défrichage a été signalée dans des organes relativement faciles à observer, tels que les racines et les feuilles. Des applications de la technologie de nettoyage dans le méristème apical des pousses (SAM) et les tiges ont également été rapportées, mais seulement dans une mesure limitée en raison de la faible pénétration de la solution de nettoyage (CS) dans ces tissus. L’efficacité limitée des solutions de nettoyage dans ces tissus a été attribuée à l’auto-fluorescence, à l’épaississement et au durcissement des tissus de la tige à mesure que les faisceaux vasculaires et l’épiderme se développent et à la stratification de la SAM avec des feuilles hydrofuges. Le présent protocole fait état de l’optimisation d’une approche de nettoyage pour l’observation continue et 3D de l’expression génique de la SAM/jeune panicule à la base des pousses au cours du développement. Des échantillons de tissus fixes exprimant un rapporteur de protéine fluorescente ont été coupés en sections à l’aide d’une micro-trancheuse vibrante. Lorsqu’une épaisseur appropriée a été atteinte, le CS a été appliqué. En ciblant spécifiquement le tissu central, le taux de pénétration et l’uniformité du CS ont augmenté, et le temps nécessaire pour rendre le tissu transparent a diminué. De plus, le dégagement des sections taillées a permis d’observer la structure interne de l’ensemble de la pousse d’un point de vue macro. Cette méthode a des applications potentielles dans l’imagerie profonde des tissus d’autres espèces végétales qui sont difficiles à nettoyer.
Introduction
La technologie de défrichage récemment développée a permis d’observer les tissus profonds des plantes tout en préservant leur structure interne 1,2,3. Dans la plante modèle dicotylédones Arabidopsis, de nombreuses études sur l’imagerie des protéines fluorescentes ont été menées à l’aide de la technologie de compensation pour éliminer les incompatibilités de l’indice de réfraction et éliminer les matériaux autofluorescents 4,5,6. Bien que l’utilisation de la technologie de défrichage7,8 et de l’imagerie 3D à la résolution cellulaire9 ait été signalée dans le riz (Oryza sativa L.), une plante modèle monocotylédones et une culture d’importance mondiale, celles-ci sont limitées à des organes relativement minces et mous, tels que les racines, les feuilles et le méristème apical des pousses (SAM), qui sont faciles à observer.
La pousse est l’organe principal constituant les parties aériennes des plantes vasculaires. Dans le riz, les pousses sont composées d’une série de « phytomères » empilés verticalement, comprenant des bourgeons axillaires, des feuilles et la tige10. À l’extrémité de la pousse, le SAM est composé de cellules souches indifférenciées au centre. Les phytomères sont formés par la différenciation des cellules dérivées de la SAM. Une fois que les plantes passent de la phase végétative à la phase de reproduction, les tiges de riz s’allongent et la SAM se différencie en jeunes panicules10. Ce changement de développement s’accompagne de fluctuations dans l’expression de divers gènes dans les tiges et les jeunes panicules SAM/SAM. Pour comprendre les mécanismes sous-jacents à la différenciation cellulaire en divers tissus, il est important d’observer structurellement la morphologie cellulaire et l’expression génique dans les tissus internes des pousses. Cependant, l’imagerie profonde des tiges (nœuds et entre-nœuds) dans la pousse présente un défi en raison de l’inefficacité des solutions de nettoyage pour pénétrer dans le tissu. Les tiges subissent immédiatement une augmentation rapide du volume à partir de la croissance latérale après différenciation de la SAM. Le durcissement des tissus des nœuds de riz dû à l’épaississement des faisceaux vasculaires et au lien complexe horizontal de l’anastomose vasculaire ganglionnaire, en plus de la forte répulsion des pousses de riz, contribuent tous à limiter la pénétration du CS dans les tiges10.
Cette étude visait à observer les changements dans l’expression des gènes dans les tissus des pousses de riz en utilisant une technique de fluorescence profonde structurelle. Ce travail optimise un protocole de nettoyage pour le riz afin d’observer en continu l’expression des gènes de la panicule SAM/jeune à la base dans une structure 3D, plutôt que sur une surface plane, à l’aide d’un microscope laser confocale.
Protocol
1. Préparation de la solution fixatrice
- Transférer 70 mL d’eau stérile dans une bouteille en verre et ajouter 10 g de paraformaldéhyde (PFA).
ATTENTION : Le PFA est toxique; Par conséquent, le port de gants est recommandé. - Ajouter 2 mL de NaOH 1 N pour dissoudre la solution de PFA.
- Dissoudre la solution de PFA sous agitation continue (300-500 tr/min) à 60 °C pendant environ 1 h jusqu’à ce que la solution de PFA soit transparente.
- Ajouter de l’eau stérilisée pour augmenter le volume de la solution de PFA à 100 mL.
REMARQUE: La solution de PFA a été préparée fraîchement avant utilisation. De plus, une solution de PFA conservée à 4 °C peut être utilisée pendant environ 2 mois. - Immédiatement avant l’échantillonnage, ajouter 25 mL de HEPES 60 mM (pH 7,4), 3 mL de saccharose 1 M et 2 mL d’eau stérile dans 20 mL de PFA à 10 % pour préparer une solution fixatrice de 50 mL.
2. Préparation de la solution de compensation (CS)
- Peser et mélanger 7,5 g de désoxycholate de sodium, 5 g de xylitol et 12,5 g d’urée (voir le tableau des matières) dans 50 mL d’eau stérile.
REMARQUE : La poudre de désoxycholate de sodium a été pesée dans une chambre de tirage de laboratoire générale pour empêcher la dispersion en suspension dans l’air. - Dissoudre les ingrédients (étape 2.1.) à l’aide d’un agitateur magnétique pour préparer le CS.
NOTE: La présente étude a utilisé une solution de compensation préparée en interne (CS), mais une solution de compensation disponible dans le commerce, ClearSee (voir le tableau des matériaux), peut également être utilisée. - Transférer le CS dans un tube conique de 50 ml et le conserver à température ambiante (15-30 °C) dans l’obscurité.
REMARQUE: Le CS peut être stocké pendant plus de 1 an.
3. Échantillonnage
- Coupez soigneusement les racines sans endommager les plantes. Lavez les plantes avec de l’eau pour enlever la saleté.
NOTE: Cette méthode a étudié l’observation des tissus du stade à trois feuilles (LS) au drapeau LS. La présente étude a utilisé les cultivars de riz Nipponbare (Nip) et Taichung 65 (T65) au 8-10 LS. - Décollez les vieilles feuilles extérieures avec les mains et la pince à épiler. Il restait environ 2-3 feuilles.
- Coupez le tissu de la chatte SAM/jeune à la base à l’aide d’un rasoir à simple tranchant en effectuant un mouvement de glissement pour éviter d’écraser les cellules (Figure 1A-C). Si la position de la SAM/jeune panicule n’est pas visible, coupez-la plus longtemps.
- Puisque la section transversale de la pousse de riz a une forme ovale (figure 1D), raser un côté de l’ovale finement dans la direction de son axe long avec un rasoir à double tranchant (figure 1E-F).
REMARQUE : Cette étape a facilité la pénétration de la solution fixatrice dans l’échantillon. Une surface de coupe horizontale facilite l’adhérence de l’échantillon à un plateau vibrant de micro-trancheuse (voir Tableau des matériaux). - Confirmer la position de la SAM/jeune panicule par l’apparition d’une couleur blanchâtre dans l’échantillon (Figure 1G). Coupez l’excès de tissu.
REMARQUE : La longueur de l’échantillon doit être ajustée à la longueur maximale qui peut être coupée à l’aide d’une microtrancheuse vibrante. Si l’échantillon est trop long, divisez-le en plusieurs morceaux.
4. Fixation des échantillons
- Pipeter 1 mL de la solution fixatrice (préparée à l’étape 1.) dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL et immédiatement mettre dans les échantillons.
NOTE: Assurez-vous que la quantité d’échantillon ne dépasse pas 20% du volume de la solution fixatrice. - Couper un morceau de film de paraffine en 2,5 cm2. Façonnez le film de paraffine en boules et placez-les sur les échantillons pour les empêcher de flotter hors de la solution fixatrice.
- Placer le tube contenant l’échantillon dans un dessiccateur. Ensuite, fermez le couvercle du dessiccateur et démarrez la pompe à vide pour dépressuriser lentement l’intérieur du dessiccateur jusqu’à -0,095 MPa.
- Après avoir fermé le dessiccateur à -0,095 MPa, éteignez la pompe à vide et laissez-la reposer pendant 30 minutes à température ambiante.
NOTE: Le niveau de vide était tel que des bulles sont apparues progressivement dans les échantillons. - Ouvrez légèrement le dessiccateur et ramenez-le lentement à la pression atmosphérique. Réduire la pression du dessiccateur à −0,095 MPa, éteindre la pompe à vide et laisser reposer le mélange pendant 30 minutes à température ambiante.
- Ouvrez légèrement le dessiccateur et ramenez-le lentement à la pression atmosphérique. Si l’échantillon est correctement fixé, il s’enfonce dans la solution fixatrice. S’il ne coule pas, réduisez à nouveau la pression.
- Retirez le film de paraffine, fermez le couvercle et maintenez les tubes pendant la nuit à 4 °C.
NOTE: Les échantillons ont été fixés dans une solution fixatrice pendant au moins 2 heures. Il peut être stocké pendant ~ 1 semaine.
5. Découpage de l’échantillon fixe
- Retirer l’excès de solution fixatrice de l’échantillon à l’aide de lingettes non pelucheuses.
REMARQUE: L’excès de solution fixatrice empêche l’échantillon de coller correctement sur le plateau. - Fixez l’échantillon sur un plateau micro-trancheur vibrant avec de la colle instantanée. Placez-le sur un plateau avec le côté plat vers le bas, qui a été rasé pendant l’échantillonnage.
REMARQUE: En raison de la structure de la pousse de riz, elle doit être coupée de la base vers la SAM / jeune panicule. - Réglez les conditions de parage en fonction de l’échantillon fixé.
REMARQUE : Dans cette étude, le parage a été réglé à ÉPAISSEUR, 130 μm; LARGE, 15 mm; FRÉQUENCE, 15 %; et VITESSE DE COUPE, 32 mm. - Ajustez la position de l’échantillon à l’aide du bouton RVS ou FWD et du bouton HAUT ou BAS . Remplissez le plateau avec de l’eau désionisée jusqu’à ce que tous les échantillons soient immergés. Après avoir rempli le plateau, appuyez sur le bouton START . Placez les échantillons coupés sur une lame de verre avec une goutte de 1x PBS.
REMARQUE: Déplacez la position de l’échantillon de l’autre côté après chaque rognage, car l’échantillon dur use la lame du rasoir. - Après avoir vérifié l’échantillon contenant le site cible au stéréomicroscope, transférer l’échantillon paré dans une plaque multipuits avec 1 mL de 1x PBS.
NOTE: Choisissez le nombre de puits en fonction de la taille de l’échantillon. Dans cette étude, une plaque multipuits de 12 puits a été utilisée.
6. Traitement avec la solution de compensation
- Retirez le 1x PBS de la plaque multipuits et ajoutez 1x PBS frais. Laisser reposer pendant 1 min.
- Supprimez 1x PBS et ajoutez le CS.
REMARQUE : La quantité de CS doit être cinq fois supérieure au volume de l’échantillon. - Placer la plaque multipuits contenant l’échantillon dans un dessiccateur. Ensuite, fermez le couvercle du dessiccateur et démarrez la pompe à vide pour dépressuriser lentement l’intérieur du dessiccateur jusqu’à -0,09 MPa.
- Après avoir fermé le dessiccateur à -0,09 MPa, éteignez la pompe à vide et laissez-la reposer pendant 1 h à température ambiante.
- Ouvrez légèrement le dessiccateur et ramenez-le lentement à la pression atmosphérique.
- Versez de l’eau désionisée dans l’espace entre les puits pour empêcher l’évaporation du CS. Stockez les plaques multipuits à température ambiante dans l’obscurité pour le nettoyage.
REMARQUE: Agiter doucement la plaque multipuits tous les 1-2 jours pour diffuser la chlorophylle et d’autres composants. - Lorsque le CS devient vert, remplacez-le par une solution fraîche.
7. Coloration de la paroi cellulaire avec un colorant chimique
- Pipeter la solution de blanc de calcofluor (1 mL, concentration finale : 1 mg/mL dans la solution de dégagement, voir le tableau des matériaux) dans une plaque multipuits. Placer les échantillons dans la solution de colorant et incuber pendant 1 h.
NOTE: Le volume du colorant ne doit pas dépasser 10% du volume du CS. - Laver les échantillons colorés dans une autre plaque multipuits avec 1 mL de CS pendant au moins 1 h.
8. Observation au microscope laser confocal
- Placez une goutte de CS sur une lame de microscope et transférez les échantillons traités (avec CS) sur la lame.
NOTE: Comme les échantillons traités sont mous, ils doivent être manipulés avec précaution avec une pince à épiler. - Couvrir l’échantillon avec une lamelle de couverture en verre pour empêcher l’évaporation du CS.
REMARQUE: Le CS précipite facilement. - Observer les échantillons traités au microscope confocale laser.
REMARQUE : Après observation, les échantillons traités peuvent être retournés au CS pour d’autres observations ultérieures.
Representative Results
Tout d’abord, la mesure dans laquelle les tissus durs et épais des plants de riz adultes pouvaient être rendus transparents par le traitement de défrichement a été validée. Nip au 9-10 LS, qui est le stade de formation des panicules, et des tissus de 12-16 mm de long découpés de la jeune panicule à la base de la pousse ont été utilisés. Ces échantillons, y compris la jeune panicule, ont été fixés dans la solution fixatrice et observés avant et après 1 à 4 semaines du traitement de clairage (Figure 2). Les échantillons non taillés sont restés verts et ne sont pas devenus transparents après 4 semaines ni même après 3 mois de traitement avec la solution de clairage (Figure 2A). Dans les échantillons qui ont été décollés de toutes les feuilles, les entre-nœuds sont devenus blancs après 1 semaine de traitement avec le CS, bien que les nœuds soient restés verts. Cet échantillon n’est pas devenu transparent après 4 semaines (figure 2B). Après 3 mois de traitement avec le CS, seule la jeune panicule est devenue transparente. Les échantillons taillés à la main sont passés au blanc, à l’exception des feuilles extérieures et des faisceaux vasculaires, après 1 semaine de traitement avec le CS. Certaines parties des feuilles, la jeune panicule et les entre-nœuds sont devenus translucides mais ne sont pas devenus transparents après 4 semaines (figure 2C). Après 3 mois, seules la jeune panicule et les feuilles internes sont devenues transparentes. Les échantillons qui ont été coupés à 130 μm d’épaisseur avec la micro-trancheuse vibrante sont devenus translucides après 1 semaine de traitement avec le CS, les feuilles devenant transparentes. Après 2 semaines, l’échantillon était presque transparent et est resté inchangé après 4 semaines (Figure 2D). Après 3 mois, les échantillons sont devenus complètement transparents.
Ensuite, la profondeur à laquelle le traitement de nettoyage a permis d’observer l’expression génique dans la pousse de T65 au 8 LS a été validée. Les pousses exprimées UBQpro:: NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro ::NGCN, voir le tableau des matériaux) ont été utilisées. Les échantillons de tissus ont été fixés dans la solution fixatrice avant de les tailler à 130 μm d’épaisseur à l’aide d’une micro-trancheuse vibrante. Les échantillons ont ensuite été observés sous un microscope laser confocal (laser : 488 nm/13 %, objectif : 20x, trou d’épingle : 0,93 UA, moyenne : 16, gain du détecteur : 800) à des intervalles de 10 μm dans la direction de l’axe z chaque semaine de 0 à 4 semaines de traitement avec le CS. Les résultats représentatifs sont présentés à la figure 3. Toutes les figures ont été ajustées avec le même traitement pour comparer l’intensité de fluorescence. Dans le nœud sans traitement, de faibles signaux fluorescents ont été observés à une profondeur de −40 μm (figure 3A). La profondeur observable était de -60 μm après 1 semaine de traitement par CS et de -90 μm après 2 semaines, mais l’auto-fluorescence du cytoplasme était perceptible aux deux semaines à une profondeur de −20 μm. L’autofluorescence est devenue un peu plus faible après 3 semaines et n’était plus visible après 4 semaines. Des signaux fluorescents ont été observés à une profondeur de −80 μm à 3 semaines et à une profondeur de −100 μm à 4 semaines. Dans l’entre-nœud, des signaux fluorescents ont été observés à une profondeur de −60 μm sans le traitement CS (figure 3B). La profondeur observable était de -90 μm après 1 semaine à 3 semaines de traitement par CS et de -100 μm après 4 semaines, mais l’autofluorescence dans le cytoplasme était perceptible à une profondeur de −20 μm après 1 semaine. L’auto-fluorescence n’était plus visible après 2 semaines. Dans les feuilles, des signaux fluorescents ont été observés à une profondeur de −90 μm sans le traitement CS (Figure 3C). Les signaux fluorescents ont été observés plus profondément dans les feuilles que dans les nœuds et les entre-nœuds. Cependant, les signaux fluorescents étaient plus faibles. Les signaux fluorescents sont devenus clairs après 1 semaine de traitement CS et ont été observés à une profondeur de −120 μm. Après 2 semaines et 3 semaines, des signaux fluorescents ont été observés à une profondeur de −110 μm et, après 4 semaines, à une profondeur de −120 μm.
Enfin, l’expression du facteur de transcription OsMADS1511 fusionné avec mOrange 12 a été observée, qui régule le passage de la SAM de la phase végétative à la phase reproductive13. Des échantillons de tissus de Nip au 10 LS avec OsMADS15-mOrange ont été fixés, parés à 130 μm d’épaisseur et traités avec le CS pendant 2 semaines. La figure 4 montre que la solution de compensation pourrait être utilisée simultanément pour observer les protéines fluorescentes (OsMADS15-mOrange) de l’expression génique naturelle et de la coloration fluorescente (blanc de calcofluor). Le fleuron entier à des profondeurs de 0 à −130 μm a été observé, et l’image 3D a été reconstruite à partir de 43 images z-stack à des intervalles de 3 μm (Figure 4E).
Figure 1: Position d’échantillonnage et traitement. (A) Nip semis à la 8 LS dans les conditions de jours courts. (B) Vue agrandie de la base. (C) Un échantillon découpé de la panicule SAM/jeune à la base. (D) Une coupe transversale ovale à partir de C (encadré). (E) Rasage fin d’un côté de la pousse avec une lame. F) Surface finement rasée. G) Échantillon montrant l’allongement entre les nœuds. La section blanchâtre indiquée par les pointes de flèches est constituée de nœuds. La face supérieure du nœud supérieur a la jeune panicule. Barres d’échelle: (A) 10 cm, (B-C,E-G) 1 cm, (D) 0,5 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Le nettoyage des tissus dépend de l’épaisseur de l’échantillon et de la période de traitement CS. (A) Échantillons non parés avec pousses partielles, y compris la jeune panicule. Épaisseur maximale: 4 mm. (B) Toutes les feuilles sont décollées des échantillons pour exposer la jeune panicule. Épaisseur maximale: 2,5 mm. yp: panicule jeune, in: entre-nœud; Les pointes de flèches indiquent le nœud. (C) Échantillons taillés à la main à 1 mm d’épaisseur. (D) Échantillons parés à l’aide de la microtrancheuse vibrante à 130 μm d’épaisseur. Barre d’échelle: 5 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : La profondeur d’observation de la fluorescence dépend du type de tissu et de la période de traitement CS. Imagerie profonde de UBQpro::NGCN dans le nœud (A), (B) inter-nœud et (C) feuille. « Fusionner » signifie que les images ont été fusionnées avec l’image DIC (différentielle d’interférence) et toutes les images z-stack. Les images dans lesquelles aucune fluorescence n’a été observée ont été marquées comme « s.d. ». (non détecté). Les réglages de la microscopie confocale laser sont les suivants : laser : 488 nm/13 %, objectif : 20x, trou d’épingle : 0,93 UA, moyenne : 16, gain du détecteur : 800, intervalle : 10 μm. Barres d’échelle: 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Observation en fluorescence profonde d’OsMADS15-mOrange. (A) L’image DIC de Nip au 10 LS. YP: Jeune panicule, Le: feuille, No: Nœud, In: Internoeud; Les pointes de flèches indiquent les fleurons. (B) Image de fluorescence de l’OsMADS15-mOrange. Les points jaunes indiquent les protéines fluorescentes d’OsMADS15-mOrange au niveau du noyau. La paroi cellulaire a été colorée cyan avec la solution blanche de calcofluor. (C) Vue agrandie de la jeune panicule. (D) Imagerie profonde du fleuron. PA: Palea, le: Lemma, FM: méristème floral; Les astérisques indiquent des étamines primordia. Le microscope confocale laser a été réglé comme suit : OsMADS15-mOrange ; laser: 555 nm/13%, objectif: 20x, trou d’épingle: 0,96 UA, moyenne: 16, gain du détecteur: 800, intervalle: 3 μm. Calcofluor blanc; laser: 405 nm/3%, objectif: 20x, trou d’épingle: 0,93 UA, moyenne: 16, gain du détecteur: 470, intervalle: 3 μm. (E) L’image 3D de la figure (D) construite à partir des images z-stack. Barres d’échelle: (A-B) 1 mm, (C) 500 μm, (D) 40 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Discussion
Étapes critiques du protocole
Les étapes critiques de ce protocole sont la fixation et le rognage. Les pousses de riz ont des tissus durs, épais ou stratifiés qui limitent la pénétration de la solution fixatrice. Pour améliorer la perméabilité de la solution fixatrice, un côté du tissu a été finement rasé lors de l’échantillonnage, comme le montre la figure 1E-F. De plus, les traitements sous vide ont été répétés deux fois en utilisant une pression plus élevée. En outre, les échantillons ont été fixés pendant une nuit à 4 °C au lieu de la fixation habituelle de 2 heures à 4 °C.
Le point clé de l’étape de parage est de déterminer l’épaisseur des tissus à préparer pour observer les protéines fluorescentes tout en préservant leur structure interne après une courte période de traitement CS. Comme le montre la figure 2C, les échantillons de 1 mm d’épaisseur, taillés à la main aussi fins que possible, ne sont devenus transparents que dans un nombre limité de tissus, même après 3 mois de traitement CS. Par conséquent, l’étape de taille est essentielle pour l’observation en fluorescence profonde des pousses de riz adultes. Dans cette étude, les échantillons ont été taillés à une épaisseur de 130 μm, comme le montre la figure 2D. L’épaisseur de 130 μm a permis de dégager les feuilles après 1 semaine de traitement CS et l’échantillon entier après 2 semaines. Des pousses de riz adultes au 9-10 LS ont été utilisées dans cette étude. Les tissus épais mais plus mous des jeunes pousses de riz peuvent être éliminés plus rapidement avec le traitement CS. L’épaisseur des échantillons et la durée du traitement CS doivent être ajustées en fonction du type de tissu, de l’état et de l’épaisseur de la structure 3D à observer.
Modifications et méthodes de dépannage
Le CS précipitait facilement à basse température. Le CS précipité ne peut pas préserver les protéines fluorescentes; Par conséquent, des précautions doivent être prises lors de la conservation des échantillons à la température appropriée. De plus, le CS et la solution fixatrice n’ont aucun effet antiseptique; Par conséquent, les protéines fluorescentes seront dégradées si elles sont contaminées. Le riz cultivé en terre est sujet à la croissance fongique; Par conséquent, l’échantillonnage et la manipulation des échantillons doivent être effectués avec soin pour éviter toute contamination.
L’excès de colorants fluorescents dans le tampon peut dégager une fluorescence de fond et interférer avec les observations microscopiques. Par exemple, une solution blanche de calcofluor contenant du colorant bleu Evans a déjà été utilisée. Après coloration pendant 1 h et lavage pendant 1 h, les protéines fluorescentes d’OsMADS15-mOrange ont été observées à l’aide d’un laser de 555 nm. Cependant, les protéines fluorescentes n’ont pas pu être observées en raison de la fluorescence de fond dérivée du colorant bleu Evans. Cette fluorescence de fond a été presque éliminée en lavant les échantillons pendant 2 h. De plus, les protéines fluorescentes étaient plus claires si les échantillons étaient laissés pendant la nuit. Par conséquent, une solution blanche de calcofluor pur a été utilisée dans cette étude. La fluorescence de fond dérivée du colorant fluorescent doit être vérifiée à l’aide de différentes longueurs d’onde laser avant les observations.
Limites de la méthode
Comme le montre la figure 3, des protéines fluorescentes profondes ont été observées dans les échantillons d’une épaisseur de 130 μm après 2 semaines de traitement par CS. Ceci est cohérent avec les résultats présentés à la figure 2D, où l’échantillon de 130 μm d’épaisseur est devenu transparent après 2 semaines de traitement CS. Cependant, comme le montre la figure 3A, l’auto-fluorescence du cytoplasme était encore perceptible dans les ganglions après 2 semaines et n’a été complètement retirée qu’après 4 semaines de traitement par CS. Les nœuds ont une densité cellulaire élevée et, par conséquent, nécessitent plus de temps pour éliminer les matériaux auto-fluorescents.
Comme le montre la figure 3C, des protéines fluorescentes profondes ont été observées dans les feuilles sans traitement CS, mais la luminosité était plus faible que celle des nœuds et des entre-nœuds à la même profondeur de 20 μm. Après 1 semaine de traitement CS, les protéines fluorescentes étaient plus brillantes. La chlorophylle est abondante dans les feuilles et absorbe 488 nm de lumière d’excitation. Ils ont également une auto-fluorescence orange / rouge, ce qui peut interférer avec l’observation des protéines fluorescentes à l’aide d’un laser de 555 nm. Après 1 semaine de traitement CS, la chlorophylle et d’autres matériaux auto-fluorescents ont été éliminés, ce qui a permis d’obtenir des images à rapport signal sur bruit élevé.
Les profondeurs qui ont pu être observées dans les tissus après 2 semaines et 4 semaines de traitement par CS n’étaient pas significativement différentes, bien que les protéines fluorescentes semblaient plus faibles après 4 semaines (Figure 3). Normalement, la luminosité des protéines fluorescentes et l’auto-fluorescence s’affaiblissent avec le temps, ce qui entraîne un rapport signal sur bruit plus élevé. Par conséquent, les protéines fluorescentes peuvent être observées plus clairement en ajustant les conditions microscopiques et le traitement de l’image. Sur la base de ces résultats, il a été conclu que 2 semaines de traitement par CS pourraient faciliter l’observation de protéines fluorescentes profondes, compte tenu de nos conditions d’échantillonnage. Cependant, 4 semaines sont nécessaires pour observer des images plus claires qui excluent complètement les matériaux auto-fluorescents.
Les structures à forte autofluorescence, telles que les faisceaux vasculaires et les cellules multibras, ne peuvent pas être éliminées dans le CS. Pour observer ces structures sans autofluorescence, il est nécessaire d’utiliser une méthode de time-gating12 ou d’obtenir des images par spectroscopie du spectre de fluorescence. Un microscope à deux photons peut être plus approprié pour observer des tissus plus profonds si des tissus plus épais sont observés.
Importance de la méthode par rapport aux méthodes existantes et alternatives
En général, les structures internes des plants de riz ont été observées à l’aide d’une section cryostat ou vibratome. Un cryostat convient à la préparation de sections minces, ce qui permet une observation plus facile, mais la préparation des échantillons et le fonctionnement de l’équipement prennent beaucoup de temps. Reconstruire la structure 3D d’origine à partir de sections minces est également difficile. Le vibratome est relativement facile à utiliser et convient à la production de sections épaisses. Cependant, les sections épaisses de tissus cibles ne permettent que d’observer la surface coupée et non les tissus profonds que la lumière ne peut atteindre. Pour ces raisons, aucune de ces méthodes ne convient aux observations par fluorescence profonde.
Cette étude a abordé les défis de l’observation de la fluorescence profonde dans les pousses de riz, tels que la pénétration tissulaire limitée du CS et la mauvaise résolution de l’objet sous un microscope confocal, en combinant les méthodes existantes. Comme le montre la figure 4, nous avons observé des protéines fluorescentes (OsMADS15-mOrange) exprimées dans les tissus profonds des pousses de riz adultes de la jeune panicule à la base. La figure 4D se concentre sur le fleuron et montre des protéines fluorescentes profondes à des intervalles de 3 μm. Des tissus à une profondeur supérieure à −130 μm ont été observés après 2 semaines de traitement par CS, mais seuls les tissus à une profondeur de −27 μm ont été observés (données non présentées) dans le fleuron à la même taille et au même stade de croissance sans traitement CS. Le protocole amélioré actuel a permis d’observer non seulement la surexpression des gènes, mais aussi l’expression naturelle des gènes dans les tissus profonds des pousses de riz adultes.
Importance et applications potentielles de la méthode dans des domaines de recherche spécifiques
Ce protocole, qui optimise l’observation en fluorescence profonde des pousses de riz adultes, permet le nettoyage efficace des tissus durs, épais ou stratifiés en coupant les tissus inutiles et en augmentant la perméabilité du CS. De plus, l’épaisseur des échantillons à analyser a été optimisée pour permettre une observation continue et structurelle de la fluorescence profonde à l’aide d’un microscope laser confocale, qui ne peut normalement pas résoudre les tissus épais ou opaques.
Il est difficile de comparer des échantillons de riz à différents stades de croissance car les protéines fluorescentes se dégradent avec le temps dans les solutions fixatrices et PBS. Cependant, les protéines fluorescentes du CS peuvent être conservées pendant plus de 5 mois1. La longue durée de conservation du CS est un avantage majeur pour l’observation en fluorescence profonde dans le riz.
Récemment, de nombreuses technologies de nettoyage ont été développées, permettant d’observer des tissus profonds en 3D tout en préservant leurs structures internes. Ces technologies ont continué d’évoluer et de nouvelles solutions de compensation ont été développées. Un bon exemple est iTOMEI14, qui permet une élimination efficace de la chlorophylle et une détection de fluorescence plus brillante. Un autre exemple est ClearSeeAlpha15, qui empêche le brunissement des tissus pendant le traitement de nettoyage et les rend transparents. La combinaison de ces solutions de compensation avec la méthode actuelle peut permettre une compensation plus efficiente et efficace.
On s’attend à ce que la méthode actuelle aide à acquérir de nouvelles connaissances grâce à l’imagerie approfondie non seulement du riz, mais aussi d’autres plantes.
Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr R. Terada, le Dr Z. Shimatani et le Dr H. Tsuji de nous avoir fourni les graines OsMADS15-mOrange; Dr. D. Kurihara pour nous avoir fourni la construction du NGCN; et le Dr R. Shim pour l’édition de notre manuscrit. Ce travail a été financé par JSPS KAKENHI (numéros de subvention JP20H05912, 20H05778, 20H05779) et par le programme SATREPS (no. JPMJSA1706) de la JST et de la JICA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | BIO-BIK | ST-0150F | |
| 12-multiwell plate | Corning | 353043 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 352070 | |
| Calcofluor white solution | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| ClearSee | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 031-25151 | This can be made or purchased. |
| Confocal laser microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Desiccator | SANPLATEC | Custom made of acrylic. 30 cm (L), 30 cm (W), 14.5 cm (H) | |
| Glass coverslip (18 × 18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
| HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 342-01375 | |
| Microscope slide (76 × 26) | MATSUNAMI | S2441 | |
| Paraffin film | Bemis | PM-996 | |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 162-16065 | |
| Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-00013 | |
| UBQpro::NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro::NGCN) | provided by Dr. Kurihara | ||
| Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
| Vacuum pump | AS One | AS-01 | |
| Vibrating micro-slicer | DOSAKA | DTK-3000 | |
| Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |
References
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