Summary
Une nouvelle méthode de préparation d’échantillons est démontrée pour l’analyse de macrocolonies bactériennes à base d’agar par spectrométrie de masse par imagerie par désorption/ionisation laser assistée par matrice.
Abstract
Comprendre les conséquences métaboliques des interactions microbiennes qui se produisent pendant l’infection présente un défi unique dans le domaine de l’imagerie biomédicale. La spectrométrie de masse par imageur de désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) représente une modalité d’imagerie in situ sans marquage capable de générer des cartes spatiales pour une grande variété de métabolites. Bien que des échantillons de tissus à coupe mince soient maintenant analysés systématiquement au moyen de cette technologie, les analyses par spectrométrie de masse par imagerie de substrats non traditionnels, tels que les colonies bactériennes couramment cultivées sur gélose dans la recherche en microbiologie, restent difficiles en raison de la teneur élevée en eau et de la topographie inégale de ces échantillons. Cet article illustre un flux de travail de préparation d’échantillons permettant des analyses par spectrométrie de masse par imagerie de ces types d’échantillons. Ce processus est illustré par la co-culture bactérienne de macrocolonies de deux pathogènes gastro-intestinaux: Clostridioides difficile et Enterococcus faecalis. L’étude des interactions microbiennes dans cet environnement de gélose bien défini complète également les études tissulaires visant à comprendre la coopération métabolique microbienne entre ces deux organismes pathogènes dans des modèles murins d’infection. Les analyses par spectrométrie de masse par imagerie des métabolites des acides aminés arginine et ornithine sont présentées comme des données représentatives. Cette méthode est largement applicable à d’autres analytes, pathogènes microbiens ou maladies, et aux types de tissus où une mesure spatiale de la biochimie cellulaire ou tissulaire est souhaitée.
Introduction
Le microbiome humain est un écosystème hautement dynamique impliquant des interactions moléculaires de bactéries, de virus, d’archées et d’autres eucaryotes microbiens. Bien que les relations microbiennes aient été intensément étudiées ces dernières années, il reste encore beaucoup à comprendre sur les processus microbiens au niveau chimique 1,2. Cela est dû en partie à l’indisponibilité d’outils capables de mesurer avec précision des environnements microbiens complexes. Les progrès réalisés dans le domaine de la spectrométrie de masse par imagerie (IMS) au cours de la dernière décennie ont permis une cartographie spatiale in situ et sans marquage de nombreux métabolites, lipides et protéines dans les substrats biologiques 3,4. La désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) est devenue la technique d’ionisation la plus couramment utilisée en spectrométrie de masse par imagerie, impliquant l’utilisation d’un laser UV pour enlever du matériau de la surface d’une section mince de tissu pour la mesure par spectrométrie de masse4. Ce processus est facilité par l’application d’une matrice chimique appliquée de manière homogène à la surface de l’échantillon, ce qui permet d’effectuer des mesures séquentielles selon un motif raster sur toute la surface de l’échantillon. Des cartes thermiques des intensités ioniques de l’analyte sont ensuite générées après l’acquisition des données. Les progrès récents dans les sources d’ionisation et les techniques d’échantillonnage ont permis l’analyse de substrats non traditionnels tels que les spécimens cellulaires bactériens5 et 6,7,8 mammifères cultivés sur gélose nutritive. L’information spatiale moléculaire fournie par l’IMS peut fournir un aperçu unique de la communication biochimique des interactions microbe-microbe et hôte-microbe pendant l’infection 9,10,11,12,13,14.
Lors de l’infection à Clostridioides difficile (ICD), C. difficile est exposé à un environnement microbien en évolution rapide dans le tractus gastro-intestinal, où les interactions polymicrobiennes sont susceptibles d’avoir une incidence sur les résultats de l’infection15,16. Étonnamment, on sait peu de choses sur les mécanismes moléculaires des interactions entre C. difficile et le microbiote résident au cours de l’infection. Par exemple, les entérocoques sont une classe d’agents pathogènes commensales opportunistes dans le microbiome intestinal et ont été associés à une sensibilité accrue et à une gravité accrue de l’ICD 17,18,19,20. Cependant, on sait peu de choses sur les mécanismes moléculaires des interactions entre ces agents pathogènes. Pour visualiser la communication des petites molécules entre ces membres du microbiome intestinal, des macrocolonies bactériennes ont été cultivées ici sur gélose pour simuler les interactions microbe-microbe et la formation de biofilm bactérien dans un environnement contrôlé. Cependant, l’obtention de distributions métaboliques représentatives lors de l’analyse par spectrométrie de masse par imagerie MALDI d’échantillons de culture bactérienne est difficile en raison de la teneur élevée en eau et de la topographie de surface inégale de ces échantillons. Ceci est dû en grande partie à la nature hautement hydrophile de la gélose et à la réponse non uniforme de la surface de la gélose lors de l’élimination de l’humidité.
La teneur élevée en eau de la gélose peut également rendre difficile l’obtention d’un revêtement matriciel MALDI homogène et peut interférer avec l’analyse MALDI ultérieure effectuée sous vide21. Par exemple, de nombreuses sources MALDI fonctionnent à des pressions de 0,1 à 10 Torr, ce qui constitue un vide suffisant pour éliminer l’humidité de la gélose et peut provoquer une déformation de l’échantillon. Ces changements morphologiques dans la gélose induits par l’environnement sous vide provoquent des bulles et des fissures dans la gélose séchée. Ces artefacts réduisent l’adhérence de la gélose à la lame et peuvent provoquer le démontage ou l’écaillage de l’échantillon dans le système de vide de l’instrument. L’épaisseur des échantillons de gélose peut atteindre 5 mm de la lame, ce qui peut créer un dégagement insuffisant de l’optique ionique à l’intérieur de l’instrument, provoquant une contamination et/ou des dommages à l’optique ionique de l’instrument. Ces effets cumulatifs peuvent entraîner des réductions du signal ionique reflétant la topographie de surface, plutôt que les interactions biochimiques microbiennes sous-jacentes. Les échantillons de gélose doivent être séchés de façon homogène et fortement collés à une lame de microscope avant d’être analysés sous vide.
Cet article démontre un flux de travail de préparation d’échantillons pour le séchage contrôlé de macrocolonies de culture bactérienne cultivées sur des milieux gélosés. Ce processus de séchage plus lent en plusieurs étapes (par rapport à ceux signalés précédemment) garantit que la gélose se déshydratera uniformément tout en minimisant les effets de bulles ou de fissuration des échantillons de gélose montés sur des lames de microscope. En utilisant cette méthode de séchage progressif, les échantillons adhèrent fortement à la lame de microscope et se prêtent à une application ultérieure de matrice et à une analyse MALDI. Ceci est illustré par des colonies bactériennes modèles de C. difficile cultivées sur des modèles de gélose et de tissus murins hébergeant des ICD avec et sans la présence d’un agent pathogène commensale et opportuniste, Enterococcus faecalis. Les analyses de spectrométrie de masse d’imagerie MALDI des modèles bactériens et tissulaires permettent la cartographie spatiale des profils de métabolites d’acides aminés, fournissant de nouvelles informations sur le métabolisme microbien bioénergétique et la communication.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
REMARQUE : Les expériences sur les animaux ont été approuvées par les comités de soin et d’utilisation des animaux de l’Hôpital pour enfants de Philadelphie et de la Perelman School of Medicine de l’Université de Pennsylvanie (protocoles IAC 18-001316 et 806279).
ATTENTION : Clostridium difficile (C. difficile) et Enterococcus faecalis (E. faecalis) sont des agents pathogènes BSLII et doivent être manipulés avec une extrême prudence. Utilisez des protocoles de décontamination appropriés au besoin.
1. Croissance des macrocolonies de culture bactérienne et préparation pour l’expédition de nuit
- Préparer des cultures de C. difficile et d’E. faecalis pendant la nuit et les cultiver individuellement à 37 °C dans une chambre anaérobie (85 % d’azote, 10 % d’hydrogène, 5 % de dioxyde de carbone) dans un bouillon d’infusion cerveau-cœur complété par 0,5 % d’extrait de levure et 0,1 % de l-cystéine (BHIS). Utilisez une gélose à 1,5 % pour tous les échantillons plaqués.
- Normaliser le milieu de culture bactérien à la densité optique à 600 nm (OD600). Plaquer 5 μL de chaque macrocolonie sur des plaques de gélose BHIS + l-cystéine et développer en anaérobiose pendant 7 jours à 37 °C. Pour les macrocolonies d’espèces mixtes, mélanger les milieux de culture bactériens dans un rapport de 1:1 avant le placage.
- Préparez des lames de microscope revêtues d’oxyde d’indium-étain (ITO) à l’aide d’un ohmmètre pour identifier le côté de la lame avec le revêtement conducteur. Utilisez un scribe à pointe de diamant pour graver et étiqueter le côté recouvert d’ITO de la lame de microscope.
- Extrayez toute la culture de la plaque de croissance de gélose, puis montez sur une lame de microscope revêtue d’ITO tout en veillant à ce que les bulles d’air ne soient pas piégées entre la gélose et la lame.
REMARQUE: La teneur en eau dans le milieu gélosé devrait permettre à la culture d’adhérer naturellement à la surface de la lame de microscope. Une vidéo illustrant ce processus est fournie dans la documentation supplémentaire de Yang et al.22. - Placez les colonies dans des boîtes de diapositives de microscope pour les protéger. Entreposer les boîtes à glissière en 8 po x 8 dans des sacs de transport d’échantillons présentant un risque biologique avec une poignée de pastilles déshydratantes et un sceau pour l’expédition de nuit en vue d’un traitement et d’une analyse ultérieurs.
REMARQUE : Il est important de maintenir un environnement sec pour les cultures bactériennes lorsqu’elles sont expédiées dans des conditions ambiantes afin de ralentir la croissance et le métabolisme des bactéries et de maintenir la fixation des échantillons bactériens jusqu’à l’analyse. Cette méthode d’expédition a été optimisée grâce à des expériences approfondies et est préférée à l’expédition des colonies congelées dans de la glace sèche. Les changements importants de température avant le séchage ont tendance à provoquer le démontage et le barbotage sous l’échantillon de gélose montée.
2. Séchage ambiant des macrocolonies bactériennes de C. difficile + E. faecalis
- Retirez du matériau d’emballage les colonies bactériennes d’agarose montées sur des lames de microscope revêtues d’ITO. Placer les échantillons dans une boîte sèche avec dessiccant pendant 48-72 h à température ambiante.
REMARQUE: Il s’agit d’un processus de séchage doux et lent qui minimise le bouillonnement, la fissuration ou le détachement du produit gélosé de la surface de la lame de microscope. - Éliminez adéquatement tous les matériaux d’emballage contaminés et décontaminez l’espace de travail avec un désinfectant bactéricide/sporicide approprié.
- Inspecter visuellement les colonies pour déceler toute déformation à la surface de la gélose (p. ex., bouillonnement, fissuration, démontage).
REMARQUE : La hauteur de la surface de l’agarose doit diminuer visiblement et reposer à plat sur la glissière.
3. Séchage sous vide et thermomédié des macrocolonies bactériennes de C. difficile + E. faecalis
REMARQUE : Un appareil de séchage sous vide sur mesure (figure 1) a été construit pour faciliter l’élimination de l’excès d’humidité des échantillons de gélose. Cet appareil utilise une pompe à vide à palettes rotatives connectée en ligne à un biofiltre HEPA, un piège à froid et une chambre en acier inoxydable, où les échantillons bactériens sont placés. Un transformateur à tension variable est connecté à un filament de fil isolé, ce qui permet à l’utilisateur de chauffer la chambre pour accélérer le processus de séchage.
- Fermez la conduite de vide de la chambre d’échantillonnage et allumez l’interrupteur d’alimentation de la pompe à palettes rotatives pour permettre à la pompe à vide de se réchauffer et d’atteindre une pression de vide appropriée.
- Allumez le transformateur à tension variable pour chauffer le filament de fil enroulé autour de la chambre. Réglez l’alimentation variable jusqu’à ce que la température interne de la chambre à vide atteigne ~50 °C. Pendant que la pompe se réchauffe, placez une boue de glace sèche et d’éthanol à 100% dans le condenseur du piège à froid.
REMARQUE: Le piège à froid condense les vapeurs ou les spores de l’échantillon et évite la contamination du système de pompe à palettes rotatives et de l’huile de la pompe à vide. - Ouvrez la chambre à vide à l’aide d’une clé pour desserrer les pinces à double griffe de 16 mm. Insérez les échantillons d’agarose dans la chambre et scellez hermétiquement la chambre avec les pinces à bride à double griffe de 16 mm.
- Ouvrez la vanne de la pompe pour évacuer la chambre. Laisser sécher les échantillons pendant 60 à 120 minutes (p. ex., à ~150 mTorr).
REMARQUE: Ce temps de séchage est suffisant pour éliminer la majeure partie de l’humidité dans les petites sections de gélose. Une détermination empirique du temps de séchage optimal pour l’élimination de l’humidité et la diminution de la hauteur de gélose peuvent être nécessaires en fonction de la configuration et des échantillons individuels. Des temps de séchage beaucoup plus longs peuvent rendre la gélose séchée fragile et sujette à la fissuration. - Lorsque vous avez terminé, évacuez lentement la chambre à vide à la pression ambiante en fermant la vanne de la pompe à palettes et en ouvrant la vanne externe à l’air ambiant. Ouvrez la chambre en utilisant le protocole mentionné précédemment et retirez l’échantillon d’agarose séchée de la chambre.
- Conserver l’échantillon dans une boîte sèche avec dessiccant jusqu’à l’application de la matrice.
REMARQUE : La figure 2 montre des images de la surface de la gélose avant et après le séchage.
4. Application de matrice MALDI par pulvérisation robotisée
REMARQUE: Une fois que les échantillons d’agarose ont été soigneusement séchés et que la hauteur des sections de culture a sensiblement diminué, utilisez un pulvérisateur à matrice robotisée pour appliquer de manière homogène une fine couche d’un composé chimique de la matrice MALDI. Cette procédure doit être effectuée dans une hotte chimique et avec un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants, des lunettes de laboratoire et une blouse de laboratoire.
- Sélectionnez la matrice MALDI appropriée. Pour suivre ce protocole, utilisez la matrice MALDI 1,5-diaminonaphtalène (DAN) pour sa désorption favorable et son ionisation des acides aminés en mode ion négatif.
- Préparer 10 mL d’une solution matricielle DAN MALDI à 10 mg/mL dans 90/10 (v/v)acétonitrile/eau. Utilisez des solvants de qualité HPLC, soniquez pendant 30 minutes et filtrez la solution à travers des filtres à seringue en nylon de 0,2 μm avant l’introduction dans la pompe à seringue robotisée du pulvérisateur. De plus, préparez des solutions de lavage pour vous assurer que la ligne du pulvérisateur est propre entre chaque utilisation.
NOTE: Les solutions de lavage sont choisies pour augmenter la solubilité de la matrice et d’autres contaminants dans la ligne de pulvérisation et faciliter leur élimination du système. Les solutions de lavage utilisées ici sont 90/10 (v/v) acétonitrile/eau, 50/50 (v/v) eau/méthanol, 99/1 (v/v) acétonitrile/acide acétique et 95/5 (v/v) eau/hydroxyde d’ammonium. - Fixez l’échantillon au plateau du pulvérisateur et chargez les solutions préparées dans la conduite du pulvérisateur (Figure 3). À l’aide du logiciel informatique, spécifier les paramètres nécessaires pour permettre un revêtement uniforme du composé matriciel : température de la buse à 30 °C, huit passages, débit de 0,1 mL/min, diagramme CC, temps de séchage de 0 s, 10 psi.
REMARQUE : Il est généralement admis que la plupart des agents pathogènes seront inactivés par l’application de la matrice MALDI, qui est généralement un petit acide organique ou une base. - Une fois la séquence de pulvérisation terminée, retirer l’échantillon du plateau du pulvérisateur et le conserver dans une armoire de dessiccation jusqu’à l’analyse.
5. Préparation des macrocolonies bactériennes pour l’acquisition de données de spectrométrie de masse par imagerie MALDI
REMARQUE : Toutes les analyses par spectrométrie de masse imageuse ont été effectuées à l’aide d’un spectromètre de masse par résonance cyclotronique ionique à transformée de Fourier (FTICR). Cet instrument est équipé d’un système laser Nd:YAG MALDI (2 kHz, 355 nm).
- Insérez l’échantillon revêtu de matrice dans l’adaptateur de lames de microscope à plaque cible MALDI et écrivez au moins trois marqueurs fiduciaires qui englobent la zone d’échantillonnage à l’aide de marqueurs permanents (Figure 4). Utilisez un scanner à plat pour acquérir une image optique de la lame de microscope, y compris les marqueurs fiduciaires.
NOTE: Les marqueurs fiduciaires permettront l’enregistrement de l’image optique à la vue de la caméra MALDI observée dans l’instrument. - Définir une méthode d’instrument MS optimisée pour la plage de masse, la sensibilité et la résolution souhaitées, qui comprend l’étalonnage de masse, les réglages laser MALDI, les paramètres d’optique ionique et les conditions des cellules ICR. Pour cette méthode, sélectionner une fenêtre de masse de 100 Da de m/z 100 à 200 pour l’enrichissement du signal en phase gazeuse en mode ion négatif en utilisant une approche d’accumulation continue d’ions sélectionnés (CASI)23, qui englobe les valeurs m/z des métabolites d’intérêt.
- Ouvrez le logiciel d’acquisition d’images de l’instrument et utilisez l’assistant de configuration pour définir le nom et l’emplacement du fichier, la méthode d’acquisition MS, les régions d’intérêt à échantillonner et la résolution spatiale de l’image.
REMARQUE: Des résolutions spatiales de 100 à 300 μm sont généralement utilisées pour l’imagerie bactérienne des macrocolonies. - Une fois tous les paramètres définis, démarrez la séquence d’acquisition pour acquérir en série un spectre de masse à chaque pixel dans la ou les régions d’intérêt définies.
REMARQUE: Le temps d’acquisition de l’image dépend des paramètres de l’instrument, mais varie généralement de 2 à 6 h pour les images contenant 5 000 à 10 000 pixels.
6. Analyse des données de spectrométrie de masse par imagerie et identification des composés
- Après l’acquisition de l’image, enregistrez les données avec une extension de fichier « .mis », qui est un format de fichier spécifique au fournisseur pour les plates-formes de spectrométrie de masse d’imagerie. Ouvrez le fichier de données dans les progiciels flexImaging ou SCiLS ou exportez-le vers un format de données non propriétaire tel que .mzml et visualisez à l’aide d’un logiciel indépendant du fournisseur (par exemple, Cardinal24 ou MSIreader25,26).
REMARQUE : Un spectre de masse moyen s’affiche à l’ouverture des données d’imagerie dans flexImaging, qui représente l’intensité moyenne de tous les ions détectés dans les régions échantillonnées. Les pics d’intérêt peuvent être provisoirement identifiés sur la base de mesures de masse précises. En règle générale, des précisions de masse supérieures à 5 parties par million (ppm) sont suffisantes pour l’identification des métabolites sur les spectromètres de masse FTICR. - À l’aide du logiciel référencé, définissez des fenêtres de masse pour les pics d’intérêt afin de générer des cartes thermiques en fausses couleurs des distributions d’ions dans les régions échantillonnées.
- Sur l’affichage du spectre de masse moyenne, effectuez un zoom avant sur le pic d’intérêt et sélectionnez une fenêtre de masse appropriée qui englobe la zone du profil de crête.
- Faites un clic droit sur la fenêtre de masse en surbrillance et sélectionnez Ajouter un filtre de masse.... Étiqueter la valeur m/z sélectionnée en utilisant l’identification provisoire du métabolite suspect, déterminée par la mesure de masse précise à haute résolution.
- Sélectionnez le seuil d’intensité pour ajuster la plage dynamique de l’image de l’analyte affichée par la carte thermique en fausses couleurs. Ajustez davantage les paramètres de filtrage de masse afin que la fenêtre de masse englobe la zone du profil de crête, puis ajoutez le filtre de masse.
REMARQUE : La normalisation de l’intensité peut être effectuée de manière appropriée pour améliorer la quantification relative entre les régions mesurées. Les expériences présentées ici ont utilisé l’acquisition de données CASI (voir infra), ce qui peut rendre inexactes les méthodes de normalisation du nombre total d’ions (TIC) et du quadratique moyen (RMS). En tant que tel, toutes les images ioniques présentées ici sont affichées sans normalisation.
7. Préparation et expédition de tissus cæcaux de souris non infectés par des témoins et infectés par C. difficile
- Inoculer des souris mâles C57BL/6 âgées de 4 à 8 semaines avec des antibiotiques (0,5 mg/mL de céfopérazone ou 0,5 mg/mL de céfopérazone + 1 mg/mL de vancomycine) dans de l’eau potable ad libitum pendant 5 jours, suivi d’une période de récupération de 2 jours et d’une infection subséquente.
- Euthanasier les animaux par asphixie au CO2 et récolter immédiatement l’organe de caecum de souris. Incorporer dans un mélange à 20% de composé à température de coupe optimale (OCT) dans de l’eau distillée.
- Placer les échantillons sur de la glace sèche, puis les emballer et les expédier pour analyse; conserver à -80 °C jusqu’à l’analyse.
8. Cryosectionnement de tissus cæcaux de souris infectés par le verus difficile témoin non infecté par C. difficile
- Nettoyez tout l’équipement de cryosectionnage en les rinçant à 100% d’éthanol et laissez sécher avant de placer les échantillons dans la chambre du cryostat. Préparez des lames de microscope revêtues d’ITO à l’aide d’un ohmmètre pour identifier le côté de la lame avec le revêtement conducteur. Utilisez un scribe à pointe de diamant pour graver et étiqueter le côté recouvert d’ITO de la lame de microscope.
REMARQUE : L’équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants, des lunettes de laboratoire, une blouse de laboratoire et des manchons de cryostat, doit être porté. - Effectuer une cryosectionnement sur un cryomicrotome de recherche. Transférer les tissus céca de souris intégrés dans les OCT d’un congélateur à -80 °C vers la chambre cryomicrotome (température de la chambre à 30 °C, température de l’objet -28 °C) sur glace sèche. Montez les échantillons de tissus à comparer à l’aide de la spectrométrie de masse par imagerie (p. ex. témoin non infecté vs infecté par C. difficile) sur la même lame de microscope pour assurer une préparation identique des échantillons des deux types de tissus et permettre des comparaisons précises des métabolites.
- À l’intérieur de la chambre du cryomicrotome, montez le tissu incorporé dans les OCT sur un mandrin d’échantillon à l’aide d’une solution OCT supplémentaire. Une fois que la solution OCT s’est solidifiée, fixer le mandrin à la tête de l’échantillon. Commencer la cryosection par incréments de 10 à 50 μm pour atteindre la profondeur / le plan tissulaire souhaité de l’organe.
- Une fois qu’une section transversale optimale du tissu est atteinte, commencez à collecter des sections à 12 μm d’épaisseur. Manipulez délicatement la tranche à l’aide de pinceaux d’artiste et placez-la sur une lame de microscope recouverte de téflon.
- Roulez la lame de microscope recouverte d’ITO sur le dessus de la section de tissu pour ramasser le tissu de la lame recouverte de téflon. Décongelez la section de tissu sur la lame de microscope en appuyant la paume à l’arrière de la lame recouverte d’ITO. Continuez à décongeler jusqu’à ce que la section de tissu passe d’une texture translucide à une texture opaque/mate.
- Transférer les lames de microscope montées sur papier sur de la glace sèche dans une boîte sèche avec dessiccant pour le stockage pour l’analyse le jour même, ou stocker à -80 ° C pour un stockage à plus long terme.
9. Préparation de tissus cæcaux de souris non infectés par des témoins non infectés par C. difficile pour application matricielle et spectrométrie de masse par imagerie MALDI
- Effectuer l’application de la matrice MALDI en utilisant le même protocole décrit à l’étape 4 (température de la buse 30 ° C, huit passages, débit de 0,1 ml / min, diagramme CC, temps de séchage 0 s, 10 psi).
- Effectuer la spectrométrie de masse par imagerie MALDI en utilisant les mêmes protocoles que ceux décrits aux étapes 5 et 6.
- Analysez les images ioniques provenant de plusieurs répétitions biologiques et comparez les résultats pour la signification via des comparaisons de diagrammes en boîte d’intensité à l’aide du logiciel statistique SCiLS référencé ci-dessus.
REMARQUE : Les tests et comparaisons statistiques appropriés dépendent de l’application et peuvent inclure une segmentation spatiale, des modèles de classification et une analyse comparative pour déterminer les caractéristiques spectrales discriminantes et corrélées. Les analyses comparatives peuvent inclure l’attribution de valeurs p à des caractéristiques significatives, la génération d’analyses en composantes principales pour les comparaisons tissulaires et la visualisation de diagrammes en boîte pour identifier les variations. Il est également utile de visualiser le tissu à l’aide de la microscopie à fond clair de la section de tissu colorée par hématoxyline et éosine (H & E) après spectrométrie de masse par imagerie. Cela permet d’identifier clairement les caractéristiques morphologiques dans le tissu et peut être analysé en consultation avec un pathologiste qualifié.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nous avons effectué la spectrométrie de masse d’imagerie MALDI des métabolites de colonies bactériennes modèles et de souris cocolonisées avec E. faecalis et C. difficile pour étudier le rôle des acides aminés dans les interactions microbe-microbe. Les macrocolonies bactériennes cultivées sur gélose servent de modèle bien défini pour analyser les changements biochimiques distincts dans la formation de biofilms bactériens. Il est important d’assurer un processus de séchage contrôlé pour les macrocolonies de culture bactérienne cultivées sur milieu gélosé afin de minimiser les déformations et la fissuration de la surface de la gélose. Ceci a été réalisé par un processus en deux étapes, impliquant un séchage préliminaire avec dessiccant sous température et pression ambiantes, suivi d’une étape de séchage assistée par vide plus rapide effectuée à une température élevée. Un appareil de séchage sur mesure a été utilisé pour faciliter la déshydratation de la gélose tout en capturant la libération de contaminants bactériens ou de spores des échantillons (figure 1). L’étape supplémentaire de séchage sous vide est nécessaire pour s’assurer que les échantillons sont complètement déshydratés et ne subiront pas de déformation lors de l’exposition au vide MS.
Les sections d’agar avaient initialement une hauteur d’échantillon de 2 à 4 mm (figure 2A) et ont été réduites à ~0,5 mm de hauteur suivant le protocole de séchage (figure 2B). Il est important d’assurer un séchage uniforme sur toute la surface de l’échantillon pendant ce protocole de préparation de l’échantillon. De grandes variations de hauteur d’échantillon entraîneront un faisceau laser MALDI défocalisé à la surface de l’échantillon, ce qui peut nuire à l’efficacité de l’ionisation et à l’intensité ionique de l’analyte qui en résulte. Un exemple de processus de séchage infructueux est illustré à la figure 2D, où la surface de la gélose a bouillonné et s’est fissurée, rendant l’échantillon inutilisable pour une analyse plus approfondie. Une fois l’échantillon bactérien soigneusement séché, une couche matricielle DAN MALDI est appliquée à l’aide d’un pulvérisateur robotisé (Figure 3). Cet instrument permet le contrôle précis des paramètres de pulvérisation, ce qui permet l’application d’un revêtement matriciel uniforme (figure 2C).
Après l’application matricielle, les lames de microscope contenant les échantillons sont insérées dans un adaptateur de lames pour analyse sur un SM FTICR (Figure 4). Les coordonnées sur la lame sont enregistrées entre le logiciel d’acquisition de spectrométrie de masse par imagerie et la caméra de l’instrument en dessinant d’abord des marques fiduciaires sur la lame autour des régions à mesurer (indiquées par les symboles « + » de la figure 4). La diapositive est ensuite numérisée à l’aide d’un scanner à plat pour enregistrer une image optique, qui est ensuite utilisée pour définir la séquence d’acquisition dans le logiciel flexImaging. Nous avons optimisé les réglages de l’instrument de spectrométrie de masse pour la transmission et la détection des anions métabolites. En utilisant l’enrichissement ionique en phase gazeuse CASI, une fenêtre d’isolation ionique a été définie pour accumuler sélectivement des ions à m/z 150 ± 50 Da (Figure 5A), qui contient un ensemble de composés observés à partir de la surface du tissu. Spécifiquement ici pour l’infection à C. difficile, nous avons trouvé des voies d’acides aminés pour démontrer des rôles intéressants et changeants au cours du catabolisme bactérien. Sur la base de mesures de masse précises, les signaux ioniques ont été identifiés à m/z 131,083 et m/z 173,104 comme étant de l’ornithine (erreur de masse de 0,34 ppm; Figure 5B) et l’arginine (erreur massique de 0,43 ppm; Figure 5C), respectivement.
La spectrométrie de masse par imagerie des macrocolonies bactériennes a été réalisée sur des monocultures de C. difficile et sur des colonies de coculture C. difficile + E. faecalis (figure 6). Une image optique des échantillons après application de la matrice MALDI met en évidence les régions d’acquisition d’intérêt, qui s’étendent jusqu’aux zones extérieures des biofilms de colonies (Figure 6A,C). La spectrométrie de masse par imagerie de ces échantillons permet de cartographier l’espace des métabolites des acides aminés ornithine et arginine, qui se révèlent altérés et localisés différemment en présence d’E. faecalis (figure 6B,D). Par exemple, l’arginine est significativement plus abondante dans la monoculture de C. difficile que dans la coculture C. difficile + E. faecalis (figure 6D). Nous avons également étendu les analyses par spectrométrie de masse par imagerie à des modèles murins d’infection utilisant des souris femelles C57BL/6 exemptes de germes âgées de 8 semaines qui ont été infectées soit par des spores de C. difficile, les deux spores de C. difficile + cellules E. faecalis (wt) (5 × 10 8/mL), soit un mutant transposon contenant à la fois des spores de C. difficile + des cellules E. faecalis (mutation ArcD) (5 × 10 8/mL) (Figure 7)27 . Le caecum de souris a été récolté et congelé dans un composé OCT à 25% pour maintenir la forme et la fidélité de l’organe. Le composé OCT a également aidé à soutenir les sections de tissus minces pendant la cryosection. Comme dans le protocole mentionné ci-dessus, les coupes de tissus sont recouvertes d’une couche matricielle DAN MALDI, balayées à l’aide d’un scanner optique à plat (Figure 7B) et analysées par spectrométrie de masse par imagerie MALDI (Figure 7C). Une coloration histologique a été effectuée sur des coupes de tissus après une analyse par spectrométrie de masse par imagerie, et un balayage optique à haute résolution en fond clair a été utilisé pour évaluer la morphologie des tissus (figure 7A). La couche de cellules épithéliales est clairement enflammée pendant l’infection par rapport au tissu témoin.
Figure 1 : Appareil de séchage sous vide construit à la maison. Un appareil de séchage sous vide sur mesure est utilisé pour accélérer l’élimination de l’humidité des échantillons de gélose. Les échantillons sont placés dans la chambre à vide, qui est scellée et évacuée à l’aide d’une pompe à palettes rotative, puis chauffée à l’aide d’un transformateur à tension variable. Toutes les vapeurs / spores de contaminants de l’échantillon sont piégées dans le piège à froid et les filtres en ligne HEPA. Des pressions de 100 à 150 mTorr sont généralement utilisées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Séchage et préparation des macrocolonies bactériennes. Images optiques d’échantillons de gélose (A) avant et (B) après élimination de l’humidité par dessiccation et séchage assisté par vide. (C) Une matrice MALDI 1,5-diaminonaphtalène est appliquée à la coculture bactérienne après séchage à l’aide d’un pulvérisateur robotisé. (D) Un séchage infructueux entraîne généralement des fissures et des bulles dans l’agar-agar, ce qui le rend inutilisable pour une analyse plus approfondie. Abréviations : DAN = 1,5-diaminonaphtalène; MALDI = désorption/ionisation laser assistée par matrice. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Pulvérisation robotisée de la matrice MALDI sur des échantillons d’agarose. Images (A) d’un pulvérisateur HTX M5 TM et (B) d’échantillons d’agarose chargés dans le pulvérisateur à matrice robotique pour application matricielle MALDI. Abréviation : MALDI = désorption/ionisation laser assistée par matrice. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Adaptateur de spectromètre de masse avec échantillons chargés pour analyse. Les échantillons d’agarose enrobés de matrice sont chargés dans un adaptateur de lames MTP pour l’analyse MALDI. Les marqueurs fiduciaires sont visibles sous forme de signes plus noirs (« + »). Abréviation : MALDI = désorption/ionisation laser assistée par matrice. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Spectres de masse représentatifs des pics d’ions métabolites identifiés. (A) Mode ion négatif L’analyse MALDI d’échantillons de culture bactérienne permet de détecter des dizaines de métabolites. Des mesures de masse précises à haute résolution permettent d’identifier provisoirement (B) l’ornithine à m/z 131,083 (erreur de masse de 0,34 ppm) et (C) l’arginine à m/z 173,104 (erreur de masse de 0,43 ppm). Les spectres de masse sont acquis en utilisant un pouvoir de résolution de masse (FWHM) de 75 000 à m/z 150. Abréviations : MALDI = désorption/ionisation laser assistée par matrice; FWHM = pleine largeur à la moitié maximum. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Analyse par spectrométrie de masse par imagerie des macrocolonies bactériennes. (A,C) Les images optiques d’échantillons d’agarose montrent les régions de mesure pour l’analyse par spectrométrie de masse par imagerie, qui sont mises en évidence par des lignes pointillées blanches. (B, D) Les images d’ions MALDI pour l’ornithine (m/z 131,083, 0,038 ppm) et l’arginine (m/z 173,104, 0,60 ppm) montrent des distributions spatiales uniques dans les cultures bactériennes. Notez que les échelles d’intensité absolue sont différentes pour les images d’ions de co-culture montrées dans les panneaux B et D. Par exemple, l’arginine est significativement plus abondante dans la monoculture de C. difficile que dans la coculture dans les panels C et D, ce qui signifie que cette échelle d’intensité est relative à l’abondance de l’arginine dans la monoculture, et il semble qu’il n’y ait pas d’arginine présente dans cette coculture. Inversement, la co-culture dans A et B projette l’intensité de l’arginine sur une échelle d’intensité absolue inférieure, puisque c’est le seul échantillon de l’image. Abréviations : MALDI = désorption/ionisation laser assistée par matrice; CASI = accumulation continue d’ions sélectionnés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Analyse par spectrométrie de masse par imagerie des tissus cæcaux murins infectés. (A) Les images de microscopie à fond clair des tissus colorés à l’hématoxyline et à l’éosine provenant de souris CEECA infectées permettent de visualiser la morphologie des tissus. (B) Des images optiques de tissus cécales de souris montrent les échantillons après application d’une couche matricielle DAN MALDI. (C) Les images d’ions MALDI pour l’ornithine (m/z 131,083, 0,88 ppm) et l’arginine (m/z 173,104, 0,15 ppm) montrent des distributions spatiales uniques dans les échantillons de tissus. Abréviations : MALDI = désorption/ionisation laser assistée par matrice; DAN = 1,5-diaminonaphtalène. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lors de la spectrométrie de masse d’imagerie MALDI, il est important d’avoir une surface d’échantillon plane pour fournir un diamètre focal constant du laser MALDI incident sur le substrat de l’échantillon. Les écarts dans la hauteur de l’échantillon peuvent provoquer un déplacement du faisceau laser MALDI, provoquant des modifications du diamètre et de l’intensité du faisceau, ce qui peut affecter l’efficacité de l’ionisation MALDI. Ces modifications de l’efficacité de l’ionisation peuvent entraîner des différences d’intensité de l’analyte à la surface du tissu qui ne reflètent pas la biochimie tissulaire sous-jacente, mais reflètent plutôt la topographie de la surface. De plus, la plupart des sources d’ionisation MALDI fonctionnent à des pressions subatmosphériques, et les échantillons de gélose hydratée sont des échantillons fragiles lorsqu’ils sont soumis à des conditions vides . Le vide de ces sources peut provoquer la déshydratation des échantillons d’agarose, ce qui peut altérer la surface de l’échantillon pendant le séchage. Les échantillons contenant des poches d’air ou de grandes quantités d’eau sont très sensibles à ces changements. Ce problème est couramment rencontré lors de l’analyse par spectrométrie de masse par imagerie MALDI de spécimens bactériens cultivés sur agar. La gélose nutritive a une teneur élevée en eau pour faciliter la croissance bactérienne; cependant, il est essentiel d’éliminer autant d’humidité que possible avant d’appliquer un revêtement matriciel MALDI et d’introduire l’échantillon dans le vide du spectromètre de masse.
Les échantillons de gélose hydratée ne sont donc pas propices à l’analyse sous vide . En plus des changements morphologiques induits par les conditions vides , il existe également des problèmes potentiels avec les hauteurs d’échantillon qui dépassent trop loin de l’adaptateur de lame de plaque cible MALDI, qui est utilisé pour maintenir l’échantillon monté sur lame de microscope et l’amener à la bonne position pour le point focal laser MALDI. Le mécanisme de l’étage MALDI est étroitement déduit avec d’autres composants mécaniques de l’étage et, lorsqu’il est en position, il n’y a qu’un jeu de quelques millimètres entre la surface de la plaque cible de l’échantillon et l’extrémité avant de l’optique de la source d’ions. Cela peut provoquer un grattage de l’échantillon, ce qui peut déplacer ou démonter complètement l’échantillon à analyser. De plus, alors que les échantillons de gélose hydratée adhèrent naturellement à la surface d’une lame de microscope, cela a tendance à être beaucoup plus faible que l’adhérence d’un spécimen de gélose complètement séché. Par conséquent, les échantillons de gélose hydratée dépassent de la surface de la plaque cible de l’échantillon et ont une adhérence plus faible, ce qui augmente le risque que l’échantillon se démonte et s’écaille.
L’identité de la matrice MALDI et le choix de la méthode d’application sont également des variables importantes à considérer dans une expérience de spectrométrie de masse par imagerie. Le choix d’une matrice MALDI organique dépend en grande partie du substrat échantillon et des composés cibles d’intérêt. Par exemple, de nombreux métabolites de faible poids moléculaire (MW < 300 Da) sont composés de nombreux acides organiques, phosphates et autres fractions, qui sont plus facilement ionisés en polariténégative 28. Pour l’analyse en mode négatif, les matrices de base sont préférées, de sorte que leurs structures chimiques se prêtent mieux à l’acceptation d’un proton (par exemple, 9-aminoacridine, 1,5-diaminonaphtalène), laissant ainsi une charge négative sur de nombreux ions de petits métabolites d’intérêt. Nous avons effectué un criblage matriciel pour les analytes ciblés d’intérêt et avons constaté que la matrice de 1,5-diaminonaptalène (DAN) produisait le signal le plus élevé pour les métabolites d’acides aminés d’intérêt pour les échantillons de tissus témoins. Lors de l’application de la matrice MALDI, les analytes d’intérêt sont extraits du substrat de l’échantillon et cocristallisent avec la matrice MALDI. Dans certains cas, des conditions d’application de matrice « plus humides » faciliteront l’extraction et la cocristallisation accrues, ce qui améliorera la détection des analytes lors de l’analyse MALDI. Cependant, si le processus d’application de la matrice utilise trop de solvant, les analytes peuvent être délocalisés dans le tissu. Il est important de trouver un équilibre entre l’extraction efficace de l’analyte et le maintien de la fidélité spatiale des analytes dans le tissu lors de la sélection des conditions d’application de la matrice. Par exemple, un appareil de sublimation sur mesure peut être utilisé pour appliquer une couche de matrice homogène sur des surfaces d’échantillonnage et produit des cristaux de matrice extrêmement petits29,30. Cependant, ce processus est assez sec et peut ne pas être optimal pour l’extraction de l’analyte31. Le pulvérisateur robotisé utilisé ici permet un contrôle reproductible et précis de la pression de pulvérisation, du débit, de la température de la buse et d’autres paramètres qui peuvent permettre des méthodes optimisées d’extraction de l’analyte et de cocristallisation de la matrice32.
Les paramètres instrumentaux du FTICR MS utilisés ici ont été optimisés pour la transmission et la détection des ions métabolites en mode ion négatif. Cela comprend le réglage des éléments RF et DC dans la région de transfert d’ions pour transmettre préférentiellement des ions de faible poids moléculaire (<m/z 200). Les paramètres qui ont un effet important sur la transmission ionique comprennent l’amplitude RF de l’entonnoir (65 V), le réglage de masse Q1 pour l’isolation ionique du filtre de masse quadripolaire (m/z 150) et le délai de temps de vol entre la cellule d’accumulation hexapole et la cellule ICR (0,400 ms). Ces valeurs de paramètres sélectionnées transmettent plus efficacement les ions de faibles valeurs m/z au détriment de l’efficacité de transmission des ions de valeurs m/z plus grandes. De plus, nous avons utilisé une approche d’accumulation continue d’ions sélectionnés (CASI), qui permet l’enrichissement sélectif des ions dans une fenêtre d’intérêt de masse définie. Dans cette approche, le filtre de masse quadripolaire est utilisé pour transmettre sélectivement une petite plage de valeurs m/z de la source d’ionisation à la cellule d’accumulation hexapolaire de l’instrument, tandis que les ions avec des valeurs m/z en dehors de cette fenêtre de masse ont des trajectoires ioniques instables et ne sont pas transmis à travers le filtre de masse quadripolaire. Cela permet l’enrichissement sélectif d’analytes d’intérêt peu abondants afin d’améliorer la limite de détection et la plage dynamique jusqu’à trois ordres de grandeur grâce à l’élimination du bruit chimique. Le pouvoir de résolution de masse élevé et la précision de masse de la plate-forme d’instruments FTICR permettent la séparation facile des composés isobares (c’est-à-dire la même masse nominale) et l’identification provisoire des métabolites.
Un contrôle minutieux et reproductible de la préparation des échantillons, l’application de la matrice MALDI et les analyses par spectrométrie de masse par imagerie peuvent permettre des vues reproductibles de la biochimie bactérienne dans les colonies et les échantillons de tissus. Les macrocolonies bactériennes servent de modèles simplifiés pour caractériser la communication métabolique croisée des agents pathogènes au cours d’une infection microbienne, qui peuvent ensuite être comparées à des systèmes plus complexes tels que les tissus animaux. Par exemple, l’arginine est peu abondante dans l’échantillon de coculture C. difficile + E. faecalis comparativement à la culture de C. difficile seule (figure 6), ce qui est corroboré par la capacité notée d’E. faecalis à consommer de l’arginine comme source d’énergie et à exporter l’ornithine de la cellule par l’intermédiaire de l’antiporteur ArcD33. Les résultats de la macrocolonie ont conduit à l’étude de cette régulation des acides aminés dans un modèle animal. Les souris infectées par C. difficile + E. faecalis (wt) ont montré significativement moins d’arginine que les souris infectées par C. difficile seul (figure 7C), récapitulant les résultats de l’image de la colonie.
Pour tester l’hypothèse du métabolisme de l’arginine et l’implication de l’antiporteur ArcD, nous avons utilisé un mutant transposon qui élimine le transport des métabolites à travers l’antiporteur ArcD de E. faecalis. Les souris infectées par C. difficile + E. faecalis (arcD::Tn) montrent une augmentation de la détection de l’arginine et une diminution de la détection de l’ornithine par rapport au modèle de co-infection de type sauvage (figure 7C) et sauvent généralement les niveaux originaux d’acides aminés observés dans le modèle d’infection à C. difficile seul (figure 7A). Cette relation inverse de la régulation des métabolites corrobore les résultats selon lesquels E. faecalis se nourrit de nutriments d’acides aminés produits à partir de C. difficile. De plus, l’analyse histologique a montré des dommages cellulaires importants chez des souris infectées à la fois par C. difficile et E. faecalis, qui sont principalement observés dans la souche de type sauvage d’E. faecalis par opposition au mutant du transposon ArcD. Ces résultats appuient nos récentes découvertes selon lesquelles l’arginine et l’ornithine sont essentielles à la virulence, au comportement et à la
Remise en forme27. Dans l’ensemble, ce flux de travail démontre une méthode efficace pour préparer des macrocolonies bactériennes à base d’agar pour la spectrométrie de masse d’imagerie MALDI et montre que ces systèmes peuvent servir de modèles utiles pour examiner la coopération microbienne pendant l’infection.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) des National Institutes of Health (NIH) sous le prix GM138660. J.T.S. a été soutenu par la bourse d’été de la famille Charles et Monica Burkett de l’Université de Floride. J.P.Z. a été soutenu par les subventions K22AI7220 (NIAID) et R35GM138369 (NIGMS) des NIH. A.B.S. a été soutenu par la subvention de formation en biologie cellulaire et moléculaire de l’Université de Pennsylvanie (T32GM07229).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm Titan3 nylon syringe filters | Thermo Scientific | 42225-NN | |
| 1,5-diaminonaphthalene MALDI matrix | Sigma Aldrich | 2243-62-1 | |
| 20 mL Henke Ject luer lock syringes | Henke Sass Wolf | 4200.000V0 | |
| 275i series convection vacuum gauge | Kurt J. Lesker company | KJL275807LL | |
| 7T solariX FTICR mass spectrometer equipped with a Smartbeam II Nd:YAG MALDI laser system (2 kHz, 355 nm) | Bruker Daltonics | ||
| Acetic acid solution, suitable for HPLC | Sigma Aldrich | 64-19-7 | |
| Acetonitrile, suitable for HPLC, gradient grade, ≥99.9% | Sigma Aldrich | 75-05-8 | |
| Ammonium hydroxide solution, 28% NH3 in H2O, ≥99.99% trace metals basis | Sigma Aldrich | 1336-21-6 | |
| Autoclavable biohazard bags: 55 gal | Grainger | 45TV10 | |
| Biohazard specimen transport bags (8 x 8 in.) | Fisher Scientific | 01-800-07 | |
| Brain heart infusion broth | BD Biosciences | 90003-040 | |
| C57BL/6 male mice | Jackson Laboratories | ||
| CanoScan 9000F Mark II photo and document scanner | Canon | ||
| CM 3050S research cryomicrotome | Leica Biosystems | ||
| Desiccator cabinet | Sigma Aldrich | Z268135 | |
| Diamond tip scriber, Electron Microscopy Sciences | Fisher Scientific | 50-254-51 | |
| Drierite desiccant pellets | Drierite | 21005 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2701 | |
| flexImaging software | Bruker Daltonics | ||
| ftmsControl software | Bruker Daltonics | ||
| Glass vacuum trap | Sigma Aldrich | Z549460 | |
| HTX M5 TM robotic sprayer | HTX Technologies | ||
| Indium Tin Oxide (ITO)-coated microscope slides | Delta Technologies | CG-81IN-S115 | |
| In-line HEPA filter to vacuum pump | LABCONCO | 7386500 | |
| Methanol, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| MTP slide-adapter II | Bruker Daltonics | 235380 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Fischer Scientific | 23-730-571 | |
| Peridox RTU Sporicide, Disinfectant and Cleaner | CONTEC | CR85335 | |
| PTFE (Teflon) printed slides, Electron Microscopy Sciences | VWR | 100488-874 | |
| Rotary vane vacuum pump RV8 | Edwards | A65401903 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable High Profile Microtome Blades | Electron Microscopy Sciences | 63068-HP | |
| Transparent vacuum tubing | Cole Palmer | EW-06414-30 | |
| Ultragrade 19 vacuum pump oil | Edwards | H11025011 | |
| Variable voltage transformer | Powerstat | ||
| Water, suitable for HPLC | Sigma Aldrich | 7732-18-5 | |
| Wide-mouth dewar flask | Sigma Aldrich | Z120790 |
References
- Biteen, J. S., et al. Tools for the microbiome: nano and beyond. ACS Nano. 10 (1), 6-37 (2016).
- Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).
- Watrous, J. D., Alexandrov, T., Dorrestein, P. C. The evolving field of imaging mass spectrometry and its impact on future biological research. Journal of Mass Spectrometry. 46 (2), 209-222 (2011).
- Gessel, M. M., Norris, J. L., Caprioli, R. M. MALDI imaging mass spectrometry: spatial molecular analysis to enable a new age of discovery. Journal of Proteomics. 107, 71-82 (2014).
- Fang, J., Dorrestein, P. C. Emerging mass spectrometry techniques for the direct analysis of microbial colonies. Current Opinion in Microbiology. 19, 120-129 (2014).
- Wheatcraft, D. R. A., Liu, X., Hummon, A. B. Sample preparation strategies for mass spectrometry imaging of 3D cell culture models. Journal of Visualized Experiments. (94), e52313 (2014).
- Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Capturing small molecule communication between tissues and cells using imaging mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (146), e59490 (2019).
- Li, H., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry of three-dimensional cell culture systems. Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).
- Watrous, J. D., Dorrestein, P. C.
- Dunham, S. J. B., Ellis, J. F., Li, B., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging of complex microbial communities. Accounts of Chemical Research. 50 (1), 96-104 (2017).
- Frydenlund Michelsen, C., et al. Evolution of metabolic divergence in Pseudomonas aeruginosa during long-term infection facilitates a proto-cooperative interspecies interaction. Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10 (6), 1323-1336 (2016).
- Si, T., et al. Characterization of Bacillus subtilis colony biofilms via mass spectrometry and fluorescence imaging. Journal of Proteome Research. 15 (6), 1955-1962 (2016).
- Wakeman, C. A., et al. The innate immune protein calprotectin promotes Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus interaction. Nature Communications. 7, 11951 (2016).
- Phelan, V. V., Fang, J., Dorrestein, P. C. Mass spectrometry analysis of Pseudomonas aeruginosa treated with azithromycin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (6), 873-877 (2015).
- Ferreyra, J. A., et al. Gut microbiota-produced succinate promotes C. difficile infection after antibiotic treatment or motility disturbance. Cell Host & Microbe. 16 (6), 770-777 (2014).
- Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517 (7533), 205-208 (2015).
- Schubert, A. M., et al. Microbiome data distinguish patients with Clostridium difficile infection and non-C. difficile-associated diarrhea from healthy controls. mBio. 5 (3), 01021-01014 (2014).
- Auchtung, J. M., et al. Identification of simplified microbial communities that inhibit Clostridioides difficile infection through dilution/extinction. mSphere. 5 (4), 00387 (2020).
- Zackular, J. P., et al. Dietary zinc alters the microbiota and decreases resistance to Clostridium difficile infection. Nature Medicine. 22 (11), 1330-1334 (2016).
- Tomkovich, S., Stough, J. M., Bishop, L., Schloss, P. D. The initial gut microbiota and response to antibiotic perturbation influence Clostridioides difficile clearance in mice. mSphere. 5 (5), 00869 (2020).
- Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. Homogeneous matrix deposition on dried agar for MALDI imaging mass spectrometry of microbial cultures. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).
- Yang, J. Y., et al. Primer on agar-based microbial imaging mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).
- Prentice, B. M., et al. Dynamic range expansion by gas-phase ion fractionation and enrichment for imaging mass spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (19), 13092-13100 (2020).
- Bemis, K. D., et al. Cardinal: an R package for statistical analysis of mass spectrometry-based imaging experiments. Bioinformatics. 31 (14), 2418-2420 (2015).
- Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. MSiReader: An open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (5), 718-721 (2013).
- Bokhart, M. T., Nazari, M., Garrard, K. P., Muddiman, D. C. MSiReader v1.0: Evolving open-source mass spectrometry imaging software for targeted and untargeted analyses. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (1), 8-16 (2018).
- Smith, A. B., et al. Enterococci enhance Clostridioides difficile Pathogenesis. Nature. , (2022).
- Korte, A. R., Lee, Y. J. MALDI-MS analysis and imaging of small molecule metabolites with 1,5-diaminonaphthalene (DAN). Journal of Mass Spectrometry. 49 (8), 737-741 (2014).
- Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 18 (9), 1646-1652 (2007).
- Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: Enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Analytical Chemistry. 84 (4), 2048-2054 (2012).
- Huizing, L. R., et al. Development and evaluation of matrix application techniques for high throughput mass spectrometry imaging of tissues in the clinic. Clinical Mass Spectrometry. 12, 7-15 (2019).
- Anderton, C. R., Chu, R. K., Tolić, N., Creissen, A., Paša-Tolić, L. Utilizing a robotic sprayer for high lateral and mass resolution MALDI FT-ICR MSI of microbial cultures. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (3), 556-559 (2016).
- Gilmore, M. S., Clewell, D. B., Ike, Y., Shankar, N. Enterococci: From commensals to leading causes of drug resistant infection. Massachusetts Eye and Ear Infirmary. , Boston. (2014).
