Summary
В настоящем протоколе описывается метод очистки побегов риса, которые трудно подготовить для внутренних структурных наблюдений из-за твердого, толстого или слоистого характера тканей. Этот метод облегчает непрерывные и глубокие флуоресцентные наблюдения даже у взрослых рисовых растений.
Abstract
Недавно разработанная технология очистки, которая устраняет несоответствия показателей преломления и уменьшает автофлуоресцентный материал, позволила наблюдать ткани растений в трех измерениях (3D) при сохранении их внутренних структур. В рисе (Oryza sativa L.), однодольном модельном растении и глобально важной культуре, технология очистки была зарегистрирована в органах, которые относительно легко наблюдать, таких как корни и листья. Также сообщалось о применении технологии очистки в побеговой апикальной меристеме (SAM) и стеблях, но только в ограниченной степени из-за плохого проникновения очищающего раствора (CS) в эти ткани. Ограниченная эффективность очищающих растворов в этих тканях объясняется автофлуоресценцией, утолщением и затвердеванием тканей в стволе по мере развития сосудистых пучков и эпидермиса и наслоения SAM водоотталкивающими листьями. В настоящем протоколе сообщается об оптимизации клирингового подхода для непрерывного и 3D-наблюдения экспрессии генов от SAM/молодой метелки до основания побегов во время развития. Фиксированные образцы тканей, экспрессирующие флуоресцентный репортер белка, были разрезаны на участки с использованием вибрационного микросайсера. Когда была достигнута соответствующая толщина, применялся CS. При целенаправленном нацеливании на центральную ткань скорость проникновения и однородность КС увеличивались, а время, необходимое для того, чтобы сделать ткань прозрачной, уменьшалось. Кроме того, очистка обрезанных участков позволила наблюдать внутреннюю структуру всей съемки с макроперспекции. Этот метод имеет потенциальное применение в глубокой визуализации тканей других видов растений, которые трудно очистить.
Introduction
Недавно разработанная технология очистки позволила наблюдать глубокие ткани растений при сохранении их внутренней структуры 1,2,3. В дикот-модельном растении Arabidopsis многие исследования по флуоресцентной визуализации белка были проведены с использованием технологии очистки для устранения несоответствий показателей преломления и удаления автофлуоресцентных материалов 4,5,6. Хотя использование технологии очистки 7,8 и 3D-визуализации с клеточным разрешением9 было зарегистрировано в рисе (Oryza sativa L.), однодольном модельном растении и глобально важной культуре, они ограничены относительно тонкими и мягкими органами, такими как корни, листья и побег апикальной меристемы (SAM), которые легко наблюдать.
Побег является главным органом, составляющим надземные части сосудистых растений. В рисе побеги состоят из ряда вертикально сложенных «фитомеров», включающих подмышечные почки, листья и стебель10. На кончике побега SAM состоит из недифференцированных стволовых клеток в центре. Фитомеры образуются путем дифференцировки клеток, полученных из SAM. После того, как растения переходят из вегетативной в репродуктивную фазу, стебли риса удлиняются и SAM дифференцируется в молодые метелки10. Это изменение развития сопровождается колебаниями экспрессии различных генов в стеблях и SAM/молодых метелках. Чтобы понять механизмы, лежащие в основе дифференцировки клеток в различные ткани, важно структурно наблюдать морфологию клеток и экспрессию генов во внутренних тканях побега. Однако глубокая визуализация стеблей (узлов и междоузлий) в побеге представляет собой проблему из-за неэффективности очищающих растворов для проникновения в ткань. Стебли сразу же подвергаются быстрому увеличению объема от бокового роста после дифференциации от SAM. Затвердевание тканей рисового узла из-за утолщения сосудистых пучков и горизонтального сложного звена узлового сосудистого анастомоза, помимо высокой репеллентности побегов риса, все это способствует ограничению проникновения КС в стебли10.
Это исследование было направлено на наблюдение за изменениями экспрессии генов в тканях рисовых побегов с использованием метода структурной глубокой флуоресценции. Эта работа оптимизирует протокол очистки риса, чтобы непрерывно наблюдать экспрессию генов от SAM / молодой метелки до основания в 3D-структуре, а не на плоской поверхности, используя конфокальный лазерный микроскоп.
Protocol
1. Приготовление фиксирующего раствора
- Переложите 70 мл стерильной воды в стеклянную бутылку и добавьте 10 г параформальдегида (PFA).
ВНИМАНИЕ: PFA токсичен; следовательно, рекомендуется носить перчатки. - Добавьте 2 мл 1 N NaOH для растворения раствора PFA.
- Растворить раствор PFA при непрерывном перемешивании (300-500 об/мин) при 60 °C в течение примерно 1 ч до тех пор, пока раствор PFA не станет прозрачным.
- Добавьте стерилизованную воду, чтобы увеличить объем раствора PFA до 100 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием раствор PFA готовили свежим способом. Кроме того, раствор PFA, хранящийся при 4 °C, можно использовать в течение приблизительно 2 месяцев. - Непосредственно перед отбором проб добавьте 25 мл 60 мМ HEPES (рН 7,4), 3 мл 1 М сахарозы и 2 мл стерильной воды в 20 мл 10% PFA для приготовления фиксаторного раствора 50 мл.
2. Приготовление клирингового раствора (КС)
- Взвесьте и смешайте 7,5 г дезоксихолата натрия, 5 г ксилита и 12,5 г мочевины (см. Таблицу материалов) в 50 мл стерильной воды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Порошок дезоксихолата натрия взвешивали в общелабораторной тягловой камере для предотвращения рассеивания в воздухе. - Растворите ингредиенты (этап 2.1.) с помощью магнитной мешалки для приготовления CS.
ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании использовалось внутренне подготовленное клиринговое решение (CS), но также может быть использовано коммерчески доступное клиринговое решение ClearSee (см. Таблицу материалов). - Переложите CS в коническую трубку объемом 50 мл и храните ее при комнатной температуре (15-30 °C) в темноте.
ПРИМЕЧАНИЕ: CS может храниться более 1 года.
3. Отбор проб
- Тщательно обрежьте корни, не повредив растения. Вымойте растения водой, чтобы удалить грязь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод изучал наблюдение за тканями от трехлистной стадии (LS) до флага LS. В настоящем исследовании использовались сорта риса Nipponbare (Nip) и Taichung 65 (T65) при 8-10 LS. - Снимите старые внешние листья руками и пинцетом. Осталось около 2-3 листьев.
- Отрежьте ткань от SAM/молодой метелки до основания однолезвийной бритвой скользящим движением, чтобы избежать дробления клеток (рисунок 1A-C). Если положение SAM/молодой метелки не видно, подрежьте ее дольше.
- Поскольку поперечное сечение побега риса имеет овальную форму (рисунок 1D), сбрите одну сторону овала тонко в направлении его длинной оси обоюдоострой бритвой (рисунок 1E-F).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг облегчил проникновение фиксаторного раствора в образец. Горизонтальная режущая поверхность облегчает прилипание образца к вибрационному лотку микросайсера (см. Таблицу материалов). - Подтвердите положение SAM/молодой метелки появлением беловатого цвета в образце (рисунок 1G). Обрежьте лишнюю ткань.
ПРИМЕЧАНИЕ: Длина образца должна быть отрегулирована до максимальной длины, которая может быть обрезана с помощью вибрационного микросайсера. Если образец слишком длинный, разделите его на несколько частей.
4. Фиксация образцов
- Пипетка 1 мл фиксирующего раствора (приготовленного на стадии 1.) до микроцентрифужной трубки объемом 1,5 мл и сразу же помещается в образцы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что количество образца не превышает 20% от объема фиксирующего раствора. - Нарежьте кусок парафиновой пленки на 2,5см2. Сформируйте парафиновую пленку в шарики и поместите их поверх образцов, чтобы они не выплывали из фиксирующего раствора.
- Поместите пробирку, содержащую образец, в осушитель. Затем закройте крышку осушителя и запустите вакуумный насос, чтобы разгерметизировать внутреннюю часть осушителя до −0,095 МПа медленно.
- После закрытия осушителя при −0,095 МПа выключите вакуумный насос и дайте ему постоять 30 мин при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Уровень вакуума был таким, что в образцах постепенно появлялись пузырьки. - Слегка откройте осушитель и медленно верните его к атмосферному давлению. Уменьшите давление осушителя до −0,095 МПа, выключите вакуумный насос и дайте смеси постоять 30 мин при комнатной температуре.
- Слегка откройте осушитель и медленно верните его к атмосферному давлению. Если образец правильно зафиксирован, он погружается в фиксирующий раствор. Если он не опустился, снова уменьшите давление.
- Снимите парафиновую пленку, закройте крышку и держите трубки в течение ночи при температуре 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы фиксировали в фиксаторном растворе не менее 2 ч. Он может храниться в течение ~ 1 недели.
5. Обрезка фиксированного образца
- Удалите излишки фиксирующего раствора из образца с помощью безворсовых салфеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избыток фиксирующего раствора препятствует правильному прилипанию образца к лотку. - Закрепите образец на вибрационном лотке микросайсера с помощью мгновенного клея. Поместите его на лоток плоской стороной вниз, который был сбрит во время отбора проб.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за структуры рисового побега его необходимо обрезать от основания к SAM/молодой метелке. - Установите условия обрезки в соответствии с фиксированным образцом.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании обрезка была установлена на THICK, 130 мкм; ШИРОКИЙ, 15 мм; ЧАСТОТА, 15%; и СКОРОСТЬ РЕЗАНИЯ, 32 мм. - Отрегулируйте положение образца с помощью кнопки RVS или FWD и кнопки UP или DOWN . Наполните лоток деионизированной водой до тех пор, пока все образцы не будут погружены. После заполнения лотка нажмите кнопку START . Поместите обрезанные образцы на стеклянную горку с каплей 1x PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сдвигайте положение образца на другую сторону после каждой обрезки, так как твердый образец изнашивает лезвие бритвы. - После проверки образца, содержащего целевой участок, под стереомикроскопом перенесите обрезанный образец на многоязычную пластину с 1 мл 1x PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите количество скважин в соответствии с размером пробы. В этом исследовании использовалась 12-многолуночная пластина.
6. Обработка очищающим раствором
- Снимите 1x PBS с многолуночной пластины и добавьте свежий 1x PBS. Дайте постоять 1 мин.
- Удалите 1x PBS и добавьте CS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество CS должно быть в пять раз больше объема выборки. - Поместите многоскважинную пластину, содержащую образец, в осушитель. Затем закройте крышку осушителя и запустите вакуумный насос, чтобы разгерметизировать внутреннюю часть адсорбтора до -0,09 МПа медленно.
- После закрытия осушителя при −0,09 МПа выключите вакуумный насос и дайте ему постоять в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Слегка откройте осушитель и медленно верните его к атмосферному давлению.
- Налейте деионизированную воду в зазор между скважинами, чтобы предотвратить испарение CS. Храните многоскважинные пластины при комнатной температуре в темноте для очистки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно встряхивайте многоязычную пластину каждые 1-2 дня, чтобы диффундировать хлорофилл и другие компоненты. - Когда CS станет зеленым, замените его свежим раствором.
7. Окрашивание клеточной стенки химическим красителем
- Пипетку белого раствора калькофтора (1 мл, конечная концентрация: 1 мг/мл в очищающем растворе, см. Таблицу материалов) в многоязычную пластину. Поместите образцы в раствор красителя и инкубируйте в течение 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем красителя не должен превышать 10% от объема КС. - Промывайте окрашенные образцы в другой многоязычной пластине с 1 мл CS в течение не менее 1 ч.
8. Наблюдение с помощью конфокального лазерного микроскопа
- Поместите каплю CS на предметное стекло микроскопа и перенесите обработанные (с CS) образцы на слайд.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку обработанные образцы мягкие, с ними необходимо осторожно обращаться пинцетом. - Накройте образец стеклянной крышкой, чтобы предотвратить испарение CS.
ПРИМЕЧАНИЕ: CS легко выпадает в осадок. - Понаблюдайте за обработанными образцами под конфокальным лазерным микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: После наблюдения обработанные образцы могут быть возвращены в CS для дальнейших наблюдений позже.
Representative Results
Во-первых, степень, в которой твердые и толстые ткани взрослых рисовых растений могут быть сделаны прозрачными с помощью очистки, была подтверждена. Использовались нип на 9-10 LS, который является стадией формирования метелки, и ткани длиной 12-16 мм, вырезанные из молодой метелки до основания побега. Эти образцы, включая молодую метелку, фиксировали в фиксаторном растворе и наблюдали до и после 1-4 недель очистительной обработки (рисунок 2). Необрезанные образцы оставались зелеными и не становились прозрачными через 4 недели или даже после 3 месяцев лечения очищающим раствором (рисунок 2А). В образцах, которые были очищены от всех листьев, междоузлия стали белыми после 1 недели обработки КС, хотя узлы остались зелеными. Этот образец не стал прозрачным через 4 недели (рисунок 2B). Через 3 месяца лечения КС прозрачной стала только молодая метель. Обрезанные вручную образцы изменились на белые, за исключением наружных листьев и сосудистых пучков, после 1 недели лечения КС. Некоторые части листьев, молодая метель и междоузлия стали полупрозрачными, но не стали прозрачными через 4 недели (рисунок 2C). Через 3 месяца прозрачной стали только молодая метель и внутренние листья. Образцы, которые были обрезаны до толщины 130 мкм с помощью вибрирующего микросайсера, стали полупрозрачными после 1 недели обработки CS, при этом листья стали прозрачными. Через 2 недели образец был почти прозрачным и оставался неизменным через 4 недели (рисунок 2D). Через 3 месяца образцы стали полностью прозрачными.
Затем была подтверждена глубина, на которую очистка позволила наблюдать экспрессию генов в побеге T65 на 8 LS. Использовались экспрессированные побеги UBQpro::NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro::NGCN, см. Таблицу материалов). Образцы тканей фиксировали в фиксаторном растворе перед обрезкой их до толщины 130 мкм с помощью вибрационного микросайсера. Затем образцы наблюдали под конфокальным лазерным микроскопом (лазер: 488 нм/ 13%, объектив: 20x, точечное отверстие: 0,93 а.е., среднее значение: 16, усиление детектора: 800) с интервалом 10 мкм в направлении оси Z каждую неделю от 0-4 недель лечения CS. Репрезентативные результаты показаны на рисунке 3. Все цифры были скорректированы с одинаковой обработкой для сравнения интенсивности флуоресценции. В узле без обработки наблюдались слабые флуоресцентные сигналы на глубине −40 мкм (рисунок 3А). Наблюдаемая глубина составляла −60 мкм после 1 недели лечения CS и −90 мкм через 2 недели, но автофлуоресценция цитоплазмы была заметна в обе недели на глубине −20 мкм. Аутофлуоресценция стала несколько слабее через 3 недели и больше не была видна через 4 недели. Флуоресцентные сигналы наблюдались на глубине −80 мкм через 3 недели и на глубине −100 мкм через 4 недели. В интерноде флуоресцентные сигналы наблюдались на глубине −60 мкм без обработки CS (рисунок 3B). Наблюдаемая глубина составляла −90 мкм через 1 неделю до 3 недель лечения CS и −100 мкм через 4 недели, но аутофлуоресценция в цитоплазме была заметна на глубине −20 мкм через 1 неделю. Автофлуоресценция больше не была видна через 2 недели. В листьях флуоресцентные сигналы наблюдались на глубине −90 мкм без обработки CS (рисунок 3C). Флуоресцентные сигналы наблюдались глубже в листьях, чем в узлах и междоузлиях. Однако флуоресцентные сигналы были слабее. Флуоресцентные сигналы стали четкими после 1 недели лечения КС и наблюдались на глубине −120 мкм. Через 2 недели и 3 недели флуоресцентные сигналы наблюдались на глубине −110 мкм, а через 4 недели — на глубине −120 мкм.
Наконец, наблюдалась экспрессия транскрипционного фактора OsMADS1511 , слитого с мОранжем12 , который регулирует переход SAM из вегетативной в репродуктивную фазу13. Образцы тканей из Nip на 10 LS с OsMADS15-mOrange фиксировали, обрезали до толщины 130 мкм и обрабатывали CS в течение 2 недель. На рисунке 4 показано, что очищающий раствор может быть использован одновременно для наблюдения флуоресцентных белков (OsMADS15-mOrange) естественной экспрессии генов и окрашивания флуоресцентным красителем (калькофтор белый). Наблюдался весь цветок на глубинах от 0 до −130 мкм, а 3D-изображение реконструировали из 43 z-стековых изображений с интервалом 3 мкм (рисунок 4E).
Рисунок 1: Положение для отбора проб и обработка. (A) Пресечь рассаду при 8 LS в условиях короткого дня. (B) Увеличенный вид основания. (C) Выборка, вырезанная из SAM/молодой метелки к основанию. D) овальное поперечное сечение от C (вставка). (E) Тонко сбривая одну сторону побега лезвием. (F) Тонко выбритая поверхность. G) Образец, показывающий междоузливое удлинение. Беловатый участок, обозначенный наконечниками стрелок, является узлами. Верхняя сторона верхнего узла имеет молодую метелку. Шкала стержней: (A) 10 см, (B-C, E-G) 1 см, (D) 0,5 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Очистка тканей зависит от толщины образца и периода обработки CS. (A) Необрезанные образцы с частичными побегами, включая молодую метелку. Максимальная толщина: 4 мм. (B) Все листья отслоились от образцов, чтобы обнажить молодую метелку. Максимальная толщина: 2,5 мм. yp: молодая метель, в: междоузлие; наконечники стрелок обозначают узел. (C) Образцы, которые были вручную обрезаны до толщины 1 мм. (D) Образцы, обрезанные вибрационным микросайсером до толщины 130 мкм. Шкала: 5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Глубина флуоресцентного наблюдения зависит от типа ткани и периода лечения КС. Глубокая визуализация UBQpro::NGCN в (A) узле, (B) междоузловном и (C) листе. «Слияние» означает, что изображения были объединены с изображением дифференциального интерференционного контраста (DIC) и всеми изображениями z-стека. Изображения, на которых не наблюдалась флуоресценция, были помечены как «n.d.». (не обнаружено). Настройки конфокальной лазерной микроскопии следующие: лазер: лазер: 488 нм/13%, объектив: 20x, точечное отверстие: 0,93 а.е., усреднение: 16, усиление детектора: 800, интервал: 10 мкм. Шкала: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Наблюдение за глубокой флуоресценцией OsMADS15-mOrange. (A) DIC-изображение Nip на 10 LS. yp: молодая метель, le: лист, no: узел, в: междоузлие; наконечники стрел указывают на цветочки. (B) Флуоресцентное изображение OsMADS15-mOrange. Желтые точки указывают на флуоресцентные белки OsMADS15-mOrange в ядре. Клеточную стенку окрашивали в голубой цвет белым раствором калькофтора. (C) Увеличенный вид молодой метелки. (D) Глубокая визуализация цветка. pa: палея, le: лемма, fm: цветочная меристема; звездочками обозначены тычинки примордии. Конфокальный лазерный микроскоп был установлен следующим образом: OsMADS15-mOrange; лазер: 555 нм/13%, объектив: 20x, точечное отверстие: 0,96 а.е., среднее значение: 16, усиление детектора: 800, интервал: 3 мкм. Кальцифтор белый; лазер: 405 нм/3%, объектив: 20x, точечное отверстие: 0,93 а.е., усреднение: 16, усиление детектора: 470, интервал: 3 мкм. (E) 3D-изображение рисунка (D), построенное из z-стековых изображений. Шкала: (A-B) 1 мм, (C) 500 мкм, (D) 40 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Критические этапы протокола
Критическими шагами в этом протоколе являются фиксация и обрезка. Побеги риса имеют твердые, толстые или слоистые ткани, которые ограничивают проникновение фиксирующего раствора. Для улучшения проницаемости фиксирующего раствора одну сторону ткани тонко выбривали при отборе проб, как показано на рисунке 1E-F. Кроме того, вакуумные обработки повторялись дважды с использованием более высокого давления. Кроме того, образцы фиксировались в течение ночи при 4 °C вместо обычной фиксации в течение 2 часов при 4 °C.
Ключевым моментом на этапе обрезки является определение толщины тканей, которые должны быть подготовлены к наблюдению флуоресцентных белков при сохранении их внутренней структуры после короткого периода лечения CS. Как показано на рисунке 2C, образцы толщиной 1 мм, обрезанные вручную как можно тоньше, стали прозрачными только в ограниченном количестве тканей даже после 3 месяцев лечения CS. Поэтому этап обрезки необходим для глубокого флуоресцентного наблюдения взрослых побегов риса. В этом исследовании образцы были обрезаны до толщины 130 мкм, как показано на рисунке 2D. Толщина 130 мкм позволила очистить листья после 1 недели обработки CS и весь образец через 2 недели. Взрослые побеги риса при 9-10 LS были использованы в этом исследовании. Толстые, но более мягкие ткани из более молодых побегов риса могут быть очищены быстрее с помощью лечения CS. Толщина образцов и продолжительность обработки CS должны быть скорректированы в соответствии с типом ткани, состоянием и толщиной 3D-структуры, которую необходимо наблюдать.
Изменения и методы устранения неполадок
CS легко выпадает в осадок при низких температурах. Осажденный CS не может сохранить флуоресцентные белки; следовательно, необходимо соблюдать осторожность при хранении образцов при надлежащей температуре. Кроме того, как КС, так и фиксирующий раствор не оказывают антисептического действия; поэтому флуоресцентные белки будут разлагаться при загрязнении. Выращенный в почве рис склонен к грибковому росту; следовательно, отбор проб и обработка образцов должны осуществляться с осторожностью, чтобы избежать загрязнения.
Избыток флуоресцентных красителей в буфере может испускать фоновую флуоресценцию и мешать микроскопическим наблюдениям. Например, ранее использовался белый раствор калькофтора, содержащий синий краситель Эванса. После окрашивания в течение 1 ч и промывки в течение 1 ч флуоресцентные белки OsMADS15-mOrange наблюдали с помощью лазера 555 нм. Однако флуоресцентные белки не могли наблюдаться из-за фоновой флуоресценции, полученной из синего красителя Эванса. Эта фоновая флуоресценция была почти устранена путем промывки образцов в течение 2 ч. Более того, флуоресцентные белки были более чистыми, если образцы оставляли на ночь. Поэтому в этом исследовании был использован чистый белый раствор калькофтора. Фоновая флуоресценция, полученная из флуоресцентного красителя, должна быть проверена с использованием различных длин волн лазера перед наблюдениями.
Ограничения метода
Как показано на рисунке 3, глубокие флуоресцентные белки наблюдались в образцах толщиной 130 мкм после 2 недель лечения CS. Это согласуется с результатами, показанными на рисунке 2D, где образец толщиной 130 мкм стал прозрачным после 2 недель лечения CS. Однако, как показано на рисунке 3А, аутофлуоресценция цитоплазмы все еще была заметна в узлах через 2 недели и была полностью удалена только после 4 недель лечения CS. Узлы имеют высокую плотность ячеек и, следовательно, требуют более длительного времени для удаления автофлуоресцентных материалов.
Как показано на рисунке 3C, глубокие флуоресцентные белки наблюдались в листьях без обработки CS, но яркость была слабее, чем в узлах и междоузлиях на той же глубине 20 мкм. После 1 недели лечения CS флуоресцентные белки стали ярче. Хлорофилл в изобилии содержится в листьях и поглощает 488 нм света возбуждения. Они также имеют оранжево-красную автофлуоресценцию, которая может мешать наблюдению флуоресцентных белков с помощью лазера 555 нм. После 1 недели обработки CS хлорофилл и другие автофлуоресцентные материалы были удалены, что привело к получению изображений с высоким соотношением сигнал/шум.
Глубины, которые можно было наблюдать в тканях после 2 недель и 4 недель лечения CS, существенно не отличались, хотя флуоресцентные белки казались слабее через 4 недели (рисунок 3). Обычно яркость флуоресцентных белков и автофлуоресценция со временем ослабевают, что приводит к более высокому соотношению сигнал/шум. Поэтому флуоресцентные белки можно наблюдать более четко, регулируя микроскопические условия и обработку изображений. На основе этих результатов был сделан вывод, что 2 недели лечения CS могут облегчить наблюдение за глубокими флуоресцентными белками, учитывая наши условия выборки. Однако для наблюдения за более четкими изображениями, которые полностью исключают автофлуоресцентные материалы, необходимы 4 недели.
Структуры с сильной аутофлуоресценцией, такие как сосудистые пучки и клетки с несколькими руками, не могут быть очищены в CS. Чтобы наблюдать эти структуры без автофлуоресценции, необходимо использовать метод12 замедления времени или получить изображения методом спектроскопии флуоресцентного спектра. Двухфотонный микроскоп может быть более подходящим для наблюдения более глубоких тканей, если наблюдаются более толстые ткани.
Значение метода по отношению к существующим и альтернативным методам
Как правило, внутренние структуры рисовых растений наблюдались с использованием криостата или вибратомного сечения. Криостат подходит для подготовки тонких срезов, которые позволяют легче наблюдать, но подготовка образцов и работа оборудования отнимают много времени. Реконструкция оригинальной 3D-структуры из тонких участков также затруднена. Вибратом относительно прост в эксплуатации и подходит для производства толстых сечений. Однако толстые участки тканей-мишеней позволяют наблюдать только поверхность разреза, а не глубокие ткани, до которых не может добраться свет. По этим причинам ни один из методов не подходит для наблюдений глубокой флуоресценции.
В этом исследовании рассматривались проблемы глубокого флуоресцентного наблюдения в побегах риса, такие как ограниченное проникновение в ткани CS и плохое разрешение объектов под конфокальным микроскопом, путем объединения существующих методов. Как показано на рисунке 4, мы наблюдали флуоресцентные белки (OsMADS15-mOrange), экспрессируемые в глубоких тканях взрослых побегов риса от молодой метелки до основания. Рисунок 4D фокусируется на цветке и показывает глубокие флуоресцентные белки с интервалом 3 мкм. Ткани глубиной более −130 мкм наблюдались после 2 недель лечения CS, но наблюдались только ткани в пределах глубины −27 мкм (данные не показаны) во флорете при том же размере и стадии роста без лечения CS. Текущий улучшенный протокол позволил наблюдать не только сверхэкспрессию генов, но и естественную экспрессию генов в глубоких тканях взрослых побегов риса.
Важность и потенциал применения метода в конкретных областях исследований
Этот протокол, который оптимизирует глубокое флуоресцентное наблюдение взрослых побегов риса, позволяет эффективно очищать твердые, толстые или слоистые ткани путем обрезки ненужных тканей и повышения проницаемости CS. Кроме того, толщина образцов для анализа была оптимизирована, чтобы обеспечить непрерывное и структурное глубокое флуоресцентное наблюдение с использованием конфокального лазерного микроскопа, который обычно не может разрешать толстые или непрозрачные ткани.
Трудно сравнивать образцы риса на разных стадиях роста, потому что флуоресцентные белки со временем разлагаются в фиксаторных и PBS растворах. Однако флуоресцентные белки в КС могут храниться более 5 месяцев1. Длительный срок хранения CS является основным преимуществом для наблюдения глубокой флуоресценции в рисе.
В последнее время разработано множество клиринговых технологий, позволяющих наблюдать глубокие ткани в 3D при сохранении их внутренних структур. Эти технологии продолжают развиваться, и были разработаны новые клиринговые решения. Хорошим примером является iTOMEI14, который обеспечивает эффективное удаление хлорофилла и более яркое обнаружение флуоресценции. Другим примером является ClearSeeAlpha15, который предотвращает потемнение тканей во время очистки и делает их прозрачными. Сочетание этих клиринговых решений с настоящим методом может обеспечить более эффективную и действенную очистку.
Ожидается, что нынешний метод поможет получить новое понимание за счет глубокой визуализации не только риса, но и других растений.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.
Acknowledgments
Мы благодарим д-ра Р. Терада, д-ра З. Шиматани и д-ра Х. Цудзи за предоставление нам семян OsMADS15-mOrange; Д-р Д. Курихара за предоставление нам конструкции NGCN; и д-р Р. Шим за редактирование нашей рукописи. Эта работа финансировалась JSPS KAKENHI (номера грантов JP20H05912, 20H05778, 20H05779) и программой SATREPS (no. JPMJSA1706) JST и JICA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | BIO-BIK | ST-0150F | |
| 12-multiwell plate | Corning | 353043 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 352070 | |
| Calcofluor white solution | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| ClearSee | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 031-25151 | This can be made or purchased. |
| Confocal laser microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Desiccator | SANPLATEC | Custom made of acrylic. 30 cm (L), 30 cm (W), 14.5 cm (H) | |
| Glass coverslip (18 × 18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
| HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 342-01375 | |
| Microscope slide (76 × 26) | MATSUNAMI | S2441 | |
| Paraffin film | Bemis | PM-996 | |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 162-16065 | |
| Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-00013 | |
| UBQpro::NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro::NGCN) | provided by Dr. Kurihara | ||
| Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
| Vacuum pump | AS One | AS-01 | |
| Vibrating micro-slicer | DOSAKA | DTK-3000 | |
| Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |
References
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
- Hasegawa, J., et al. Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique. Plant and Cell Physiology. 57 (3), 462-472 (2016).
- Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. A versatile optical clearing protocol for deep tissue imaging of fluorescent proteins in Arabidopsis thaliana. PLoS One. 11 (8), 0161107 (2016).
- Pandey, K. B., et al. Plant roots sense soil compaction through restricted ethylene diffusion. Science. 371 (6526), 276-280 (2021).
- Ejaza, M., Bencivenga, S., Tavaresa, R., Busha, M., Sablowski, R. ARABIDOPSIS THALIANA HOMEOBOX GENE 1 controls plant architecture by locally restricting environmental responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (17), (2021).
- Smetana, O., et al. High levels of auxin signalling define the stem-cell organizer of the vascular cambium. Nature. 565 (7740), 485-489 (2019).
- Chu, T. T. H., et al. Sub-cellular markers highlight intracellular dynamics of membrane proteins in response to abiotic treatments in rice. Rice. 11 (1), 23 (2018).
- Nagaki, K., Yamaji, N., Murata, M. ePro-ClearSee: A simple immunohistochemical method that does not require sectioning of plant samples. Scientific Reports. 7, 42203 (2017).
- Sato, M., Akashi, H., Sakamoto, Y., Matsunaga, S., Tsuji, H. Whole-tissue three-dimensional imaging of rice at single-cell resolution. International Journal of Molecular Sciences. 23 (1), 40 (2022).
- Matsuo, T., Hoshikawa, K.
- Kobayashi, K., et al. Inflorescence meristem identity in rice is specified by overlapping functions of three AP1/FUL-Like MADS box genes and PAP2, a SEPALLATA MADS box gene. Plant Cell. 24 (5), 1848-1859 (2012).
- Tamaki, S., et al. FT-like proteins induce transposon silencing in the shoot apex during floral induction in rice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (8), 901-910 (2015).
- Kodama, Y. Time gating of chloroplast autofluorescence allows clearer fluorescence imaging In Planta. PLoS One. 11 (3), 0152484 (2016).
- Sakamoto, Y., et al. Improved clearing method contributes to deep imaging of plant organs. Communications Biology. 5 (1), 12 (2022).
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Nagahara, S., Higashiyama, T. ClearSeeAlpha: Advanced optical clearing for whole-plant imaging. Plant and Cell Physiology. 62 (8), 1302-1310 (2021).
