Summary
Le présent protocole décrit l’ensemencement et la coloration des mitochondries neuronales dans des chambres microfluidiques. Le gradient de pression fluidique dans ces chambres permet le traitement sélectif des mitochondries dans les axones pour analyser leurs propriétés en réponse à des défis pharmacologiques sans affecter le compartiment du corps cellulaire.
Abstract
Les mitochondries sont les principaux fournisseurs d’ATP (adénosine triphosphate) dans les neurones. Le dysfonctionnement mitochondrial est un phénotype courant dans de nombreuses maladies neurodégénératives. Compte tenu de l’architecture élaborée et de la longueur extrême de certains axones, il n’est pas surprenant que les mitochondries dans les axones puissent connaître des environnements différents de ceux de leurs homologues du corps cellulaire. Fait intéressant, le dysfonctionnement des mitochondries axonales précède souvent les effets sur le corps cellulaire. Pour modéliser le dysfonctionnement mitochondrial axonal in vitro, des dispositifs microfluidiques permettent de traiter les mitochondries axonales sans affecter les mitochondries somales. Le gradient de pression fluidique dans ces chambres empêche la diffusion des molécules contre le gradient, permettant ainsi l’analyse des propriétés mitochondriales en réponse aux défis pharmacologiques locaux au sein des axones. Le protocole actuel décrit l’ensemencement des neurones dissociés de l’hippocampe dans des dispositifs microfluidiques, la coloration avec un colorant sensible au potentiel membranaire, le traitement avec une toxine mitochondriale et l’analyse microscopique subséquente. Cette méthode polyvalente pour étudier la biologie axonale peut être appliquée à de nombreuses perturbations pharmacologiques et lectures d’imagerie, et convient à plusieurs sous-types neuronaux.
Introduction
Les mitochondries sont les principaux fournisseurs d’ATP (adénosine triphosphate) dans les neurones. Comme la santé neuronale est intimement liée à la fonction mitochondriale, il n’est pas surprenant que la régulation dysfonctionnelle de ces organites ait été associée à l’apparition de diverses maladies neurodégénératives, dont la maladie de Parkinson1. De plus, l’intoxication mitochondriale a été utilisée avec succès pour modéliser les symptômes parkinsoniens chez les animaux2. Dans les modèles animaux et les maladies humaines, la disparition des neurones commence aux parties distales3,4, ce qui suggère que les mitochondries axonales pourraient être plus sensibles aux insultes. Cependant, la biologie des mitochondries dans les axones n’est pas bien comprise en raison des difficultés associées au traitement ciblé et à l’analyse des mitochondries axonales sans perturbation simultanée des processus du corps cellulaire.
Les progrès récents dans les techniques de culture de neurones dissociés in vitro permettent maintenant la séparation fluidique des axones et des corps cellulaires grâce à des dispositifs microfluidiques5. Comme le montre la figure 1A, ces dispositifs comportent quatre puits d’accès (a/h et c/i), avec deux canaux reliant chaque paire (d et f). Les grands canaux sont reliés entre eux par une série de microcanaux de 450 μm de long (e). Les différences intentionnelles dans les niveaux de remplissage entre les deux chambres créent un gradient de pression du fluide (Figure 1B) qui empêche la diffusion de petites molécules du canal avec un niveau de fluide inférieur de l’autre côté (Figure 1C, illustrée avec un colorant bleu trypan).
Nous avons récemment utilisé des dispositifs microfluidiques pour étudier les besoins de traduction locale en mitophagie axonale, l’élimination sélective des mitochondries endommagées6. Dans le présent protocole, différentes étapes sont présentées pour induire des lésions mitochondriales locales par traitement sélectif des axones à l’aide de l’inhibiteur du complexe mitochondrial III Antimycine A 6,7.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément aux directives et réglementations pertinentes du gouvernement de Haute-Bavière. Les neurones primaires ont été préparés à partir d’embryons de souris sauvages E16.5 C57BL/6 des deux sexes selon les méthodes standard décrites précédemment6.
1. Assemblage du dispositif microfluidique
- Enduire une plaque de culture tissulaire à fond de verre à six puits avec une concentration finale de 20 μg/mL de poly-D-lysine et de 3,4 μg/mL de laminine dans du PBS (solution saline tamponnée au phosphate) (voir le tableau des matériaux).
- Incuber la plaque enduite pendant une nuit dans l’obscurité à température ambiante.
REMARQUE: Le revêtement peut également être effectué à 37 ° C pendant 1-2 h. Le choix du revêtement dépend du type de cellule utilisé. - Après le revêtement, amenez les plaques à six puits dans la hotte stérile et lavez-les deux fois avec du ddH2O stérile.
REMARQUE: Ne pas laver avec des tampons contenant du sel tels que le PBS, car les cristaux de sel interféreront avec la formation des joints. - Laissez la plaque sécher en position inclinée pendant 3 à 5 minutes. Éliminer l’excès d’eau par aspiration sous vide ou pipetage.
- Faire tremper la chambre microfluidique dans de l’éthanol à 80%.
REMARQUE : La chambre microfluidique a été obtenue à partir de sources commerciales (voir le tableau des matériaux). - Laissez sécher la chambre microfluidique pendant 3 à 5 minutes en position inclinée. Éliminer l’excès d’éthanol par aspiration, aspiration ou pipetage.
- Lorsqu’il est complètement sec, placez la chambre microfluidique au centre du puits.
NOTE: La formation du joint peut être observée comme un changement dans les propriétés réfléchissantes lors de l’exclusion de l’air de l’interface entre la plaque et le dispositif en silicone. La plaque et la chambre microfluidique doivent être complètement sèches avant l’assemblage pour créer une bonne étanchéité. Cependant, le temps de séchage doit être minimisé autant que possible pour assurer une bonne adhérence aux cellules. Par conséquent, les puits et les chambres doivent être inspectés visuellement pour détecter les gouttelettes de liquide restantes. Si aucune gouttelette n’est visible, assemblez immédiatement les chambres. - Tapotez doucement la chambre microfluidique à ses bordures et la section microrainure au milieu pour une fixation appropriée à la plaque de verre.
2. Ensemencement et maintien des neurones
- Recueillir le nombre désiré de neurones dissociés de l’hippocampe par chambre dans un tube de réaction de 1,5 mL.
REMARQUE: Pour la présente étude, 1,5 x 105 neurones ont été ensemencés par dispositif pour des applications basées sur l’imagerie. - Centrifuger les neurones à 1000 x g pendant 4 min à température ambiante.
- Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre en suspension la pastille dans 8 μL de milieu B27-neurobasal (voir le tableau des matériaux).
- Introduire à la pipette la solution cellulaire dans l’entrée du canal de la chambre microfluidique (b sur la figure 1A).
- Tapotez à l’arrière de la plaque pour faciliter l’écoulement dans le canal.
REMARQUE: Le tapotement peut être effectué avec force sans craindre que le sceau ne se brise. - Aspirer à l’aide d’une pipette toute suspension cellulaire restante à la sortie du canal (g sur la figure 1A) pour diminuer le nombre de cellules à l’extérieur du canal.
- Incuber la chambre microfluidique avec des cellules pendant 15-20 min à 37 °C et 5% de CO2.
- Remplir le puits axonal supérieur avec 50 μL de milieu B27-Neurobasal (c sur la figure 1A).
- Tapotez à l’arrière de la plaque pour faciliter l’écoulement dans le canal.
- Remplissez les puits du côté soma (a et h sur la figure 1A) avec 150 μL de milieu B27-Neurobasal chacun, créant une bulle de tension sur le dessus. Le volume de la bulle est d’environ 20 μL.
REMARQUE: La création d’une bulle de tension n’est pas nécessaire pour obtenir une isolation fluidique, mais elle fournit une vision claire du volume plus élevé du côté soma. - Remplir les deux puits de la face axonale (c et i sur la figure 1A) avec 100 μL de milieu B27-neurobasal chacun.
REMARQUE: Pour favoriser la croissance axonale à travers les microrainures, il est recommandé que les puits du côté soma contiennent plus de milieux que les puits du côté axonal. Cependant, les axones se développeront par hasard à travers les microrainures même sans différences de volume. - Incuber la chambre microfluidique à 37 °C et 5% de CO2 pendant 7-8 jours.
REMARQUE: La croissance des axones dans la chambre axonale peut généralement être observée à partir du jour in vitro (DIV) 5. Des périodes de culture plus longues sont possibles si des cultures plus matures sont souhaitées. - Nourrir les neurones tous les 2-3 jours en retirant le milieu des deux puits supérieurs (a et c) et en le remplaçant par un milieu B27-neurobasal frais jusqu’à ce qu’une bulle de tension se forme.
3. Coloration avec un colorant sensible potentiel de la membrane mitochondriale
- À DIV 7-8, évaluer que les axones ont grandi à travers les microrainures et s’étendent dans le compartiment axonal sous un microscope optique.
REMARQUE: Différents stades DIV sont également possibles en fonction de l’âge souhaité. - Effectuer deux lavages avec un milieu imageur préchauffé (37 °C) en retirant le milieu B27-Neurobasal de tous les puits et en ajoutant environ 100 μL du milieu imageur aux puits supérieurs des canaux axonal et soma (a et c). Laissez le milieu s’écouler vers les puits inférieurs (h et i).
- Retirer le milieu des puits inférieurs et tout milieu restant dans les puits supérieurs, et répéter avec un milieu frais, en laissant les puits vides à la fin du lavage.
REMARQUE: En raison de la force capillaire élevée dans les canaux (d et f), il restera un produit de lavage dans les canaux qui ne doit pas être retiré pour empêcher les neurones de sécher. Tout milieu d’imagerie sans rouge de phénol peut être utilisé ici, par exemple, Hibernate E (voir le tableau des matériaux). Si le microscope n’est pas équipé d’une alimentation en CO 2, s’assurer que le milieu d’imagerie utilise un système tampon alternatif au carbonate/CO2 (p. ex., HEPES)8.
- Retirer le milieu des puits inférieurs et tout milieu restant dans les puits supérieurs, et répéter avec un milieu frais, en laissant les puits vides à la fin du lavage.
- Diluer 1 mM d’ester éthylique de tétraméthylrhodamine (TMRE, rouge, voir le tableau des matières) à 5 nM dans le milieu imageur.
NOTA: Ne pas dépasser 1% de DMSO dans la dilution finale pour éviter toute toxicité. - Ajouter 100 μL de la dilution TMRE de 5 nM aux puits supérieurs somatiques et axonaux (a et c) et laisser le milieu s’écouler à travers les compartiments somatique et axonal jusqu’à ce qu’il y ait un volume égal dans tous les puits. Faites le plein avec le milieu contenant TMRE.
- Replacez les neurones dans une chambre à environnement contrôlé (37 °C et 5% de CO2) pendant 25 min.
- Effectuer deux lavages avec le milieu imageur préchauffé (37 °C) comme décrit précédemment (étape 3.2). Lors du dernier lavage, remplir 100 μL dans chaque puits et créer une bulle de tension du milieu sur les puits somatiques (a et c).
4. Imagerie de cellules vivantes
REMARQUE : Les images fixes présentées ont été acquises sur un microscope confocal à disque rotatif, à l’aide d’un objectif d’immersion 40x NA 1,25 (voir le tableau des matériaux). Un temps d’exposition de 200 ms et une puissance laser de 10 % pour le canal rouge et un temps d’exposition de 500 ms pour le fond clair ont été choisis. Cependant, des microscopes confocaux ou inversés à grand champ ordinaires peuvent également être utilisés pour étudier l’intensité de l’EMRT.
- Imagez les cellules avec un microscope inversé.
- Assurez-vous que le microscope est équipé d’un incubateur de scène pour maintenir la culture neuronale à 37 °C tout au long de l’expérience.
- Sélectionnez une région d’intérêt dans le compartiment somatique et suivez-la à travers les microsillons dans le compartiment axonal. Assurez-vous que les microrainures imagées correspondent à celles des compartiments somatique et axonal (pour faciliter la comparaison de base et post-traitement).
- Capturez des images de fluorescence en utilisant l’excitation à 561 nm et l’émission à 625 nm pour le signal de fluorescence rouge.
- Acquérir les images.
- Pour induire une dépolarisation mitochondriale, ajouter 20 μM d’antimycine A (voir le tableau des matériaux) dans le milieu d’imagerie au compartiment axonal. Pour assurer une différence de volume entre le soma et la chambre axonale, vérifier la présence d’une bulle de tension du côté somatique (égale au volume >110 μL).
- Retirer tout milieu imageur du puits inférieur de la face axonale (i), à l’exception du milieu à l’intérieur du canal (f). Ajouter 160 μL d’antimycine A 20 μM au puits axonal supérieur (c) et laisser s’écouler dans le canal jusqu’à ce qu’il y ait un volume égal dans les deux puits axonaux. Les volumes dans les puits axonaux sont d’environ 80 μL par puits.
REMARQUE: Assurez-vous que le volume dans les puits axonaux est plus petit que dans les puits somatiques pour assurer une pression de fluide appropriée. Une différence d’au moins 10 μL (10% du volume du puits) est recommandée, mais des différences plus élevées sont également possibles.
- Retirer tout milieu imageur du puits inférieur de la face axonale (i), à l’exception du milieu à l’intérieur du canal (f). Ajouter 160 μL d’antimycine A 20 μM au puits axonal supérieur (c) et laisser s’écouler dans le canal jusqu’à ce qu’il y ait un volume égal dans les deux puits axonaux. Les volumes dans les puits axonaux sont d’environ 80 μL par puits.
- Incuber les neurones dans la chambre à environnement contrôlé (37 °C) pendant 20-30 min.
- Répétez l’imagerie comme décrit ci-dessus (étapes 4.3-4.5). Assurez-vous que les mêmes positions sont imagées (facilement identifiables par les microrainures) que lors de l’acquisition de la ligne de base.
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Representative Results
Les neurones primaires de l’hippocampe ont été cultivés dans des dispositifs microfluidiques pendant 7 à 8 jours avant que les mitochondries ne soient colorées avec le colorant sensible à la membrane (TMRE) pendant 25 minutes dans les deux canaux. Comme le montre la figure 2A, cela a donné une coloration homogène des mitochondries des deux côtés des microrainures, mais elle était insuffisante pour équilibrer la coloration au milieu des microrainures. Lors de l’ajout de l’antimycine A à la face axonale, les mitochondries somiques ont conservé le signal TMRE (Figure 2B et Vidéo 1), tandis que la fluorescence TMRE a été perdue des mitochondries axonales (Figure 2C et Vidéo 1). La vidéo a été capturée à l’aide d’un microscope numérique à grand champ entièrement intégré (voir Tableau des matériaux).
Figure 1 : Les dispositifs microfluidiques permettent l’isolation fluidique des axones. (A) Schéma du dispositif microfluidique utilisé dans cette étude. Le disque en silicone (diamètre 21 mm) s’insère facilement dans une plaque à six puits. a) Puits côté soma, b) Entrée du canal côté soma, c) Puits côté axone, d) Canal côté soma, e) Microrainures, f) Canal côté axone, g) Sortie du canal côté soma, h) Puits côté soma, i) Puits côté axone. (B) Schéma détaillant comment les différents niveaux de fluide créent un gradient de pression fluidique à travers les microcanaux. (C) Démonstration de l’isolement fluidique par addition de bleu de trypan sur un côté de la chambre. Notez qu’en raison du gradient de pression fluidique, le colorant bleu ne s’équilibre pas à travers les microcanaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Le traitement sélectif des axones dépolarise les mitochondries axonales mais pas les mitochondries du corps cellulaire. (A) Micrographie représentative présentant un aperçu de l’efficacité de la coloration TMRE dans les dispositifs microfluidiques. Barre d’échelle = 100 μm. (B-C) La micrographie représentative montre la même zone dans le corps cellulaire et le compartiment axonal avant et après l’ajout de 20 μM d’antimycine A (AA) au compartiment axonal. Barre d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Vidéo 1: Effet du traitement à l’antimycine A sur les mitochondries dans les axones et les corps cellulaires. Imagerie cellulaire vivante de la perte de fluorescence TMRE lors de l’ajout d’antimycine A. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
Le présent protocole décrit une méthode pour ensemencer et cultiver des neurones hippocampiques dissociés dans un dispositif microfluidique pour traiter séparément les mitochondries axonales. L’utilité de cette approche avec le colorant TMRE sensible à la membrane et l’inhibiteur complexe III Antimycin A (comme démontré précédemment7) est démontrée ici, mais cette méthode peut être facilement adaptée à d’autres colorants mitochondriaux ou capteurs génétiquement codés des fonctions mitochondriales qui permettent des lectures locales basées sur la microscopie9. D’autres types de cellules neuronales peuvent également être cultivées dans des chambres microfluidiques, telles que les neurones corticaux primaires10 ou les motoneurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites (ipSC)11, faisant de cette plate-forme un outil polyvalent pour étudier la fonction mitochondriale dans la neurodégénérescence dans le type de cellule neuronale d’intérêt. L’assemblage de dispositifs microfluidiques est crucial pour obtenir une étanchéité efficace et s’explique plus facilement en regardant un chercheur expérimenté effectuer l’assemblage. La procédure d’étiquetage et de traitement en aval décrite ici se veut exemplaire et peut être ajustée pour s’adapter aux protocoles actuellement établis dans les laboratoires respectifs tout en maintenant le gradient de pression fluidique.
La technique d’ensemencement décrite ici diffère des protocoles publiés et de la description du fabricant, car nous sautons les lavages suggérés du dispositif assemblé et ensemençons directement les neurones dissociés dans la chambre sèche (section 2). Il a été observé que cela réduit le nombre de neurones nécessaires, car cela augmente la densité des neurones dans le canal (e) et limite la propagation des neurones dans les puits éloignés des microcanaux. L’ensemencement à sec est facilité par le taraudage du fond de la plaque (étape 2.5), ce qui peut être nécessaire ou non en fonction de la force appliquée précédemment lors de l’assemblage du dispositif.
Cependant, certaines limitations existent dans cette procédure. Il existe une certaine variabilité dans l’étanchéité du joint en raison des différences dans la force appliquée pendant l’assemblage qui peuvent conduire à une croissance restreinte à travers les microrainures. En outre, l’humidité restante peut perturber la formation du joint et permettre la croissance axonale ou même la migration cellulaire sous l’appareil. Les deux problèmes peuvent facilement être repérés avant la coloration, ce qui conduit à l’exclusion des chambres défectueuses de l’expérience.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par la Fondation allemande pour la recherche (HA 7728/2-1 et EXC2145 Project ID 390857198) et la Société Max Planck.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well Glass bottom plate | Cellvis | P06.1.5H-N | Silicone device |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| EVOS M5000 widefield microscope | Thermofischer Scientific | EVOS M5000 | fully integrated digital widefield microscope |
| Hibernate E | BrainBits | HE500 | |
| Inverted spinning disk confocal | Nikon | TI2-E + CSU-W1 | With incubator chamber |
| Laminin | Invitrogen | L2020 | |
| Microfluidic devices | XONA microfluidics | RD450 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P2636 | |
| TMRE | Sigma | 87917 |
References
- Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson's disease. Advanced Biology. 5 (9), 2100663 (2021).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).
- Moratalla, R., et al. Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).
- Cheng, H. -C., Ulane, C. M., Burke, R. E. Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons. Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Harbauer, A. B., et al. Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy. Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).
- Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin. Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).
- Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).
- Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. Analysis of mitochondria by single-organelle resolution. Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).
- Altman, T., et al. Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
