Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Evaluering og manipulering av nevral aktivitet ved bruk av to-foton holografisk mikroskopi

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64205
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2, 4, 5, 6, 1,2,6
1Department of Anatomy and Molecular Cell Biology, Nagoya University Graduate School of Medicine, 2Division of Multicellular Circuit Dynamics, National Institute for Physiological Sciences, National Institutes of Natural Sciences, 3Department of System Science, Kobe University Graduate School of System Informatics, 4Department of Biology, Graduate School of Sciences, Kobe University, 5Department of Information Science, Kobe University Graduate School of System Informatics, 6Center of Optical Scattering Image Science, Kobe University

Summary

Vi utviklet et to-foton holografisk mikroskop som kan visualisere, vurdere og manipulere nevral aktivitet ved hjelp av høy spatiotemporal oppløsning, med sikte på å belyse patogenesen av nevropsykiatriske lidelser som er forbundet med unormal nevral aktivitet.

Abstract

Nylige fremskritt innen optisk bioimaging og optogenetikk har muliggjort visualisering og manipulering av biologiske fenomener, inkludert cellulære aktiviteter, hos levende dyr. Innen nevrovitenskap har detaljert nevral aktivitet relatert til hjernefunksjoner, som læring og minne, nå blitt avslørt, og det har blitt mulig å kunstig manipulere denne aktiviteten for å uttrykke hjernefunksjoner. Imidlertid har den konvensjonelle evalueringen av nevral aktivitet ved to-foton Ca2+ avbildning problemet med lav temporal oppløsning. I tillegg kan manipulering av nevral aktivitet ved konvensjonell optogenetikk gjennom optisk fiber bare samtidig regulere aktiviteten til nevroner med samme genetiske bakgrunn, noe som gjør det vanskelig å kontrollere aktiviteten til individuelle nevroner. For å løse dette problemet har vi nylig utviklet et mikroskop med høy spatiotemporal oppløsning for biologiske applikasjoner ved å kombinere optogenetikk med digital holografisk teknologi som kan modifisere femtosekund infrarøde laserstråler. Her beskriver vi protokoller for visualisering, evaluering og manipulering av nevral aktivitet, inkludert fremstilling av prøver og drift av et to-foton holografisk mikroskop (figur 1). Disse protokollene gir nøyaktig spatiotemporal informasjon om nevral aktivitet, noe som kan være nyttig for å belyse patogenesen av nevropsykiatriske lidelser som fører til abnormiteter i nevral aktivitet.

Introduction

To-foton Ca2+ avbildning er en nyttig teknikk for vurdering av nevral aktivitet. Det kan brukes til å identifisere ikke bare nevral aktivitet som kreves for atferd og minne hos normale dyr1,2, men også en unormal nevronaktivitet som oppstår i musemodeller av nevropsykiatriske lidelser 3,4. Teknikken har blitt brukt til å belyse det nevrale grunnlaget for hjernefunksjoner. Men selv om det kan gi bilder med høy oppløsning og høy kvalitet, er den tidsmessige oppløsningen lavere enn den elektrofysiologiske metoden 1,3.

Optogenetikk har bidratt til å innovere måten nevrologer forstår hjernefunksjon5. Gitt de tekniske begrensningene har flertallet av optogenetisk forskning brukt aktiveringsordninger med lav romlig oppløsning, og dermed begrenset hvilke typer manipulasjoner av nevral aktivitet som kan utføres tilsvarende. Imidlertid kan manipulering av nevral aktivitet på finere spatiotemporale skalaer potensielt være nyttig for en mer fullstendig forståelse av nevrale beregninger og patogenesen av nevropsykiatriske lidelser. Romlig presis holografisk teknologi som kan forme femtosekund nær infrarøde laserstråler lover å overvinne denne utfordringen og åpner for flere nye eksperimentelle klasser som tidligere var umulige 6,7. Denne teknologien gjør det mulig for nevrologer å avdekke de grunnleggende aspektene og patologiene til sensoriske, kognitive og atferdsmessige nevrale koder som har vært utenfor rekkevidde.

Holografisk projeksjon innebærer generering av ønskede lysmønstre for å få tilgang til individuelle celler og funksjonelle nettverk selektivt. In vivo-eksperimenter krever optimal lysoverføring for å målrette celler i den levende hjernen. Infrarødt lys trenger dypere inn i levende vev og kan brukes til ikke-lineær to-foton eksitasjon (2PE)8,9,10. Dermed kan to-foton holografisk mikroskopi, som kombinerer holografisk projeksjon og 2PE, brukes til å evaluere og manipulere nevrale aktiviteter for å undersøke cellulære og funksjonelle nettverk in vivo. Nylige biologiske anvendelser av to-foton holografisk mikroskopi har belyst nevral aktivitet og kretsløp som kreves for læring i den visuelle cortex 11,12, olfaktorisk pære13 og hippocampus14.

Tallrike laboratorier over hele verden har rapportert spennende resultater og forbedringer ved hjelp av deres holografiske stimuleringssystemer 15,16,17,18,19,20,21,22,23. I systemet beskrevet her kan det holografiske stimuleringssystemet bygges som en tilleggsanordning for et konvensjonelt mikroskop. Den fasebaserte romlige lysmodulatoren (SLM) er nøkkelenheten for å modulere en planbølgefront til enhver form, og interferenseffekten brukes til å kontrollere intensiteten og plasseringen av foci. Figur 2 viser holografisk stimulering og avbildning av lysbaner. Den første lysbanen er for punktskanningsmodus og består av et skannehode og bildedetektorer. Den andre lysbanen er for holografisk stimulering med en bølgelengde på 1040 nm og består av en SLM1. Den tredje lysbanen er for holografisk belysning med 920 nm bølgelengde og består av en SLM2 og en bildesensor. Den holografiske bildemodusen kan registrere intensiteter fra flere interesseområder ved å belyse flere punkter i prøven. På denne måten kan opptakshastigheten økes til noen hundre bilder per sekund. For å oppnå punktskanning eller holografisk belysningsavbildning ble 920 nm laseren delt inn i to baner av en strålesplitter med et fast forhold på 3: 7. Alle de optiske elementene ble justert på en optisk brødfjøl med dimensjoner på 600 mm × 600 mm. Det modulerte lyset kom inn gjennom lysporten på siden av det mikroskopiske legemet, mens punktskanningslyset kom inn gjennom skannehodet på toppen av det mikroskopiske legemet. Disse lysene ble integrert like over objektivlinsen og skapte foci i prøveplanet. I tillegg gjorde den skreddersydde programvaren det mulig for den vanlige arbeidsflyten å være enkel og konsistent.

I denne artikkelen presenteres en komplett protokoll for bruk av holografisk stimulering eller belysning for å måle nevral aktivitet og vurdere funksjonell tilkobling mellom nevroner. For demonstrasjonsformål beskriver vi her en hjernekirurgi rettet mot bakkroppsområdet av den primære somatosensoriske cortex (S1HL) i musehjernen og en metode for å vurdere og manipulere nevral aktivitet ved hjelp av to-foton holografisk mikroskopi. Den eksperimentelle prosedyren er delt inn i fire deler. Først ble hodeplaten festet til musens skalle ved hjelp av tannsement. For det andre ble en viral vektor som uttrykker jGCaMP8f eller GCaMP6m-P2A-ChRmine stereotaktisk injisert i S1HL. For det tredje ble det holografiske stimulerings- eller belysningssystemet kalibrert. For det fjerde, etter postoperativ gjenoppretting og ekspresjon av disse to proteinene, ble in vivo Ca2+ avbildning utført for å vurdere nevral aktivitet og funksjonell tilkobling mellom nevroner med to-foton holografisk mikroskopi.

Protocol

Alle eksperimentelle protokoller ble godkjent av dyrepleie- og brukskomiteene ved Nagoya University Graduate School of Medicine (godkjenningsnummer: M220295-003).

1. Implantasjon av hodeplate (figur 1A)

  1. Administrer bedøvelsen (en blanding av 74 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xylazin) intraperitonealt for å bedøve musen. Sjekk bedøvelsesstatusen til musen ofte ved å vurdere pedalrefleksene.
  2. Etter anestesi, plasser musen i et stereotaksisk instrument. Påfør en øyesalve (se materialfortegnelse) for å forhindre at hornhinnen tørker ut når hodeplaten er implantert.
  3. Barber operasjonsområdet og desinfiser huden med tre alternerende runder med povidon-jod eller klorhexidinskrubb etterfulgt av 70% alkoholservietter. Forsiktig utsette skallen og rengjør den med bomullspinne.
    MERK: Alle kirurgiske instrumenter skal steriliseres, og alle prosedyrer skal utføres tilsvarende. Eventuelle gjenværende rusk (f.eks. hår eller tørket blod) forårsaker inflammatoriske reaksjoner. Derfor bør noe rusk fjernes under et stereoskop ved hjelp av bomullspinne fuktet med sterilt vann eller 70% alkohol.
  4. Bruk de stereotaktiske koordinatene - anterior og posterior = 0,5 mm, mediale og laterale = 1,5 mm fra bregma - for å finne sentrum av kraniotomien og merk den med en markørpenn.
  5. Plasser en skreddersydd hodeplate i midten av skallen. Påfør deretter dental sement (se materialtabell) for å feste den fast til skallen. Påfør lett trykk til hodeplaten har fast kontakt med forsiden og baksiden av skallen.
    MERK: Dette trinnet tar omtrent 20 minutter å fullføre og er avgjørende for å redusere bevegelsesartefakter i hjernen under to-foton avbildning. Dimensjonene på hodeplaten er 20 mm × 40 mm × 1 mm med en hjemmeplateformet åpning med en kant 15 mm lang, to tilstøtende sider 3 mm lange og de resterende to sidene 10 mm lange.
  6. Bland sammen en akrylbasert dental harpiks sement som følger: en halv skje pulver, tre dråper væske og en dråpe katalysator (se materialfortegnelse). For å forhindre tørking, påfør denne blandede tannklebende harpikssementen på musens intakte skalleoverflatemed hodeplaten.
  7. Plasser musen i et varmt bur til den har gjenopprettet fra anestesi. Ikke la musen være uten tilsyn før den har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal recumbency.

2. Injeksjon med kirurgi og adenoassosiert virus (AAV) (figur 1B)

  1. Utfør kraniotomi eller viral injeksjon uten fjerning av tannklebende harpiks sement fra skallen 1 dag etter hodeplateimplantasjon.
    MERK: Administrer anestesi (en blanding av 74 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xylazin) intraperitonealt til musen under denne prosedyren.
  2. For å unngå cerebralt ødem, administrer deksametason natriumfosfat (1,32 mg / kg) intraperitonealt 1 time før kirurgi.
  3. Bedøv musen med hodeplaten med 1% isoflurananestesi ved hjelp av en fordamper (anestesileveringssystem) mens du opprettholder kroppstemperaturen med en varmepute. Påfør en øyesalve for å forhindre hornhinnetørking.
  4. Under et stereoskop, utfør en sirkulær kraniotomi ca. 2 mm i diameter ved hjelp av en tannbor. For å redusere hjerneskade, bruk tannboret forsiktig med konstant liten bevegelse og lett nedadgående trykk.
  5. Fjern beinfragmenter flere ganger ved hjelp av et sugesystem. Etter å ha fjernet beinfragmentene, bruk en kunstig spinalvæske (ACSF) løsning for å fjerne og vaske eventuelle rusk som er igjen på hjerneoverflaten. Gjenta denne rengjøringsprosedyren flere ganger for å undertrykke inflammatoriske reaksjoner.
    ACSF-oppløsningen (140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 5 mM HEPES, 2,0 mM CaCl 2 og 1,0 mM MgCl2) ble lagret ved 4 °C i 1 måned etter at reagenset var oppløst og filtrert (porestørrelse = 0,22 μm).
  6. Bruk et trykkinjeksjonssystem (se materialfortegnelsen) til å fastsette passende trykk (ca. 10 PSI i pulser med en varighet på 4 ms) for å injisere 500 nL AAV-oppløsning gjennom en glasskapillær med en spissdiameter på 10-20 μm (klargjort med en mikropipettetrekker) i 10 minutter.
  7. Avgjøre om AAV-oppløsningen gis til hjernen ved å kontrollere om nivået av AAV-oppløsningen i glasskapillæren gradvis synker.
  8. La glasskapillæren være på plass i ytterligere 10 minutter for å forhindre tilbakestrømning. Gjenta tre ganger for å administrere totalt 1,5 μl AAV-oppløsning i hjernen.
  9. For å evaluere og manipulere nevral aktivitet i pyramideceller i lag 2/3 (L2/3), injiser en AAV-løsning (for Ca 2+-avbildning: AAV2/1-Syn-jGCaMP8f-WPRE ved 1,28 × 1014 vektorgenomer/ml, fortynnet 1:1 i saltvann; for Ca2+ avbildning med optogenetikk: AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1-WPRE ved 1,73 × 1014 vektorgenomer/ml, fortynnet 1:1 i saltvann) i bakpoteområdet i den primære somatosensoriske cortex hos villtypemus (S1, sentrert ved 0,5 mm bakre og 1,5 mm lateralt fra bregma, 150 μm dybde fra overflaten).
    MERK: AAV-oppløsningen skal injiseres ved 2-3 uker og 1-2 uker før avbildning for henholdsvis jGCaMP8f og GCaMP6m-P2A-ChRmine-uttrykk.
  10. Etter påføring av 2 % (w/v) lavsmeltende agarose på hjerneoverflaten av S1 ved hjelp av en mikropipette, plasser et glassvindu over kraniotomien med to dekkglass. Fest de to dekkglassene (liten diameter på 2,0 mm og stor diameter på 4,5 mm, se materialfortegnelse) med UV-herdbart lim.
  11. Trykk dekselglasset mot agarose mens det fortsatt er flytende; Dette forhindrer dannelsen av luftbobler i agarose. Forsegl kantene på kranialvinduet med tann- og selvklebende harpikssement (figur 1C).
  12. Fjern musen fra det stereotaktiske instrumentet og sett den tilbake i buret. Plasser musen i et varmt bur og ikke gå tilbake til buret med andre dyr før det har fullstendig gjenopprettet fra anestesi. Oppretthold forsiktig sterile forhold under overlevelseskirurgi.
  13. For de første 72 timene etter operasjonen, kontroller musens helsestatus ved å observere generell oppførsel. Hvis det er noen abnormiteter i generell oppførsel, injiserer du subkutant antiinflammatoriske og smertestillende midler.

3. Forberedelse til det holografiske stimulerings- eller belysningssystemet (figur 3)

  1. Kalibrer det holografiske stimuleringssystemet ved å plassere overflaten på et rødt fluorescenslysbilde (støpt akrylsubstrat) i prøveplanet. Sett mikroskopet i live bildemodus med et svakt eksitasjonslys og kjør calibration_GUI.m-filen. Sjekk parameterruten og klikk på Lagre-knappen .
  2. Klikk på Z Skann-knappen i trinn 1-ruten. Det vil automatisk generere tre tilfeldige flekker i alle 21 aksiale plan, 2 μm fra hverandre fra hvert plan.
  3. Flytt glidebryteren og sjekk live-bildet. Finn et perfekt plan der flekkene vises minst og lysest, og klikk deretter på Lagre-knappen . Dette vil automatisk generere en offset sfærisk bølgefront for det digitale hologrammet.
    MERK: Hvis du ikke finner de lyseste fluorescenspunktene, endrer du minimums- og maksimumsverdiene for skanneområdet og prøver på nytt.
  4. Klikk Gå til-knappen i trinn 2-ruten, og klikk deretter seks plasser på venstre firkant. Sjekk live-bildet. Hvis det er seks forskjellige fluorescenspunkter, skriver du inn x- og y-aksen til redigeringsboksene og klikker på Lagre-knappen . Dette vil automatisk generere affine transformasjonskoeffisienter for å koordinere kalibrering mellom det holografiske stimulerings- og bildesystemet.
    MERK: Akseparnummeret og klikket spotnummer må samsvare i rekkefølge. Hvis du ikke er sikker, eller hvis det ikke er noen flekker i bildet, kan du prøve igjen og generere et unikt spotmønster eller velge et mindre område rundt midten av synsfeltet (FOV).
  5. Klikk Skann-knappen i trinn 3-ruten. Det vil generere 441 digitale hologrammer for å utføre enkelt punktskanning over FOV i 21 × 21 trinn.
    1. Sjekk først bildene mens du endrer mønstre i listeboksen. Deretter justerer du lasereffekten for å få spotbilder innenfor bildeenhetens dynamiske område (for eksempel for å unngå altfor mettede bilder).
    2. Deretter justerer du intervalltiden i redigeringsboksen; Intervalltiden bør være mer enn to ganger registreringsintervalltiden. Til slutt setter du bildeenheten i opptaksmodus og klikker på Play-knappen . Hvis avspillingen fullføres, vises "vis OK" -strenger i kommandovinduet. Stopp opptaket og stable opp innspilte sekvensielle bilder ved hjelp av maksimal intensitetsmetode.
  6. Klikk på Generer WM i trinn 4-ruten, og velg et stablet bilde ovenfra. Lukk deretter calibration_GUI vinduet. Det vil automatisk generere et vektkart for å kompensere for den ubalanserte intensiteten på hvert sted.
    MERK: For en mer detaljert beskrivelse, se 2; Matlab-koden kan lastes ned herfra (https://github.com/ZenKG/SLM_control).

4. Ca2+ avbildning ved hjelp av en bildesensor med holografisk belysning (figur 4)

  1. Plasser den AAV-injiserte musen med en hodeplate under mikroskopet (figur 1D).
    MERK: Under denne prosedyren er musen begrenset i våken tilstand, men er i stand til å unnslippe ubehagelige stimuli.
  2. Utfør to-foton avbildning (punktskanningsmodus) ved hjelp av et holografisk mikroskop og en moduslåst Ti: safirlaser innstilt til 920 nm med et 25x mål (se materialfortegnelse).
  3. Slå på den kommersielle bildebehandlingsprogramvaren (se Materialfortegnelse). I live bildemodus justerer du spenningen til bildedetektoren (se Materialfortegnelse) og kraften til bildelaseren for å optimalisere lysstyrken til nevronene som uttrykker jGCaMP8f. Ta bilder av nevronene som uttrykker dette proteinet.
    MERK: Intensiteten til bildelaseren (920 nm) er 20-30 mW. FOV var 512 μm × 512 μm i en dybde på 100-150 μm fra den kortikale overflaten.
  4. For å belyse spesifikke nevroner som uttrykker jGCaMP8f med holografisk belysning, kjør SLMcontrol.m-skriptfilen. Klikk på referansebildet og velg bildet som er anskaffet ovenfor. Klikk deretter på Spot-knappen for å velge bestemte piksler på nevronene i bildet ved å klikke kontinuerlig med museen (figur 4A). Hvis valget er fullført, trykker du på Enter-knappen på tastaturet for å fullføre det.
    MERK: Det digitale hologrammet beregnes automatisk og vises på SLM. Dette mønsteret kan også besøkes på nytt ved å klikke på en liste. Den romlige oppløsningen til et enkelt punkt generert av SLM var omtrent 1,2 μm langs tverrretningen og ~ 8,3 μm langs den optiske aksen. Vi brukte en objektivlinse med høy numerisk blenderåpning (1.1) for å oppnå mer lokalisert holografisk stimulering. Tabell 1 oppsummerer tidligere rapporter og dette systemet med hensyn til romlig oppløsning av holografisk stimulering.
  5. For å oppdage nevral aktivitet med høy temporal oppløsning ved hjelp av en bildesensor (se Materialfortegnelse), still inn eksponeringstid, bildeområde og binning (figur 4B) før du utfører bildeopptak (figur 4C).
    MERK: Intensiteten til den holografiske belysningslaseren (920 nm) som kontinuerlig stimulerer ett nevron, er 2 mW, som er tilstrekkelig til å oppdage nevral aktivitet. For eksempel, for å oppnå en bildefrekvens på 100 Hz for bildebehandling, er eksponeringstiden 9 ms, bildeområdet er 400 μm × 400 μm, og binningen er 4.
  6. Etter eksperimentet, returner musen til hjemmeburet.

5. To-foton avbildning (punktskanningsmodus) med optogenetikk ved hjelp av et holografisk mikroskop (figur 2)

  1. Gjenta trinn 4.1 og 4.2.
  2. Slå på den kommersielle bildebehandlingsprogramvaren (se Materialfortegnelse). I live bildemodus justerer du spenningen til bildedetektoren (se materialfortegnelse) og kraften til bildelaseren for å optimalisere lysstyrken til nevronene som uttrykker GCaMP6m-P2A-ChRmine. Ta bilder av nevronene som uttrykker disse proteinene (figur 1E).
  3. Gjenta trinn 4.4.
  4. For å undersøke funksjonell tilkobling i L2/3-nevroner, bruk en SLM til å generere holografiske mønstre av optogenetisk stimulering (ChRmine; 1,040 nm) og kombinere den med to-foton Ca 2+ avbildning (GCaMP6m; 920 nm, 512 × 512 piksler, 2 Hz eller 30 Hz,2x digital zoom, punktskanningsmodus; Figur 4D-H).
    1. For denne protokollen, sett intensiteten til bildelaseren til 920 nm, ved 10-20 mW, og FOV som 256 μm × 256 μm målt i en dybde på 100-150 μm fra den kortikale overflaten. Sett pikseloppholdstiden til 1,5 μs for 2 Hz eller 100 ns for 30 Hz.
    2. For å se om en enkelt holografisk stimulus forårsaket en kalsiumrespons i nevronene, bruk både 2 Hz og 30 Hz som bildefrekvens. Still inn intensiteten til den holografiske stimuleringslaseren (1040 nm) som stimulerer et enkelt nevron ved 10 mW, som er tilstrekkelig til å indusere nevral aktivitet (figur 4D).
      MERK: Den romlige oppløsningen til et enkelt punkt generert av SLM er omtrent 1,2 μm langs tverrretningen og ~ 8,3 μm langs den optiske aksen. Utvalget av tilgjengelig volum i sideretning er rundt 500 μm × 500 μm og 100 μm i aksial retning. Vi har videre bekreftet med Ca2+ -avbildning ved 2 Hz eller 30 Hz bildebildebildefrekvens at ikke bare ett nevron, men flere nevroner kan stimuleres holografisk samtidig (figur 4E).
  5. Utfør bildeopptak med følgende protokoll: avbilde samtidig Ca2+ -responsen ved 920 nm med 10 holografiske stimuli ved 1,040 nm med 8 s-intervaller (0,125 Hz) i en varighet på 50 ms etter en basisperiode på 10 s. Etter at alle forsøkene er fullført, blir musene avlivet.
    MERK: Ca2+ transienter, hvis de var til stede, ble fremkalt av holografisk stimulering, med topp som vises innen 1 s etter stimulering (figur 4F-H).

6. Bildeanalyse og vurdering av funksjonell tilkobling (figur 4)

  1. Åpne RAW-bildene som ble lagret i trinn 4.5 eller 5.5, ved hjelp av ImageJ. Hvis du vil kompensere for fokalplanforskyvning, bruker du ImageJ-pluginmodulen TurboReg.
    MERK: Hvis korreksjonen med TurboReg ikke er tilstrekkelig, anbefales det å bruke CaImAn (http://github.com/simonsfoundation) for å korrigere fokalplanets forskyvning.
  2. For å vurdere nevral aktivitet, bestem interesseområdene (ROI) i L2/3 ved hjelp av en automatisert algoritme (CaImAn). Oppdage og analysere Ca2+ transienter etter å ha definert baseline fluorescensintensitet (F0) og terskelverdien.
    MERK: F0 er den 35. persentilverdien av fluorescensintensitet oppnådd i løpet av baseline imaging perioden. Ca2+ transienter er betegnet med ΔF / F 0 (Δ F = F-F0), hvorF er det øyeblikkelige fluorescenssignalet. Hvis Δ F-verdien er over 2 S.D. fra F0, evaluerer vi en signifikant Ca2+ transient.
  3. For å definere funksjonell tilkobling i L2/3-nevroner, stimulere målnevroner og måle GCaMP6m-responser i stimulerte og omkringliggende nevroner, tilsvarende (figur 4F-H).

Representative Results

Representative opptak oppnådd ved hjelp av metoden beskrevet her presenteres. In vivo Ca2+ avbildning med holografisk mikroskopi krever 2-4 uker å fullføre fra hodeplateimplantasjon og AAV-injeksjon til datainnsamling. Derfor, for å oppnå stabile resultater, er det viktig å redusere bevegelsesartefakter i hjernen. Implantasjonen av hodeplaten (trinn 1.5) og plasseringen av kranialvinduet (trinn 2.9) er svært viktige trinn i denne prosessen. Videre er det også viktig å velge en AAV (AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1) som samtidig uttrykker kalsiumindikator og opsin i et enkelt nevron (trinn 2.8).

Figur 4A viser et sted for holografisk belysning av et ervervet nevronbilde ved hjelp av et skreddersydd MATLAB-skript. Hvis holografisk belysning vellykket belyste nevronene som uttrykker jGCaMP8f, kunne Ca2+ spor oppnås med en bildesensor (figur 4B), som vist i figur 4C.

Funksjonell tilkobling mellom nevroner ble evaluert ved hjelp av holografisk stimulering (figur 4D), som vist i figur 4E. Fordi funksjonell tilkobling mellom nevroner er en av nevrale kretsegenskaper som endres i patogenesen til en smertemodellmus24, beskriver vi en enkel prosedyre for å evaluere den. Figur 4F viser et typisk bilde av L2/3-nevroner i S1HL visualisert ved hjelp av GCaMP6m. Når en nevron (oransje sirkel) ble holografisk stimulert, var et annet nevron (rød sirkel) samtidig aktiv; Dermed var antall funksjonelle forbindelser mellom nevroner en (figur 4G).

Figure 1
Figur 1: Skjematisk oversikt over eksperimentell prosedyre . (A) Fiksering av hodeplaten til skallen. (B) Stereotaktisk injeksjon av AAV i bakpoteområdet i primær somatosensorisk cortex (S1HL). (C) Implantasjon av kranialvinduet. For å vurdere og manipulere nevral aktivitet, utføres in vivo Ca2+ avbildning i våkne mus (D) med holografisk stimulering (E). Blitsmerker indikerer holografisk stimulering eller belysning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: System brukt til holografisk mikroskop. (A) Bilder av holografisk stimulering og belysning lysbaner (venstre) nær mikroskopet (midten) med en bildesensor (høyre). (B) Dette er forstørrede bilder av holografisk stimulering og belysning lysbaner rundt respektive SLM (venstre og høyre) og et punkt skanning lysbane rundt et skannehode (midt og høyre). (C) Et skjema over stimulering og avbildning optiske baner. Fasebaserte SLM-er brukes til å vise digitale hologrammer, og en stråleekspander (en kombinasjon av L1 og L2) og et 4f-relésystem (en kombinasjon av L3 og L4 for holografisk stimulering og L4 og L5 for holografisk belysning) plasseres før og etter respektive SLM-er for å sikre at hvert digitale hologram avbildes ved utgangspupillen til en objektivlinse for nedsenking i vann, med litt underfylt bildestørrelse. For å undertrykke gjenværende nullordenskomponenter, plasseres en stråleblokk i mellomplanet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Flytskjema for kalibrering av holografisk stimulerings- eller belysningssystem. Dette flytskjemaet beskriver trinnene for å kalibrere et holografisk stimulerings- eller belysningssystem til prøveområdet og avbildningssystemet. Gå til trinn 3, forberedelse til holografisk stimulering eller belysningssystem, for detaljerte instruksjoner og last ned et eksempelprogram. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representative resultater av avbildning og funksjonell tilkobling ved hjelp av et holografisk mikroskop . (A) For å belyse spesifikke nevroner som uttrykker jGCaMP8f eller GCaMP6m-P2A-ChRmine, blir bildet av nevroner fanget, og deretter dannes et sted på nevronet ved hjelp av et skreddersydd MATLAB-skript. (B) Innstillingen av bildesensoren (eksponeringstid, bildeområde og binning). (C) Representativt bilde og spor av nevroner som uttrykker jGCaMP8f i 100 Hz avbildning med holografisk belysning og en bildesensor. (D) Denne grafen viser den nevrale responsen på holografisk stimulering (1,040 nm) ved hver laserkraft (data fra GCaMP6m-P2A-ChRmine som uttrykker nevroner ved 2 Hz bildebildebildefrekvens [n = 16]). Feilfelt angir standardfeilen til gjennomsnittet. (E) Representative Ca2+ spor under holografisk stimulering (blå vertikale linjer) av 10 forskjellige nevroner ved 2 Hz (venstre) og 30 Hz (høyre) bildefrekvens. I 2 Hz og 30 Hz Ca2+ spor indikerer samme farge det samme nevronet. (F) Skjematisk diagram som evaluerer funksjonelle forbindelser mellom nevroner. Når den oransje nevronen stimuleres, reagerer de røde nevronene samtidig, noe som indikerer at det er funksjonell forbindelse mellom disse nevronene. (G) Et typisk bilde av S1HL-nevroner som uttrykker GCaMP6m i WT. Skalastang = 10 μm. (H) Typiske Ca2+ -spor under holografisk stimulering (blå vertikale linjer) ved 2 Hz (øvre) og 30 Hz (lavere) bildefrekvens. Det stimulerte nevronet er sirklet i oransje, responderende nevroner er sirklet i rødt, og ikke-responderende nevroner er sirklet i grått. Nevral respons på holografisk stimulering kan detekteres ved både 2 Hz og 30 Hz bildehastigheter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Vårt oppsett 6  Prakash, R. et al. 25  Marshel, JH et al. 12 Robinson, N. T. M. et al. 14
Lateral oppløsning 1,2 μm 1,27 μm ― 2,22 μm
Aksial oppløsning 8,3 μm 56,86 μm 15,5 μm 10,26 μm
Objektiv linse / numerisk blenderåpning 25 x / 1,1 20 x / 0,5 16 x / 0,8 16 x / 0,8

Tabell 1: Sammendrag av tidligere rapporter og dette systemet for romlig oppløsning av holografisk stimulering. Lateral oppløsning, aksial oppløsning og objektivlinsen som ble brukt under målingen er beskrevet.

Discussion

For å forstå hjernens funksjon, er det nødvendig å nøyaktig vurdere nevrale kretsløp som ligger til grunn for hjernefunksjonen ved å trekke ut dynamikken i nevral aktivitet. Videre er det viktig å identifisere hvordan denne nevrale kretsen endres for å belyse patogenesen av nevropsykiatriske lidelser. Faktisk er det kjent at nevral aktivitet er forhøyet i musemodeller av Alzheimers sykdom4 og fragilt X-syndrom26 og mus med nedsatt hvit materiefunksjon3. Videre, i en musemodell av inflammatorisk smerte, er økt synkronisering av nevral aktivitet og funksjonell tilkobling mellom nevroner forbundet med symptomer24. To-foton holografisk mikroskopi tillater oss samtidig å observere aktiviteten til individuelle nevroner og de funksjonelle forbindelsene mellom nevroner, noe som er nødvendig for å forstå nevrale kretser. Vi brukte en 25x objektivlinse med numerisk blenderåpning = 1,1 med bølgelengder på 1,040 nm. Den teoretiske punktspredningsfunksjonen er en gaussisk fordeling med full bredde ved maksimalt 0,5 μm lateralt og 1,7 μm aksialt. Den faktiske numeriske blenderåpningen er imidlertid mindre enn 1,1, og den målte punktstørrelsen på en fluorescensperle er 1,2 μm lateralt og 8,3 μm aksialt. Gitt at nevrondiameteren er ca. 15 μm og kalibreringsfeilen er innenfor 3 μm, er målrettingen generelt god. Celler i aksial retning kan imidlertid påvirkes av den lengre punktstørrelsen6. Her beskrev vi virusinjeksjon, kirurgi, kalibrering av holografiske stimulerings- eller belysningssystemer og bildeprotokoller for evaluering og manipulering av nevral aktivitet hos levende mus ved hjelp av vårt mikroskopisystem.

Det tar 2-4 uker å fullføre alle eksperimentelle prosedyrer, fra hodeplateimplantasjon og virusinjeksjon til datainnsamling for in vivo Ca2+ avbildning ved hjelp av holografisk mikroskopi. Prosessen er kompleks og arbeidskrevende, og eksperimentets endelige suksess avhenger av flere faktorer, inkludert tilstanden til kranialvinduet, som påvirkes av postoperativ betennelse, riktig valg av Ca2+ indikator og opsin, og om bevegelsesartefakter i de oppkjøpte bildene kan korrigeres. Spesielt to trinn er viktige for et vellykket resultat. Den første gjelder hodeplatefiksering og kirurgi; Det er avgjørende at hodeplaten festes godt til musehodet med tannsement. Videre er det viktig å gjentatte ganger rengjøre beinfragmenter og koagulert blod ved hjelp av kald ACSF under operasjonen. Siden overholdelse av denne prosedyren reduserer betennelse, observerte vi vellykket dynamikken til mikroglia, cellene som er ansvarlige for hjernens immunsystem, uten å aktivere sine prosesser og spines eller mikrostrukturer av nevroner27,28. Det andre problemet er evaluering og manipulering av nevral aktivitet. Vi valgte AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1 for å uttrykke Ca2+-indikatoren og opsin i ett nevron samtidig. Dette fordi det er vanskelig å infisere ett nevron med ulike AAV-typer på en effektiv måte. En annen grunn til dette valget var at ChRmine effektivt kan aktivere nevral aktivitet ved 1,040 nm ved hjelp av en to-foton laser12. Nylig har det blitt rapportert at ChRmine, ved å mutere sin struktur basert på strukturell informasjon oppnådd ved kryo-elektronmikroskopi, forbedrer sin funksjon29, som anses som nyttig for målfunksjonsanalyse innen nevrovitenskap. I lys av disse problemene er det nødvendig å dele effektive metoder for å evaluere og manipulere nevroner når du leser nevral aktivitet og skriver informasjon ved hjelp av holografisk mikroskopi.

Nylige fremskritt innen bildebehandling og optogenetikk har avslørt den detaljerte nevrale aktiviteten som er involvert i hjernefunksjoner som læring og minne, og det er mulig å kunstig manipulere denne nevrale aktiviteten for å uttrykke hjernefunksjoner30. Imidlertid er konvensjonelle metoder for manipulering av nevral aktivitet svært invasive på grunn av innsetting av optiske fibre i hjernen og fordi en gruppe opsinuttrykkende celler samtidig stimuleres, noe som gjør det umulig å manipulere nevral aktivitet med tidsmessig og romlig presisjon. Vår metode kan manipulere nevral aktivitet ved å stimulere bare spesifikke nevroner i hjernen, og dermed muliggjøre manipulering av nevral aktivitet med spesifikke stimuleringsmønstre og høy spatiotemporal oppløsning. Videre er det viktig å merke seg at funksjonell tilkobling mellom nevroner bare kan evalueres i et lite antall nevroner ved hjelp av hjerneskiveeksperimenter31; Imidlertid tillater denne teknikken samtidig evaluering av flere nevroner i levende dyr.

En av de største begrensningene i dagens holografiske mikroskoper er behovet for å fikse musehodet, noe som begrenser musens oppførsel. Nylig ble det utviklet et miniatyrisert to-foton mikroskop32, og med den videre miniatyriseringen av enheten kan in vivo Ca2+ avbildning med holografisk stimulering være mulig i frittbevegelige mus. I tillegg kan potensialet til dette mikroskopet utvides ved å forbedre den tidsmessige oppløsningen av bildebehandling og kombinere den med svært følsomme spenningsfølsomme fluorescerende proteiner33.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Grants-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (19H04753, 19H05219 og 25110732 til HW), Grants-in-Aid for Transformative Research Areas (A) (20H05899 til HW, 20H05886 til O. M., og 21H05587 til D. K.), Fostering Joint International Research (B) (20KK0170 til H. W.), Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (18H02598 til HW), Grant-in-Aid for Scientific Research (A) (21H04663 til O. M.), Grant-in-aid for forskere tidlig i karrieren (20K15193 til X. Q.), JST CREST Grant Number JPMJCR1755, Japan, og JST A-STEP Grant Number JPMJTR204C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
25x Objective Nikon N25X-APO-MP Objective
A1MP Nikon A1MP Microscope
AnesII Bio machinery AnesII Anesthesia delivery system
C2 plus Nikon C2 plus Microscope
DECADRON Phosphate Injection Aspen 21N024 Avoid cerebral edema
Dental Drill Jota C1.HP.005 Dental drill
Electric Microinjector NARISHIGE IM-31 Pressure injection system
FEATHERS FEARGER FA-10 Shaving
G-CEM ONE ADHESIVE ENHANCING PRIMER GC 2110271 Resin cement primer for dental adhesion
G-CEM ONE neo GC 43093 Resin cement for dental adhesion
Glass Capillary with Filament NARISHIGE GDC-1 Glass capillary
Image Detector Hamamatsu H10770PA-40 GaAsP photocathode photomultiplier tube
Imaging Software Nikon NISelements Imaging software
Isoflurane Inhalation Solution Pfizer 229KAR Anesthetics
iXon EMCCD Camera Andor iXon Life 888 Image sensor
Ketamine daiitisannkyou s9-018506 Anesthetics
Leica-M60 Leica M60 Stereoscope
Linicon Linicon LV-125 Vacuum pump
Mode-locked Ti:sapphire Chameleon Ultra II laser  Coherent Chameleon Discovery NX Femtosecond laser
Mos-Cure U-VIX mini 365 Portable LED UV Light Source
PEN Bright SHOFU INC. PEN Bright Dental light curing unit
Puller SUTTER instaument P-97 Puller
Stereotaxic Instrument (for Mice) NARISHIGE SR-6M-H Stereotaxic instrument
Stereotaxic Micromanipulator NARISHIGE SM-15R Stereotaxic micromanipulator
Super-Bond CATALYST V SUN MEDICAL 8070 Dental adhesive resin cement
Super-Bond Dental Adhesive Monomer SUN MEDICAL 8071 Dental adhesive monomer
Super-Bond Teeth Color Polymer Powder SUN MEDICAL 145052000 Teeth color polymer powder
Tarivid Ophthalmic Ointment 0.3% Santen Pharmaceutical  TRN3952 Eye ointment
UlTIMATE XL NSK Y141446 Dental laboratory micromotor control unit
UV Curing Optical Adhesives THORLABS NOA61 UV Curing Optical Adhesives
Xylazine Bayer KP0F2BK Anesthetics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Masamizu, Y., et al. Two distinct layer-specific dynamics of cortical ensembles during learning of a motor task. Nature Neuroscience. 17 (7), 987-994 (2014).
  2. Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
  3. Kato, D., et al. Motor learning requires myelination to reduce asynchrony and spontaneity in neural activity. Glia. 68 (1), 193-210 (2020).
  4. Busche, M. A., et al. Tau impairs neural circuits, dominating amyloid-β effects, in Alzheimer models in vivo. Nature Neuroscience. 22 (1), 57-64 (2019).
  5. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  6. Quan, X., Kato, D., Daria, V., Matoba, O., Wake, H. Holographic microscope and its biological application. Neuroscience Research. 179, 57-64 (2022).
  7. Adesnik, H., Abdeladim, L. Probing neural codes with two-photon holographic optogenetics. Nature Neuroscience. 24 (10), 1356-1366 (2021).
  8. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  9. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  10. Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).
  11. Carrillo-Reid, L., Han, S., Yang, W., Akrouh, A., Yuste, R. Controlling visually guided behavior by holographic recalling of cortical ensembles. Cell. 178 (2), 447-457 (2019).
  12. Marshel, J. H., et al. Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception. Science. 365 (6453), (2019).
  13. Gill, J. V., et al. Precise holographic manipulation of olfactory circuits reveals coding features determining perceptual detection. Neuron. 108 (2), 382-393 (2020).
  14. Robinson, N. T. M., et al. Targeted activation of hippocampal place cells drives memory-guided spatial behavior. Cell. 183 (6), 1586-1599 (2020).
  15. Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Häusser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).
  16. Mardinly, A. R., et al. Precise multimodal optical control of neural ensemble activity. Nature Neuroscience. 21 (6), 881-893 (2018).
  17. Yang, W., Carrillo-Reid, L., Bando, Y., Peterka, D. S., Yuste, R. Simultaneous two-photon imaging and two-photon optogenetics of cortical circuits in three dimensions. Elife. 7, 32671 (2018).
  18. Forli, A., et al. Two-photon bidirectional control and imaging of neuronal excitability with high spatial resolution in vivo. Cell Reports. 22 (11), 3087-3098 (2018).
  19. Pégard, N. C., et al. Three-dimensional scanless holographic optogenetics with temporal focusing (3D-SHOT). Nature Communications. 8 (1), 1228 (2017).
  20. Dal Maschio, M., Donovan, J. C., Helmbrecht, T. O., Baier, H. Linking neurons to network function and behavior by two-photon holographic optogenetics and volumetric imaging. Neuron. 94 (4), 774-789 (2017).
  21. Russell, L. E., et al. All-optical interrogation of neural circuits in behaving mice. Nature Protocols. 17 (7), 1579-1620 (2022).
  22. Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. Two-photon optogenetics. Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).
  23. Hernandez, O., et al. Three-dimensional spatiotemporal focusing of holographic patterns. Nature Communications. 7, 11928 (2016).
  24. Okada, T., et al. Pain induces stable, active microcircuits in the somatosensory cortex that provide a therapeutic target. Science Advances. 7 (12), 8261 (2021).
  25. Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).
  26. Gonçalves, J. T., Anstey, J. E., Golshani, P., Portera-Cailliau, C. Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice. Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).
  27. Akiyoshi, R., et al. Microglia enhance synapse activity to promote local network synchronization. eNeuro. 5 (5), (2018).
  28. Haruwaka, K., et al. Dual microglia effects on blood brain barrier permeability induced by systemic inflammation. Nature Communications. 10 (1), 5816 (2019).
  29. Kishi, K. E., et al. Structural basis for channel conduction in the pump-like channelrhodopsin ChRmine. Cell. 185 (4), 672-689 (2022).
  30. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  31. Ko, H., et al. The emergence of functional microcircuits in visual cortex. Nature. 496 (7443), 96-100 (2013).
  32. Zong, W., et al. Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice. Cell. 185 (7), 1240-1256 (2022).
  33. Villette, V., et al. ultrafast two-photon imaging of a high-gain voltage indicator in awake behaving mice. Cell. 179 (7), 1590-1608 (2019).

Tags

Tilbaketrekking utgave 187
Evaluering og manipulering av nevral aktivitet ved bruk av to-foton holografisk mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kato, D., Quan, X., Tanisumi, Y.,… More

Kato, D., Quan, X., Tanisumi, Y., Guo, Z., Morita, M., Takiguchi, T., Matoba, O., Wake, H. Evaluation and Manipulation of Neural Activity Using Two-Photon Holographic Microscopy. J. Vis. Exp. (187), e64205, doi:10.3791/64205 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter