Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल चावल की शूटिंग के लिए एक समाशोधन तकनीक का वर्णन करता है, जो ऊतकों की कठोर, मोटी या स्तरित प्रकृति के कारण आंतरिक संरचनात्मक टिप्पणियों के लिए तैयार करना मुश्किल है। यह विधि वयस्क चावल के पौधों में भी निरंतर और गहरी प्रतिदीप्ति टिप्पणियों की सुविधा प्रदान करती है।
Abstract
हाल ही में विकसित समाशोधन तकनीक जो अपवर्तक सूचकांक बेमेल को समाप्त करती है और ऑटो-फ्लोरोसेंट सामग्री को कम करती है, ने अपनी आंतरिक संरचनाओं को संरक्षित करते हुए तीन आयामों (3 डी) में पौधों के ऊतकों का निरीक्षण करना संभव बना दिया है। चावल (ओरिज़ा सैटिवा एल), एक मोनोकोट मॉडल प्लांट और विश्व स्तर पर महत्वपूर्ण फसल में, उन अंगों में समाशोधन तकनीक की सूचना दी गई है जो अपेक्षाकृत आसान हैं, जैसे कि जड़ें और पत्तियां। शूट एपिकल मेरिस्टेम (एसएएम) और उपजी में समाशोधन तकनीक के अनुप्रयोगों की भी सूचना दी गई है, लेकिन इन ऊतकों में समाशोधन समाधान (सीएस) के खराब प्रवेश के कारण केवल सीमित डिग्री तक। इन ऊतकों में समाशोधन समाधानों की सीमित दक्षता को स्टेम में ऊतकों के ऑटो-प्रतिदीप्ति, मोटा होना और सख्त होने के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है क्योंकि संवहनी बंडल और एपिडर्मिस पानी-विकर्षक पत्तियों के साथ एसएएम के विकास और लेयरिंग के रूप में जिम्मेदार ठहराया गया है। वर्तमान प्रोटोकॉल विकास के दौरान शूटिंग के आधार पर एसएएम / युवा पुष्पगुच्छ से जीन अभिव्यक्ति के निरंतर और 3 डी अवलोकन के लिए एक समाशोधन दृष्टिकोण के अनुकूलन की रिपोर्ट करता है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन रिपोर्टर को व्यक्त करने वाले फिक्स्ड ऊतक के नमूनों को एक कंपन माइक्रो-स्लाइसर का उपयोग करके वर्गों में छंटनी की गई थी। जब एक उपयुक्त मोटाई हासिल की गई थी, तो सीएस लागू किया गया था। विशेष रूप से केंद्रीय ऊतक को लक्षित करके, सीएस की प्रवेश दर और एकरूपता में वृद्धि हुई, और ऊतक को पारदर्शी बनाने के लिए आवश्यक समय कम हो गया। इसके अतिरिक्त, छंटनी किए गए वर्गों के समाशोधन ने मैक्रो परिप्रेक्ष्य से पूरे शूट की आंतरिक संरचना के अवलोकन को सक्षम किया। इस पद्धति में अन्य पौधों की प्रजातियों के ऊतकों की गहरी इमेजिंग में संभावित अनुप्रयोग हैं जिन्हें साफ़ करना मुश्किल है।
Introduction
हाल ही में विकसित समाशोधन तकनीक ने पौधों की आंतरिक संरचना 1,2,3 को संरक्षित करते हुए उनके गहरे ऊतकों का निरीक्षण करना संभव बना दिया है। डायकोट मॉडल प्लांट अरबिडोप्सिस में, फ्लोरोसेंट प्रोटीन इमेजिंग पर कई अध्ययन अपवर्तक सूचकांक बेमेल को खत्म करने और ऑटो-फ्लोरोसेंट सामग्री 4,5,6 को हटानेके लिए समाशोधन तकनीक का उपयोग करके आयोजित किए गए हैं। यद्यपि सेलुलर रिज़ॉल्यूशन9 पर समाशोधन तकनीक 7,8 और 3 डी इमेजिंग का उपयोग चावल (ओरिज़ा सैटिवा एल), एक मोनोकोट मॉडल प्लांट और विश्व स्तर पर महत्वपूर्ण फसल में बताया गया है, ये अपेक्षाकृत पतले और नरम अंगों तक सीमित हैं, जैसे जड़ें, पत्तियां, और शूट एपिकल मेरिस्टेम (एसएएम), जिन्हें निरीक्षण करना आसान है।
शूट संवहनी पौधों के उपरोक्त भागों का गठन करने वाला मुख्य अंग है। चावल में, शूट लंबवत स्टैक्ड "फाइटोमर्स" की एक श्रृंखला से बने होते हैं, जिसमें एक्सिलरी कलियां, पत्तियां और स्टेम10 शामिल होते हैं। शूट की नोक पर, एसएएम केंद्र में उदासीन स्टेम कोशिकाओं से बना है। फाइटोमर्स एसएएम से प्राप्त कोशिकाओं के भेदभाव से बनते हैं। पौधों को वनस्पति से प्रजनन चरण में स्थानांतरित करने के बाद, चावल के तने लम्बे हो जाते हैं और एसएएम युवा पुष्पगुच्छ10 में अंतर करता है। यह विकासात्मक परिवर्तन उपजी और एसएएम / युवा पुष्पगुच्छ में विभिन्न जीनों की अभिव्यक्ति में उतार-चढ़ाव के साथ होता है। विभिन्न ऊतकों में सेल भेदभाव अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए, आंतरिक शूट ऊतकों में सेल आकृति विज्ञान और जीन अभिव्यक्ति का संरचनात्मक रूप से निरीक्षण करना महत्वपूर्ण है। हालांकि, शूट में उपजी (नोड्स और इंटर्नोड्स) की गहरी इमेजिंग ऊतक में प्रवेश करने के लिए समाशोधन समाधान की अक्षमता के कारण एक चुनौती प्रस्तुत करती है। स्टेम तुरंत एसएएम से भेदभाव के बाद पार्श्व विकास से तेजी से मात्रा में वृद्धि से गुजरते हैं। संवहनी बंडलों के मोटा होने और नोडल संवहनी एनास्टोमोसिस के क्षैतिज जटिल लिंक के कारण चावल नोड ऊतकों का सख्त होना, चावल की शूटिंग की उच्च पुनरावृत्ति के अलावा, सभी उपजी10 में सीएस के प्रवेश को सीमित करने में योगदान करते हैं।
इस अध्ययन का उद्देश्य संरचनात्मक गहरी प्रतिदीप्ति तकनीक का उपयोग करके चावल शूट ऊतकों में जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का निरीक्षण करना था। यह काम चावल के लिए एक समाशोधन प्रोटोकॉल का अनुकूलन करता है ताकि एसएएम / युवा पुष्पगुच्छ से 3 डी संरचना में आधार तक जीन अभिव्यक्ति का लगातार निरीक्षण किया जा सके, बजाय एक सपाट सतह पर, एक कॉन्फोकल लेजर माइक्रोस्कोप का उपयोग करके।
Protocol
1. फिक्सेटिव समाधान की तैयारी
- एक कांच की बोतल में बाँझ पानी के 70 मिलीलीटर स्थानांतरण और पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 10 ग्राम जोड़ें।
सावधानी: पीएफए विषाक्त है; इसलिए, दस्ताने पहनने की सिफारिश की जाती है। - पीएफए समाधान को भंग करने के लिए 1 एन एनएओएच के 2 एमएल जोड़ें।
- पीएफए समाधान पारदर्शी होने तक लगभग 1 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर निरंतर सरगर्मी (300-500 आरपीएम) के साथ पीएफए समाधान को भंग करें।
- पीएफए समाधान की मात्रा को 100 एमएल तक बढ़ाने के लिए निष्फल पानी जोड़ें।
नोट: पीएफए समाधान उपयोग से पहले ताजा तैयार किया गया था। इसके अलावा, 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत एक पीएफए समाधान का उपयोग लगभग 2 महीने तक किया जा सकता है। - नमूने लेने से तुरंत पहले, 50 एमएल फिक्सेटिव समाधान तैयार करने के लिए 60 एमएम एचईपीईएस (पीएच 7.4), 1 एम सुक्रोज के 3 एमएल, और 10% पीएफए के 20 एमएल में बाँझ पानी के 25 एमएल जोड़ें।
2. समाशोधन समाधान की तैयारी (सीएस)
- 50 मिलीलीटर बाँझ पानी में 7.5 ग्राम सोडियम डीऑक्सीकोलेट, 5 ग्राम जाइलिटोल और 12.5 ग्राम यूरिया ( सामग्री की तालिका देखें) का वजन और मिश्रण करें।
नोट: सोडियम डीऑक्सीकोलेट पाउडर को हवाई फैलाव को रोकने के लिए एक सामान्य प्रयोगशाला ड्राफ्ट चैंबर में तौला गया था। - सीएस तैयार करने के लिए चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग करके सामग्री (चरण 2.1.) को भंग करें।
नोट: वर्तमान अध्ययन में इन-हाउस तैयार समाशोधन समाधान (सीएस) का उपयोग किया गया है, लेकिन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध समाशोधन समाधान, क्लियरसी ( सामग्री की तालिका देखें), का भी उपयोग किया जा सकता है। - सीएस को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे अंधेरे में कमरे के तापमान (15-30 डिग्री सेल्सियस) पर स्टोर करें।
नोट: सीएस को 1 वर्ष से अधिक समय तक संग्रहीत किया जा सकता है।
3. नमूनाकरण
- पौधों को नुकसान पहुंचाए बिना जड़ों को सावधानी से काटें। गंदगी हटाने के लिए पौधों को पानी से धोएं।
नोट: इस विधि ने एलएस को ध्वजांकित करने के लिए तीन-पत्ती चरण (एलएस) से ऊतकों के अवलोकन का अध्ययन किया। वर्तमान अध्ययन में 8-10 एलएस में चावल की खेती निप्पोनबारे (एनआईपी) और ताइचुंग 65 (टी 65) का उपयोग किया गया था। - हाथों और चिमटी से पुरानी बाहरी पत्तियों को छील लें। लगभग 2-3 पत्ते बचे थे।
- कोशिकाओं (चित्रा 1 ए-सी) को कुचलने से बचने के लिए एक स्लाइडिंग गति का उपयोग करके एक एकल धार वाले रेजर के साथ आधार पर एसएएम / यदि एसएएम / युवा पुष्पगुच्छ की स्थिति दिखाई नहीं देती है, तो इसे लंबे समय तक काट लें।
- चूंकि चावल शूट के क्रॉस-सेक्शन में एक अंडाकार आकार (चित्रा 1 डी) होता है, इसलिए अंडाकार के एक तरफ को दोधारी रेजर (चित्रा 1 ई-एफ) के साथ अपनी लंबी धुरी की दिशा में पतला करें।
नोट: इस कदम ने फिक्सेटिव समाधान के लिए नमूना में प्रवेश करना आसान बना दिया। एक क्षैतिज काटने की सतह नमूने को एक कंपन माइक्रो-स्लाइसर ( सामग्री की तालिका देखें) ट्रे से चिपकने में आसान बनाती है। - नमूने (चित्रा 1 जी) में एक सफेद रंग की उपस्थिति से एसएएम / युवा पुष्पगुच्छ की स्थिति की पुष्टि करें। अतिरिक्त ऊतक को ट्रिम करें।
नोट: नमूने की लंबाई को अधिकतम लंबाई में समायोजित किया जाना चाहिए जिसे कंपन माइक्रो-स्लाइसर का उपयोग करके छंटनी की जा सकती है। यदि नमूना बहुत लंबा है, तो इसे कई टुकड़ों में विभाजित करें।
4. नमूनों का निर्धारण
- एक 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब के लिए फिक्सेटिव समाधान (चरण 1 में तैयार) के पिपेट 1 एमएल और तुरंत नमूनों में डाल दिया।
नोट: सुनिश्चित करें कि नमूने की मात्रा फिक्सेटिव समाधान की मात्रा के 20% से अधिक नहीं है। - पैराफिन फिल्म का एक टुकड़ा 2.5 सेमी2 में काटें। पैराफिन फिल्म को गेंदों में आकार दें और उन्हें फिक्सेटिव समाधान से बाहर निकलने से रोकने के लिए नमूनों के शीर्ष पर रखें।
- एक डिसिकेटर में नमूना युक्त ट्यूब रखें। फिर, डिसिकेटर के ढक्कन को बंद करें और धीरे-धीरे -0.095 एमपीए तक डिसिकेटर के अंदर को अवसादग्रस्त करने के लिए वैक्यूम पंप शुरू करें।
- -0.095 एमपीए पर डिसिकेटर को बंद करने के बाद, वैक्यूम पंप बंद करें और इसे कमरे के तापमान पर 30 मिनट तक खड़े होने दें।
नोट: वैक्यूम स्तर ऐसा था कि बुलबुले धीरे-धीरे नमूनों में दिखाई दिए। - डिसिकेटर को थोड़ा खोलें और धीरे-धीरे इसे वायुमंडलीय दबाव में वापस करें। -0.095 एमपीए के लिए डिसिकेटर के दबाव को कम करें, वैक्यूम पंप बंद करें, और मिश्रण को कमरे के तापमान पर 30 मिनट तक खड़े होने दें।
- डिसिकेटर को थोड़ा खोलें और धीरे-धीरे इसे वायुमंडलीय दबाव में वापस करें। यदि नमूना सही ढंग से तय किया गया है, तो यह फिक्सेटिव समाधान में डूब जाता है। यदि यह डूबता नहीं है, तो दबाव को फिर से कम करें।
- पैराफिन फिल्म निकालें, ढक्कन बंद करें, और ट्यूबों को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
नोट: नमूने कम से कम 2 घंटे के लिए फिक्सेटिव समाधान में तय किए गए थे। इसे ~ 1 सप्ताह के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।
5. तय नमूना ट्रिमिंग
- लिंट-मुक्त पोंछे का उपयोग करके नमूने से अतिरिक्त फिक्सेटिव समाधान निकालें।
नोट: अतिरिक्त फिक्सेटिव समाधान ट्रे पर ठीक से चिपकने से नमूना रोकता है। - तत्काल गोंद के साथ एक कंपन माइक्रो-स्लाइसर ट्रे पर नमूना ठीक करें। इसे फ्लैट साइड के साथ एक ट्रे पर रखें, जिसे नमूने के दौरान मुंडा दिया गया था।
नोट: चावल शूट की संरचना के कारण, इसे आधार से एसएएम / युवा पुष्पगुच्छ की ओर छंटनी की जानी चाहिए। - निश्चित नमूने के अनुसार ट्रिमिंग स्थितियों को सेट करें।
नोट: इस अध्ययन में, ट्रिमिंग को मोटी, 130 μm पर सेट किया गया था; वाइड, 15 मिमी; आवृत्ति, 15%; और काटने की गति, 32 मिमी। - आरवीएस या एफडब्ल्यूडी बटन और ऊपर या नीचे बटन के साथ नमूना स्थिति समायोजित करें। ट्रे को विआयनीकृत पानी से भरें जब तक कि सभी नमूने डूब न जाएं। ट्रे भरने के बाद स्टार्ट बटन दबाएं। 1x पीबीएस की एक बूंद के साथ एक ग्लास स्लाइड पर छंटनी नमूने रखें।
नोट: कठिन नमूना रेजर ब्लेड पहनता है के बाद से प्रत्येक ट्रिमिंग के बाद दूसरी तरफ नमूना की स्थिति शिफ्ट। - स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत लक्ष्य साइट युक्त नमूने की जांच करने के बाद, छंटनी किए गए नमूने को 1 एक्स पीबीएस के 1 एमएल के साथ मल्टीवेल प्लेट में स्थानांतरित करें।
नोट: नमूने के आकार के अनुसार कुओं की संख्या चुनें। इस अध्ययन में, एक 12-मल्टीवेल प्लेट का उपयोग किया गया था।
6. समाशोधन समाधान के साथ उपचार
- मल्टीवेल प्लेट से 1 एक्स पीबीएस निकालें और ताजा 1 एक्स पीबीएस जोड़ें। इसे 1 मिनट के लिए छोड़ दें।
- 1x पीबीएस निकालें और सीएस जोड़ें।
नोट: सीएस की मात्रा नमूना मात्रा का पांच गुना होना चाहिए। - नमूने वाले मल्टीवेल प्लेट को एक डेसिकेटर में रखें। फिर, डिसिकेटर के ढक्कन को बंद करें और धीरे-धीरे -0.09 एमपीए तक डिसिकेटर के अंदर को निराश करने के लिए वैक्यूम पंप शुरू करें।
- -0.09 एमपीए पर डिसिकेटर को बंद करने के बाद, वैक्यूम पंप को बंद कर दें और इसे कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए खड़े होने दें।
- डिसिकेटर को थोड़ा खोलें और धीरे-धीरे इसे वायुमंडलीय दबाव में वापस करें।
- सीएस के वाष्पीकरण को रोकने के लिए कुओं के बीच की खाई में विआयनीकृत पानी डालें समाशोधन के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर मल्टीवेल प्लेटों को स्टोर करें।
नोट: क्लोरोफिल और अन्य घटकों को फैलाने के लिए हर 1-2 दिनों में मल्टीवेल प्लेट को धीरे से हिलाएं। - जब सीएस हरा हो जाता है, तो इसे ताजा समाधान के साथ बदलें।
7. रासायनिक डाई के साथ सेल की दीवार धुंधला
- कैल्कोफ्लोर सफेद समाधान (1 एमएल, अंतिम एकाग्रता: समाशोधन समाधान में 1 मिलीग्राम / एमएल, सामग्री की तालिका देखें) को मल्टीवेल प्लेट में पाइप करें। डाई समाधान में नमूने रखें और 1 घंटे के लिए सेते हैं।
नोट: डाई की मात्रा सीएस की मात्रा के 10% से अधिक नहीं होनी चाहिए। - कम से कम 1 घंटे के लिए सीएस के 1 एमएल के साथ एक और मल्टीवेल प्लेट में दाग वाले नमूनों को धो लें।
8. एक कॉन्फोकल लेजर माइक्रोस्कोप के साथ अवलोकन
- एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर सीएस की एक बूंद रखें और स्लाइड पर इलाज (सीएस के साथ) नमूनों को स्थानांतरित करें।
नोट: जैसा कि इलाज किए गए नमूने नरम हैं, उन्हें चिमटी के साथ सावधानीपूर्वक संभाला जाना चाहिए। - सीएस के वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक ग्लास कवरस्लिप के साथ नमूना कवर करें।
नोट: सीएस आसानी से अवक्षेपित होता है। - एक कॉन्फोकल लेजर माइक्रोस्कोप के तहत इलाज किए गए नमूनों का निरीक्षण करें।
नोट: अवलोकन के बाद, इलाज किए गए नमूनों को बाद में आगे की टिप्पणियों के लिए सीएस में लौटाया जा सकता है।
Representative Results
सबसे पहले, समाशोधन उपचार द्वारा वयस्क चावल के पौधों के कठोर और मोटे ऊतकों को पारदर्शी बनाने की सीमा को मान्य किया गया था। 9-10 एलएस पर निप, जो पुष्पगुच्छ गठन चरण है, और युवा पुष्पगुच्छ से शूट के आधार तक काटे गए 12-16 मिमी लंबे ऊतकों का उपयोग किया गया था। युवा पुष्पगुच्छ सहित इन नमूनों को फिक्सेटिव समाधान में तय किया गया था और समाशोधन उपचार (चित्रा 2) के 1-4 सप्ताह से पहले और बाद में मनाया गया था। अनियंत्रित नमूने हरे बने रहे और 4 सप्ताह के बाद या समाशोधन समाधान (चित्रा 2 ए) के साथ उपचार के 3 महीने बाद भी पारदर्शी नहीं हुए। सभी पत्तियों को छीलने वाले नमूनों में, सीएस के साथ 1 सप्ताह के उपचार के बाद इंटर्नोड सफेद हो गए, हालांकि नोड्स हरे बने रहे। यह नमूना 4 सप्ताह (चित्रा 2 बी) के बाद पारदर्शी नहीं हुआ। सीएस के साथ उपचार के 3 महीने बाद, केवल युवा पुष्पगुच्छ पारदर्शी हो गया। सीएस के साथ 1 सप्ताह के उपचार के बाद, बाहरी पत्तियों और संवहनी बंडलों को छोड़कर हाथ से छंटनी किए गए नमूने सफेद रंग में बदल गए। पत्तियों के कुछ हिस्से, युवा पुष्पगुच्छ, और इंटर्नोडपारभासी हो गए लेकिन 4 सप्ताह (चित्रा 2 सी) के बाद पारदर्शी नहीं हुए। 3 महीने के बाद, केवल युवा पुष्पगुच्छ और आंतरिक पत्तियां पारदर्शी हो गईं। कंपन माइक्रो-स्लाइसर के साथ 130 μm मोटाई तक छंटनी किए गए नमूने सीएस के साथ 1 सप्ताह के उपचार के बाद पारदर्शी हो गए, जिसमें पत्तियां पारदर्शी हो गईं। 2 सप्ताह के बाद, नमूना लगभग पारदर्शी था और 4 सप्ताह (चित्रा 2 डी) के बाद अपरिवर्तित रहा। 3 महीने के बाद, नमूने पूरी तरह से पारदर्शी हो गए।
अगला, जिस गहराई से समाशोधन उपचार ने 8 एलएस पर टी 65 की शूटिंग में जीन अभिव्यक्ति टिप्पणियों की अनुमति दी थी, उसे मान्य किया गया था। यूबीक्यूप्रो :: एनएलएस-एसजीएफपी-एनक्लोवर 3-एमनग्रीन (यूबीक्यूप्रो :: एनजीसीएन, सामग्री की तालिका देखें) व्यक्त शूट का उपयोग किया गया था। ऊतक के नमूने एक कंपन माइक्रो-स्लाइसर का उपयोग करके उन्हें 130 μm मोटाई तक ट्रिम करने से पहले फिक्सेटिव समाधान में तय किए गए थे। नमूनों को तब सीएस के साथ उपचार के 0-4 सप्ताह से हर हफ्ते जेड-अक्ष दिशा में 10 μm अंतराल पर एक कॉन्फोकल लेजर माइक्रोस्कोप (लेजर: 488 एनएम / 13%, उद्देश्य: 20x, पिनहोल: 0.93 एयू, औसत: 16, डिटेक्टर लाभ: 800) के तहत देखा गया था। प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 3 में दिखाए गए हैं। प्रतिदीप्ति तीव्रता की तुलना करने के लिए सभी आंकड़ों को एक ही प्रसंस्करण के साथ समायोजित किया गया था। उपचार के बिना नोड में, बेहोश फ्लोरोसेंट संकेतों को -40 μm (चित्रा 3 ए) की गहराई पर देखा गया था। सीएस उपचार के 1 सप्ताह के बाद अवलोकन योग्य गहराई -60 μm और 2 सप्ताह के बाद -90 μm थी, लेकिन साइटोप्लाज्म का ऑटो-प्रतिदीप्ति -20 μm की गहराई पर दोनों सप्ताह में ध्यान देने योग्य था। ऑटोफ्लोरेसेंस 3 सप्ताह के बाद कुछ हद तक कमजोर हो गया और 4 सप्ताह के बाद दिखाई नहीं दे रहा था। फ्लोरोसेंट सिग्नल 3 सप्ताह में -80 μm की गहराई पर और 4 सप्ताह में -100 μm की गहराई पर देखे गए थे। इंटर्नोड में, फ्लोरोसेंट संकेतों सीएस उपचार (चित्रा 3 बी) के बिना -60 μm की गहराई पर मनाया गया। सीएस उपचार के 1 सप्ताह से 3 सप्ताह के बाद अवलोकन योग्य गहराई -90 μm और 4 सप्ताह के बाद -100 μm थी, लेकिन साइटोप्लाज्म में ऑटो-प्रतिदीप्ति 1 सप्ताह के बाद -20 μm की गहराई पर ध्यान देने योग्य थी। ऑटो-प्रतिदीप्ति अब 2 सप्ताह के बाद दिखाई नहीं दे रही थी। पत्तियों में, फ्लोरोसेंट संकेतों सीएस उपचार (चित्रा 3 सी) के बिना -90 μm की गहराई पर मनाया गया। फ्लोरोसेंट सिग्नल नोड्स और इंटर्नोड्स की तुलना में पत्तियों में गहराई से देखे गए थे। हालांकि, फ्लोरोसेंट सिग्नल कमजोर थे। फ्लोरोसेंट सिग्नल सीएस उपचार के 1 सप्ताह के बाद स्पष्ट हो गए और -120 μm की गहराई पर देखे गए। 2 सप्ताह और 3 सप्ताह के बाद, फ्लोरोसेंट सिग्नल -110 μm की गहराई पर और 4 सप्ताह के बाद, -120 μm की गहराई पर देखे गए।
अंत में, प्रतिलेखन कारक ओएसएमएडीएस 1511 की अभिव्यक्ति एमओआरंज12 के साथ जुड़ी हुई थी, जो वनस्पति से प्रजनन चरण13 तक एसएएम के संक्रमण को नियंत्रित करती है। ओएसएमएडीएस 15-एमओआरएंज के साथ 10 एलएस पर एनआईपी से ऊतक के नमूने तय किए गए थे, 130 μm मोटाई तक छंटनी की गई थी, और 2 सप्ताह के लिए सीएस के साथ इलाज किया गया था। चित्रा 4 से पता चलता है कि समाशोधन समाधान का उपयोग प्राकृतिक जीन अभिव्यक्ति और फ्लोरोसेंट डाई धुंधला (कैल्कोफ्लोर सफेद) के फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ओएसएमएडीएस 15-एमओआरंज) का निरीक्षण करने के लिए एक साथ किया जा सकता है। 0 से -130 μm तक गहराई पर पूरे फ्लोरेट को देखा गया था, और 3 डी छवि को 3 μm अंतराल (चित्रा 4 ई) पर 43 जेड-स्टैक छवियों से पुनर्निर्माण किया गया था।
चित्रा 1: नमूना स्थिति और प्रसंस्करण( ए) लघु-दिन की स्थिति के तहत 8 एलएस पर निप अंकुर। (बी) आधार का बढ़ा हुआ दृश्य। (सी) एसएएम /युवा पुष्पगुच्छ से आधार तक एक नमूना कट-आउट। (डी) सी (इनसेट) से एक अंडाकार क्रॉस-सेक्शन। (ई) ब्लेड के साथ शूट के एक तरफ पतले शेविंग। (एफ) पतली मुंडा सतह। (जी) इंटर्नोड बढ़ाव दिखाने वाला नमूना। एरोहेड्स द्वारा इंगित सफेद अनुभाग नोड्स है। ऊपरी नोड के ऊपरी हिस्से में युवा पुष्पगुच्छ होता है। स्केल बार: (ए) 10 सेमी, (बी-सी, ई-जी) 1 सेमी, (डी) 0.5 सेमी कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: ऊतक समाशोधन नमूना मोटाई और सीएस उपचार अवधि पर निर्भर करता है( ए) युवा पुष्पगुच्छ सहित आंशिक शूट के साथ अनियंत्रित नमूने। अधिकतम मोटाई: 4 मिमी (बी) युवा पुष्पगुच्छ को उजागर करने के लिए नमूनों से छीलने वाली सभी पत्तियां। अधिकतम मोटाई: 2.5 मिमी वाईपी: युवा पुष्पगुच्छ, में: इंटर्नोड; तीरहेड नोड को इंगित करते हैं। (सी) नमूने जो 1 मिमी मोटाई के लिए हाथ से छंटनी किए गए थे। (डी) 130 μm मोटाई के लिए कंपन माइक्रो स्लाइसर के साथ छंटनी नमूने। स्केल बार: 5 मिमी कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: प्रतिदीप्ति अवलोकन की गहराई ऊतक प्रकार और सीएस उपचार अवधि पर निर्भर करती है। यूबीक्यूप्रो की गहरी इमेजिंग:: (ए) नोड, (बी) इंटर्नोड, और (सी) पत्ती में एनजीसीएन। "मर्ज" का अर्थ है कि छवियों को अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) छवि और सभी जेड-स्टैक छवियों के साथ जोड़ा गया था। जिन छवियों में कोई प्रतिदीप्ति नहीं देखी गई थी, उन्हें "एनडी" के रूप में चिह्नित किया गया था। (पता नहीं चला)। कॉन्फोकल लेजर माइक्रोस्कोपी की सेटिंग्स निम्नानुसार हैं: लेजर: 488 एनएम / 13%, उद्देश्य: 20x, पिनहोल: 0.93 एयू, औसत: 16, डिटेक्टर लाभ: 800, अंतराल: 10 μm। स्केल सलाखों: 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: ओएसएमएडीएस 15-मोरेंज का गहरा प्रतिदीप्ति अवलोकन (ए) 10 एलएस पर एनआईपी की डीआईसी छवि। वाईपी: युवा पुष्पगुच्छ, ले: पत्ती, नहीं: नोड, में: इंटर्नोड; तीरहेड्स फ्लोरेट्स को इंगित करते हैं। (बी) ओएसएमएडीएस 15-मोरेंज की प्रतिदीप्ति छवि। पीले डॉट्स नाभिक पर ओएसएमएडीएस 15-एमओआरंज के फ्लोरोसेंट प्रोटीन को इंगित करते हैं। कोशिका भित्ति को कैल्कोफ्लोर सफेद समाधान के साथ सियान दाग दिया गया था। (सी) युवा पुष्पगुच्छ का बढ़ा हुआ दृश्य। (डी) फ्लोरेट की गहरी इमेजिंग। पा: पीला, ले: लेम्मा, एफएम: पुष्प मेरिस्टेम; तारांकन पुंकेसर प्राइमर्डिया को इंगित करते हैं। कॉन्फोकल लेजर माइक्रोस्कोप निम्नानुसार सेट किया गया था: ओएसएमएडीएस 15-एमओआरंज; 13%, उद्देश्य: 20x, पिनहोल: 0.96 AU, औसत: 16, डिटेक्टर लाभ: 800, अंतराल: 3 μm। कैल्कोफ्लोर सफेद; 3%, उद्देश्य: 20x, पिनहोल: 0.93 AU, औसत: 16, डिटेक्टर लाभ: 470, अंतराल: 3 μm. (ई) जेड-स्टैक छवियों से निर्मित आकृति (डी) की 3 डी छवि। स्केल बार: (ए-बी) 1 मिमी, (सी) 500 μm, (D) 40 μm। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम
इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम निर्धारण और ट्रिमिंग हैं। चावल की शूटिंग में कठोर, मोटे या स्तरित ऊतक होते हैं जो फिक्सेटिव समाधान के प्रवेश को सीमित करते हैं। फिक्सेटिव समाधान की पारगम्यता में सुधार करने के लिए, ऊतक के एक तरफ नमूने पर पतली मुंडा किया गया था, जैसा कि चित्रा 1 ई-एफ में दिखाया गया है। इसके अलावा, वैक्यूम उपचार को उच्च दबाव का उपयोग करके दो बार दोहराया गया था। इसके अलावा, नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर सामान्य 2 घंटे निर्धारण के बजाय 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर तय किए गए थे।
ट्रिमिंग चरण में मुख्य बिंदु सीएस उपचार की एक छोटी अवधि के बाद अपनी आंतरिक संरचना को संरक्षित करते हुए फ्लोरोसेंट प्रोटीन का निरीक्षण करने के लिए तैयार होने वाले ऊतकों की मोटाई निर्धारित करना है। जैसा कि चित्रा 2 सी में दिखाया गया है, 1 मिमी मोटी नमूने, जितना संभव हो उतना पतला हाथ से छंटनी की गई, सीएस उपचार के 3 महीने बाद भी केवल सीमित संख्या में ऊतकों में पारदर्शी हो गई। इसलिए, वयस्क चावल की शूटिंग के गहरे प्रतिदीप्ति अवलोकन के लिए ट्रिमिंग चरण आवश्यक है। इस अध्ययन में, नमूनों को 130 μm की मोटाई तक छंटनी की गई थी, जैसा कि चित्रा 2 डी में दिखाया गया है। 130 μm मोटाई सीएस उपचार के 1 सप्ताह के बाद पत्तियों को साफ करने के लिए अनुमति दी और 2 सप्ताह के बाद पूरे नमूने. इस अध्ययन में 9-10 एलएस पर वयस्क चावल की शूटिंग का उपयोग किया गया था। छोटे चावल की शूटिंग से मोटी लेकिन नरम ऊतकों को सीएस उपचार के साथ तेजी से साफ किया जा सकता है। नमूनों की मोटाई और सीएस उपचार की अवधि को ऊतक प्रकार, स्थिति और 3 डी संरचना की मोटाई के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए।
संशोधन और समस्या निवारण विधियाँ
सीएस कम तापमान पर आसानी से अवक्षेपित हो जाता है। अवक्षेपित सीएस फ्लोरोसेंट प्रोटीन को संरक्षित नहीं कर सकता है; इसलिए, उचित तापमान पर नमूनों को संग्रहीत करते समय देखभाल की जानी चाहिए। इसके अलावा, सीएस और फिक्सेटिव समाधान दोनों का कोई एंटीसेप्टिक प्रभाव नहीं है; इसलिए, दूषित होने पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन अपमानित हो जाएगा। मिट्टी में उगाए गए चावल फंगल विकास के लिए प्रवण होते हैं; इसलिए, नमूनों के नमूने और हैंडलिंग संदूषण से बचने के लिए देखभाल के साथ किया जाना चाहिए।
बफर में अतिरिक्त फ्लोरोसेंट रंग पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति दे सकते हैं और सूक्ष्म टिप्पणियों में हस्तक्षेप कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, इवांस ब्लू डाई युक्त एक कैल्कोफ्लोर सफेद समाधान का उपयोग पहले किया गया था। 1 घंटे के लिए धुंधला होने और 1 घंटे के लिए धोने के बाद, ओएसएमएडीएस 15-एमओआरंज के फ्लोरोसेंट प्रोटीन को 555 एनएम लेजर का उपयोग करके देखा गया था। हालांकि, इवांस ब्लू डाई से प्राप्त पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के कारण फ्लोरोसेंट प्रोटीन नहीं देखा जा सका। इस पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति लगभग 2 घंटे के लिए नमूने धोने से समाप्त हो गया था। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट प्रोटीन स्पष्ट थे अगर नमूने रात भर छोड़ दिए गए थे। इसलिए, इस अध्ययन में एक शुद्ध कैल्कोफ्लोर सफेद समाधान का उपयोग किया गया था। फ्लोरोसेंट डाई से व्युत्पन्न पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति टिप्पणियों से पहले विभिन्न लेजर तरंग दैर्ध्य का उपयोग कर जाँच की जानी चाहिए।
विधि की सीमाएँ
जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है, सीएस उपचार के 2 सप्ताह के बाद 130 μm मोटी नमूनों में गहरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन देखी गई थी। यह चित्रा 2 डी में दिखाए गए परिणामों के अनुरूप है, जहां 130 μm मोटी नमूना सीएस उपचार के 2 सप्ताह के बाद पारदर्शी हो गया। हालांकि, जैसा कि चित्रा 3 ए में दिखाया गया है, साइटोप्लाज्म का ऑटो-प्रतिदीप्ति अभी भी 2 सप्ताह के बाद नोड्स में ध्यान देने योग्य था और सीएस उपचार के 4 सप्ताह के बाद ही पूरी तरह से हटा दिया गया था। नोड्स में एक उच्च सेल घनत्व होता है और इसलिए, ऑटो-फ्लोरोसेंट सामग्री को हटाने के लिए लंबे समय की आवश्यकता होती है।
जैसा कि चित्रा 3 सी में दिखाया गया है, सीएस उपचार के बिना पत्तियों में गहरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन देखे गए थे, लेकिन चमक 20 μm की समान गहराई पर नोड्स और इंटर्नोड्स की तुलना में कमजोर थी। सीएस उपचार के 1 सप्ताह के बाद, फ्लोरोसेंट प्रोटीन उज्ज्वल थे। क्लोरोफिल पत्तियों में प्रचुर मात्रा में होता है और उत्तेजना प्रकाश के 488 एनएम को अवशोषित करता है। लाल ऑटो-प्रतिदीप्ति भी है, जो 555 एनएम लेजर का उपयोग करके फ्लोरोसेंट प्रोटीन के अवलोकन में हस्तक्षेप कर सकता है। सीएस उपचार के 1 सप्ताह के बाद, क्लोरोफिल और अन्य ऑटो-फ्लोरोसेंट सामग्रियों को हटा दिया गया था, जिसके परिणामस्वरूप उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात छवियां थीं।
सीएस उपचार के 2 सप्ताह और 4 सप्ताह के बाद ऊतकों में देखी जा सकने वाली गहराई काफी अलग नहीं थी, हालांकि फ्लोरोसेंट प्रोटीन 4 सप्ताह (चित्रा 3) के बाद कमजोर दिखाई दिए। आम तौर पर, फ्लोरोसेंट प्रोटीन और ऑटो-फ्लोरेसेंस की चमक समय के साथ कमजोर हो जाती है, जिसके परिणामस्वरूप उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात होता है। इसलिए, फ्लोरोसेंट प्रोटीन को सूक्ष्म स्थितियों और छवि प्रसंस्करण को समायोजित करके अधिक स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है। इन परिणामों के आधार पर, यह निष्कर्ष निकाला गया था कि सीएस उपचार के 2 सप्ताह हमारे नमूना स्थितियों को देखते हुए गहरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन के अवलोकन की सुविधा प्रदान कर सकते हैं। हालांकि, स्पष्ट छवियों का निरीक्षण करने के लिए 4 सप्ताह की आवश्यकता होती है जो ऑटो-फ्लोरोसेंट सामग्री को पूरी तरह से बाहर करते हैं।
मजबूत ऑटोफ्लोरेसेंस वाली संरचनाएं, जैसे संवहनी बंडल और बहु-बांह कोशिकाएं, सीएस में साफ नहीं की जा सकती हैं। ऑटोफ्लोरेसेंस के बिना इन संरचनाओं का निरीक्षण करने के लिए, एक समय-गेटिंग विधि12 का उपयोग करना या प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम की स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा छवियों को प्राप्त करना आवश्यक है। एक दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप गहरे ऊतकों को देखने के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है यदि मोटे ऊतक देखे जाते हैं।
मौजूदा और वैकल्पिक तरीकों के संबंध में विधि का महत्व
आम तौर पर, चावल के पौधों की आंतरिक संरचनाओं को क्रायोस्टैट या वाइब्रेटोम सेक्शनिंग का उपयोग करके देखा गया है। एक क्रायोस्टैट पतले वर्गों को तैयार करने के लिए उपयुक्त है, जो आसान अवलोकन की अनुमति देता है, लेकिन नमूनों की तैयारी और उपकरणों का संचालन समय लेने वाला है। पतले वर्गों से मूल 3 डी संरचना का पुनर्निर्माण करना भी मुश्किल है। वाइब्रेटोम संचालित करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है और मोटे वर्गों के उत्पादन के लिए उपयुक्त है। हालांकि, लक्ष्य ऊतकों के मोटे वर्ग केवल कट सतह की टिप्पणियों की अनुमति देते हैं और गहरे ऊतकों को नहीं जो प्रकाश तक नहीं पहुंच सकते हैं। इन कारणों से, गहरी प्रतिदीप्ति टिप्पणियों के लिए न तो विधि उपयुक्त है।
इस अध्ययन ने चावल की शूटिंग में गहरी प्रतिदीप्ति अवलोकन में चुनौतियों को संबोधित किया, जैसे कि सीएस के सीमित ऊतक प्रवेश और मौजूदा तरीकों के संयोजन से एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत खराब वस्तु संकल्प। जैसा कि चित्रा 4 में दिखाया गया है, हमने फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ओएसएमएडीएस 15-एमओआरंज) को युवा पुष्पगुच्छ से आधार तक वयस्क चावल की शूटिंग के गहरे ऊतकों में व्यक्त किया। चित्रा 4 डी फ्लोरेट पर केंद्रित है और 3 μm अंतराल पर गहरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन दिखाता है। सीएस उपचार के 2 सप्ताह के बाद -130 μm गहराई से अधिक ऊतकों को देखा गया था, लेकिन सीएस उपचार के बिना एक ही आकार और विकास चरण में फ्लोरेट में केवल -27 μm गहराई के भीतर के ऊतकों को देखा गया (डेटा नहीं दिखाया गया)। वर्तमान बेहतर प्रोटोकॉल ने न केवल जीन के ओवरएक्सप्रेशन के अवलोकन की अनुमति दी, बल्कि वयस्क चावल की शूटिंग के गहरे ऊतकों में प्राकृतिक जीन अभिव्यक्ति भी की अनुमति दी।
विशिष्ट अनुसंधान क्षेत्रों में विधि का महत्व और संभावित अनुप्रयोग
यह प्रोटोकॉल, जो वयस्क चावल की शूटिंग के गहरे प्रतिदीप्ति अवलोकन का अनुकूलन करता है, अनावश्यक ऊतकों को ट्रिम करके और सीएस की पारगम्यता को बढ़ाकर कठिन, मोटी या स्तरित ऊतकों के कुशल समाशोधन को सक्षम बनाता है। इसके अलावा, विश्लेषण के लिए नमूनों की मोटाई को एक कॉन्फोकल लेजर माइक्रोस्कोप का उपयोग करके निरंतर और संरचनात्मक गहरी प्रतिदीप्ति अवलोकन की अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया गया था, जो आमतौर पर मोटी या अपारदर्शी ऊतकों को हल नहीं कर सकता है।
विभिन्न विकास चरणों में चावल के नमूनों की तुलना करना मुश्किल है क्योंकि फ्लोरोसेंट प्रोटीन फिक्सेटिव और पीबीएस समाधानों में समय के साथ नीचा दिखाते हैं। हालांकि, सीएस में फ्लोरोसेंट प्रोटीन को 5 महीने से अधिक समय तक संग्रहीत किया जा सकताहै 1. सीएस का लंबा शेल्फ जीवन चावल में गहरी प्रतिदीप्ति अवलोकन के लिए एक बड़ा लाभ है।
हाल ही में, कई समाशोधन प्रौद्योगिकियां विकसित की गई हैं, जिससे उनकी आंतरिक संरचनाओं को संरक्षित करते हुए 3 डी में गहरे ऊतकों का निरीक्षण करना संभव हो गया है। इन प्रौद्योगिकियों का विकास जारी है, और नए समाशोधन समाधान विकसित किए गए हैं। एक अच्छा उदाहरण iTOMEI14 है, जो कुशल क्लोरोफिल हटाने और उज्ज्वल प्रतिदीप्ति का पता लगाने में सक्षम बनाता है। एक अन्य उदाहरण क्लियरसीअल्फा15 है, जो समाशोधन उपचार के दौरान ऊतकों के ब्राउनिंग को रोकता है और उन्हें पारदर्शी दिखाई देता है। वर्तमान विधि के साथ इन समाशोधन समाधानों के संयोजन से अधिक कुशल और प्रभावी समाशोधन की अनुमति मिल सकती है।
यह उम्मीद की जाती है कि वर्तमान विधि न केवल चावल बल्कि अन्य पौधों की गहरी इमेजिंग के माध्यम से नई अंतर्दृष्टि प्राप्त करने में मदद करेगी।
Disclosures
लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
हम ओएसएमएडीएस 15-मोरेंज बीज प्रदान करने के लिए डॉ आर टेराडा, डॉ जेड शिमातानी और डॉ एच त्सुजी को धन्यवाद देते हैं; एनजीसीएन निर्माण के साथ हमें प्रदान करने के लिए डॉ डी कुरिहारा; और हमारी पांडुलिपि के संपादन के लिए डॉ आर शिम। इस काम को जेएसपीएस काकेन्ही (अनुदान संख्या जेपी 20 एच 05 9 12, 20 एच 05778, 20 एच 0577 9) और एसएटीआरईपीएस कार्यक्रम (सं। जेएसटी और जेआईसीए के जेपीएमजेएसए 1706)।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | BIO-BIK | ST-0150F | |
| 12-multiwell plate | Corning | 353043 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 352070 | |
| Calcofluor white solution | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| ClearSee | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 031-25151 | This can be made or purchased. |
| Confocal laser microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Desiccator | SANPLATEC | Custom made of acrylic. 30 cm (L), 30 cm (W), 14.5 cm (H) | |
| Glass coverslip (18 × 18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
| HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 342-01375 | |
| Microscope slide (76 × 26) | MATSUNAMI | S2441 | |
| Paraffin film | Bemis | PM-996 | |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 162-16065 | |
| Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-00013 | |
| UBQpro::NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro::NGCN) | provided by Dr. Kurihara | ||
| Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
| Vacuum pump | AS One | AS-01 | |
| Vibrating micro-slicer | DOSAKA | DTK-3000 | |
| Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |
References
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