Summary
本协议描述了微流体室中神经元线粒体的播种和染色。这些腔室中的流体压力梯度允许选择性处理轴突中的线粒体，以分析其性质以应对药理学挑战而不影响细胞体区室。
Abstract
线粒体是神经元中ATP（三磷酸腺苷）的主要供应商。线粒体功能障碍是许多神经退行性疾病的常见表型。鉴于一些轴突的复杂结构和极端的长度，与细胞体对应物相比，轴突中的线粒体可以经历不同的环境也就不足为奇了。有趣的是，轴突线粒体的功能障碍通常先于对细胞体的影响。为了在体 外模拟轴突线粒体功能障碍，微流体装置允许在不影响体细胞线粒体的情况下治疗轴突线粒体。这些腔室中的流体压力梯度阻止了分子逆梯度扩散，从而允许分析线粒体特性以响应轴突内的局部药理学挑战。目前的协议描述了在微流体装置中分离的海马神经元的接种，用膜电位敏感染料染色，用线粒体毒素处理以及随后的显微镜分析。这种研究轴突生物学的通用方法可以应用于许多药理学扰动和成像读数，并且适用于几种神经元亚型。
Introduction
线粒体是神经元中ATP（三磷酸腺苷）的主要供应商。由于神经元健康与线粒体功能密切相关，因此这些细胞器的功能失调与各种神经退行性疾病（包括帕金森病）的发作有关也就不足为奇了1。此外，线粒体中毒已成功用于模拟动物的帕金森病症状2。在动物模型和人类疾病中，神经元的死亡始于远端3，4，这表明轴突线粒体可能更容易受到侮辱。然而，轴突中线粒体的生物学尚不清楚，因为与轴突线粒体的靶向治疗和分析相关的困难，而不会同时干扰细胞体过程。
体外解离神经元培养技术的最新进展现在允许通过微流体装置对轴突和细胞体进行流体分离5。如图1A所示，这些器件具有四个接入井（a/h和c/i），每对（d和f）有两个通道连接。大通道通过一系列450μm长的微通道（e）相互连接。两个腔室之间填充水平的故意差异会产生流体压力梯度（图1B），防止小分子从液位较低的通道扩散到另一侧（图1C，用台盼蓝染料说明）。
我们最近使用微流体装置来研究轴突线粒体自噬的局部翻译要求，即选择性去除受损线粒体6。在本协议中，提出了通过使用线粒体复合物III抑制剂抗霉素A6，7选择性治疗轴突来诱导局部线粒体损伤的不同步骤。
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Protocol
所有动物实验均按照上巴伐利亚州政府的相关准则和法规进行。原代神经元由E16.5 C57BL / 6野生型小鼠胚胎制备，遵循先前描述的标准方法6。
1. 微流控装置的组装
- 在PBS（磷酸盐缓冲盐水）中涂覆一个六孔玻璃底组织培养板，终浓度为20μg/ mL的聚-D-赖氨酸和3.4μg/ mL层粘连蛋白（参见 材料表）。
- 将涂层板在室温下在黑暗中孵育过夜。
注意：涂层也可以在37°C下进行1-2小时。包衣的选择取决于所使用的细胞类型。 - 包衣后，将六孔板带到无菌罩中，并用无菌ddH2O洗涤两次。
注意：不要用含盐缓冲液（如PBS）洗涤，因为盐晶体会干扰密封的形成。 - 让板在倾斜位置干燥3-5分钟。通过真空抽吸或移液去除多余的水分。
- 将微流体室浸泡在80%乙醇中。
注意：微流体室是从商业来源获得的（见 材料表）。 - 让微流体室在倾斜位置干燥3-5分钟。通过真空、抽吸或移液去除多余的乙醇。
- 完全干燥后，将微流体室放在孔的中心。
注意： 当空气从板和硅胶装置之间的界面中排除时，可以观察到密封件的形成是反射性能的变化。板和微流体室在组装前必须完全干燥，以形成良好的密封。然而，需要尽可能减少干燥时间，以确保正确粘附在细胞上。因此，必须目视检查孔和腔室是否有剩余的液滴。如果没有可见液滴，请立即组装腔室。 - 轻轻敲击微流体室的边界和中间的微槽部分，以正确连接到玻璃板上。
2. 神经元的播种和维持
- 在 1.5 mL 反应管中每个腔室收集所需数量的解离海马神经元。
注意：对于本研究，每个设备接种1.5 x 105 个神经元，用于基于成像的应用。 - 在室温下以1000× g 离心神经元4分钟。
- 用移液管弃去上清液，并将沉淀重悬于8μL的B27-神经基础培养基中（参见 材料表）。
- 将细胞溶液移液到微流体室的通道入口中（图1A中的b）。
- 点击板的背面以协助流过通道。
注意：可以非常有力地进行攻丝，而不必担心密封件会破裂。 - 用移液管吸出通道出口处的任何剩余细胞悬液（图1A中的g）以减少通道外的细胞数量。
- 将微流体室与细胞在37°C和5%CO 2下孵育15-20分钟。
- 用 50 μL 的 B27-神经基础培养基填充顶部轴突孔（图 1A 中的 c）。
- 点击板的背面以协助流过通道。
- 在体细胞侧（图 1A 中的 a 和 h）上分别用 150 μL B27-神经基础培养基填充孔，在顶部产生张力气泡。气泡的体积约为 20 μL。
注意：创建张力气泡不是实现流体隔离所必需的，但它提供了体细胞侧较高体积的清晰视觉效果。 - 分别用 100 μL B27-神经基础培养基填充轴突侧的两个孔（图 1A 中的 c 和 i）。
注意：为了通过微槽促进轴突生长，建议体细胞侧的孔比轴突侧的孔包含更多的介质。然而，即使没有体积差异，轴突也会偶然通过微凹槽生长。 - 将微流体室在37°C和5%CO2 下孵育7-8天。
注意：轴突在轴突室中的生长通常可以从 体外 （DIV）5开始观察到。如果需要更成熟的培养物，则可以延长培养时间。 - 每2-3天通过从两个上孔（a 和 c）中取出培养基并用新鲜的B27-神经基础培养基替换它，直到形成张力气泡，每2-3天喂食神经元。
3.用线粒体膜电位敏感染料染色
- 在DIV 7-8处，评估轴突是否通过微凹槽生长并延伸到光学显微镜下方的轴突室。
注意：根据所需的年龄，也可以进行不同的DIV阶段。 - 通过从所有孔中去除B27-神经基础培养基并将约100μL成像培养基添加到轴突和体细胞通道（a 和 c）的顶部孔中，用预热的成像介质（37°C）进行两次洗涤。让培养基流向较低的孔（h 和 i）。
- 从下孔中取出培养基和顶部孔中的任何剩余培养基，然后用新鲜培养基重复，在洗涤结束时使孔空。
注意：由于通道（d 和 f）中的高毛细管力，通道中将有剩余的洗涤介质，不应将其移除以防止神经元干燥。任何不含酚红的成像介质都可以在这里使用，例如Hibernate E（见 材料表）。如果显微镜未设置CO2 电源，请确保成像介质使用碳酸盐/ CO2 的替代缓冲系统（例如HEPES）8。
- 从下孔中取出培养基和顶部孔中的任何剩余培养基，然后用新鲜培养基重复，在洗涤结束时使孔空。
- 在成像介质中将1 mM四甲基罗丹明乙酯（TMRE，红色，参见 材料表）原液稀释至5 nM。
注意：在最终稀释度中不要超过1%的DMSO，以避免毒性。 - 向体细胞和轴突顶孔（a 和 c）中加入100 μL的5 nM TMRE稀释液，让培养基流过体细胞和轴突隔室，直到所有孔中的体积相等。填充含TMRE的培养基。
- 将神经元放回受控环境室（37°C和5%CO2）25分钟。
- 如前所述（步骤3.2），用预热的成像介质（37°C）进行两次洗涤。在最后一次洗涤时，在每个孔中填充 100 μL，并在体细胞孔（a 和 c）上产生培养基的张力气泡。
4. 活细胞成像
注意：所示静止图像是在转盘共聚焦显微镜上使用40x NA 1.25浸没物镜采集的（参见 材料表）。红色通道的曝光时间和10%的激光功率以及明场的曝光时间为500 ms。然而，常规共聚焦或宽场倒置显微镜也可用于研究TMRE强度。
- 用倒置显微镜对细胞进行成像。
- 确保显微镜配备载物台培养箱，以在整个实验过程中将神经元培养物保持在37°C。
- 在体细胞隔室中选择一个感兴趣的区域，并跟随它穿过微凹槽进入轴突隔室。确保成像的微凹槽与体细胞和轴突隔室中的微凹槽相匹配（以便于基线和治疗后比较）。
- 使用561 nm激发和625 nm发射红色荧光信号捕获荧光图像。
- 获取图像。
- 为了诱导线粒体去极化，在成像介质中向轴突隔室添加20μM抗霉素A（参见 材料表）。为确保体细胞和轴突腔之间的体积差异，请检查体细胞侧是否存在张力气泡（等于体积>110μL）。
- 从轴突侧（i）的下孔中取出所有成像介质，通道内（f）内的培养基除外。向顶部轴突孔 （c） 中加入 160 μL 20 μM 抗霉素 A，让它流过通道，直到两个轴突孔中的体积相等。轴突孔中的体积约为每孔 80 μL。
注意：确保轴突井中的体积小于体细胞孔中的体积，以确保适当的流体压力。建议至少相差 10 μL（孔体积的 10%），但也可能存在更高的差异。
- 从轴突侧（i）的下孔中取出所有成像介质，通道内（f）内的培养基除外。向顶部轴突孔 （c） 中加入 160 μL 20 μM 抗霉素 A，让它流过通道，直到两个轴突孔中的体积相等。轴突孔中的体积约为每孔 80 μL。
- 在受控环境室（37°C）中孵育神经元20-30分钟。
- 如上所述重复成像（步骤4.3-4.5）。确保成像位置（易于通过微凹槽识别）与基线采集期间相同。
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Representative Results
原代海马神经元在微流体装置中生长7-8天，然后线粒体在两个通道中用膜敏感染料（TMRE）染色25分钟。如图2A所示，这在微凹槽的两侧产生了线粒体的均匀染色，但不足以平衡微槽中间的染色。在轴突侧加入抗霉素A后，体细胞线粒体保留TMRE信号（图2B和视频1），而轴突线粒体的TMRE荧光丢失（图2C和视频1）。视频是使用完全集成的数字宽场显微镜拍摄的（见材料表）。
图1：微流体装置允许轴突的流体隔离 。 （A）本研究中使用的微流控装置示意图。硅胶盘（直径 21 mm）可轻松装入六孔板中。a）体侧的井，b）体细胞侧通道的入口，c）轴突侧的井，d）体侧的通道，e）微槽，f）轴突侧的通道，g）体侧通道的出口，h）体侧的通道，i）轴突侧的井。（B）详细说明不同液位如何在微通道上产生流体压力梯度的示意图。（C）通过在腔室的一侧添加台盼蓝来演示流体隔离。请注意，由于流体压力梯度，蓝色染料不会在微通道上平衡。 请点击此处查看此图的大图。
图2：轴突的选择性处理使轴突去极化，但不使细胞体线粒体去极化。 （A）代表性显微照片，概述了微流体装置中TMRE染色的有效性。比例尺= 100μm.（B-C）代表性显微照片显示了向轴突区室添加20μM抗霉素A（AA）之前和之后细胞体和轴突隔室中的相同区域。比例尺 = 20 μm。 请点击此处查看此图的大图。
视频1：抗霉素A治疗对轴突和细胞体线粒体的影响。 添加抗霉素A后TMRE荧光损失的活细胞成像， 请点击此处下载此视频。
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Discussion
本协议描述了一种在微流体装置中播种和培养解离的海马神经元以分别治疗轴突线粒体的方法。本文展示了这种方法与膜敏感染料TMRE和复合物III抑制剂抗霉素A（如前所述7）的实用性，但该方法可以很容易地适应其他线粒体染料或线粒体功能的遗传编码传感器，允许局部的，基于显微镜的读数9。其他神经元细胞类型也可以在微流体室中生长，例如原代皮质神经元10 或诱导多能干细胞（ipSC）衍生的运动神经元11，使该平台成为研究线粒体功能在感兴趣的神经元细胞类型中神经变性的多功能工具。微流体装置的组装对于实现高效密封至关重要，通过观看经验丰富的研究人员进行组装最容易解释。此处描述的下游标记和处理程序旨在作为示例，并且可以进行调整以适应当前在各自实验室中建立的方案，同时保持流体压力梯度。
这里描述的播种技术与已发布的方案和制造商的描述不同，因为我们跳过了组装设备的建议洗涤，而是直接将解离的神经元播种到干燥室中（第2节）。已经观察到，这减少了所需的神经元数量，因为它增加了通道（e）内神经元的密度，并限制了神经元扩散到远离微通道的孔中。通过敲击板的底部（步骤2.5）来辅助干播种，这可能是必需的，也可能不是必需的，具体取决于先前组装设备时施加的力。
但是，此过程存在某些限制。由于装配过程中施加的力的差异，密封件的密封性存在一些变化，这可能导致通过微槽的生长受限。此外，残留的水分会干扰密封的形成，并允许轴突生长甚至细胞在设备下方迁移。在染色之前，这两个问题都很容易被发现，从而将有缺陷的腔室排除在实验之外。
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Disclosures
作者声明没有竞争利益。
Acknowledgments
这项研究得到了德国研究基金会（HA 7728/2-1和EXC2145项目编号390857198）和马克斯普朗克学会的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well Glass bottom plate | Cellvis | P06.1.5H-N | Silicone device |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| EVOS M5000 widefield microscope | Thermofischer Scientific | EVOS M5000 | fully integrated digital widefield microscope |
| Hibernate E | BrainBits | HE500 | |
| Inverted spinning disk confocal | Nikon | TI2-E + CSU-W1 | With incubator chamber |
| Laminin | Invitrogen | L2020 | |
| Microfluidic devices | XONA microfluidics | RD450 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P2636 | |
| TMRE | Sigma | 87917 |
References
- Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson's disease. Advanced Biology. 5 (9), 2100663 (2021).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).
- Moratalla, R., et al. Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).
- Cheng, H. -C., Ulane, C. M., Burke, R. E. Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons. Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Harbauer, A. B., et al. Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy. Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).
- Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin. Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).
- Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).
- Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. Analysis of mitochondria by single-organelle resolution. Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).
- Altman, T., et al. Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
