Summary
Denne protokollen beskriver en renseteknikk for risskudd, som er vanskelig å forberede for interne strukturelle observasjoner på grunn av vevets harde, tykke eller lagdelte natur. Denne metoden muliggjør kontinuerlige og dype fluorescensobservasjoner, selv i voksne risplanter.
Abstract
Den nylig utviklede clearingteknologien som eliminerer brytningsindeksfeil og reduserer autofluorescerende materiale, har gjort det mulig å observere plantevev i tre dimensjoner (3D) samtidig som de opprettholder sine indre strukturer. I ris (Oryza sativa L.), en monocot-modellplante og en globalt viktig avling, har clearingteknologi blitt rapportert i organer som er relativt enkle å observere, for eksempel røttene og bladene. Anvendelser av clearingteknologi i shoot apikal meristem (SAM) og stengler er også rapportert, men bare i begrenset grad på grunn av dårlig penetrasjon av clearingløsningen (CS) i disse vevene. Den begrensede effektiviteten til clearingløsningene i disse vevene har blitt tilskrevet autofluorescens, fortykning og herding av vevene i stammen ettersom vaskulære bunter og epidermis utvikler seg og lagdeling av SAM med vannavvisende blader. Denne protokollen rapporterer optimalisering av en clearing-tilnærming for kontinuerlig og 3D-observasjon av genuttrykk fra SAM / ung panicle til bunnen av skuddene under utvikling. Faste vevsprøver som uttrykker en fluorescerende proteinreporter ble trimmet inn i seksjoner ved hjelp av en vibrerende mikroskjærer. Når en passende tykkelse ble oppnådd, ble CS påført. Ved å spesifikt målrette mot det sentrale vevet økte penetrasjonshastigheten og ensartetheten til CS, og tiden som kreves for å gjøre vevet gjennomsiktig, reduseres. I tillegg gjorde rydding av de trimmede seksjonene det mulig å observere den interne strukturen til hele skuddet fra et makroperspektiv. Denne metoden har potensielle anvendelser i dyp avbildning av vev av andre plantearter som er vanskelige å fjerne.
Introduction
Nylig utviklet clearingteknologi har gjort det mulig å observere plantens dype vev samtidig som de opprettholder sin indre struktur 1,2,3. I dikotmodellanlegget Arabidopsis har mange studier på fluorescerende proteinavbildning blitt utført ved hjelp av clearingteknologi for å eliminere brytningsindeksfeil og fjerne autofluorescerende materialer 4,5,6. Selv om bruk av clearingteknologi7,8 og 3D-avbildning ved cellulær oppløsning9 er rapportert i ris (Oryza sativa L.), en monocot-modellplante og en globalt viktig avling, er disse begrenset til relativt tynne og myke organer, som røtter, blader og skyte apikal meristem (SAM), som er enkle å observere.
Skuddet er hovedorganet som utgjør de overjordiske delene av karplanter. I ris består skuddene av en serie vertikalt stablede "fytomerer", som består av aksillære knopper, blader og stammen10. På spissen av skytingen består SAM av utifferentierte stamceller i midten. Fytomerer dannes ved differensiering av celler avledet fra SAM. Etter at plantene skifter fra vegetativ til reproduktiv fase, strekker risstengler seg og SAM skiller seg ut i unge panicles10. Denne utviklingsendringen er ledsaget av svingninger i uttrykket av ulike gener i stilkene og SAM / unge panicles. For å forstå mekanismene som ligger til grunn for celledifferensiering i ulike vev, er det viktig å strukturelt observere cellemorfologien og genuttrykket i indre skuddvev. Imidlertid gir den dype avbildningen av stengler (noder og internoder) i skuddet en utfordring på grunn av ineffektiviteten til clearingløsninger for å trenge inn i vevet. Stengler gjennomgår umiddelbart en rask volumøkning fra lateral vekst etter differensiering fra SAM. Herdingen av risknutevevet på grunn av fortykning av vaskulære bunter og den horisontale komplekse koblingen av nodal vaskulær anastomose, i tillegg til den høye avstøtningen av risskudd, bidrar alle til å begrense penetrering av CS i stengler10.
Denne studien hadde som mål å observere endringer i genuttrykk i risskuddvev ved hjelp av en strukturell dyp fluorescensteknikk. Dette arbeidet optimaliserer en clearingprotokoll for ris for kontinuerlig å observere genuttrykk fra SAM / ung panicle til basen i en 3D-struktur, i stedet for på en flat overflate, ved hjelp av et konfokalt lasermikroskop.
Protocol
1. Fremstilling av fikseringsløsningen
- Overfør 70 ml sterilt vann til en glassflaske og tilsett 10 g paraformaldehyd (PFA).
FORSIKTIG: PFA er giftig; Derfor anbefales det å bruke hansker. - Tilsett 2 ml 1 N NaOH for å løse opp PFA-oppløsningen.
- Løs opp PFA-oppløsningen under kontinuerlig omrøring (300-500 o/min) ved 60 °C i ca. 1 time til PFA-oppløsningen er gjennomsiktig.
- Tilsett sterilisert vann for å øke volumet av PFA-løsningen til 100 ml.
MERK: PFA-løsningen ble tilberedt ferskt før bruk. Videre kan en PFA-løsning lagret ved 4 °C brukes i ca. 2 måneder. - Umiddelbart før prøvetaking, tilsett 25 ml 60 mM HEPES (pH 7,4), 3 ml 1 M sukrose og 2 ml sterilt vann i 20 ml 10 % PFA for å tilberede en 50 ml fikseringsmiddelløsning.
2. Klargjøring av clearingløsning (CS)
- Vei og bland 7,5 g natriumdeoksykolat, 5 g xylitol og 12,5 g urea (se materialtabell) i 50 ml sterilt vann.
MERK: Natriumdeoksykolatpulver ble veid i et generelt laboratorieutkastkammer for å forhindre luftbåren spredning. - Løs opp ingrediensene (trinn 2.1.) ved hjelp av en magnetisk omrører for å forberede CS.
MERK: Denne studien brukte in-house forberedt clearingløsning (CS), men en kommersielt tilgjengelig clearingløsning, ClearSee (se materialtabell), kan også brukes. - Overfør CS til et 50 ml konisk rør og oppbevar det ved romtemperatur (15-30 °C) i mørket.
MERK: CS kan lagres i mer enn 1 år.
3. Prøvetaking
- Klipp røttene forsiktig uten å skade plantene. Vask plantene med vann for å fjerne smuss.
MERK: Denne metoden studerte observasjon av vev fra trebladstrinnet (LS) for å flagge LS. Den nåværende studien brukte riskulturene Nipponbare (Nip) og Taichung 65 (T65) på 8-10 LS. - Skrell av de gamle ytre bladene med hender og pinsett. Det var ca 2-3 blader igjen.
- Klipp vevet fra SAM / ung panicle til basen med en enkantet barberhøvel ved hjelp av en glidende bevegelse for å unngå å knuse cellene (figur 1A-C). Hvis posisjonen til SAM / ung panicle ikke er synlig, kutt den lenger.
- Siden tverrsnittet av risskuddet har en oval form (figur 1D), barberer du av den ene siden av ovalen tynt i retning av den lange aksen med en tveegget barberhøvel (figur 1E-F).
MERK: Dette trinnet gjorde det lettere for den fikserende løsningen å trenge inn i prøven. En horisontal skjæreflate gjør prøven enklere å feste til en vibrerende mikroskjærer (se Materialfortegnelse). - Bekreft posisjonen til SAM / ung panicle ved utseendet av en hvitaktig farge i prøven (figur 1G). Trim av overflødig vev.
MERK: Lengden på prøven bør justeres til den maksimale lengden som kan trimmes ved hjelp av en vibrerende mikroskjærer. Hvis prøven er for lang, del den i flere stykker.
4. Fiksering av prøvene
- Pipette 1 ml av den fiksative oppløsningen (fremstilt i trinn 1.) til et 1,5 ml mikrosentrifugerør og sett umiddelbart i prøvene.
MERK: Forsikre deg om at prøvemengden ikke overstiger 20 % av volumet av fikseringsløsningen. - Klipp et stykke parafinfilm i 2,5 cm2. Form parafinfilmen til baller og legg dem på toppen av prøvene for å forhindre at de flyter ut av fikseringsløsningen.
- Plasser røret som inneholder prøven i en desiccator. Lukk deretter lokket på desiccator og start vakuumpumpen for å trykkavlaste innsiden av desiccator til -0,095 MPa sakte.
- Etter å ha lukket tørkemidlet ved -0,095 MPa, slå av vakuumpumpen og la den stå i 30 minutter ved romtemperatur.
MERK: Vakuumnivået var slik at bobler dukket opp gradvis i prøvene. - Åpne desiccator litt og sakte returnere den til atmosfærisk trykk. Reduser trykket på tørkemidlet til -0,095 MPa, slå av vakuumpumpen og la blandingen stå i 30 minutter ved romtemperatur.
- Åpne desiccator litt og sakte returnere den til atmosfærisk trykk. Hvis prøven er riktig festet, synker den inn i fikseringsløsningen. Hvis det ikke synker, reduser trykket igjen.
- Fjern parafinfilmen, lukk lokket og hold slangene over natten ved 4 °C.
MERK: Prøvene ble fikset i fikseringsløsning i minst 2 timer. Den kan lagres i ~ 1 uke.
5. Trimming av den faste prøven
- Fjern overflødig fikseringsmiddel fra prøven ved hjelp av lofrie våtservietter.
MERK: Overflødig fikseringsmiddel forhindrer at prøven fester seg ordentlig på skuffen. - Fest prøven på et vibrerende mikroslicerbrett med øyeblikkelig lim. Legg den på et brett med den flate siden ned, som ble barbert av under prøvetaking.
MERK: På grunn av strukturen til risskuddet, må den trimmes fra basen mot SAM / ung panicle. - Still inn beskjæringsforholdene i henhold til den faste prøven.
MERK: I denne studien ble trimming satt til tykk, 130 μm; BRED, 15 mm; FREKVENS, 15%; og SKJÆREHASTIGHET, 32 mm. - Juster prøveposisjonen med RVS - eller FWD-knappen og UP - eller NED-knappen . Fyll brettet med avionisert vann til alle prøvene er nedsenket. Etter å ha fylt skuffen, trykk på START-knappen . Plasser de trimmede prøvene på et glassglass med en dråpe på 1x PBS.
MERK: Flytt plasseringen av prøven til den andre siden etter hver trimming siden den harde prøven sliter ut barberbladet. - Etter å ha kontrollert prøven som inneholder målstedet under et stereomikroskop, overfør den trimmede prøven til en multiwellplate med 1 ml 1x PBS.
MERK: Velg antall brønner i henhold til størrelsen på prøven. I denne studien ble det brukt en 12-multiwell plate.
6. Behandling med clearingløsningen
- Fjern 1x PBS fra multiwell-platen og tilsett fersk 1x PBS. La det stå i 1 min.
- Fjern 1x PBS og legg til CS.
MERK: Mengden CS må være fem ganger prøvevolumet. - Plasser multibrønnplaten som inneholder prøven i en desiccator. Lukk deretter lokket på desiccator og start vakuumpumpen for å trykkavlaste innsiden av desiccator til -0,09 MPa sakte.
- Etter å ha lukket tørkemidlet ved -0,09 MPa, slå av vakuumpumpen og la den stå i 1 time ved romtemperatur.
- Åpne desiccator litt og sakte returnere den til atmosfærisk trykk.
- Hell avionisert vann i gapet mellom brønnene for å forhindre fordampning av CS. Oppbevar multiwellplatene ved romtemperatur i mørket for rydding.
MERK: Rist forsiktig multiwellplaten hver 1-2 dag for å diffundere klorofyll og andre komponenter. - Når CS blir grønn, bytt den ut med fersk løsning.
7. Celleveggfarging med kjemisk fargestoff
- Pipet den hvite kalkofluoroppløsningen (1 ml, sluttkonsentrasjon: 1 mg/ml i clearingoppløsningen, se materialfortegnelse) i en flerbrønnsplate. Plasser prøvene i fargestoffoppløsningen og inkuber i 1 time.
MERK: Volumet av fargestoffet må ikke overstige 10% av volumet av CS. - Vask de flekkete prøvene i en annen multiwell plate med 1 ml CS i minst 1 time.
8. Observasjon med et konfokalt lasermikroskop
- Plasser en dråpe CS på et mikroskop lysbilde og overføre behandlet (med CS) prøver på lysbildet.
MERK: Siden de behandlede prøvene er myke, må de håndteres forsiktig med pinsett. - Dekk prøven med et glassdeksel for å forhindre fordampning av CS.
MERK: CS faller lett. - Vær oppmerksom på de behandlede prøvene under et konfokalt lasermikroskop.
MERK: Etter observasjon kan de behandlede prøvene returneres til CS for ytterligere observasjoner senere.
Representative Results
For det første ble det validert i hvilken grad det harde og tykke vevet til voksne risplanter kunne gjøres gjennomsiktig ved clearingbehandlingen. Nip ved 9-10 LS, som er panikkdannelsesstadiet, og 12-16 mm lange vev kuttet ut fra den unge panicle til bunnen av skytingen ble brukt. Disse prøvene, inkludert den unge panicle, ble fikset i fikseringsløsningen og observert før og etter 1-4 uker av clearingbehandlingen (figur 2). De utrimmede prøvene forble grønne og ble ikke gjennomsiktige etter 4 uker eller til og med etter 3 måneders behandling med clearingløsningen (figur 2A). I prøver som ble avskallet av alle blader, ble internodene hvite etter 1 ukes behandling med CS, selv om nodene forble grønne. Denne prøven ble ikke transparent etter 4 uker (figur 2B). Etter 3 måneders behandling med CS ble bare den unge panicle gjennomsiktig. De håndtrimmede prøvene endret seg til hvite, bortsett fra ytre blader og vaskulære bunter, etter 1 ukes behandling med CS. Noen deler av bladene, ung panicle og internoder ble gjennomsiktige, men ble ikke gjennomsiktige etter 4 uker (figur 2C). Etter 3 måneder ble bare de unge panicle og indre bladene gjennomsiktige. Prøvene som ble trimmet til 130 μm tykkelse med den vibrerende mikroskjæreren ble gjennomsiktige etter 1 ukes behandling med CS, med bladene gjennomsiktige. Etter 2 uker var utvalget tilnærmet transparent og forble uendret etter 4 uker (figur 2D). Etter 3 måneder ble prøvene helt gjennomsiktige.
Deretter ble dybden som clearingbehandlingen tillot genuttrykksobservasjoner i skuddet av T65 ved 8 LS validert. UBQpro:: NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro ::NGCN, se Materialtabell) uttrykte skudd ble brukt. Vevsprøver ble festet i fikseringsløsningen før de ble trimmet til 130 μm tykkelse ved hjelp av en vibrerende mikroskjærer. Prøvene ble deretter observert under et konfokalt lasermikroskop (laser: 488 nm / 13%, mål: 20x, pinhole: 0,93 AU, gjennomsnitt: 16, detektorforsterkning: 800) ved 10 μm intervaller i z-aksens retning hver uke fra 0-4 ukers behandling med CS. De representative resultatene er vist i figur 3. Alle tallene ble justert med samme prosessering for å sammenligne fluorescensintensiteten. I knuten behandling ble svake fluorescerende signaler observert på en dybde på -40 μm (figur 3A). Den observerbare dybden var −60 μm etter 1 uke av CS-behandlingen og −90 μm etter 2 uker, men autofluorescens av cytoplasma var merkbar ved begge uker på en dybde på −20 μm. Autofluorescensen ble noe svakere etter 3 uker og var ikke lenger synlig etter 4 uker. Fluorescerende signaler ble observert på en dybde på -80 μm ved 3 uker og på en dybde på -100 μm ved 4 uker. I internoden ble fluorescerende signaler observert på en dybde på -60 μm uten CS-behandling (figur 3B). Den observerbare dybden var -90 μm etter 1 uke til 3 uker av CS-behandlingen og -100 μm etter 4 uker, men autofluorescens i cytoplasma var merkbar på en dybde på -20 μm etter 1 uke. Autofluorescens var ikke lenger synlig etter 2 uker. I bladene ble fluorescerende signaler observert på en dybde på -90 μm uten CS-behandling (figur 3C). De fluorescerende signalene ble observert dypere i bladene enn i nodene og internodene. De fluorescerende signalene var imidlertid svakere. De fluorescerende signalene ble tydelige etter 1 ukes CS-behandling og ble observert på en dybde på -120 μm. Etter 2 uker og 3 uker ble fluorescerende signaler observert på en dybde på -110 μm og etter 4 uker på en dybde på -120 μm.
Endelig ble uttrykket av transkripsjonsfaktoren OsMADS1511 smeltet sammen med mOrange 12 observert, noe som regulerer overgangen av SAM fra vegetativ til reproduktiv fase13. Vevsprøver fra Nip ved 10 LS med OsMADS15-mOrange ble fikset, trimmet til 130 μm tykkelse og behandlet med CS i 2 uker. Figur 4 viser at clearingløsningen kan brukes samtidig for å observere fluorescerende proteiner (OsMADS15-mOrange) av naturlig genuttrykk og fluorescerende fargestoff (calcofluor hvit). Hele buketten på dybder fra 0 til -130 μm ble observert, og 3D-bildet ble rekonstruert fra 43 z-stackbilder med 3 μm intervaller (figur 4E).
Figur 1: Prøvetakingsposisjon og prosessering. (A) Nip-frøplante ved 8 LS under kortdagstilstanden. (B) Forstørret visning av basen. (C) En prøve cut-out fra SAM / unge panicle til basen. (D) Et ovalt tverrsnitt fra C (innfelt). (E) Barbering av den ene siden av skytingen med et blad. (F) Tynt barbert overflate. (G) Prøve som viser forlengelse av internode. Den hvite delen indikert av pilspissene er noder. Oversiden av den øvre knuten har den unge panicle. Vektstenger: (A) 10 cm, (B-C, E-G) 1 cm, (D) 0,5 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Vevsrydding avhenger av prøvetykkelse og CS-behandlingsperiode . (A) Utrimmede prøver med partielle skudd, inkludert den unge panicle. Maksimal tykkelse: 4 mm. (B) Alle blader avskallet fra prøvene for å eksponere den unge panicle. Maksimal tykkelse: 2,5 mm. yp: ung panicle, i: internode; pilspisser indikerer node. (C) Prøver som ble håndtrimmet til 1 mm tykkelse. (D) Prøver trimmet med den vibrerende mikroskjæreren til 130 μm tykkelse. Vektstang: 5 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Dybden av fluorescensobservasjon avhenger av vevstype og CS-behandlingsperiode. Dyp avbildning av UBQpro::NGCN i (A)-noden, (B) internoden og (C) bladet. "Slå sammen" betyr at bildene ble smeltet sammen med DIC-bildet (Differential Interinterference Contrast) og alle Z-stack-bilder. Bilder der det ikke ble observert fluorescens, ble merket som "n.d." (ikke oppdaget). Innstillinger for konfokal lasermikroskopi er som følger: laser: 488 nm / 13%, mål: 20x, pinhole: 0,93 AU, gjennomsnitt: 16, detektorforsterkning: 800, intervall: 10 μm. Vektstenger: 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Dyp fluorescensobservasjon av OsMADS15-mOrange. (A) DIC-bildet av Nip ved 10 LS. yp: ung panicle, le: blad, nei: node, i: internode; pilspisser indikerer buketter. (B) Fluorescensbilde av OsMADS15-mOrange. Gule prikker indikerer fluorescerende proteiner av OsMADS15-mOrange ved kjernen. Celleveggen ble farget cyan med kalkofluor hvit løsning. (C) Forstørret syn på den unge panicle. (D) Dyp avbildning av buketten. pa: palea, le: lemma, fm: floral meristem; stjerner indikerer stamen primordia. Det konfokale lasermikroskopet ble satt som følger: OsMADS15-mOrange; laser: 555 nm/13%, mål: 20x, nålehull: 0,96 AU, gjennomsnitt: 16, detektorforsterkning: 800, intervall: 3 μm. Calcofluor hvit; laser: 405 nm/3 %, mål: 20x, nålehull: 0,93 AU, gjennomsnitt: 16, detektorforsterkning: 470, intervall: 3 μm. (E) 3D-bildet av figuren (D) konstruert fra z-stack-bildene. Vektstenger: (A-B) 1 mm, (C) 500 μm, (D) 40 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Kritiske trinn i protokollen
De kritiske trinnene i denne protokollen er fiksering og trimming. Risskudd har hardt, tykt eller lagdelt vev som begrenser penetrasjon av fikseringsløsningen. For å forbedre permeabiliteten til den fiksative løsningen ble den ene siden av vevet tynt barbert ved prøvetaking, som vist i figur 1E-F. I tillegg ble vakuumbehandlingene gjentatt to ganger ved bruk av høyere trykk. Videre ble prøvene fiksert over natten ved 4 °C i stedet for vanlig 2 timers fiksering ved 4 °C.
Nøkkelpunktet i trimmingstrinnet er å bestemme tykkelsen på vevet som skal være forberedt på å observere fluorescerende proteiner samtidig som de opprettholder sin indre struktur etter en kort periode med CS-behandling. Som vist i figur 2C ble de 1 mm tykke prøvene, håndtrimmet så tynne som mulig, gjennomsiktige i bare et begrenset antall vev selv etter 3 måneders CS-behandling. Derfor er trimmingstrinnet viktig for dyp fluorescensobservasjon av voksne risskudd. I denne studien ble prøvene trimmet til en tykkelse på 130 μm, som vist i figur 2D. Tykkelsen på 130 μm tillot å rydde bladene etter 1 uke med CS-behandling og hele prøven etter 2 uker. Voksne risskudd på 9-10 LS ble brukt i denne studien. Tykt, men mykere vev fra yngre risskudd kan fjernes raskere med CS-behandlingen. Tykkelsen på prøvene og varigheten av CS-behandlingen bør justeres i henhold til vevstype, tilstand og tykkelse på 3D-strukturen som skal observeres.
Modifikasjoner og feilsøkingsmetoder
CS falt lett ut ved lave temperaturer. Den utfelte CS kan ikke bevare fluorescerende proteiner; Derfor må det utvises forsiktighet ved lagring av prøvene ved riktig temperatur. I tillegg har både CS og fikseringsløsning ingen antiseptisk effekt; Derfor vil fluorescerende proteiner nedbrytes hvis de er forurenset. Jorddyrket ris er utsatt for soppvekst; Prøvetaking og håndtering av prøver må derfor utføres med forsiktighet for å unngå forurensning.
Overflødig fluorescerende fargestoffer i bufferen kan avgi bakgrunnsfluorescens og forstyrre mikroskopiske observasjoner. For eksempel ble en calcofluor hvit løsning som inneholder Evans blå fargestoff tidligere brukt. Etter farging i 1 time og vask i 1 time ble de fluorescerende proteinene til OsMADS15-mOrange observert ved bruk av en 555 nm laser. Imidlertid kunne fluorescerende proteiner ikke observeres på grunn av bakgrunnsfluorescensen avledet fra Evans blå fargestoff. Denne bakgrunnsfluorescensen ble nesten eliminert ved å vaske prøvene i 2 timer. Dessuten var de fluoriserende proteinene tydeligere hvis prøvene ble liggende over natten. Derfor ble en ren kalkofluor hvit løsning brukt i denne studien. Bakgrunnsfluorescens avledet fra det fluorescerende fargestoffet bør kontrolleres ved hjelp av forskjellige laserbølgelengder før observasjoner.
Begrensninger av metoden
Som vist i figur 3 ble det observert dype fluorescerende proteiner i prøvene som var 130 μm tykke etter 2 ukers CS-behandling. Dette samsvarer med resultatene vist i figur 2D, hvor den 130 μm tykke prøven ble gjennomsiktig etter 2 ukers CS-behandling. Imidlertid, som vist i figur 3A, var autofluorescens av cytoplasma fortsatt merkbar i nodene etter 2 uker og ble først fullstendig fjernet etter 4 ukers CS-behandling. Noder har høy celletetthet og krever derfor lengre tid å fjerne autofluorescerende materialer.
Som vist i figur 3C ble dype fluorescerende proteiner observert i bladene uten CS-behandling, men lysstyrken var svakere enn i noder og internoder på samme dybde på 20 μm. Etter 1 uke med CS-behandling var de fluorescerende proteinene lysere. Klorofyll er rikelig i blader og absorberer 488 nm eksitasjonslys. De har også oransje / rød autofluorescens, som kan forstyrre observasjonen av fluorescerende proteiner ved hjelp av en 555 nm laser. Etter 1 ukes CS-behandling ble klorofyll og andre autofluorescerende materialer fjernet, noe som resulterte i bilder med høyt signal/støy-forhold.
Dybden som kunne observeres i vev etter 2 uker og 4 ukers CS-behandling var ikke signifikant forskjellig, selv om de fluorescerende proteinene virket svakere etter 4 uker (figur 3). Normalt svekkes lysstyrken til fluorescerende proteiner og autofluorescens med tiden, noe som resulterer i et høyere signal-til-støy-forhold. Derfor kan fluorescerende proteiner observeres tydeligere ved å justere mikroskopiske forhold og bildebehandling. Basert på disse resultatene ble det konkludert med at 2 ukers CS-behandling kunne lette observasjonen av dype fluorescerende proteiner, gitt våre prøveforhold. Imidlertid er det nødvendig med 4 uker for å observere klarere bilder som helt utelukker de autofluorescerende materialene.
Strukturer med sterk autofluorescens, som vaskulære bunter og flerarmsceller, kan ikke fjernes i CS. For å observere disse strukturene uten autofluorescens, er det nødvendig å bruke en tidsgivende metode12 eller å oppnå bilder ved spektroskopi av fluorescensspekteret. Et to-foton mikroskop kan være mer egnet for å observere dypere vev hvis tykkere vev observeres.
Metodens betydning i forhold til eksisterende og alternative metoder
Vanligvis har de indre strukturer av ris planter blitt observert ved hjelp av enten cryostat eller vibratome seksjonering. En cryostat er egnet for å forberede tynne seksjoner, noe som gjør det lettere å observere, men forberedelsen av prøvene og driften av utstyret er tidkrevende. Det er også vanskelig å rekonstruere den opprinnelige 3D-strukturen fra tynne seksjoner. Vibratomen er relativt enkel å betjene og egnet for produksjon av tykke seksjoner. Imidlertid tillater tykke deler av målvev bare observasjoner av kuttoverflaten og ikke dype vev som lyset ikke kan nå. Av disse grunner er ingen av metodene egnet for dypfluorescensobservasjoner.
Denne studien adresserte utfordringer i dyp fluorescensobservasjon i risskudd, for eksempel den begrensede vevspenetrasjonen av CS og den dårlige objektoppløsningen under et konfokalt mikroskop, ved å kombinere eksisterende metoder. Som vist i figur 4 observerte vi fluorescerende proteiner (OsMADS15-mOrange) uttrykt i det dype vevet av voksne risskudd fra den unge panicle til basen. Figur 4D fokuserer på buketten og viser dype fluorescerende proteiner med 3 μm intervaller. Vev over −130 μm dybde ble observert etter 2 ukers CS-behandling, men bare vev innenfor −27 μm dybde ble observert (data ikke vist) i buketten i samme størrelse og vekststadium uten CS-behandling. Den nåværende forbedrede protokollen tillot observasjon ikke bare av overekspresjon av gener, men også naturlig genuttrykk i det dype vevet av voksne risskudd.
Metodens betydning og mulige anvendelser i spesifikke forskningsområder
Denne protokollen, som optimaliserer den dype fluorescensobservasjonen av voksne risskudd, muliggjør effektiv rydding av hardt, tykt eller lagdelt vev ved å trimme av unødvendige vev og øke permeabiliteten til CS. I tillegg ble tykkelsen på prøvene for analyse optimalisert for å tillate kontinuerlig og strukturell dyp fluorescensobservasjon ved hjelp av et konfokalt lasermikroskop, som normalt ikke kan løse tykt eller ugjennomsiktig vev.
Det er vanskelig å sammenligne risprøver i forskjellige vekststadier fordi fluorescerende proteiner nedbrytes over tid i fikserings- og PBS-løsningene. Imidlertid kan fluorescerende proteiner i CS lagres i mer enn 5 måneder1. Den lange holdbarheten til CS er en stor fordel for dyp fluorescensobservasjon i ris.
Nylig har mange clearing-teknologier blitt utviklet, noe som gjør det mulig å observere dype vev i 3D samtidig som de opprettholder sine interne strukturer. Disse teknologiene har fortsatt å utvikle seg, og nye clearingløsninger er utviklet. Et godt eksempel er iTOMEI14, som muliggjør effektiv klorofyllfjerning og lysere fluorescensdeteksjon. Et annet eksempel er ClearSeeAlpha15, som forhindrer av vev under rydding av behandling og får dem til å virke gjennomsiktige. Å kombinere disse clearingløsningene med dagens metode kan muliggjøre mer effektiv clearing.
Det forventes at den nåværende metoden vil bidra til å få ny innsikt gjennom dyp avbildning av ikke bare ris, men også andre planter.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Vi takker Dr. R. Terada, Dr. Z. Shimatani og Dr. H. Tsuji for å gi oss OsMADS15-mOrange frø; Dr. D. Kurihara for å gi oss NGCN-konstruksjonen; og Dr. R. Shim for redigering av manuskriptet vårt. Dette arbeidet ble finansiert av JSPS KAKENHI (tilskuddsnummer JP20H05912, 20H05778, 20H05779) og av SATREPS-programmet (nr. JPMJSA1706) fra JST og JICA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | BIO-BIK | ST-0150F | |
| 12-multiwell plate | Corning | 353043 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 352070 | |
| Calcofluor white solution | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| ClearSee | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 031-25151 | This can be made or purchased. |
| Confocal laser microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Desiccator | SANPLATEC | Custom made of acrylic. 30 cm (L), 30 cm (W), 14.5 cm (H) | |
| Glass coverslip (18 × 18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
| HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 342-01375 | |
| Microscope slide (76 × 26) | MATSUNAMI | S2441 | |
| Paraffin film | Bemis | PM-996 | |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 162-16065 | |
| Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-00013 | |
| UBQpro::NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro::NGCN) | provided by Dr. Kurihara | ||
| Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
| Vacuum pump | AS One | AS-01 | |
| Vibrating micro-slicer | DOSAKA | DTK-3000 | |
| Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |
References
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
- Hasegawa, J., et al. Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique. Plant and Cell Physiology. 57 (3), 462-472 (2016).
- Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. A versatile optical clearing protocol for deep tissue imaging of fluorescent proteins in Arabidopsis thaliana. PLoS One. 11 (8), 0161107 (2016).
- Pandey, K. B., et al. Plant roots sense soil compaction through restricted ethylene diffusion. Science. 371 (6526), 276-280 (2021).
- Ejaza, M., Bencivenga, S., Tavaresa, R., Busha, M., Sablowski, R. ARABIDOPSIS THALIANA HOMEOBOX GENE 1 controls plant architecture by locally restricting environmental responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (17), (2021).
- Smetana, O., et al. High levels of auxin signalling define the stem-cell organizer of the vascular cambium. Nature. 565 (7740), 485-489 (2019).
- Chu, T. T. H., et al. Sub-cellular markers highlight intracellular dynamics of membrane proteins in response to abiotic treatments in rice. Rice. 11 (1), 23 (2018).
- Nagaki, K., Yamaji, N., Murata, M. ePro-ClearSee: A simple immunohistochemical method that does not require sectioning of plant samples. Scientific Reports. 7, 42203 (2017).
- Sato, M., Akashi, H., Sakamoto, Y., Matsunaga, S., Tsuji, H. Whole-tissue three-dimensional imaging of rice at single-cell resolution. International Journal of Molecular Sciences. 23 (1), 40 (2022).
- Matsuo, T., Hoshikawa, K.
- Kobayashi, K., et al. Inflorescence meristem identity in rice is specified by overlapping functions of three AP1/FUL-Like MADS box genes and PAP2, a SEPALLATA MADS box gene. Plant Cell. 24 (5), 1848-1859 (2012).
- Tamaki, S., et al. FT-like proteins induce transposon silencing in the shoot apex during floral induction in rice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (8), 901-910 (2015).
- Kodama, Y. Time gating of chloroplast autofluorescence allows clearer fluorescence imaging In Planta. PLoS One. 11 (3), 0152484 (2016).
- Sakamoto, Y., et al. Improved clearing method contributes to deep imaging of plant organs. Communications Biology. 5 (1), 12 (2022).
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Nagahara, S., Higashiyama, T. ClearSeeAlpha: Advanced optical clearing for whole-plant imaging. Plant and Cell Physiology. 62 (8), 1302-1310 (2021).
