Summary
Detta protokoll beskriver en röjningsteknik för risskott, som är svåra att förbereda för interna strukturella observationer på grund av vävnadernas hårda, tjocka eller skiktade natur. Denna metod underlättar kontinuerliga och djupa fluorescensobservationer, även i vuxna risplantor.
Abstract
Den nyligen utvecklade röjningstekniken som eliminerar brytningsindexmatchningar och minskar autofluorescerande material har gjort det möjligt att observera växtvävnader i tre dimensioner (3D) samtidigt som deras inre strukturer bevaras. I ris (Oryza sativa L.), en monocotmodellväxt och en globalt viktig gröda, har röjningsteknik rapporterats i organ som är relativt lätta att observera, såsom rötter och löv. Tillämpningar av röjningsteknik i skottapiskt meristem (SAM) och stjälkar har också rapporterats, men endast i begränsad utsträckning på grund av den dåliga penetrationen av clearinglösningen (CS) i dessa vävnader. Den begränsade effektiviteten hos clearinglösningarna i dessa vävnader har tillskrivits autofluorescens, förtjockning och härdning av vävnaderna i stammen när kärlbuntarna och epidermis utvecklas och skiktning av SAM med vattenavvisande löv. Detta protokoll rapporterar optimering av en clearingmetod för kontinuerlig och 3D-observation av genuttryck från SAM / ung panikel till basen av skotten under utveckling. Fasta vävnadsprover som uttrycker en fluorescerande proteinreporter trimmades i sektioner med hjälp av en vibrerande mikroskivare. När en lämplig tjocklek uppnåddes applicerades CS. Genom att specifikt rikta in sig på den centrala vävnaden ökade penetrationshastigheten och enhetligheten hos CS och den tid som krävdes för att göra vävnaden transparent minskade. Dessutom möjliggjorde rensning av de trimmade sektionerna observation av den interna strukturen för hela fotograferingen ur ett makroperspektiv. Denna metod har potentiella tillämpningar vid djupavbildning av vävnader från andra växtarter som är svåra att rensa.
Introduction
Nyligen utvecklad röjningsteknik har gjort det möjligt att observera växternas djupa vävnader samtidigt som deras inre struktur 1,2,3 bevaras. I dikotmodellväxten Arabidopsis har många studier på fluorescerande proteinavbildning utförts med hjälp av clearingteknik för att eliminera brytningsindexmatchningar och avlägsna autofluorescerande material 4,5,6. Även om användningen av clearingteknik7,8 och 3D-avbildning vid cellulär upplösning9 har rapporterats i ris (Oryza sativa L.), en monocotmodellväxt och en globalt viktig gröda, är dessa begränsade till relativt tunna och mjuka organ, såsom rötter, löv och skjuta apikal meristem (SAM), som är lätta att observera.
Skottet är huvudorganet som utgör de ovanjordiska delarna av kärlväxter. I ris består skott av en serie vertikalt staplade "fytomerer", bestående av axillära knoppar, löv och stammen10. Vid skottets spets består SAM av odifferentierade stamceller i mitten. Fytomerer bildas genom differentiering av celler härledda från SAM. Efter att växterna skiftat från vegetativ till reproduktiv fas förlängs risstammarna och SAM differentieras till unga paniklar10. Denna utvecklingsförändring åtföljs av fluktuationer i uttrycket av olika gener i stjälkarna och SAM / unga paniklar. För att förstå mekanismerna bakom celldifferentiering i olika vävnader är det viktigt att strukturellt observera cellmorfologin och genuttrycket i inre skottvävnader. Den djupa avbildningen av stjälkar (noder och internoder) i skottet utgör emellertid en utmaning på grund av ineffektiviteten i clearinglösningar för att tränga in i vävnaden. Stammar genomgår omedelbart en snabb volymökning från lateral tillväxt efter differentiering från SAM. Härdningen av risnodvävnaderna på grund av förtjockningen av kärlbuntarna och den horisontella komplexa länken i nodal vaskulär anastomos, förutom den höga avstötningen av risskott, bidrar alla till att begränsa penetrationen av CS i stjälkar10.
Denna studie syftade till att observera förändringar i genuttryck i risskottvävnader med hjälp av en strukturell djupfluorescensteknik. Detta arbete optimerar ett clearingprotokoll för ris för att kontinuerligt observera genuttryck från SAM / ung panikel till basen i en 3D-struktur, snarare än på en plan yta, med hjälp av ett konfokalt lasermikroskop.
Protocol
1. Beredning av fixeringslösningen
- Överför 70 ml sterilt vatten till en glasflaska och tillsätt 10 g paraformaldehyd (PFA).
VARNING: PFA är giftigt; Därför rekommenderas att bära handskar. - Tillsätt 2 ml 1 N NaOH för att lösa upp PFA-lösningen.
- Lös PFA-lösningen under kontinuerlig omrörning (300–500 rpm) vid 60 °C i ca 1 timme tills PFA-lösningen är transparent.
- Tillsätt steriliserat vatten för att öka volymen av PFA-lösningen till 100 ml.
PFA-lösningen bereddes nyligen före användning. Dessutom kan en PFA-lösning som förvaras vid 4 °C användas i cirka 2 månader. - Tillsätt omedelbart före provtagningen 25 ml 60 mM HEPES (pH 7.4), 3 ml 1 M sackaros och 2 ml sterilt vatten till 20 ml 10 % PFA för att bereda en 50 ml fixativ lösning.
2. Beredning av clearinglösningen (CS)
- Väg och blanda 7,5 g natriumdeoxikolat, 5 g xylitol och 12,5 g urea (se materialtabell) i 50 ml sterilt vatten.
OBS: Natriumdeoxikolatpulver vägdes i en allmän laboratoriekammare för att förhindra luftburen dispersion. - Lös upp ingredienserna (steg 2.1) med hjälp av en magnetomrörare för att bereda cs.
OBS: Den aktuella studien använde en intern förberedd clearinglösning (CS), men en kommersiellt tillgänglig clearinglösning, ClearSee (se materialförteckning), kan också användas. - Överför CS till ett 50 ml koniskt rör och förvara det vid rumstemperatur (15-30 °C) i mörkret.
CS kan lagras i mer än 1 år.
3. Provtagning
- Skär rötterna försiktigt utan att skada växterna. Tvätta växterna med vatten för att ta bort smuts.
OBS: Denna metod studerade observationen av vävnader från trebladsstadiet (LS) till flaggan LS. I den aktuella studien användes rissorterna Nipponbare (Nip) och Taichung 65 (T65) vid 8-10 LS. - Skala av de gamla yttre bladen med händer och pincett. Det var ca 2-3 blad kvar.
- Skär vävnaden från SAM/ungplinten till basen med en enkantig rakhyvel med en glidande rörelse för att undvika att krossa cellerna (figur 1A-C). Om SAM/ungens position inte syns, klipp den längre.
- Eftersom risskottets tvärsnitt har en oval form (figur 1D), raka av ena sidan av ovalen tunt i riktning mot dess långa axel med en tveeggad rakhyvel (figur 1E-F).
OBS: Detta steg gjorde det lättare för fixeringslösningen att tränga igenom provet. En horisontell skäryta gör provet lättare att fästa vid en vibrerande mikroskivare (se materialtabell). - Bekräfta SAM/ungens position genom att se ut som en vitaktig färg i provet (figur 1G). Trimma bort överflödig vävnad.
OBS: Provets längd bör justeras till den maximala längd som kan trimmas med en vibrerande mikroskivare. Om provet är för långt, dela det i flera bitar.
4. Fixering av proverna
- Pipettera 1 ml av fixeringslösningen (beredd i steg 1.) till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och lägg omedelbart i proverna.
OBS: Se till att provmängden inte överstiger 20% av fixeringslösningens volym. - Skär en bit paraffinfilm i 2,5 cm2. Forma paraffinfilmen till bollar och placera dem ovanpå proverna för att förhindra att de flyter ut ur fixeringslösningen.
- Placera röret som innehåller provet i en exsickator. Stäng sedan locket på exsickatorn och starta vakuumpumpen för att trycksätta insidan av exsickatorn tills −0,095 MPa långsamt.
- När du har stängt exsickatorn vid −0,095 MPa, stäng av vakuumpumpen och låt den stå i 30 minuter vid rumstemperatur.
OBS: Vakuumnivån var sådan att bubblor uppträdde gradvis i proverna. - Öppna exsickatorn något och återför den långsamt till atmosfärstrycket. Sänk torkbehållarens tryck till −0,095 MPa, stäng av vakuumpumpen och låt blandningen stå i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Öppna exsickatorn något och återför den långsamt till atmosfärstrycket. Om provet är korrekt fixerat sjunker det in i fixeringslösningen. Om det inte sjönk, minska trycket igen.
- Ta bort paraffinfilmen, stäng locket och håll rören över natten vid 4 °C.
OBS: Proverna fixerades i fixativ lösning i minst 2 timmar. Den kan lagras i ~ 1 vecka.
5. Trimning av det fasta provet
- Ta bort den överflödiga fixeringslösningen från provet med luddfria våtservetter.
OBS: Överskott av fixativ lösning förhindrar att provet fastnar ordentligt på brickan. - Fixa provet på ett vibrerande mikroskivbricka med omedelbart lim. Lägg den på en bricka med den plana sidan nedåt, som rakades av under provtagningen.
OBS: På grund av risskottets struktur måste den trimmas från basen mot SAM / ung panikel. - Ställ in trimningsförhållandena enligt det fasta provet.
OBS: I denna studie sattes trimningen till TJOCK, 130 μm; BRED, 15 mm; FREKVENS, 15%; och SKÄRHASTIGHET, 32 mm. - Justera provpositionen med RVS - eller FWD-knappen och UPP - eller NED-knappen . Fyll brickan med avjoniserat vatten tills alla prover är nedsänkta. När du har fyllt facket trycker du på START-knappen . Placera de trimmade proverna på en glasskiva med en droppe 1x PBS.
OBS: Flytta provets position till andra sidan efter varje trimning eftersom det hårda provet sliter ut rakbladet. - Efter att ha kontrollerat provet som innehåller målplatsen under ett stereomikroskop, överför det trimmade provet till en multiwellplatta med 1 ml 1x PBS.
OBS: Välj antalet brunnar enligt provets storlek. I denna studie användes en 12-multiwellplatta.
6. Behandling med clearinglösningen
- Ta bort 1x PBS från multiwellplattan och tillsätt färsk 1x PBS. Låt det stå i 1 min.
- Ta bort 1x PBS och lägg till CS.
OBS: Mängden CS måste vara fem gånger provvolymen. - Placera multiwellplattan som innehåller provet i en exsickator. Stäng sedan locket på exsickatorn och starta vakuumpumpen för att trycksätta insidan av exsickatorn tills −0,09 MPa långsamt.
- När du har stängt exsickatorn vid −0,09 MPa, stäng av vakuumpumpen och låt den stå i 1 timme vid rumstemperatur.
- Öppna exsickatorn något och återför den långsamt till atmosfärstrycket.
- Häll avjoniserat vatten i gapet mellan brunnarna för att förhindra avdunstning av CS. Förvara multiwellplattorna vid rumstemperatur i mörkret för rensning.
OBS: Skaka försiktigt multiwellplattan var 1-2: e dag för att sprida klorofyllet och andra komponenter. - När CS blir grön, byt ut den med en ny lösning.
7. Cellväggsfärgning med kemiskt färgämne
- Pipa den vita kolvätelösningen (1 ml, slutlig koncentration: 1 mg/ml i röjningslösningen, se materialförteckning) till en flerbrunnsplatta. Placera proverna i färglösningen och inkubera i 1 timme.
OBS: Färgämnets volym får inte överstiga 10% av CS-volymen. - Tvätta de färgade proverna i en annan flerwellsplatta med 1 ml av kolväteindikatorn i minst 1 timme.
8. Observation med ett konfokalt lasermikroskop
- Placera en droppe CS på ett mikroskopglas och överför de behandlade (med CS) proverna till bilden.
OBS: Eftersom de behandlade proverna är mjuka måste de hanteras försiktigt med pincett. - Täck provet med en glasöverdragsglas för att förhindra avdunstning av CS.
CS fälls lätt ut. - Observera de behandlade proverna under ett konfokalt lasermikroskop.
OBS: Efter observation kan de behandlade proverna returneras till CS för ytterligare observationer senare.
Representative Results
För det första validerades i vilken utsträckning de hårda och tjocka vävnaderna hos vuxna risplantor kunde göras transparenta genom röjningsbehandlingen. Nip vid 9-10 LS, som är panikelbildningssteget, och 12-16 mm långa vävnader som skärs ut från den unga panikeln till skottets botten användes. Dessa prover, inklusive den unga panikeln, fixerades i fixeringslösningen och observerades före och efter 1-4 veckor efter clearingbehandlingen (figur 2). De otrimmade proverna förblev gröna och blev inte transparenta efter 4 veckor eller ens efter 3 månaders behandling med clearinglösningen (figur 2A). I prover som skalades av alla löv blev internoderna vita efter 1 veckas behandling med CS, även om noderna förblev gröna. Detta urval blev inte transparent efter 4 veckor (figur 2B). Efter 3 månaders behandling med CS blev endast den unga panikeln transparent. De handtrimmade proverna ändrades till vitt, förutom de yttre bladen och kärlbuntarna, efter 1 veckas behandling med CS. Vissa delar av bladen, unga panikel och internoder blev genomskinliga men blev inte transparenta efter 4 veckor (figur 2C). Efter 3 månader blev endast den unga panikeln och de inre bladen transparenta. Proverna som trimmades till 130 μm tjocklek med den vibrerande mikroskivaren blev genomskinliga efter 1 veckas behandling med CS, med bladen genomskinliga. Efter 2 veckor var provet nästan transparent och förblev oförändrat efter 4 veckor (figur 2D). Efter 3 månader blev proverna helt transparenta.
Därefter validerades djupet genom vilket clearingbehandlingen möjliggjorde genuttrycksobservationer i skottet av T65 vid 8 LS. UBQpro:: NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro ::NGCN, se Materialförteckning) uttryckta skott användes. Vävnadsprover fixerades i fixeringslösningen innan de trimmades till 130 μm tjocklek med hjälp av en vibrerande mikroskivare. Proverna observerades sedan under ett konfokalt lasermikroskop (laser: 488 nm/13%, mål: 20x, pinhål: 0,93 AU, medelvärde: 16, detektorförstärkning: 800) vid 10 μm intervall i z-axelns riktning varje vecka från 0-4 veckors behandling med CS. De representativa resultaten visas i figur 3. Alla siffror justerades med samma bearbetning för att jämföra fluorescensintensiteten. I noden utan behandling observerades svaga fluorescerande signaler på ett djup av −40 μm (figur 3A). Det observerbara djupet var −60 μm efter 1 veckas CS-behandling och −90 μm efter 2 veckor, men autofluorescens av cytoplasman var märkbar vid båda veckorna på ett djup av −20 μm. Autofluorescensen blev något svagare efter 3 veckor och var inte längre synlig efter 4 veckor. Fluorescerande signaler observerades på ett djup av −80 μm vid 3 veckor och på ett djup av −100 μm vid 4 veckor. I internoden observerades fluorescerande signaler på ett djup av −60 μm utan CS-behandling (figur 3B). Det observerbara djupet var −90 μm efter 1 vecka till 3 veckor av CS-behandlingen och −100 μm efter 4 veckor, men autofluorescens i cytoplasman märktes på ett djup av −20 μm efter 1 vecka. Autofluorescens var inte längre synlig efter 2 veckor. I bladen observerades fluorescerande signaler på ett djup av −90 μm utan CS-behandling (figur 3C). De fluorescerande signalerna observerades djupare i bladen än i noderna och internoderna. De fluorescerande signalerna var dock svagare. De fluorescerande signalerna blev tydliga efter 1 veckas CS-behandling och observerades på ett djup av −120 μm. Efter 2 veckor och 3 veckor observerades fluorescerande signaler på ett djup av -110 μm och efter 4 veckor på ett djup av -120 μm.
Slutligen observerades uttrycket av transkriptionsfaktorn OsMADS1511 smält med mOrange 12, vilket reglerar övergången av SAM från vegetativ till reproduktiv fas13. Vävnadsprover från Nip vid 10 LS med OsMADS15-mOrange fixerades, trimmades till 130 μm tjocklek och behandlades med CS i 2 veckor. Figur 4 visar att clearinglösningen kan användas samtidigt för att observera de fluorescerande proteinerna (OsMADS15-mOrange) av naturligt genuttryck och fluorescerande färgfärgning (kalcofluorvit). Hela floretten på djup från 0 till −130 μm observerades och 3D-bilden rekonstruerades från 43 z-stackbilder med 3 μm intervall (figur 4E).
Figur 1: Provtagningsposition och bearbetning. (A) Nip plantor vid 8 LS under kortdagstillstånd. (B) Förstorad vy av basen. C) Ett prov som klipps ut från SAM/ungplåtarna till basen. (D) Ett ovalt tvärsnitt från C (insats). (E) Raka av ena sidan av skottet med ett blad. (F) Tunt rakad yta. (G) Prov som visar internodförlängning. Den vitaktiga sektionen som indikeras av pilspetsarna är noder. Den övre sidan av den övre noden har den unga panikeln. Skalstänger: (A) 10 cm, (B-C,E-G) 1 cm, (D) 0,5 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Vävnadsrensning beror på provets tjocklek och CS-behandlingsperiod . (A) Otrimmade prover med partiella skott inklusive den unga panikeln. Maximal tjocklek: 4 mm. (B) Alla blad avskalade från proverna för att exponera den unga panikeln. Maximal tjocklek: 2,5 mm. yp: ung panikel, i: internod; pilspetsar indikerar nod. C) Provexemplar som har handtrimmats till 1 mm tjocklek. (D) Prover trimmade med det vibrerande mikroskivaren till 130 μm tjocklek. Skalstreck: 5 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Djupet av fluorescensobservation beror på vävnadstyp och CS-behandlingsperiod. Djupavbildning av UBQpro::NGCN i (A)-noden, (B) internoden och (C)-bladet. "Sammanfoga" betyder att bilderna har smälts samman med DIC-bilden (differential interference contrast) och alla z-stackbilder. Bilder där ingen fluorescens observerades markerades som "n.d." (ej upptäckt). Inställningarna för den konfokala lasermikroskopin är följande: laser: 488 nm / 13%, mål: 20x, pinhole: 0,93 AU, medelvärde: 16, detektorförstärkning: 800, intervall: 10 μm. Skalstreck: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Djupfluorescensobservation av OsMADS15-mOrange. (A) DIC-bilden av Nip vid 10 LS. yp: ung panikel, le: blad, nej: nod, i: internod; pilspetsar indikerar floretter. (B) Fluorescensbild av OsMADS15-mOrange. Gula prickar indikerar fluorescerande proteiner från OsMADS15-mOrange vid kärnan. Cellväggen färgades cyan med den kalcofluorvita lösningen. (C) Vidgad syn på den unga panikeln. (D) Djup avbildning av floretten. pa: palea, le: lemma, fm: blommigt meristem; asterisker indikerar ståndare primordia. Det konfokala lasermikroskopet ställdes in enligt följande: OsMADS15-mOrange; laser: 555 nm/13%, mål: 20x, pinhål: 0,96 AU, medelvärde: 16, detektorförstärkning: 800, intervall: 3 μm. Calcofluor vit; laser: 405 nm/3%, mål: 20x, pinhål: 0,93 AU, medelvärde: 16, detektorförstärkning: 470, intervall: 3 μm. (E) 3D-bilden av figuren (D) konstruerad från z-stackbilderna. Skalstänger: (A-B) 1 mm, (C) 500 μm, (D) 40 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Kritiska steg i protokollet
De kritiska stegen i detta protokoll är fixering och trimning. Risskott har hårda, tjocka eller skiktade vävnader som begränsar penetrationen av fixeringslösningen. För att förbättra fixeringslösningens permeabilitet rakades ena sidan av vävnaden tunt vid provtagning, vilket visas i figur 1E-F. Dessutom upprepades vakuumbehandlingarna två gånger med högre tryck. Dessutom fixerades proverna över natten till 4 °C i stället för den vanliga 2-timmarsfixeringen vid 4 °C.
Nyckelpunkten i trimningssteget är att bestämma tjockleken på vävnaderna som ska beredas för att observera de fluorescerande proteinerna samtidigt som deras inre struktur bevaras efter en kort period av CS-behandling. Som visas i figur 2C blev de 1 mm tjocka proverna, handtrimmade så tunna som möjligt, transparenta i endast ett begränsat antal vävnader även efter 3 månaders CS-behandling. Därför är trimningssteget viktigt för djupfluorescensobservation av vuxna risskott. I denna studie trimmades proverna till en tjocklek av 130 μm, vilket visas i figur 2D. Tjockleken på 130 μm möjliggjorde för att rensa bladen efter 1 veckas CS-behandling och hela provet efter 2 veckor. Vuxna risskott vid 9-10 LS användes i denna studie. Tjocka men mjukare vävnader från yngre risskott kan rensas snabbare med CS-behandlingen. Provernas tjocklek och varaktigheten av CS-behandlingen bör justeras beroende på vävnadstyp, tillstånd och tjocklek på den 3D-struktur som ska observeras.
Ändringar och felsökningsmetoder
CS fälldes lätt ut vid låga temperaturer. Den utfällda CS kan inte bevara de fluorescerande proteinerna; Därför måste man vara försiktig när proverna förvaras vid rätt temperatur. Dessutom har både CS och fixativ lösning ingen antiseptisk effekt; Därför kommer fluorescerande proteiner att brytas ned om de är förorenade. Jordodlat ris är benäget för svamptillväxt; Därför måste provtagning och hantering av prover utföras med försiktighet för att undvika kontaminering.
Överskott av fluorescerande färgämnen i bufferten kan avge bakgrundsfluorescens och störa mikroskopiska observationer. Till exempel användes tidigare en kalcofluorvit lösning innehållande Evans blått färgämne. Efter färgning i 1 h och tvättning i 1 h observerades de fluorescerande proteinerna i OsMADS15-mOrange med användning av en 555 nm laser. Fluorescerande proteiner kunde emellertid inte observeras på grund av bakgrundsfluorescensen härrörande från Evans blå färgämne. Denna bakgrundsfluorescens eliminerades nästan genom att tvätta proverna i 2 timmar. Dessutom var de fluorescerande proteinerna tydligare om proverna lämnades över natten. Därför användes en ren kalcofluorvit lösning i denna studie. Bakgrundsfluorescens härledd från det fluorescerande färgämnet bör kontrolleras med olika laservåglängder före observationer.
Begränsningar av metoden
Som visas i figur 3 observerades djupa fluorescerande proteiner i proverna som var 130 μm tjocka efter 2 veckors CS-behandling. Detta överensstämmer med resultaten som visas i figur 2D, där det 130 μm tjocka provet blev transparent efter 2 veckors CS-behandling. Som visas i figur 3A var emellertid autofluorescens av cytoplasman fortfarande märkbar i noderna efter 2 veckor och avlägsnades först helt efter 4 veckors CS-behandling. Noder har en hög celldensitet och kräver därför längre tid för att ta bort autofluorescerande material.
Som visas i figur 3C observerades djupa fluorescerande proteiner i bladen utan CS-behandling, men ljusstyrkan var svagare än den i noderna och internoderna på samma djup av 20 μm. Efter 1 veckas CS-behandling var de fluorescerande proteinerna ljusare. Klorofyll är rikligt i löv och absorberar 488 nm excitationsljus. De har också orange / röd autofluorescens, vilket kan störa observationen av fluorescerande proteiner med hjälp av en 555 nm laser. Efter 1 veckas CS-behandling avlägsnades klorofyll och andra autofluorescerande material, vilket resulterade i bilder med högt signal-brusförhållande.
Djupet som kunde observeras i vävnader efter 2 veckor och 4 veckors CS-behandling var inte signifikant annorlunda, även om de fluorescerande proteinerna verkade svagare efter 4 veckor (Figur 3). Normalt försvagas ljusstyrkan hos fluorescerande proteiner och autofluorescens med tiden, vilket resulterar i ett högre signal-brusförhållande. Därför kan fluorescerande proteiner observeras tydligare genom att justera de mikroskopiska förhållandena och bildbehandlingen. Baserat på dessa resultat drogs slutsatsen att 2 veckors CS-behandling kunde underlätta observationen av djupfluorescerande proteiner, med tanke på våra provförhållanden. 4 veckor behövs dock för att observera tydligare bilder som helt utesluter de autofluorescerande materialen.
Strukturer med stark autofluorescens, såsom vaskulära buntar och flerarmsceller, kan inte rensas i CS. För att observera dessa strukturer utan autofluorescens är det nödvändigt att använda en tidsstyrningsmetod12 eller att erhålla bilder genom spektroskopi av fluorescensspektrumet. Ett tvåfotonmikroskop kan vara mer lämpligt för att observera djupare vävnader om tjockare vävnader observeras.
Metodens betydelse i förhållande till befintliga och alternativa metoder
I allmänhet har de inre strukturerna hos risplantor observerats med antingen kryostat eller vibratomsektionering. En kryostat är lämplig för beredning av tunna sektioner, vilket möjliggör enklare observation, men beredningen av proverna och driften av utrustningen är tidskrävande. Att rekonstruera den ursprungliga 3D-strukturen från tunna sektioner är också svårt. Vibratomet är relativt lätt att använda och lämpligt för att producera tjocka sektioner. Tjocka delar av målvävnader tillåter dock endast observationer av den skurna ytan och inte djupa vävnader som ljuset inte kan nå. Av dessa skäl är ingen av metoderna lämplig för observationer av djup fluorescens.
Denna studie behandlade utmaningar i djupfluorescensobservation i risskott, såsom den begränsade vävnadspenetrationen av CS och den dåliga objektupplösningen under ett konfokalmikroskop, genom att kombinera befintliga metoder. Som visas i figur 4 observerade vi fluorescerande proteiner (OsMADS15-mOrange) uttryckta i de djupa vävnaderna hos vuxna risskott från den unga panikeln till basen. Figur 4D fokuserar på floretten och visar djupfluorescerande proteiner med 3 μm intervall. Vävnader över −130 μm djup observerades efter 2 veckors CS-behandling, men endast vävnaderna inom −27 μm djup observerades (data visas inte) i floretten i samma storlek och tillväxtstadium utan CS-behandling. Det nuvarande förbättrade protokollet möjliggjorde observation inte bara av överuttryck av gener utan också naturligt genuttryck i de djupa vävnaderna hos vuxna risskott.
Metodens betydelse och potentiella tillämpningar inom specifika forskningsområden
Detta protokoll, som optimerar djupfluorescensobservationen av vuxna risskott, möjliggör effektiv rensning av hårda, tjocka eller skiktade vävnader genom att trimma bort onödiga vävnader och öka CS permeabilitet. Dessutom optimerades tjockleken på proverna för analys för att möjliggöra kontinuerlig och strukturell djupfluorescensobservation med hjälp av ett konfokalt lasermikroskop, som normalt inte kan lösa tjocka eller ogenomskinliga vävnader.
Det är svårt att jämföra risprover i olika tillväxtstadier eftersom de fluorescerande proteinerna bryts ned med tiden i fixerings- och PBS-lösningarna. De fluorescerande proteinerna i CS kan emellertid lagras i mer än 5 månader1. Cs långa hållbarhet är en stor fördel för observation av djup fluorescens i ris.
Nyligen har många clearingtekniker utvecklats, vilket gör det möjligt att observera djupa vävnader i 3D samtidigt som de bevarar sina interna strukturer. Dessa tekniker har fortsatt att utvecklas och nya clearinglösningar har utvecklats. Ett bra exempel är iTOMEI14, som möjliggör effektiv klorofyllborttagning och ljusare fluorescensdetektion. Ett annat exempel är ClearSeeAlpha15, som förhindrar brunning av vävnader under rensningsbehandling och får dem att se transparenta ut. Genom att kombinera dessa clearinglösningar med den nuvarande metoden kan det bli möjligt att rensa och ändamålsenligare.
Det förväntas att den nuvarande metoden kommer att hjälpa till att få nya insikter genom djup avbildning av inte bara ris utan även andra växter.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. R. Terada, Dr. Z. Shimatani och Dr. H. Tsuji för att de gav oss OsMADS15-mOrange frön; Dr. D. Kurihara för att förse oss med NGCN-konstruktionen; och Dr. R. Shim för redigering av vårt manuskript. Detta arbete finansierades av JSPS KAKENHI (bidragsnummer JP20H05912, 20H05778, 20H05779) och av SATREPS-programmet (nr. JPMJSA1706) från JST och JICA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | BIO-BIK | ST-0150F | |
| 12-multiwell plate | Corning | 353043 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 352070 | |
| Calcofluor white solution | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| ClearSee | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 031-25151 | This can be made or purchased. |
| Confocal laser microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Desiccator | SANPLATEC | Custom made of acrylic. 30 cm (L), 30 cm (W), 14.5 cm (H) | |
| Glass coverslip (18 × 18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
| HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 342-01375 | |
| Microscope slide (76 × 26) | MATSUNAMI | S2441 | |
| Paraffin film | Bemis | PM-996 | |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 162-16065 | |
| Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-00013 | |
| UBQpro::NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro::NGCN) | provided by Dr. Kurihara | ||
| Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
| Vacuum pump | AS One | AS-01 | |
| Vibrating micro-slicer | DOSAKA | DTK-3000 | |
| Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |
References
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
- Hasegawa, J., et al. Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique. Plant and Cell Physiology. 57 (3), 462-472 (2016).
- Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. A versatile optical clearing protocol for deep tissue imaging of fluorescent proteins in Arabidopsis thaliana. PLoS One. 11 (8), 0161107 (2016).
- Pandey, K. B., et al. Plant roots sense soil compaction through restricted ethylene diffusion. Science. 371 (6526), 276-280 (2021).
- Ejaza, M., Bencivenga, S., Tavaresa, R., Busha, M., Sablowski, R. ARABIDOPSIS THALIANA HOMEOBOX GENE 1 controls plant architecture by locally restricting environmental responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (17), (2021).
- Smetana, O., et al. High levels of auxin signalling define the stem-cell organizer of the vascular cambium. Nature. 565 (7740), 485-489 (2019).
- Chu, T. T. H., et al. Sub-cellular markers highlight intracellular dynamics of membrane proteins in response to abiotic treatments in rice. Rice. 11 (1), 23 (2018).
- Nagaki, K., Yamaji, N., Murata, M. ePro-ClearSee: A simple immunohistochemical method that does not require sectioning of plant samples. Scientific Reports. 7, 42203 (2017).
- Sato, M., Akashi, H., Sakamoto, Y., Matsunaga, S., Tsuji, H. Whole-tissue three-dimensional imaging of rice at single-cell resolution. International Journal of Molecular Sciences. 23 (1), 40 (2022).
- Matsuo, T., Hoshikawa, K.
- Kobayashi, K., et al. Inflorescence meristem identity in rice is specified by overlapping functions of three AP1/FUL-Like MADS box genes and PAP2, a SEPALLATA MADS box gene. Plant Cell. 24 (5), 1848-1859 (2012).
- Tamaki, S., et al. FT-like proteins induce transposon silencing in the shoot apex during floral induction in rice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (8), 901-910 (2015).
- Kodama, Y. Time gating of chloroplast autofluorescence allows clearer fluorescence imaging In Planta. PLoS One. 11 (3), 0152484 (2016).
- Sakamoto, Y., et al. Improved clearing method contributes to deep imaging of plant organs. Communications Biology. 5 (1), 12 (2022).
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Nagahara, S., Higashiyama, T. ClearSeeAlpha: Advanced optical clearing for whole-plant imaging. Plant and Cell Physiology. 62 (8), 1302-1310 (2021).
