Denne protokollen beskriver en renseteknikk for risskudd, som er vanskelig å forberede for interne strukturelle observasjoner på grunn av vevets harde, tykke eller lagdelte natur. Denne metoden muliggjør kontinuerlige og dype fluorescensobservasjoner, selv i voksne risplanter.
Den nylig utviklede clearingteknologien som eliminerer brytningsindeksfeil og reduserer autofluorescerende materiale, har gjort det mulig å observere plantevev i tre dimensjoner (3D) samtidig som de opprettholder sine indre strukturer. I ris (Oryza sativa L.), en monocot-modellplante og en globalt viktig avling, har clearingteknologi blitt rapportert i organer som er relativt enkle å observere, for eksempel røttene og bladene. Anvendelser av clearingteknologi i shoot apikal meristem (SAM) og stengler er også rapportert, men bare i begrenset grad på grunn av dårlig penetrasjon av clearingløsningen (CS) i disse vevene. Den begrensede effektiviteten til clearingløsningene i disse vevene har blitt tilskrevet autofluorescens, fortykning og herding av vevene i stammen ettersom vaskulære bunter og epidermis utvikler seg og lagdeling av SAM med vannavvisende blader. Denne protokollen rapporterer optimalisering av en clearing-tilnærming for kontinuerlig og 3D-observasjon av genuttrykk fra SAM / ung panicle til bunnen av skuddene under utvikling. Faste vevsprøver som uttrykker en fluorescerende proteinreporter ble trimmet inn i seksjoner ved hjelp av en vibrerende mikroskjærer. Når en passende tykkelse ble oppnådd, ble CS påført. Ved å spesifikt målrette mot det sentrale vevet økte penetrasjonshastigheten og ensartetheten til CS, og tiden som kreves for å gjøre vevet gjennomsiktig, reduseres. I tillegg gjorde rydding av de trimmede seksjonene det mulig å observere den interne strukturen til hele skuddet fra et makroperspektiv. Denne metoden har potensielle anvendelser i dyp avbildning av vev av andre plantearter som er vanskelige å fjerne.
Nylig utviklet clearingteknologi har gjort det mulig å observere plantens dype vev samtidig som de opprettholder sin indre struktur 1,2,3. I dikotmodellanlegget Arabidopsis har mange studier på fluorescerende proteinavbildning blitt utført ved hjelp av clearingteknologi for å eliminere brytningsindeksfeil og fjerne autofluorescerende materialer 4,5,6. Selv om bruk av clearingteknologi7,8 og 3D-avbildning ved cellulær oppløsning9 er rapportert i ris (Oryza sativa L.), en monocot-modellplante og en globalt viktig avling, er disse begrenset til relativt tynne og myke organer, som røtter, blader og skyte apikal meristem (SAM), som er enkle å observere.
Skuddet er hovedorganet som utgjør de overjordiske delene av karplanter. I ris består skuddene av en serie vertikalt stablede “fytomerer”, som består av aksillære knopper, blader og stammen10. På spissen av skytingen består SAM av utifferentierte stamceller i midten. Fytomerer dannes ved differensiering av celler avledet fra SAM. Etter at plantene skifter fra vegetativ til reproduktiv fase, strekker risstengler seg og SAM skiller seg ut i unge panicles10. Denne utviklingsendringen er ledsaget av svingninger i uttrykket av ulike gener i stilkene og SAM / unge panicles. For å forstå mekanismene som ligger til grunn for celledifferensiering i ulike vev, er det viktig å strukturelt observere cellemorfologien og genuttrykket i indre skuddvev. Imidlertid gir den dype avbildningen av stengler (noder og internoder) i skuddet en utfordring på grunn av ineffektiviteten til clearingløsninger for å trenge inn i vevet. Stengler gjennomgår umiddelbart en rask volumøkning fra lateral vekst etter differensiering fra SAM. Herdingen av risknutevevet på grunn av fortykning av vaskulære bunter og den horisontale komplekse koblingen av nodal vaskulær anastomose, i tillegg til den høye avstøtningen av risskudd, bidrar alle til å begrense penetrering av CS i stengler10.
Denne studien hadde som mål å observere endringer i genuttrykk i risskuddvev ved hjelp av en strukturell dyp fluorescensteknikk. Dette arbeidet optimaliserer en clearingprotokoll for ris for kontinuerlig å observere genuttrykk fra SAM / ung panicle til basen i en 3D-struktur, i stedet for på en flat overflate, ved hjelp av et konfokalt lasermikroskop.
Kritiske trinn i protokollen
De kritiske trinnene i denne protokollen er fiksering og trimming. Risskudd har hardt, tykt eller lagdelt vev som begrenser penetrasjon av fikseringsløsningen. For å forbedre permeabiliteten til den fiksative løsningen ble den ene siden av vevet tynt barbert ved prøvetaking, som vist i figur 1E-F. I tillegg ble vakuumbehandlingene gjentatt to ganger ved bruk av høyere trykk. Videre ble prøvene fiksert over natten ved 4 °C i stedet for vanlig 2 timers fiksering ved 4 °C.
Nøkkelpunktet i trimmingstrinnet er å bestemme tykkelsen på vevet som skal være forberedt på å observere fluorescerende proteiner samtidig som de opprettholder sin indre struktur etter en kort periode med CS-behandling. Som vist i figur 2C ble de 1 mm tykke prøvene, håndtrimmet så tynne som mulig, gjennomsiktige i bare et begrenset antall vev selv etter 3 måneders CS-behandling. Derfor er trimmingstrinnet viktig for dyp fluorescensobservasjon av voksne risskudd. I denne studien ble prøvene trimmet til en tykkelse på 130 μm, som vist i figur 2D. Tykkelsen på 130 μm tillot å rydde bladene etter 1 uke med CS-behandling og hele prøven etter 2 uker. Voksne risskudd på 9-10 LS ble brukt i denne studien. Tykt, men mykere vev fra yngre risskudd kan fjernes raskere med CS-behandlingen. Tykkelsen på prøvene og varigheten av CS-behandlingen bør justeres i henhold til vevstype, tilstand og tykkelse på 3D-strukturen som skal observeres.
Modifikasjoner og feilsøkingsmetoder
CS falt lett ut ved lave temperaturer. Den utfelte CS kan ikke bevare fluorescerende proteiner; Derfor må det utvises forsiktighet ved lagring av prøvene ved riktig temperatur. I tillegg har både CS og fikseringsløsning ingen antiseptisk effekt; Derfor vil fluorescerende proteiner nedbrytes hvis de er forurenset. Jorddyrket ris er utsatt for soppvekst; Prøvetaking og håndtering av prøver må derfor utføres med forsiktighet for å unngå forurensning.
Overflødig fluorescerende fargestoffer i bufferen kan avgi bakgrunnsfluorescens og forstyrre mikroskopiske observasjoner. For eksempel ble en calcofluor hvit løsning som inneholder Evans blå fargestoff tidligere brukt. Etter farging i 1 time og vask i 1 time ble de fluorescerende proteinene til OsMADS15-mOrange observert ved bruk av en 555 nm laser. Imidlertid kunne fluorescerende proteiner ikke observeres på grunn av bakgrunnsfluorescensen avledet fra Evans blå fargestoff. Denne bakgrunnsfluorescensen ble nesten eliminert ved å vaske prøvene i 2 timer. Dessuten var de fluoriserende proteinene tydeligere hvis prøvene ble liggende over natten. Derfor ble en ren kalkofluor hvit løsning brukt i denne studien. Bakgrunnsfluorescens avledet fra det fluorescerende fargestoffet bør kontrolleres ved hjelp av forskjellige laserbølgelengder før observasjoner.
Begrensninger av metoden
Som vist i figur 3 ble det observert dype fluorescerende proteiner i prøvene som var 130 μm tykke etter 2 ukers CS-behandling. Dette samsvarer med resultatene vist i figur 2D, hvor den 130 μm tykke prøven ble gjennomsiktig etter 2 ukers CS-behandling. Imidlertid, som vist i figur 3A, var autofluorescens av cytoplasma fortsatt merkbar i nodene etter 2 uker og ble først fullstendig fjernet etter 4 ukers CS-behandling. Noder har høy celletetthet og krever derfor lengre tid å fjerne autofluorescerende materialer.
Som vist i figur 3C ble dype fluorescerende proteiner observert i bladene uten CS-behandling, men lysstyrken var svakere enn i noder og internoder på samme dybde på 20 μm. Etter 1 uke med CS-behandling var de fluorescerende proteinene lysere. Klorofyll er rikelig i blader og absorberer 488 nm eksitasjonslys. De har også oransje / rød autofluorescens, som kan forstyrre observasjonen av fluorescerende proteiner ved hjelp av en 555 nm laser. Etter 1 ukes CS-behandling ble klorofyll og andre autofluorescerende materialer fjernet, noe som resulterte i bilder med høyt signal/støy-forhold.
Dybden som kunne observeres i vev etter 2 uker og 4 ukers CS-behandling var ikke signifikant forskjellig, selv om de fluorescerende proteinene virket svakere etter 4 uker (figur 3). Normalt svekkes lysstyrken til fluorescerende proteiner og autofluorescens med tiden, noe som resulterer i et høyere signal-til-støy-forhold. Derfor kan fluorescerende proteiner observeres tydeligere ved å justere mikroskopiske forhold og bildebehandling. Basert på disse resultatene ble det konkludert med at 2 ukers CS-behandling kunne lette observasjonen av dype fluorescerende proteiner, gitt våre prøveforhold. Imidlertid er det nødvendig med 4 uker for å observere klarere bilder som helt utelukker de autofluorescerende materialene.
Strukturer med sterk autofluorescens, som vaskulære bunter og flerarmsceller, kan ikke fjernes i CS. For å observere disse strukturene uten autofluorescens, er det nødvendig å bruke en tidsgivende metode12 eller å oppnå bilder ved spektroskopi av fluorescensspekteret. Et to-foton mikroskop kan være mer egnet for å observere dypere vev hvis tykkere vev observeres.
Metodens betydning i forhold til eksisterende og alternative metoder
Vanligvis har de indre strukturer av ris planter blitt observert ved hjelp av enten cryostat eller vibratome seksjonering. En cryostat er egnet for å forberede tynne seksjoner, noe som gjør det lettere å observere, men forberedelsen av prøvene og driften av utstyret er tidkrevende. Det er også vanskelig å rekonstruere den opprinnelige 3D-strukturen fra tynne seksjoner. Vibratomen er relativt enkel å betjene og egnet for produksjon av tykke seksjoner. Imidlertid tillater tykke deler av målvev bare observasjoner av kuttoverflaten og ikke dype vev som lyset ikke kan nå. Av disse grunner er ingen av metodene egnet for dypfluorescensobservasjoner.
Denne studien adresserte utfordringer i dyp fluorescensobservasjon i risskudd, for eksempel den begrensede vevspenetrasjonen av CS og den dårlige objektoppløsningen under et konfokalt mikroskop, ved å kombinere eksisterende metoder. Som vist i figur 4 observerte vi fluorescerende proteiner (OsMADS15-mOrange) uttrykt i det dype vevet av voksne risskudd fra den unge panicle til basen. Figur 4D fokuserer på buketten og viser dype fluorescerende proteiner med 3 μm intervaller. Vev over −130 μm dybde ble observert etter 2 ukers CS-behandling, men bare vev innenfor −27 μm dybde ble observert (data ikke vist) i buketten i samme størrelse og vekststadium uten CS-behandling. Den nåværende forbedrede protokollen tillot observasjon ikke bare av overekspresjon av gener, men også naturlig genuttrykk i det dype vevet av voksne risskudd.
Metodens betydning og mulige anvendelser i spesifikke forskningsområder
Denne protokollen, som optimaliserer den dype fluorescensobservasjonen av voksne risskudd, muliggjør effektiv rydding av hardt, tykt eller lagdelt vev ved å trimme av unødvendige vev og øke permeabiliteten til CS. I tillegg ble tykkelsen på prøvene for analyse optimalisert for å tillate kontinuerlig og strukturell dyp fluorescensobservasjon ved hjelp av et konfokalt lasermikroskop, som normalt ikke kan løse tykt eller ugjennomsiktig vev.
Det er vanskelig å sammenligne risprøver i forskjellige vekststadier fordi fluorescerende proteiner nedbrytes over tid i fikserings- og PBS-løsningene. Imidlertid kan fluorescerende proteiner i CS lagres i mer enn 5 måneder1. Den lange holdbarheten til CS er en stor fordel for dyp fluorescensobservasjon i ris.
Nylig har mange clearing-teknologier blitt utviklet, noe som gjør det mulig å observere dype vev i 3D samtidig som de opprettholder sine interne strukturer. Disse teknologiene har fortsatt å utvikle seg, og nye clearingløsninger er utviklet. Et godt eksempel er iTOMEI14, som muliggjør effektiv klorofyllfjerning og lysere fluorescensdeteksjon. Et annet eksempel er ClearSeeAlpha15, som forhindrer av vev under rydding av behandling og får dem til å virke gjennomsiktige. Å kombinere disse clearingløsningene med dagens metode kan muliggjøre mer effektiv clearing.
Det forventes at den nåværende metoden vil bidra til å få ny innsikt gjennom dyp avbildning av ikke bare ris, men også andre planter.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. R. Terada, Dr. Z. Shimatani og Dr. H. Tsuji for å gi oss OsMADS15-mOrange frø; Dr. D. Kurihara for å gi oss NGCN-konstruksjonen; og Dr. R. Shim for redigering av manuskriptet vårt. Dette arbeidet ble finansiert av JSPS KAKENHI (tilskuddsnummer JP20H05912, 20H05778, 20H05779) og av SATREPS-programmet (nr. JPMJSA1706) fra JST og JICA.
1.5 mL microcentrifuge tube | BIO-BIK | ST-0150F | |
12-multiwell plate | Corning | 353043 | |
50 mL conical tube | Corning | 352070 | |
Calcofluor white solution | Sigma-Aldrich | 910090 | |
ClearSee | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 031-25151 | This can be made or purchased. |
Confocal laser microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
Desiccator | SANPLATEC | Custom made of acrylic. 30 cm (L), 30 cm (W), 14.5 cm (H) | |
Glass coverslip (18 × 18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 342-01375 | |
Microscope slide (76 × 26) | MATSUNAMI | S2441 | |
Paraffin film | Bemis | PM-996 | |
Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 162-16065 | |
Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | |
Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-00013 | |
UBQpro::NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro::NGCN) | provided by Dr. Kurihara | ||
Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
Vacuum pump | AS One | AS-01 | |
Vibrating micro-slicer | DOSAKA | DTK-3000 | |
Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |