Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Aussaat und Färbung neuronaler Mitochondrien in mikrofluidischen Kammern. Der fluidische Druckgradient in diesen Kammern ermöglicht die selektive Behandlung von Mitochondrien in Axonen, um ihre Eigenschaften als Reaktion auf pharmakologische Herausforderungen zu analysieren, ohne das Zellkörperkompartiment zu beeinträchtigen.
Abstract
Mitochondrien sind die Hauptlieferanten von ATP (Adenosintriphosphat) in Neuronen. Mitochondriale Dysfunktion ist ein häufiger Phänotyp bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen. Angesichts der ausgeklügelten Architektur und extremen Länge einiger Axone ist es nicht verwunderlich, dass Mitochondrien in Axonen andere Umgebungen erfahren können als ihre Zellkörper-Gegenstücke. Interessanterweise geht die Dysfunktion der axonalen Mitochondrien oft Auswirkungen auf den Zellkörper voraus. Um axonale mitochondriale Dysfunktion in vitro zu modellieren, ermöglichen mikrofluidische Geräte die Behandlung von axonalen Mitochondrien, ohne die somalen Mitochondrien zu beeinflussen. Der fluidische Druckgradient in diesen Kammern verhindert die Diffusion von Molekülen gegen den Gradienten und ermöglicht so die Analyse der mitochondrialen Eigenschaften als Reaktion auf lokale pharmakologische Herausforderungen innerhalb von Axonen. Das aktuelle Protokoll beschreibt die Aussaat von dissoziierten Hippocampus-Neuronen in mikrofluidischen Geräten, die Färbung mit einem membranpotentialempfindlichen Farbstoff, die Behandlung mit einem mitochondrialen Toxin und die anschließende mikroskopische Analyse. Diese vielseitige Methode zur Untersuchung der axonalen Biologie kann auf viele pharmakologische Störungen und bildgebende Auslesungen angewendet werden und eignet sich für mehrere neuronale Subtypen.
Introduction
Mitochondrien sind die Hauptlieferanten von ATP (Adenosintriphosphat) in Neuronen. Da die neuronale Gesundheit eng mit der mitochondrialen Funktion verbunden ist, ist es nicht verwunderlich, dass eine dysfunktionale Regulation dieser Organellen mit dem Auftreten verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen, einschließlich der Parkinson-Krankheit1, in Verbindung gebracht wurde. Darüber hinaus wurde die mitochondriale Intoxikation erfolgreich eingesetzt, um Parkinson-Symptome bei Tieren zu modellieren2. Sowohl in Tiermodellen als auch bei menschlichen Krankheiten beginnt der Absterben von Neuronen an den distalen Teilen 3,4, was darauf hindeutet, dass axonale Mitochondrien anfälliger für Beleidigungen sein könnten. Die Biologie der Mitochondrien in Axonen ist jedoch aufgrund der Schwierigkeiten, die mit einer gezielten Behandlung und Analyse axonaler Mitochondrien bei gleichzeitiger Störung der Zellkörperprozesse verbunden sind, nicht gut verstanden.
Jüngste Fortschritte bei der Kultivierung von dissoziierten Neuronen in vitro ermöglichen nun die fluidische Trennung von Axonen und Zellkörpern durch mikrofluidische Geräte5. Wie in Abbildung 1A dargestellt, verfügen diese Geräte über vier Zugangsmulden (a/h und c/i), wobei zwei Kanäle jedes Paar (d und f) verbinden. Die großen Kanäle sind durch eine Reihe von 450 μm langen Mikrokanälen miteinander verbunden (e). Absichtliche Unterschiede in den Füllständen zwischen den beiden Kammern erzeugen einen Flüssigkeitsdruckgradienten (Abbildung 1B), der die Diffusion kleiner Moleküle aus dem Kanal mit einem niedrigeren Flüssigkeitsspiegel auf die andere Seite verhindert (Abbildung 1C, dargestellt mit Trypanblau-Farbstoff).
Wir haben kürzlich mikrofluidische Geräte verwendet, um lokale Translationsanforderungen in der axonalen Mitophagie, der selektiven Entfernung beschädigter Mitochondrien, zu untersuchen6. Im vorliegenden Protokoll werden verschiedene Schritte vorgestellt, um lokale mitochondriale Schäden durch selektive Behandlung von Axonen unter Verwendung des mitochondrialen Komplex-III-Inhibitors Antimycin A 6,7 zu induzieren.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden nach den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften der Regierung von Oberbayern durchgeführt. Die primären Neuronen wurden aus E16.5 C57BL/6 Wildtyp-Mausembryonen beiderlei Geschlechts nach Standardmethoden wie zuvor beschrieben hergestellt6.
1. Montage der mikrofluidischen Vorrichtung
- Beschichten Sie eine Gewebekulturplatte mit sechs Vertiefungen auf dem Glasboden mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml Poly-D-Lysin und 3,4 μg/ml Laminin in PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) (siehe Materialtabelle).
- Inkubieren Sie die beschichtete Platte über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Die Beschichtung kann auch bei 37 °C für 1-2 h durchgeführt werden. Die Wahl der Beschichtung hängt vom verwendeten Zelltyp ab. - Nach der Beschichtung die sechs Well-Platten in die sterile Haube bringen und zweimal mit sterilemddH2O waschen.
HINWEIS: Nicht mit salzhaltigen Puffern wie PBS waschen, da Salzkristalle die Dichtungsbildung stören. - Lassen Sie die Platte in einer geneigten Position für 3-5 min trocknen. Entfernen Sie überschüssiges Wasser durch Vakuumsaugen oder Pipettieren.
- Die mikrofluidische Kammer in 80% Ethanol einweichen.
HINWEIS: Die mikrofluidische Kammer wurde aus kommerziellen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle). - Lassen Sie die mikrofluidische Kammer 3-5 min in geneigter Position trocknen. Entfernen Sie überschüssiges Ethanol durch Vakuum, Absaugen oder Pipettieren.
- Wenn Sie vollständig trocken sind, platzieren Sie die mikrofluidische Kammer in der Mitte des Brunnens.
HINWEIS: Die Bildung der Dichtung kann als Änderung der Reflexionseigenschaften beobachtet werden, wenn Luft von der Grenzfläche zwischen der Platte und dem Silikongerät ausgeschlossen wird. Sowohl die Platte als auch die mikrofluidische Kammer müssen vor der Montage vollständig trocken sein, um eine gute Abdichtung zu erzielen. Die Trocknungszeit muss jedoch so weit wie möglich minimiert werden, um eine ordnungsgemäße Haftung an den Zellen zu gewährleisten. Daher müssen die Vertiefungen und Kammern visuell auf verbleibende Flüssigkeitströpfchen untersucht werden. Wenn keine Tröpfchen sichtbar sind, montieren Sie sofort die Kammern. - Klopfen Sie vorsichtig auf die mikrofluidische Kammer an ihren Rändern und den Mikronutabschnitt in der Mitte, um sie ordnungsgemäß an der Glasplatte zu befestigen.
2. Aussaat und Erhalt von Neuronen
- Sammeln Sie die gewünschte Anzahl dissoziierter Hippocampus-Neuronen pro Kammer in einem 1,5-ml-Reaktionsröhrchen.
HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurden 1,5 x 105 Neuronen pro Gerät für bildgebende Anwendungen ausgesät. - Zentrifugieren Sie Neuronen bei 1000 x g für 4 min bei Raumtemperatur.
- Verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette und resuspendieren Sie das Pellet in 8 μL B27-Neurobasalmedien (siehe Materialtabelle).
- Pipettieren Sie die Zelllösung in den Kanaleingang der mikrofluidischen Kammer (b in Abbildung 1A).
- Tippen Sie auf die Rückseite der Platte, um den Fluss durch den Kanal zu unterstützen.
HINWEIS: Das Klopfen kann ziemlich kraftvoll durchgeführt werden, ohne befürchten zu müssen, dass die Dichtung bricht. - Die verbleibende Zellsuspension am Ausgang des Kanals (g in Abbildung 1A) wird mit einer Pipette aspiriert, um die Anzahl der Zellen außerhalb des Kanals zu verringern.
- Die mikrofluidische Kammer mit Zellen für 15-20 min bei 37 °C und 5%CO2 inkubieren.
- Füllen Sie die obere axonale Vertiefung mit 50 μL B27-Neurobasalmedien (c in Abbildung 1A).
- Tippen Sie auf die Rückseite der Platte, um den Fluss durch den Kanal zu unterstützen.
- Füllen Sie Vertiefungen auf der Soma-Seite (a und h in Abbildung 1A) mit jeweils 150 μL B27-Neurobasalmedien, wodurch oben eine Spannungsblase entsteht. Das Volumen der Blase beträgt etwa 20 μL.
HINWEIS: Das Erstellen einer Spannblase ist nicht notwendig, um eine fluidische Isolierung zu erreichen, aber es bietet eine klare Sicht auf das höhere Volumen auf der Soma-Seite. - Füllen Sie beide Vertiefungen der axonalen Seite (c und i in Abbildung 1A) mit jeweils 100 μL B27-Neurobasalmedien.
HINWEIS: Um das axonale Wachstum durch die Mikrorillen zu fördern, wird empfohlen, dass die Vertiefungen auf der Soma-Seite mehr Medien enthalten als die Vertiefungen auf der Axonseite. Axone wachsen jedoch zufällig durch die Mikrorillen auch ohne Volumenunterschiede. - Die mikrofluidische Kammer bei 37 °C und 5%CO2 für 7-8 Tage inkubieren.
HINWEIS: Das Wachstum von Axonen in die axonale Kammer kann normalerweise ab dem Tag in vitro (DIV) 5 beobachtet werden. Längere Kultivierungszeiten sind möglich, wenn reifere Kulturen gewünscht werden. - Füttern Sie Neuronen alle 2-3 Tage, indem Sie das Medium aus den beiden oberen Vertiefungen (a und c) entfernen und durch frisches B27-Neurobasalmedium ersetzen, bis sich eine Spannungsblase bildet.
3. Färbung mit potentiell empfindlichem Farbstoff der mitochondrialen Membran
- Beurteilen Sie bei DIV 7-8, ob die Axone durch die Mikrorillen gewachsen sind und sich unter einem Lichtmikroskop in das axonale Kompartiment erstrecken.
HINWEIS: Je nach gewünschtem Alter sind auch unterschiedliche DIV-Stufen möglich. - Führen Sie zwei Wäschen mit vorgewärmtem Bildmedium (37 °C) durch, indem Sie das B27-Neurobasalmedium aus allen Vertiefungen entfernen und etwa 100 μL des Bildmediums in die oberen Vertiefungen sowohl des axonalen als auch des Somakanals (a und c) geben. Lassen Sie das Medium zu den unteren Vertiefungen (h und i) durchströmen.
- Entfernen Sie das Medium aus den unteren Vertiefungen und das übrig gebliebene Medium in den oberen Vertiefungen und wiederholen Sie den Vorgang mit frischem Medium, wobei die Vertiefungen am Ende der Wäsche leer bleiben.
HINWEIS: Aufgrund der hohen Kapillarkraft in den Kanälen (d und f) verbleibt in den Kanälen ein Waschmedium, das nicht entfernt werden sollte, um das Austrocknen der Neuronen zu verhindern. Hier kann jedes phenolrotfreie Bildgebungsmedium verwendet werden, zum Beispiel Hibernate E (siehe Materialtabelle). Wenn das Mikroskop nicht mit einer CO 2 -Zufuhr ausgestattet ist, stellen Sie sicher, dass das Bildmedium ein alternatives Puffersystem zu Karbonat/CO2 (z. B. HEPES)8 verwendet.
- Entfernen Sie das Medium aus den unteren Vertiefungen und das übrig gebliebene Medium in den oberen Vertiefungen und wiederholen Sie den Vorgang mit frischem Medium, wobei die Vertiefungen am Ende der Wäsche leer bleiben.
- 1 mM Tetramethylrhodaminethylester (TMRE, rot, siehe Materialtabelle) im Bildmedium auf 5 nM verdünnen.
HINWEIS: Überschreiten Sie nicht 1% DMSO in der endgültigen Verdünnung, um Toxizität zu vermeiden. - Fügen Sie 100 μL der 5 nM TMRE-Verdünnung sowohl in die somatischen als auch in die axonalen oberen Vertiefungen (a und c) hinzu und lassen Sie das Medium sowohl durch die somatischen als auch durch die axonalen Kompartimente fließen, bis in allen Vertiefungen ein gleiches Volumen vorhanden ist. Füllen Sie das TMRE-haltige Medium auf.
- Legen Sie die Neuronen für 25 min zurück in eine Kammer mit kontrollierter Umgebung (37 °C und 5%CO2).
- Führen Sie zwei Waschgänge mit dem vorgewärmten Bildmedium (37 °C) durch, wie zuvor beschrieben (Schritt 3.2). Bei der letzten Wäsche in jeder Vertiefung 100 μL auffüllen und eine Spannungsblase des Mediums auf den somatischen Vertiefungen (a und c) erzeugen.
4. Live-Cell-Bildgebung
HINWEIS: Die gezeigten Standbilder wurden mit einem konfokalen Spinnscheibenmikroskop mit einem 40x NA 1,25-Tauchobjektiv aufgenommen (siehe Materialtabelle). Es wurden 200 ms Belichtungszeit und 10% Laserleistung für den Rotkanal und 500 ms Belichtungszeit für Hellfeld gewählt. Es können jedoch auch reguläre konfokale oder Weitfeld-inverse Mikroskope verwendet werden, um die TMRE-Intensität zu untersuchen.
- Bilden Sie die Zellen mit einem inversen Mikroskop ab.
- Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop mit einem Stufeninkubator ausgestattet ist, um die neuronale Kultur während des gesamten Experiments bei 37 ° C zu halten.
- Wählen Sie eine Region von Interesse im somatischen Kompartiment und folgen Sie ihr durch die Mikrorillen in das axonale Kompartiment. Stellen Sie sicher, dass die abgebildeten Mikrorillen mit denen in den somatischen und axonalen Kompartimenten übereinstimmen (für einen einfacheren Vergleich zu Studienbeginn und nach der Behandlung).
- Nehmen Sie Fluoreszenzbilder mit Anregung bei 561 nm und Emission bei 625 nm für ein rotes Fluoreszenzsignal auf.
- Erfassen Sie die Bilder.
- Um eine mitochondriale Depolarisation zu induzieren, fügen Sie 20 μM Antimycin A (siehe Materialtabelle) im Bildmedium in das axonale Kompartiment ein. Um einen Volumenunterschied zwischen der Soma- und der axonalen Kammer zu gewährleisten, überprüfen Sie das Vorhandensein einer Spannungsblase auf der somatischen Seite (entspricht dem Volumen >110 μL).
- Entfernen Sie das gesamte Bildmedium aus der unteren Vertiefung der axonalen Seite (i), mit Ausnahme des Mediums innerhalb des Kanals (f). 160 μL 20 μM Antimycin A in die obere axonale Vertiefung (c) geben und durch den Kanal fließen lassen, bis in beiden axonalen Vertiefungen ein gleiches Volumen vorhanden ist. Die Volumina in axonalen Vertiefungen betragen etwa 80 μL pro Well.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Volumen in den axonalen Vertiefungen kleiner ist als in den somatischen Vertiefungen, um den richtigen Flüssigkeitsdruck zu gewährleisten. Eine Differenz von mindestens 10 μL (10% des Wellvolumens) wird empfohlen, aber auch höhere Unterschiede sind möglich.
- Entfernen Sie das gesamte Bildmedium aus der unteren Vertiefung der axonalen Seite (i), mit Ausnahme des Mediums innerhalb des Kanals (f). 160 μL 20 μM Antimycin A in die obere axonale Vertiefung (c) geben und durch den Kanal fließen lassen, bis in beiden axonalen Vertiefungen ein gleiches Volumen vorhanden ist. Die Volumina in axonalen Vertiefungen betragen etwa 80 μL pro Well.
- Neuronen in der kontrollierten Umgebung (37 °C) für 20-30 min inkubieren.
- Wiederholen Sie die Bildgebung wie oben beschrieben (Schritte 4.3-4.5). Stellen Sie sicher, dass die gleichen Positionen abgebildet werden (leicht erkennbar an den Mikrorillen) wie während der Baseline-Erfassung.
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Representative Results
Primäre Hippocampus-Neuronen wurden 7-8 Tage lang in mikrofluidischen Geräten gezüchtet, bevor die Mitochondrien 25 Minuten lang in beiden Kanälen mit dem membransensitiven Farbstoff (TMRE) angefärbt wurden. Wie in Abbildung 2A gezeigt, ergab dies eine homogene Färbung der Mitochondrien auf beiden Seiten der Mikrorillen, reichte jedoch nicht aus, um die Färbung in die Mitte der Mikrorillen auszugleichen. Bei Zugabe von Antimycin A auf der axonalen Seite behielten die somalen Mitochondrien das TMRE-Signal bei (Abbildung 2B und Video 1), während die TMRE-Fluoreszenz von axonalen Mitochondrien verloren ging (Abbildung 2C und Video 1). Das Video wurde mit einem voll integrierten digitalen Weitfeldmikroskop aufgenommen (siehe Materialtabelle).
Abbildung 1: Mikrofluidische Geräte ermöglichen die fluidische Isolierung von Axonen . (A) Schematische Darstellung der in dieser Studie verwendeten mikrofluidischen Vorrichtung. Die Silikonscheibe (Durchmesser 21 mm) passt problemlos in eine Sechs-Well-Platte. a) Brunnen auf Soma-Seite, b) Eingang des Kanals auf Soma-Seite, c) Brunnen auf Axon-Seite, d) Kanal auf Soma-Seite, e) Mikrorillen, f) Kanal auf Axon-Seite, g) Ausgang des Kanals auf Soma-Seite, h) Brunnen auf Soma-Seite, i) Brunnen auf Axon-Seite. (B) Schematische Beschreibung, wie die verschiedenen Flüssigkeitsniveaus einen fluidischen Druckgradienten über die Mikrokanäle erzeugen. (C) Demonstration der fluidischen Isolierung durch Zugabe von Trypanblau auf einer Seite der Kammer. Beachten Sie, dass der blaue Farbstoff aufgrund des fluidischen Druckgradienten nicht über die Mikrokanäle ausgeglichen ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Die selektive Behandlung von Axonen depolarisiert axonale, aber nicht Zellkörpermitochondrien. (A) Repräsentative Mikroskopaufnahme, die einen Überblick über die Wirksamkeit der TMRE-Färbung in mikrofluidischen Geräten gibt. Maßstabsbalken = 100 μm. (B-C) Die repräsentative Mikroskopaufnahme zeigt den gleichen Bereich im Zellkörper und im axonalen Kompartiment vor und nach Zugabe von 20 μM Antimycin A (AA) zum axonalen Kompartiment. Maßstabsbalken = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Video 1: Wirkung der Antimycin-A-Behandlung auf Mitochondrien in Axonen und Zellkörpern. Live-Zell-Bildgebung des Verlustes der TMRE-Fluoreszenz nach Zugabe von Antimycin A. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Aussaat und Kultur dissoziierter Hippocampus-Neuronen in einem mikrofluidischen Gerät, um axonale Mitochondrien separat zu behandeln. Der Nutzen dieses Ansatzes mit dem membransensitiven Farbstoff TMRE und dem Komplex-III-Inhibitor Antimycin A (wie zuvor gezeigt7) wird hier demonstriert, aber diese Methode kann leicht an andere mitochondriale Farbstoffe oder genetisch kodierte Sensoren mitochondrialer Funktionen angepasst werden, die lokale, mikroskopiebasierte Auslesungen ermöglichen9. Andere neuronale Zelltypen können auch in mikrofluidischen Kammern gezüchtet werden, wie primäre kortikale Neuronen10 oder induzierte pluripotente Stammzellen (ipSC)-abgeleitete Motorneuronen11, was diese Plattform zu einem vielseitigen Werkzeug macht, um die mitochondriale Funktion bei Neurodegeneration im interessierenden neuronalen Zelltyp zu untersuchen. Die Montage von mikrofluidischen Geräten ist entscheidend für eine effiziente Abdichtung und lässt sich am einfachsten erklären, indem man einem erfahrenen Forscher bei der Montage zusieht. Das hier beschriebene nachgeschaltete Kennzeichnungs- und Behandlungsverfahren soll beispielhaft sein und kann unter Beibehaltung des fluidischen Druckgradienten an die derzeit in den jeweiligen Labors etablierten Protokolle angepasst werden.
Die hier beschriebene Seeding-Technik unterscheidet sich von veröffentlichten Protokollen und der Beschreibung des Herstellers, da wir die vorgeschlagenen Waschungen des zusammengebauten Geräts überspringen und stattdessen die dissoziierten Neuronen direkt in die Trockenkammer säen (Abschnitt 2). Es wurde beobachtet, dass dies die Anzahl der benötigten Neuronen reduziert, da es die Dichte der Neuronen innerhalb des Kanals (e) erhöht und die Ausbreitung von Neuronen in die weit von den Mikrokanälen entfernten Vertiefungen begrenzt. Die Trockensaat wird durch Klopfen auf den Boden der Platte unterstützt (Schritt 2.5), was je nach zuvor beim Zusammenbau des Geräts aufgebrachten Kraft erforderlich sein kann oder auch nicht.
Bei diesem Verfahren bestehen jedoch gewisse Einschränkungen. Es gibt eine gewisse Variabilität in der Dichtheit der Dichtung aufgrund von Unterschieden in der Kraft, die während der Montage ausgeübt wird, was zu einem eingeschränkten Wachstum durch die Mikrorillen führen kann. Auch die verbleibende Feuchtigkeit kann die Siegelbildung stören und ein axonales Wachstum oder sogar eine Zellmigration unter dem Gerät ermöglichen. Beide Probleme können vor der Färbung leicht erkannt werden, was zum Ausschluss fehlerhafter Kammern aus dem Experiment führt.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Studie wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (HA 7728/2-1 und EXC2145 Project ID 390857198) und der Max-Planck-Gesellschaft unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well Glass bottom plate | Cellvis | P06.1.5H-N | Silicone device |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| EVOS M5000 widefield microscope | Thermofischer Scientific | EVOS M5000 | fully integrated digital widefield microscope |
| Hibernate E | BrainBits | HE500 | |
| Inverted spinning disk confocal | Nikon | TI2-E + CSU-W1 | With incubator chamber |
| Laminin | Invitrogen | L2020 | |
| Microfluidic devices | XONA microfluidics | RD450 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P2636 | |
| TMRE | Sigma | 87917 |
References
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