Summary
שיטות אימונוהיסטוכימיות שימושיות במחקר דבורת הדבש כדי לזהות ולהעריך את רמת האפופטוזיס והנמק בבלוטות האמצע והלוע של דבורים בוגרות.
Abstract
דבורי הדבש (Apis mellifera L.) בתוך הכוורת (אחיות ודבורי כוורת אחרות) ומחוץ לכוורת (foragers) חשופות לשינויי אקלים ומזג אוויר, חומרי הדברה שונים, פתוגנים ותת תזונה, הנכנסים בעיקר דרך הפה ומשפיעים בעיקר על דרכי העיכול של דבורים בוגרות. כדי להבין ולמנוע את ההשפעות של גורמי לחץ חיצוניים ופנימיים כאלה על דבורי הדבש, אחת משיטות המחקר השימושיות היא השיטה האימונוהיסטוכימית. פרוטוקול בסיסי מתואר להכנת בלוטות האמצע (ventriculus) וההיפו-לוע (HPGs) של דבורים בוגרות לניתוח היסטולוגי. מתודולוגיה מפורטת מתוארת כדי להעריך את רמת הנזק לתאים ולהבחין בין נמק למוות תאי מתוכנת (אפופטוזיס) כתהליך טבעי של התחדשות רקמות. תוצאות הטיפול בדבורת הדבש הבוגרת בחומצה אוקסלית ובחומרי הדברה (קוטל חרקים ואקריציד) וקביעת מוות תאי בחדר וב- HPGs מוצגות. היתרונות והחסרונות של המתודולוגיה נדונים גם הם.
Introduction
דבורי הדבש (Apis mellifera L.) הן, בין שאר מאביקות הבר, המאביקות החשובות ביותר של צמחים חקלאיים. במשך אלפי שנים, הסביבה המשתנה השפיעה על הדבורים להתאים את המורפולוגיה, הפיזיולוגיה, ההתנהגות והעמידות שלהן למספר פתוגנים וטפילים. לכן, דבורי הדבש פיתחו מגוון רחב מאוד של מינים ותת-מינים ברחבי העולם1. תוצאות אלה עולות בקנה אחד עם ממצאים קודמים, שלפיהם קיימת שונות גנטית במבנה מערכת העיכול של דבורת הדבש, אך גם מצביעות על כך ששינויים במידגוט נובעים מגורמים סביבתיים 2,3.
מערכת העיכול של דבורת הדבש כוללת שלושה חלקים עיקריים: פורגוט, מידגוט (ventriculus) והינדגוט4. החדר הוא איבר חיוני לעיכול אבקה וצוף/דבש; ב hindgut, שליטה אוסמוטית מתרחשת באמצעות ספיגת מים ויונים2. בלוטות ההיפו-לוע (HPGs) של עובדי דבורת הדבש ממוקמות בראש ומסנתזות ומפרישות רכיבי מזון מלכות כדי להאכיל את הברוד, את המלכה ואת חברי המושבה. גודלם משתנה עם הגיל והמשימות ותלוי בתזונה נכונה (אבקה איכותית). עובדי אחיות בגילאי 6 עד 18 ימים מבצעים גידול גזעים, וגודל ה- HPGs גדלב- 5,6. בדבורים, ה-HPGs מתנוונים ומפרישים רק אנזימים החשובים להמרת הסוכרים המורכבים לפשוטים (α-גלוקוזידאזות, לאוצין ארילאמידאז, אינברטאז) בדבש7.
דבורי הדבש נחשפות למספר גורמי עקה ביוטיים וא-ביוטיים8, ומערכת העיכול עלולה להיות מושפעת ממספר ממריצים שליליים. המחסום הראשון המגן על האורגניזם מפני פתוגנים הוא הממברנה הפריטרופית ב midgut, אשר מורכב רירית המעי כדי להגן מפני פתוגנים4. ההתפתחות והתפקוד של HPGs תלויים בתזונה, בגיל ובמצב המושבה9, והם מושפעים מקוטלי חרקים, אקריצידים 10 ופתוגנים11,12,13. שאריות של קוטל בקראיים בכוורת עקב טיפול בהדברת וורואה וחומרי הדברה מהסביבה משפיעים על דבורי מספוא ודבורים אחיות14,15. האיום הגדול ביותר על מושבות דבורי הדבש הוא משמיד הקרדית Varroa, הן כווקטור של וירוסים התורמים לאובדן מושבות16 והן כצרכן של גוף השומן של המארח (איבר חיוני חשוב בדבורי הדבש), וכתוצאה מכך משפיע על גופו של הפרט ועל תפקודי המושבה17.
עם זאת, בתי גידול חקלאיים אינטנסיביים יכולים לספק אספקת מזון לטווח קצר לדבורי הדבש. לכן, תוכניות חקלאיות-סביבתיות צריכות לשפר את הזמינות של פרחי דבש בנופים חקלאיים18. כדי להעריך את המורפולוגיה של תת-מינים שונים 6,19,20,21 או השפעות תת-קטלניות של גורמים אלה ברמת התא או הרקמה, במיוחד midgut ו- HPGs, שיטות היסטולוגיות ואימונוהיסטוכימיות הן מעשיות ומדויקות מספיק כדי לשמש במחקר היסטולוגיה בדבורי דבש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. היסטולוגיה בסיסית לחקר דבורת הדבש
- דיסקציה של רקמת דבורת הדבש
הערה: לנתיחה של דבורים עובדות, השתמש במיקרוסקופ מנתח עם מקור אור LED. ההגדלה השימושית ביותר היא ~ 20x.- מניפולציה ונתיחה
- בזהירות לקחת דבורה עובד עם מלקחיים ולשים אותו על קרח (או לתוך המקפיא ב -20 מעלות צלזיוס) במשך 2 דקות כדי לשתק אותו22. הצמידו את הדבורה לצלחת הפטרי באלכסון דרך החלק האחורי העליון של בית החזה פעמיים, משמאל לימין ומימין לשמאל.
- יוצקים חרקים מלוחים כדי לכסות את הגוף. הניחו את צלחת הפטרי מתחת למיקרוסקופ, התמקדו והתכווננו.
- הכינו את המכשירים (ראו טבלת חומרים).
- דיסקציה של מידגוט
- התחילו עם הבטן על ידי הכנסת נקודה אחת של המספריים מתחת לטרגיט A5 (איור 1) במרכז הצד הימני של גוף הדבורה. חותכים לטרגיט A2.
- שמור על הלהב הפנימי של המספריים במקביל לצד הגוף כדי למנוע פגיעה באיברים הפנימיים. סובב את המספריים שמאלה ועשה חתך אחד; פנה ימינה ובצע חתך נוסף. פתח בעדינות את החלק השמאלי של הבטן והצמיד אותו. חוזרים על הפעולה בצד השני.
- בעזרת מלקחיים ביד אחת, מושכים בעדינות את בטן דבורת הדבש כלפי מעלה, וביד השנייה חותכים בקצה הוושט. מושכים את הבטן ואת המותניים הרחק מהבטן וחותכים בפי הטבעת. השתמש פיפטה עם תמיסת מלח חרקים ולהסיר כל צואה או חלקים של הרקמה.
- דיסקציה של HPGs
- שיתוק דבורה עובדת על קרח כמתואר בשלב 1.1.1. חותכים את הראש ומניחים אותו על הצלחת הקטנה יותר כשהאנטנות פונות כלפי מעלה. אבטחו את הראש באמצעות שני סיכות: האחת דרך העין המורכבת השמאלית והשנייה דרך העין המורכבת הימנית.
- בצעו חתך על פני העין המורכבת הראשונה בצד הפנימי של הסיכות, המשיכו ללברום, ואז בצעו חתך נוסף בצד השני על פני העין המורכבת השנייה (איור 2).
- נתק את האנטנות. מרימים את המסכה וחותכים היכן שעדיין מחוברים. קח את המלקחיים בזהירות להסיר את הבלוטות יחד עם המוח וחלק מהעיניים המורכבת.
- מניפולציה ונתיחה
- קיבוע, התייבשות והטמעת פרפין
הערה: יש ללבוש כפפות מגן.- מניחים את הרקמה בבקבוקי פניצילין, מלאים 3/4 עם 10% פורמלין. יש לשמור במקרר בטמפרטורה של 4°C.
- לאחר 24 שעות, לייבש את הרקמה בסדרה של אלכוהולים: 70%, 80%, 90%, 100%, במשך שעה אחת כל אחד, 100% 2-פרופנול במשך שעה, 100% 2-פרופנול במשך 12 שעות, ולבסוף 100% 2-פרופנול במשך שעה אחת.
- מניחים את הרקמה בהיסטוקסטים; מסמנים ומניחים אותם בתאי הזכוכית עם 2-פרופנול ופרפין (1:1) באינקובטור בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
- מעבירים את ההיסטוקסטים לתא אחר עם פרפין (I.) למשך 24 שעות נוספות. חזור על ההליך עם פרפין טרי פעמיים נוספות (II. ו- III.), שניהם במשך 24 שעות.
- לבסוף, הכינו את תחנת ההרכבה והתחילו להטמיע את הרקמה בשעווה.
- פתח כל היסטוקסט והסר את הכיסוי. ממלאים את התבנית בשעווה ומניחים בזהירות את הרקמה עם מלקחיים חמים באמצע התבנית.
- מניחים את ההיסטוקססט על התבנית ומכסים אותה מעט בשעווה. מיד מניחים את התבנית על המשטח הקר של תחנת ההרכבה למשך מספר שניות, ואז מניחים אותה על הלוח הקר למשך מספר דקות עד שהשעווה מתקשה ונפרדת מהתבנית יחד ומההיסטוקסט.
- אחסנו את הדוגמאות המוגמרות בקופסה, הרחק מאבק וחום.
- חותכים חתכים דקים של 4 מיקרומטר על מיקרוטום: ראשית, שני חלקים המחוברים זה לזה ולאחר מכן אחד בנפרד. מעבירים את החלקים עם מלקחיים ונותנים להם לצוף על מים מזוקקים (42 מעלות צלזיוס), ואז אוספים אותם במגלשות נקיות על ידי הצבת שני חלקים יחד בצד שמאל של הזכוכית האובייקטיבית והשלישי בצד ימין, ונשארים נפרדים באופן מובהק. השאירו את המגלשות המסומנות למשך הלילה במכשיר החימום ולבסוף אחסנו אותן בקופסה המוקדשת לדגימות היסטולוגיה.
- התייבשות והתייבשות
הערה: יש ללבוש כפפות מגן.- הכינו תשע צנצנות קופלין והכניסו את החלקים לסדרה של חומרי ניקוי (I., II., III.) למשך 5 דקות כל אחד.
- מכניסים ל-2-פרופנול, אתנול 96% (I., II.), אלכוהול 90% ו-80%, ומזקקים מים במשך 3 דקות כל אחד.
- צביעה עם המטוקסילין ואוסין
הערה: יש ללבוש כפפות מגן.- מכינים שש צנצנות קופלין.
- לצביעת המטוקסילין ואוזין (H&E), הכניסו את החלקים המיובשים והמיובשים להמטוקסילין למשך 5 דקות, ואז הניחו אותם בזהירות מתחת למי הברז הזורמים למשך 2 דקות. ואז לשים אותם לתוך מים מזוקקים במשך 1 דקות ו eosin במשך 4 דקות (עבור eosin, צנצנת קופלין אינו הכרחי).
- מניחים את השקופיות באתנול 96% למשך דקה אחת, לאחר מכן 2-פרופנול למשך 2 דקות, ולבסוף לסוכן הסליקה למשך 2 דקות.
- הוסיפו מדיום הרכבה וכוס כיסוי ותנו להם להתייבש. התבונן תחת מיקרוסקופ אור.
איור 1: מבט דורסלי על גוף דבורת הדבש. A1-A7 טרגיטים. את ההוראות המפורטות על דיסקציה של דבורת הדבש ניתן למצוא ב- Carreck et al.24. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: מבט דורסלי של HPGs, חלקים של עיניים מורכבות המחוברים למוח (לא נראה לעין). לדבורה עובדת צעירה בגילאי 5 עד 6 ימים יש HPGs לבנים שמנמנים וקרמיים. האצ'יני ממוקמים על המוח וממלאים את אזור הראש בענפים המגיעים לחלק האחורי של המוח. בדבורים, בלוטות אלה מכווצות מאוד ומותירות רק שרידים דקים דמויי חוטים. מסיבה זו, עדיף להסיר בלוטות יחד עם המוח כדי להקל על הליכים נוספים, כדי למנוע אובדן הרקמה. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
2. זיהוי מוות תאי במקטעי רקמות
- ערכת זיהוי אפופטוזיס (בדיקה A)
הערה: פעל בהתאם לפרוטוקול היצרן (עיין בטבלת החומרים).- מכינים את צנצנות הקופלין.
- לאחר התייבשות והתייבשות (ראו שלב 1.3), טבלו את השקופיות בתמיסת NaCl של 0.85%, ולאחר מכן בתמיסת מלח עם אגירת פוספטים (PBS) (5 דקות).
- שים את השקופיות ב 4% paraformaldehyde 2 x 15 דקות.
- הניחו את השקופיות שטוחות במיכל והוסיפו 100 מיקרולטר של תמיסת פרוטאינאז K (20 מיקרוגרם למ"ל), ואז השאירו אותן למשך 10-30 דקות.
- מקם את השקופיות ב- PBS (5 דקות).
- מקמו את השקופיות ב-4% פרפורמלדהיד ב-PBS (5 דקות).
- לטבול את השקופיות ב- PBS (2 x 5 דקות).
- מניחים את השקופיות שטוחות במיכל, מוסיפים 100 μL של מאגר שיווי משקל, ומשאירים אותן למשך 5-10 דקות.
- הוסף 100 μL של תערובת תגובה TdT. שים מגבות נייר בתוך המיכל, סביב המגלשות, להרטיב את המגבות עם מים, ולאחר מכן לכסות עם ניילון נצמד. דגירה מגלשות במשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- החזירו את המגלשות למדף הכתמים וטבלו ב-2x מלח-נתרן ציטראט (SSC) למשך 15 דקות.
- לטבול את השקופיות 3 x 5 דקות ב- PBS, לאחר מכן ב- 0.3% מי חמצן למשך 3-5 דקות, ואז שוב ב- PBS, 3 x 5 דקות.
- שוב, מניחים את המגלשות שטוחות במיכל, מוסיפים 100 μL של Streptavidin HRP (חזרת peroxidase), ולהשאיר במשך 30 דקות (לכסות עם ניילון נצמד).
- לטבול את השקופיות 3 x 5 דקות ב- PBS.
- הנח את המגלשות שטוחות במיכל והוסף 100 μL של תמיסת 3,3'-diaminobenzidine (DAB). חפשו רקע חום בהיר.
- החזירו את המגלשות למדף ושטפו אותן מספר פעמים במים (מזוקקים פעמיים).
- הרכב את המגלשות מתחת לכיסויי זכוכית במדיום הרכבה והשאר שטוח לייבוש.
- התבונן תחת מיקרוסקופ אור.
- ערכת זיהוי אפופטוזיס (בדיקה B)
הערה: פעל בהתאם לפרוטוקול היצרן (עיין בטבלת החומרים).- מכינים צנצנות קופלין.
- הכינו פרוטאינאז K (20 מיקרוגרם/מ"ל מדולל ב-PBS).
- לאחר הסרת השעווה וייבוש מחדש של החלקים (שלב 1.3), מקם את השקופיות ב- PBS למשך 5 דקות.
- הניחו את השקופיות שטוחות במיכל והוסיפו פרוטאינאז K (20 מיקרוגרם/מ"ל, 60 מיקרון לדגימה של 5 סמ"ר).
- שטפו את המגלשות 2 על 2 דקות במים מזוקקים.
- להרוות פרוקסידאז אנדוגני (ב-3% מימן פרוקסידאז) בטמפרטורת החדר.
- שטפו את המגלשות 2 x 5 דקות עם PBS או מים.
- הניחו את המגלשות שטוחות במיכל והפעילו את חיץ שיווי המשקל (75 μL/5 ס"מ2) למשך 10 שניות בטמפרטורת החדר.
- בזהירות לנגב סביב הרקמה.
- יש להוסיף את האנזים TdT (דאוקסינוקלאוטידיל טרנספראז סופני) לכל מקטע ולדגור בתא לח למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. שים מגבות נייר בתוך המגש, סביב המגלשות, להרטיב את המגבות במים, ולכסות אותם בניילון נצמד.
- לאחר הדגירה, הכניסו את הדגימות למדף והשאירו אותן במאגר עצירה/שטיפה (10 דקות).
- יש לחמם את הצמד נגד דיגוקסיגנין לטמפרטורת החדר.
- לשטוף את השקופיות ב- PBS (3 x 1 דקות).
- נגבו בזהירות סביב הרקמה.
- יש להוסיף שתי טיפות של מצומד אנטי-דיגוקסיגנין-פרוקסידאז (65 μL/5 סמ"ר) למקטעים ולדגור במשך 30 דקות במיכל לח.
- לאחר שטיפה ב-PBS 4x2 דקות, הכינו מצע פרוקסידאז בעל חוזק עבודה, טפחו בעדינות על עודפי נוזלים ושאפו סביב המקטע.
- מכסים את החלקים במצע פרוקסידאז (75 μL/5 cm²) ומכתימים למשך 5 דקות. הניחו שקופית מתחת למיקרוסקופ וקבעו את זמן הצביעה האופטימלי.
- שטפו את המגלשות במדף מכתים במים מזוקקים (3 x 1 דקות).
- דגרו את המגלשות במים מזוקקים למשך 5 דקות.
- מכתים נגדיים באמצעות המטוקסילין למשך 2 דקות.
- הניחו את המגלשה מתחת למי ברז זורמים למשך 3 דקות.
- שטפו את המגלשה במים מזוקקים.
- הרכב את המגלשות מתחת לכיסויי זכוכית במדיום הרכבה והשאר שטוח לייבוש.
- התבונן תחת מיקרוסקופ אור.
- ערכת זיהוי אפופטוזיס (בדיקה C)
הערה: פעל בהתאם לפרוטוקול היצרן (עיין בטבלת החומרים).- מכינים את צנצנות הקופלין.
- יש לייבש את חלקי הרקמה ולייבש אותם מחדש (ראו שלב 1.3).
- לדגום את הרקמה עם פרוטאינאז K (15-30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס).
- החזירו את המגלשות לארון התקשורת ושטפו 2x ב-PBS.
- מכסים ב-50 מיקרוגרם של 'תערובת תגובת TUNEL'. מניחים מגבות נייר רטובות בתוך המיכל, מכסים אותן בניילון נצמד ומשאירים אותן למשך 60 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.
- יש לשטוף 3x עם PBS.
- מניחים את השקופיות במיכל ומייבשים את האזור סביב דגימת הרקמה.
- הוסף 50 μL של Converter-AP לדגימה ודגרה במיכל לח למשך 30 דקות ב- 37 °C.
- יש לשטוף 3 פעמים ב-PBS.
- מוסיפים 50-100 μL של תמיסת מצע ומשאירים למשך 10 דקות בחושך.
הערה: שימו לב לכתמים תחת מיקרוסקופ אור. - שטפו את השקופיות 3x עם PBS.
- יש לנטרל את הכתמים על ידי העברת חלקים להמטוקסילין למשך 2 דקות ולאחר מכן לשטוף בזהירות במי ברז זורמים למשך 5 דקות.
- הרכיבו את המגלשות מתחת לכיסויי זכוכית במדיום הרכבה מימי והשאירו אותן שטוחות לייבוש.
- התבונן תחת מיקרוסקופ אור. הערך את התאים הנגועים (החיוביים) על-ידי ספירת 70 עד 100 תאים בכל דגימה של מידגוט או HPGs תחת מיקרוסקופ אור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זיהוי מוות תאי במרכז הגוף
דבורים עובדות חדשות (Apis mellifera carnica) מהמכוורת הניסיונית במכון החקלאי של סלובניה בלובליאנה טופלו בנפרד ב-3% חומצה אוקסלית (OA)23. OA משמש לעתים קרובות בגידול דבורים לבקרת הרס Varroa . לאחר הטיפול, הדבורים העובדות (שלוש מכל קבוצה) היו משותקות על הקרח. את ה-midgut ניתחו וקיבעו אותו ב-10% פורמלין. לאחר מכן התייבשה הרקמה בסדרה של תמיסות אלכוהול ולבסוף הוטמעה בשעוות פרפין. לאחר שנחתכו במיקרוטום למקטעים דקים של 7 מיקרומטר, הוכנו דגימות הרקמה לניתוח. באמצעות מיקרוסקופ אור חושב אחוז התאים הנגועים (70-100 תאים מכל אחת משלוש דגימות מידגוט). התוצאות עם Assay B הצביעו על כך שטיפול ב-OA השפיע באופן משמעותי על התאים במרכז הגוף (איור 3). בדיקה א' לא הראתה הבדל בין דבורים מטופלות לדבורים שטופלו; שיעור המוות התאי היה נמוך מ-10%. בדבורי בקרה, שניזונו מסירופ סוכר בלבד, המורפולוגיה של המידגוט לא הושפעה והשתמרה היטב.
איור 3: מידגוט. (A) המטוקסילין וכתמי אוזין; (B) חיסון (בדיקה C) של המידגוט. כתמים אדומים עזים ממוקמים בגרעינים של תאי midgut. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
זיהוי מוות תאי ב-HPGs
בניסוי הבא נערך הניסוי, ובחר שלוש מושבות נטולות מחלות (Apis mellifera L.). מסרקים עם גזע מכוסה הונחו באינקובטור (34.5 מעלות צלזיוס), והדבורים העובדות החדשות שיצאו סומנו עם נקודה על בית החזה כדי להגדיר את גילן. הליך זה חזר על עצמו שלוש פעמים כדי להשיג דבורים בגיל שונה. הדבורים סומנו והוחזרו למושבתן. הדבורים נדגמו לאחר 30 יום מתחילת המשפט. לבסוף, הם הוכנסו לכלוב אגירה בגודל 7.5 ס"מ על 4 ס"מ על 4 ס"מ, עם רשת תיל בצד אחד והוחזקו באינקובטור בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס.
העובדים טופלו בקוטלי חרקים (imidacloprid) או בקוטל חרקים (coumaphos), שניהם תמיסות במינונים תת-קטלניים, או בסירופ סוכר כקבוצת ביקורת10. הדבורים של קבוצות שונות היו משותקות וה-HPGs נותחו. דגימה כללה שלושה עד חמישה עובדים מאותה קבוצה כדי להשיג כמה שיותר תאים. התאים הנגועים הוערכו בשיטות אימונוהיסטולוגיה. תוצרי תגובה אדומים (Assay C) וחומים (Assay B) זוהו בגרעינים האפופטוטיים של HPGs. גרעינים אדומים חיוביים לאחר טיפול באימידקלופריד או בקומפוס נקבעו ברוב תאי הבלוטות (איור 4), ורק גרעיני תאים ספורדיים הראו תוצר תגובה חום מאותן קבוצות שטופלו. בקבוצת הביקורת לא היו תאי HPG פגומים.
איור 4: בלוטות היפו-לוע. (A) הכתמת המטוקסילין ואאוזין; (B) חיסון (בדיקה C). כתמים אדומים ממוקמים בגרעיני התאים. (C) אימונוסטינינג (בדיקה ב'). תוצר התגובה החום מציין את גרעיני התאים החיוביים. פסי קנה מידה = 50 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
באורגניזמים חיים, מוות תאי מוגדר כאפופטוזיס או נמק25 ויכול להיות מלווה באוטופגיה26. ההבדל בין תאים אפופטוטיים לנמקיים הוא שאפופטוזיס הוא סוג של מוות תאי מתוכנת ומופיע בתאים רגילים, בעוד נמק מתרחש עקב תנאים קטלניים (למשל, תאונה, מחלה)27,28. ניתן לזהות אפופטוזיס באמצעות ערכות בדיקה המבוססות על טכניקת TUNEL (זיהוי פיצול DNA על ידי תיוג 3′-הידרוקסיל טרמיני בהפסקות הדנ"א הדו-גדיליות הנוצרות במהלך אפופטוזיס). ערכות שונות מספקות מספר רמות של רגישות באיתור מחיקת תאים.
אחד המבחנים (בדיקה C) הוא רגיש מאוד ומזהה הן אפופטוזיס והן נמק29; הבדיקה השנייה (B) מראה רגישות גבוהה יותר לאיתור מוות של תאים אפופטוטיים30. העיקרון של Assay C הוא לזהות שברי דנ"א בשלבים המוקדמים של אפופטוזיס. לאחר תיקון וחדירה של התאים האפופטוטיים, הרקמה דוגרת עם תערובת תגובת TUNEL. בינתיים, התפקיד של TdT הוא לזרז את התוספת של פלואורסצין-dUTP בקבוצות 3′-OH בחינם בדנ"א. לאחר שטיפת הרקמה, הנוגדן נגד פלואורסצין מסמן את התווית בחלקים הפגועים של הדנ"א. העיקרון של הנוגדן הוא לצרף את האנזים אלקליין phosphatase שעובד כמדווח. לבסוף, ניתן לראות את ה- AP כתוצאה מתגובה ספציפית זו31.
המטוקסילין וצביעת אאוסין של איברים היא שיטה פשוטה ושימושית לניתוח מורפולוגי באמצעות מיקרוסקופיית אור. כולל צעד זה הראשון כדי לבחון כל שינויים מורפולוגיים של תאים מומלץ. לגילוי שלבים מוקדמים של אפופטוזיס בחלקים הדקים של רקמת דבורת הדבש, לפחות שתי ערכות זמינות לניתוח אימונוהיסטוכימי (ראו טבלת חומרים). שניהם הופכים את גרעיני התאים האפופטוטיים לחומים כהים ומדמיינים אותם באמצעות מיקרוסקופיה בהירה. באמצעות Assay A (טכניקת TUNEL), הסטרפטווידין HRP (חזרת פרוקסידאז) מצומד לנוקלאוטידים ביוטינילטים, וגרעינים אפופטוטיים הופכים חומים לאחר התגובה של DAB (דיאמינובנזידין, כרומוגן יציב). בדיקה B מבחינה בין נזק לתאים באמצעות זיהוי של ביקוע DNA וכרומטין מעובה, המהווה סימן לאפופטוזיס מוקדם.
באורגניזם בריא, ניתן בדרך כלל להעריך את רמת חידוש התאים באחוזים קטניםשל 32,33. מוות תאי במידגוט עלה לאחר הטיפול ב-OA, מה שמצביע על כך שלשימוש ב-OA יש השפעה מזיקה על ה-midguts של הדבורים העובדות בניסויי מעבדה. קבוצת הדבורים שטופלו באימידקלופריד ובקומפוס גילתה מוות תאי מוגבר (גרעינים אדומים) בבלוטות המזון10, מה שמעיד על נזק לתאים או נמק; מוות תאי מתוכנת נמצא ברמה נמוכה (גרעינים חומים)10. עם זאת, מוות תאי נמק ואפופטוטי נמצא ברמות גבוהות, במיוחד לאחר טיפול באימידקלופריד. בקבוצת הדבורים שלא טופלו, רמת המוות התאי המתוכנת ב-HPGs לא עלתה על 10%, וזה בהתאם לתחלופת רקמות רגילה32.
מוות תאי, הן כתוצאה מנזק והן ממוות תאי מתוכנת, זוהה על ידי שני המבחנים (B ו-C) והביא לרגישות שונה; הראשון מזהה גם מוות תאי נמק וגם מוות תאי מתוכנת11. כפי שאושר בעובדים הבריאים (קבוצת הביקורת), שני המבחנים זיהו תאים חיוביים ספורדייםרק 10. מבחני זיהוי האפופטוזיס והנמק המשמשים בניתוח אימונוהיסטוכימי של רקמת דבורת הדבש התבררו כשיטה רבת עוצמה לחקור את ההשפעות התת-קטלניות של חומרים שונים על דבורי הדבש.
שלבים קריטיים בפרוטוקול:
לאחר חיתוך עם מיקרוטום, יש להניח את חלקי הרקמה על הזכוכית האובייקטיבית על צלחת חמה (שולחן שיטוח, ראו טבלת חומרים) למשך הלילה. חיוני שהדגימות יתייבשו היטב לצעדים עתידיים בפרוטוקולים. כאשר רקמה אינה מחוברת היטב לזכוכית, היא יכולה להתנתק מפני השטח בהליך לזיהוי מוות תאי. מומלץ להשתמש במיקרוסקופ האור כדי לאמת את נוכחותה של הרקמה הרצויה. לאחר מכן, כדאי לצבוע את השקופית הראשונה עם H&E כדי לבדוק את החלק הנכון עם תאים רבים (במיוחד רקמת הבלוטות) ולהכין חדשים למקרה שמקטע midgut אינו מתאים. HPGs יכול להיות די מאתגר למצוא, ולכן יש להיזהר לא לחתוך יותר מדי חלקים; אחרת, הבלוטות יאבדו.
הוספת בקרה חיובית לזיהוי פיצול DNA היא שימושית אך אופציונלית. חשוב להתייחס לשקופיות בנפרד כדי למנוע הכתמת רקע גבוהה בשקופיות הניסוי. במבחן ב', הבקרות החיוביות נכללות בחלק מהערכות (ראו טבלת חומרים); אחרים יש לרכוש בנפרד.
לשיטה יש מגבלה באורכה ובדיוקה. שימור רקמות במדיום הרכבה מימי הוא לטווח קצר בלבד (מתחת ל -3 חודשים). אם רוצים שימור ארוך יותר (לא מומלץ בגלל שינויים אפשריים בצבע), ישנם מדיומים אחרים, אך התוצאות אינן אמינות באותה מידה.
שימוש בשתי שיטות אלה (אפופטוזיס וזיהוי נמק) בו זמנית הוא מאוד שימושי כדי להשוות את ההשפעות השונות של חומרי הדברה על רקמת דבורת הדבש, במיוחד עבור השפעות sublethal. השיטה החלופית תהיה תצפית על פעילות ההזדקנות והשפעתה על התפיסה הקוגניטיבית של דבורים עובדות המושפעות מחומרי הדברה. שיטה כזו תהיה מהירה יותר באיתור השפעות תת-קרקעיות על פעילותן של דבורים בוגרות, אך לא תענה על שאלות לגבי היקף הנזק הפנימי שיכול לשנות התנהגות בשלב מוקדם, כמו אצל דבורים צעירות (אחיות).
ניתוח היסטולוגי של המורפולוגיה הפשוטה של רקמת דבורת הדבש הוא בסיס מוצק לגישה לנקודות מבט מחקריות שונות בפגיעה בתאים, אפופטוזיס או מומים. הגורמים לשימוש בחומרי הדברה בסביבה או בטיפול במושבה עקב טפילים ומזיקים יכולים להיות מזיקים ולהשפיע באופן משמעותי על תוחלת החיים של דבורת הדבש ועל הישרדות המושבה. המידגוט וה-HPG הם איברים חיוניים בדבורי הדבש ויש להם את היכולת והמטרה להגיב במהירות לכל סוג של גורמים חיצוניים שליליים המשפיעים על פעילותן הקשורה לגיל של דבורים. ה-HPGs פוחתים בגודלם וביכולות ההפרשה, ותאי האפיתל במרכז הגוף מגיבים למוות מוגבר של תאים. שיטות אימונוהיסטוכימיה, כגון מחקרי in situ , הן כלים שימושיים לזיהוי אפופטוזיס ברקמת דבורה. הם גם מראים את הפוטנציאל להיות מיושם במחקרים על השפעות שליליות אפשריות על דבורי דבש וחרקים מועילים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחבר אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
אני מודה על תמיכת סוכנות המחקר הסלובנית, מענק מס 'P4-133.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | |||
| ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101 |
| Covers | |||
| DeadEnd Colorimetric TUNEL system | Promega | G7360 | Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
| Dissecting microscope (for bee dissection) | Zeiss | ||
| Distilled water | |||
| Embedding cassette | |||
| EnVision System alkaline phosphatase kit | Dako | ||
| Eosin Y Solution | Sigma-Aldrich | alcoholic | |
| Ethanol | 95% (or less pure), 90%, 80% | ||
| Faramount mounting medium, aqueous | Dako | mounting medium | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 11294-00 | Standard #4 |
| Formalin 10% | Formaldehyde | ||
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | ||
| HistoChoice Clearing Agent | Sigma-Aldrich | clearing agent | |
| Hydrogen peroxidase 3% | |||
| Incubator | BioRad | ||
| Insect pins (for bee dissection) | Entosphinx | 44594 | Insect pins stainless steel – white, size 2 |
| ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
| KH2PO4 | |||
| Lab clock | |||
| Light microscope | Leica | ||
| Microscope slides | Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust | ||
| Microtome | Leica | ||
| Modular tissue embedding station | Leica | ||
| Na2HPO4 | |||
| NaCl | |||
| Paraformaldehyde 4% | |||
| Paraplast | Leica | ||
| Pasteur pipettes | 1.5 mL; 3 mL | ||
| PBS | |||
| Petri dish (for bee dissection) | Filled with condensation silicon (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator) | ||
| Proteinase K | Merck | 21627 | |
| Ringers' solution (for bee dissection) | 7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water | ||
| Scissors (for bee dissection) | Fine science tools | 1406-09, 14061-09 | Straight and curved, 9 cm |
| Universal liquid plus activator (for bee dissection) | Kulzer | ||
| Watchmaker’s forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 91100-12 | |
| Water bath | Leica | ||
| Watercolor brush | 2x | ||
| Xantoprene L blue (for bee dissection) | Kulzer |
References
- Ruttner, F. Naturgeschichte der Honigbienen. , Ehrenwirth. München. (1992).
- Jordan, R.
- Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee. The Hive and the Honey Bee. , Dadant and Sons. 111-113 (1975).
- Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee. , Cornell University Press. (2004).
- Hrassnigg, N., Crailsheim, K. Adaptation of hypopharyngeal gland development to the brood status of honeybee (Apis mellifera L.) colonies. Journal of Insect Physiology. 44 (10), 929-939 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Characteristics of hypopharyngeal glands in honeybees (Apis mellifera carnica) from a nurse colony. Slovenian Veterinary Research. 52 (2), 67-74 (2015).
- Kubo, T. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. Journal of Biochemistry. 119 (2), 291-295 (1996).
- Sammataro, D., Yoder, J. A. Honey bee colony health: Challenges and sustainable solutions. , Taylor & Francis Group. 302 (2012).
- Crailsheim, K., Stolberg, E. Influence of diet, age and colony condition upon intestinal proteolytic activity and size of the hypopharyngeal glands in the honeybee (Apis mellifera L.). Journal of Insect Physiology. 35 (8), 595-602 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Heat shock proteins and cell death in situ localisation in hypopharyngeal glands of honeybee (Apis mellifera carnica) workers after imidacloprid or coumaphos treatment. Apidologie. 41 (1), 73-86 (2010).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. The histochemical characterisation of cell death in honeybee larvae midgut after treatment with Paenibacillus larvae, Amitraz and Oxytetracycline. Cell Biology International. 24 (5), 319-324 (2000).
- Higes, M., et al. Apoptosis in the pathogenesis of Nosema ceranae (Microsporidia: Nosematidae) in honey bees (Apis mellifera). Environmental Microbiology Reports. 5 (4), 530-536 (2013).
- Kurze, C., et al. Infection dynamics of Nosema ceranae in honey bee midgut and host cell apoptosis. Journal of Invertebrate Pathology. 154, 1-4 (2018).
- Johnson, R. M.
- Gashout, H. A., Guzman-Novoa, E., Goodwin, P. H. Synthetic and natural acaricides impair hygienic and foraging behaviors of honey bees. Apidologie. 51 (6), 1155-1165 (2020).
- McMenamin, A. J., Genersch, E. Honey bee colony losses and associated viruses. Current Opinion in Insect Science. 8, 121-129 (2015).
- Ramsey, S. D., et al. Varroa destructor feeds primarily on honey bee fat body tissue and not hemolymph. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 116 (5), 1792-1801 (2019).
- Requier, F., et al. Honey bee diet in intensive farmland habitats reveals an unexpectedly high flower richness and a major role of weeds. Ecological Applications. 25 (4), 881-890 (2015).
- Santos, C., Serrão, J. Histology of the ileum in bees (Hymenoptera, Apoidea). Brazilian Journal of Morphological Sciences. 23 (3), 405-413 (2006).
- Suwannapong, G., Saichon, C., Benbow, M. Histochemical comparison of the hypopharyngeal gland in Apis cerana Fabricius, 1793 workers and Apis mellifera Linnaeus, 1758 workers. Psyche: A Journal of Entomology. , (2010).
- Ceylan, A., Sevin, S., Özgenç, Ö Histomorphological and histochemical structure of the midgut and hindgut of the Caucasian honey bee (Apis mellifera caucasia). Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences. 43 (6), 747-753 (2019).
- Human, H., et al. Miscellaneous standard methods for Apis mellifera research. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-53 (2013).
- Gregorc, A., Smodiš Škerl, M. I. Toxicological and immunohistochemical testing of honeybees after oxalic and rotenone treatments. Apidologie. 38 (3), 296-305 (2007).
- Carreck, N. L., et al. Standard methods for Apis mellifera anatomy and dissection. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-40 (2013).
- Bowen, I. D., Bowen, S. M., Jones, A. H. Mitosis and apoptosis: Matters of Life and Death. , Chapman & Hall. London. (1998).
- Eisenberg-Lerner, A., et al. Life and death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between them. Cell Death and Differentiation. 16 (7), 966-975 (2009).
- Bowen, I. D., Mullarkey, K., Morgan, S. M. Programmed cell death in the salivary gland of the blow fly Calliphora vomitoria. Microscopy Research Techniques. 34, 202-207 (1996).
- D'Arcy, M. S. Cell death: a review of the major forms of apoptosis, necrosis and autophagy. Cell Biology International. 43 (6), 582-592 (2019).
- Matylevitch, N. P., et al. Apoptosis and accidental cell death in cultured human keratinocytes after thermal injury. American Journal of Pathology. 153 (2), 567-577 (1998).
- Perry, S. W., Epstein, L. G., Gelbard, H. A. Simultaneous in situ detection of apoptosis and necrosis in monolayer cultures by TUNEL and trypan blue staining. BioTechniques. 22 (6), 1102-1106 (1997).
- Cuello-Carrion, F. D., Ciocca, D. Improved detection of apoptotic cells using a modified in situ TUNEL technique. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 837-839 (1999).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. Programmed cell death in the honeybee (Apis mellifera L.) larvae midgut. Cell Biology International. 21 (3), 151-158 (1997).
- Gregorc, A., Pogačnik, A., Bowen, I. D. Cell death in honey bee (Apis mellifera) larvae treated with oxalic or formic acid. Apidologie. 35 (5), 453-460 (2004).
