Summary
Detta protokoll beskriver sådd och färgning av neuronala mitokondrier i mikrofluidiska kamrar. Den fluidiska tryckgradienten i dessa kamrar möjliggör selektiv behandling av mitokondrier i axoner för att analysera deras egenskaper som svar på farmakologiska utmaningar utan att påverka cellkroppsfacket.
Abstract
Mitokondrier är de primära leverantörerna av ATP (adenosintrifosfat) i nervceller. Mitokondriell dysfunktion är en vanlig fenotyp vid många neurodegenerativa sjukdomar. Med tanke på vissa axoners utarbetade arkitektur och extrema längd är det inte förvånande att mitokondrier i axoner kan uppleva olika miljöer jämfört med deras motsvarigheter i cellkroppen. Intressant är att dysfunktion av axonala mitokondrier ofta föregår effekter på cellkroppen. För att modellera axonal mitokondriell dysfunktion in vitro tillåter mikrofluidiska anordningar behandling av axonala mitokondrier utan att påverka de somala mitokondrierna. Den fluidiska tryckgradienten i dessa kamrar förhindrar diffusion av molekyler mot gradienten, vilket möjliggör analys av mitokondriella egenskaper som svar på lokala farmakologiska utmaningar inom axoner. Det nuvarande protokollet beskriver sådd av dissocierade hippocampusneuroner i mikrofluidiska anordningar, färgning med ett membranpotentialkänsligt färgämne, behandling med ett mitokondriellt toxin och den efterföljande mikroskopiska analysen. Denna mångsidiga metod för att studera axonal biologi kan tillämpas på många farmakologiska störningar och avbildningsavläsningar och är lämplig för flera neuronala subtyper.
Introduction
Mitokondrier är de viktigaste leverantörerna av ATP (adenosintrifosfat) i neuroner. Eftersom neuronal hälsa är intimt kopplad till mitokondriell funktion är det inte förvånande att dysfunktionell reglering av dessa organeller har associerats med uppkomsten av olika neurodegenerativa sjukdomar, inklusive Parkinsons sjukdom1. Dessutom har mitokondriell förgiftning framgångsrikt använts för att modellera Parkinsons symtom hos djur2. I både djurmodeller och mänsklig sjukdom börjar neurons bortgång vid de distala delarna3,4, vilket antyder att axonala mitokondrier kan vara mer mottagliga för förolämpningar. Mitokondriernas biologi i axoner är emellertid inte väl förstådd på grund av svårigheterna i samband med riktad behandling och analys av axonala mitokondrier utan samtidig störning av cellkroppsprocesser.
De senaste framstegen inom odlingstekniker för dissocierade neuroner in vitro tillåter nu fluidisk separation av axoner och cellkroppar genom mikrofluidiska anordningar5. Som visas i figur 1A har dessa enheter fyra åtkomstbrunnar (a / h och c / i), med två kanaler som förbinder varje par (d och f). De stora kanalerna är förbundna med varandra med en serie av 450 μm långa mikrokanaler (e). Avsiktliga skillnader i fyllningsnivåerna mellan de två kamrarna skapar en vätsketrycksgradient (figur 1B) som förhindrar diffusion av små molekyler från kanalen med en lägre vätskenivå till andra sidan (figur 1C, illustrerad med trypanblått färgämne).
Vi använde nyligen mikrofluidiska enheter för att studera lokala översättningskrav i axonal mitophagi, selektivt avlägsnande av skadade mitokondrier6. I detta protokoll presenteras olika steg för att inducera lokal mitokondriell skada genom selektiv behandling av axoner med användning av mitokondriell komplex III-hämmare Antimycin A 6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med relevanta riktlinjer och föreskrifter från regeringen i Oberbayern. De primära neuronerna framställdes från E16.5 C57BL/6 musembryon av båda könen enligt standardmetoder som tidigare beskrivits6.
1. Montering av mikrofluidikanordningen
- Täck en vävnadsodlingsplatta med sex brunnar med glasbotten med en slutlig koncentration på 20 μg/ml poly-D-lysin och 3,4 μg/ml laminin i PBS (fosfatbuffrad saltlösning) (se materialförteckning).
- Inkubera den belagda plattan över natten i mörkret vid rumstemperatur.
OBS: Beläggning kan också utföras vid 37 °C i 1-2 timmar. Valet av beläggningen beror på vilken celltyp som används. - Efter beläggning, ta med sexbrunnsplattorna till den sterila huven och tvätta dem två gånger med steril ddH2O.
OBS: Tvätta inte med salthaltiga buffertar som PBS, eftersom saltkristaller kommer att störa tätningsbildningen. - Låt plattan torka i lutat läge i 3-5 min. Ta bort överflödigt vatten genom vakuumsugning eller pipettering.
- Blötlägg mikrofluidikkammaren i 80% etanol.
OBS: Den mikrofluidiska kammaren erhölls från kommersiella källor (se materialförteckning). - Låt mikrofluidikkammaren torka i 3-5 min i lutat läge. Ta bort överskott av etanol genom vakuum, sug eller pipettering.
- När den är helt torr, placera den mikrofluidiska kammaren i mitten av brunnen.
OBS: Tätningens bildning kan observeras som en förändring i reflekterande egenskaper vid uteslutning av luft från gränssnittet mellan plattan och silikonanordningen. Både plattan och mikrofluidikkammaren måste vara helt torra före montering för att skapa en bra tätning. Torktiden måste dock minimeras så mycket som möjligt för att säkerställa korrekt vidhäftning till cellerna. Därför måste brunnarna och kamrarna inspekteras visuellt för återstående vätskedroppar. Om inga droppar är synliga, montera omedelbart kamrarna. - Knacka försiktigt på mikrofluidikkammaren vid dess gränser och mikrogroovesektionen i mitten för korrekt fastsättning på glasplattan.
2. Sädning och underhåll av neuroner
- Samla det önskade antalet dissocierade hippocampusneuroner per kammare i ett 1,5 ml reaktionsrör.
OBS: För den aktuella studien såddes 1,5 x 105 neuroner per enhet för avbildningsbaserade applikationer. - Centrifugera neuroner vid 1000 x g i 4 minuter vid rumstemperatur.
- Kassera supernatanten med pipett och återsuspendera pelleten i 8 μl B27-neurobasala medier (se materialtabell).
- Pipettera celllösningen in i mikrofluidikkammarens kanalingång (b i figur 1A).
- Tryck på baksidan av plattan för att hjälpa flödet genom kanalen.
OBS: Tappning kan göras ganska kraftfullt utan att oroa sig för att tätningen kommer att gå sönder. - Aspirera med pipett eventuell återstående cellsuspension vid kanalens utgång (g i figur 1A) för att minska antalet celler utanför kanalen.
- Inkubera mikrofluidikkammaren med celler i 15-20 min vid 37 °C och 5%CO2.
- Fyll den övre axonala brunnen med 50 μL B27-neurobasala medier i (c i figur 1A).
- Tryck på baksidan av plattan för att hjälpa flödet genom kanalen.
- Fyll brunnar på soma-sidan (a och h i figur 1A) med 150 μL B27-neurobasala medier vardera, vilket skapar en spänningsbubbla ovanpå. Bubbelns volym är ca 20 μl.
OBS: Att skapa en spänningsbubbla är inte nödvändigt för att uppnå flytande isolering, men det ger en tydlig bild av den högre volymen på soma-sidan. - Fyll båda brunnarna på den axonala sidan (c och i i figur 1A) med 100 μL B27-neurobasala medier vardera.
OBS: För att främja axonal tillväxt genom mikrospåren rekommenderas att brunnarna på soma-sidan innehåller mer media än brunnarna på axonsidan. Axoner kommer dock av en slump att växa genom mikrospåren även utan volymskillnader. - Inkubera mikrofluidikkammaren vid 37 °C och 5 %CO2 i 7–8 dagar.
OBS: Tillväxt av axoner i axonalkammaren kan vanligtvis observeras från och med dag in vitro (DIV) 5. Längre odlingstider är möjliga om mer mogna kulturer önskas. - Mata neuroner var 2-3: e dag genom att ta bort mediet från de två övre brunnarna (a och c) och ersätta det med färskt B27-Neurobasalmedium tills en spänningsbubbla bildas.
3. Färgning med mitokondriellt membran potentiellt känsligt färgämne
- Vid DIV 7-8, bedöma att axonerna har vuxit genom mikrospåren och sträcker sig in i axonalfacket under ett ljusmikroskop.
OBS: Olika DIV-steg är också möjliga beroende på önskad ålder. - Utför två tvättar med förvärmt bildmedium (37 °C) genom att avlägsna B27-Neurobasal-mediet från alla brunnar och tillsätta cirka 100 μL av bildmediet till de övre brunnarna i både axonal- och somakanalerna (a och c). Låt mediet strömma igenom till de nedre brunnarna (h och i).
- Ta bort mediet från de nedre brunnarna och eventuellt kvarvarande medium i de övre brunnarna och upprepa med nytt medium och lämna brunnarna tomma i slutet av tvätten.
OBS: På grund av den höga kapillärkraften i kanalerna (d och f) kommer det att finnas ett återstående tvättmedium i kanalerna som inte bör tas bort för att förhindra att neuronerna torkar. Alla fenolrödfria bildmedier kan användas här, till exempel Viloläge E (se Materialförteckning). Om mikroskopet inte är inrättat med en CO2-tillförsel, se till att bildmediet använder ett alternativt buffertsystem till karbonat/CO2 (t.ex. HEPES)8.
- Ta bort mediet från de nedre brunnarna och eventuellt kvarvarande medium i de övre brunnarna och upprepa med nytt medium och lämna brunnarna tomma i slutet av tvätten.
- Späd 1 mM tetrametylrhodaminetylester (TMRE, röd, se materialförteckning) till 5 nM i bildmediet.
OBS: Överskrid inte 1% DMSO i den slutliga utspädningen för att undvika toxicitet. - Tillsätt 100 μL av 5 nM TMRE-utspädningen till både de somatiska och axonala toppbrunnarna (a och c) och låt mediet flöda genom både det somatiska och axonala facket tills det finns lika stor volym i alla brunnar. Fyll på med det TMRE-innehållande mediet.
- Placera nervcellerna tillbaka i en kontrollerad miljökammare (37 ° C och 5% CO2) i 25 minuter.
- Utför två tvättar med det förvärmda bildmediet (37 °C) enligt beskrivningen ovan (steg 3.2). Vid den sista tvätten fylls 100 μL i varje brunn och skapar en spänningsbubbla av mediet på de somatiska brunnarna (a och c).
4. Avbildning av levande celler
OBS: Stillbilder som visas förvärvades på ett konfokalmikroskop med snurrande skivor med hjälp av ett 40x NA 1.25 nedsänkningsmål (se materialtabell). 200 ms exponeringstid och 10% lasereffekt för den röda kanalen och 500 ms exponeringstid för brightfield valdes. Vanliga konfokala eller widefield inverterade mikroskop kan dock också användas för att studera TMRE-intensitet.
- Avbilda cellerna med ett inverterat mikroskop.
- Se till att mikroskopet är utrustat med en steginkubator för att hålla neuronkulturen vid 37 °C under hela experimentet.
- Välj en region av intresse i det somatiska facket och följ det genom mikrospåren in i axonalfacket. Se till att de avbildade mikrospåren matchar dem i de somatiska och axonala facken (för enklare jämförelse av baslinje och efterbehandling).
- Fånga fluorescensbilder med excitation vid 561 nm och emission vid 625 nm för röd fluorescenssignal.
- Skaffa bilderna.
- För att inducera mitokondriell depolarisering, tillsätt 20 μM Antimycin A (se materialförteckning) i bildmediet till axonalfacket. För att säkerställa en volymskillnad mellan soma och axonala kamrar, kontrollera närvaron av en spänningsbubbla på den somatiska sidan (lika med volymen >110 μL).
- Ta bort allt bildmedium från den nedre brunnen på den axonala sidan (i), förutom mediet inuti kanalen (f). Tillsätt 160 μL 20 μM Antimycin A till den övre axonala brunnen (c) och låt den strömma genom kanalen tills det finns lika stor volym i båda axonala brunnarna. Volymerna i axonala brunnar är ungefär 80 μL per brunn.
OBS: Se till att volymen i axonala brunnar är mindre än i de somatiska brunnarna för att säkerställa korrekt vätsketryck. En skillnad på minst 10 μL (10% av brunnsvolymen) rekommenderas, men också högre skillnader är möjliga.
- Ta bort allt bildmedium från den nedre brunnen på den axonala sidan (i), förutom mediet inuti kanalen (f). Tillsätt 160 μL 20 μM Antimycin A till den övre axonala brunnen (c) och låt den strömma genom kanalen tills det finns lika stor volym i båda axonala brunnarna. Volymerna i axonala brunnar är ungefär 80 μL per brunn.
- Inkubera nervceller i den kontrollerade miljökammaren (37 °C) i 20-30 min.
- Upprepa avbildningen enligt beskrivningen ovan (steg 4.3–4.5). Se till att samma positioner avbildas (lätt identifieras av mikrospåren) som vid baslinjeförvärvet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Primära hippocampusneuroner odlades i mikrofluidiska enheter i 7-8 dagar innan mitokondrier färgades med det membrankänsliga färgämnet (TMRE) i 25 minuter i båda kanalerna. Som visas i figur 2A gav detta homogen färgning av mitokondrier på båda sidor av mikrospåren, men det var otillräckligt för att balansera färgningen i mitten av mikrospåren. Vid tillsats av antimycin A till axonalsidan behöll somala mitokondrier TMRE-signalen (figur 2B och video 1), medan TMRE-fluorescens förlorades från axonala mitokondrier (figur 2C och video 1). Videon spelades in med ett helt integrerat digitalt widefieldmikroskop (se Materialförteckning).
Figur 1: Mikrofluidiska anordningar möjliggör fluidisk isolering av axoner . (A) Schematisk för den mikrofluidiska anordning som används i denna studie. Silikonskivan (diameter 21 mm) passar lätt in i en sexbrunnsplatta. a) Väl på soma sidan, b) Ingång av kanal på soma sida, c) Väl på axonsidan, d) Kanal på soma sida, e) Microgrooves, f) Kanal på axonsidan, g) Utgång av kanalen på soma sida, h) Väl på soma sida, i) Väl på axon sida. (B) Schematisk beskrivning av hur de olika vätskenivåerna skapar en fluidisk tryckgradient över mikrokanalerna. (C) Demonstration av fluidisk isolering genom tillsats av Trypanblått på ena sidan av kammaren. Observera att på grund av den fluidiska tryckgradienten balanserar det blå färgämnet inte över mikrokanalerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Selektiv behandling av axoner depolariserar axonala men inte cellkroppsmitokondrier. (A) Representativ mikrograf som presenterar en översikt över effektiviteten av TMRE-färgning i mikrofluidiska enheter. Skalstreck = 100 μm. (B-C) Den representativa mikrografen visar samma område i cellkroppen och det axonala facket före och efter tillsats av 20 μM Antimycin A (AA) till det axonala facket. Skalstreck = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Video 1: Effekt av Antimycin A-behandling på mitokondrier i axoner och cellkroppar. Live cell avbildning av förlusten av TMRE fluorescens vid tillägg av Antimycin A. Klicka här för att ladda ner denna video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en metod för att fröa och odla dissocierade hippocampusneuroner i en mikrofluidisk anordning för att behandla axonala mitokondrier separat. Nyttan av detta tillvägagångssätt med det membrankänsliga färgämnet TMRE och den komplexa III-hämmaren Antimycin A (som tidigare visats7) demonstreras här, men denna metod kan enkelt anpassas till andra mitokondriella färgämnen eller genetiskt kodade sensorer av mitokondriella funktioner som möjliggör lokala, mikroskopibaserade avläsningar9. Andra neuronala celltyper kan också odlas i mikrofluidiska kamrar, såsom primära kortikala neuroner10 eller inducerade pluripotenta stamceller (ipSC) -härledda motorneuroner11, vilket gör denna plattform till ett mångsidigt verktyg för att studera mitokondriell funktion vid neurodegeneration i den neuronala celltypen av intresse. Montering av mikrofluidiska enheter är avgörande för att uppnå en effektiv tätning och förklaras lättast genom att se en erfaren forskare utföra monteringen. Nedströms märknings- och behandlingsproceduren som beskrivs här är avsedd att vara exemplarisk och kan justeras för att passa de protokoll som för närvarande är etablerade i respektive laboratorier samtidigt som den fluidiska tryckgradienten bibehålls.
Såningstekniken som beskrivs här skiljer sig från publicerade protokoll och tillverkarens beskrivning, eftersom vi hoppar över de föreslagna tvättarna av den monterade enheten och istället direkt såddar de dissocierade neuronerna i den torra kammaren (avsnitt 2). Det har observerats att detta minskar antalet neuroner som behövs, eftersom det ökar tätheten av neuroner i kanalen (e) och begränsar spridningen av neuroner i brunnarna långt borta från mikrokanalerna. Den torra sådden stöds genom att knacka på plattans botten (steg 2.5), vilket kan vara nödvändigt eller inte beroende på den kraft som tidigare applicerats vid montering av enheten.
Vissa begränsningar finns dock i detta förfarande. Det finns en viss variation i tätningens täthet på grund av skillnader i kraften som appliceras under montering som kan leda till begränsad tillväxt genom mikrospåren. Återstående fukt kan också störa tätningsbildningen och tillåta axonal tillväxt eller till och med cellmigration under enheten. Båda problemen kan lätt upptäckas före färgning, vilket leder till att felaktiga kamrar utesluts från experimentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av den tyska forskningsstiftelsen (HA 7728/2-1 och EXC2145 Project ID 390857198) och Max Planck Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well Glass bottom plate | Cellvis | P06.1.5H-N | Silicone device |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| EVOS M5000 widefield microscope | Thermofischer Scientific | EVOS M5000 | fully integrated digital widefield microscope |
| Hibernate E | BrainBits | HE500 | |
| Inverted spinning disk confocal | Nikon | TI2-E + CSU-W1 | With incubator chamber |
| Laminin | Invitrogen | L2020 | |
| Microfluidic devices | XONA microfluidics | RD450 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P2636 | |
| TMRE | Sigma | 87917 |
References
- Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson's disease. Advanced Biology. 5 (9), 2100663 (2021).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).
- Moratalla, R., et al. Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).
- Cheng, H. -C., Ulane, C. M., Burke, R. E. Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons. Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Harbauer, A. B., et al. Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy. Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).
- Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin. Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).
- Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).
- Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. Analysis of mitochondria by single-organelle resolution. Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).
- Altman, T., et al. Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
