Explorer les mutations des caspases et la modification post-traductionnelle par des approches de modélisation moléculaire
Summary
Le présent protocole utilise un ensemble de simulation biomoléculaire et décrit l’approche de dynamique moléculaire (DM) pour modéliser la caspase de type sauvage et ses formes mutantes. La méthode MD permet d’évaluer l’évolution dynamique de la structure des caspases et l’effet potentiel de mutations ou de modifications post-traductionnelles.
Abstract
L’apoptose est un type de mort cellulaire programmée qui élimine les cellules endommagées et contrôle le développement et l’homéostasie tissulaire des organismes multicellulaires. Les caspases, une famille de cystéines protéases, jouent un rôle clé dans l’initiation et l’exécution de l’apoptose. La maturation des caspases et leur activité sont affinées par des modifications post-traductionnelles de manière très dynamique. Pour évaluer l’effet des changements post-traductionnels, les sites potentiels sont systématiquement mutés avec des résidus persistants à toute modification. Par exemple, le résidu de sérine est remplacé par de l’alanine ou de l’acide aspartique. Cependant, de telles substitutions pourraient altérer la conformation du site actif de la caspase, entraînant des perturbations de l’activité catalytique et des fonctions cellulaires. De plus, des mutations d’autres résidus d’acides aminés situés dans des positions critiques pourraient également briser la structure et les fonctions des caspases et entraîner une perturbation de l’apoptose. Pour éviter les difficultés liées à l’utilisation de résidus mutés, des approches de modélisation moléculaire peuvent être facilement appliquées pour estimer l’effet potentiel des substitutions d’acides aminés sur la structure des caspases. Le protocole actuel permet la modélisation de la caspase de type sauvage et de ses formes mutantes avec le progiciel de simulation biomoléculaire (Amber) et des installations de superordinateur pour tester l’effet des mutations sur la structure et la fonction des protéines.
Introduction
L’apoptose est l’un des processus cellulaires les plus étudiés qui régulent la morphogenèse et l’homéostasie tissulaire des organismes multicellulaires. L’apoptose peut être initiée par un large éventail de stimuli externes ou internes, tels que l’activation des récepteurs de mort, la perturbation des signaux du cycle cellulaire, les dommages à l’ADN, le stress du réticulum endoplasmique (RE) et diverses infections bactériennes et virales1. Les caspases – acteurs clés de l’apoptose – sont classiquement classées en deux groupes: les initiateurs (caspase-2, caspase-8, caspase-9 et caspase-10) et les effecteurs (caspase-3, caspase-6 et caspase-7), en fonction de leur structure de domaine et de la place dans la cascade des caspases 2,3. Lors des signaux de mort cellulaire, les caspases initiatrices interagissent avec les molécules adaptatrices qui facilitent la dimérisation induite par la proximité et l’autotraitement pour former une enzyme active. Les caspases effectrices sont activées par clivage par les caspases initiatrices et effectuent des étapes d’exécution en aval en clivant plusieurs substrats cellulaires4.
La maturation et la fonction des caspases initiatrices et effectrices sont régulées par un grand nombre de mécanismes intracellulaires différents, parmi lesquels la modification post-traductionnelle joue un rôle indispensable dans la modulation de la mort cellulaire5. L’ajout de groupes modificateurs (phosphorylation, nitrosylation, méthylation ou acétylation) ou de protéines (ubiquitination ou SUMOylation) modifie l’activité enzymatique des caspases ou la conformation et la stabilité des protéines qui régulent l’apoptose. La mutagénèse dirigée est largement appliquée pour étudier les sites potentiels de modification post-traductionnelle et discerner leur rôle. Un site de modification putatif est généralement remplacé par un autre acide aminé, qui ne peut plus être modifié. Ainsi, la sérine et la thréonine potentiellement phosphorylées sont mutées en alanine, et les sites d’ubiquitination de la lysine sont remplacés par de l’arginine. Une autre stratégie consiste à substituer un acide aminé qui imite particulièrement la modification post-traductionnelle (p. ex., le glutamate et l’aspartate ont été utilisés pour imiter la sérine phosphorylée ou la thréonine)6. Cependant, certaines de ces substitutions situées à proximité élevée d’un site actif ou dans des positions critiques pourraient modifier la structure des caspases, perturber l’activité catalytique et supprimer la mort cellulaire apoptotique7. Des effets similaires ont pu être observés dans les cas de mutations faux-sens associées à la tumeur dans les gènes de la caspase. Par exemple, la mutation tumorale de la caspase-6 – R259H – a entraîné des modifications conformationnelles des boucles dans la poche de liaison au substrat, réduisant le renouvellement catalytique efficace des substrats8. La substitution d’acides aminés G325A dans la caspase-8 identifiée dans le carcinome épidermoïde de la tête et du cou pourrait entraver l’activité de la caspase-8, ce qui a conduit à la modulation de la signalisation du facteur nucléaire kB (NF-kB) et a favorisé la tumorigenèse9.
Pour évaluer l’effet potentiel des substitutions d’acides aminés sur la structure et la fonction des caspases, la modélisation moléculaire peut être appliquée. L’approche de la dynamique moléculaire (DM) est décrite dans ce travail pour modéliser la caspase de type sauvage et ses formes mutantes à l’aide du package de simulation biomoléculaire (Amber). La méthode MD donne une vue de l’évolution dynamique de la structure protéique suite à l’introduction de mutations. Développé à l’origine par le groupe de Peter Kollman, le package Amber est devenu l’un des outils logiciels les plus populaires pour les simulations biomoléculaires10,11,12,13. Ce logiciel est divisé en deux parties: (1) AmberTools, un ensemble de programmes couramment utilisés pour la préparation du système (affectation du type d’atome, ajout d’hydrogènes et de molécules d’eau explicites, etc.) et l’analyse de trajectoire; et (2) Amber, qui est centré sur le programme de simulation pmemd. AmberTools est un package gratuit (et une condition préalable à l’installation d’Amber lui-même), tandis qu’Amber est distribué avec une licence et une structure de frais distinctes. Des simulations parallèles sur un supercalculateur et/ou à l’aide d’unités de traitement graphique (GPU) peuvent améliorer considérablement les performances de la recherche scientifique sur la dynamique de la structure des protéines14. Les dernières versions logicielles disponibles sont AmberTools21 et Amber20, mais les protocoles décrits peuvent également être utilisés avec les versions précédentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’approche DM décrite permet de modéliser à la fois les formes sauvages et mutantes de la caspase à l’aide des progiciels de simulation biomoléculaire. Plusieurs questions importantes de la méthodologie sont abordées ici. Tout d’abord, une structure cristalline représentative de la caspase doit être sélectionnée à partir de la banque de données sur les protéines. Il est important de noter que les formes monomères et dimériques de la caspase sont acceptables. Choisir des structures à haute résoluti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation russe de la science (17-75-20102, l’élaboration du protocole). Les expériences décrites dans la section des résultats représentatifs (analyse de la phosphorylation) ont été soutenues par les sociétés de lutte contre le cancer de Stockholm (181301) et suédoise (190345).
Materials
| Amber20 | University of California, San Francisco | Software for molecular dynamics simulation http://ambermd.org |
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| AmberTools21 | University of California, San Francisco | Software for molecular modeling and analysis http://ambermd.org |
References
- Olsson, M., Zhivotovsky, B. Caspases and cancer. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1441-1449 (2011).
- Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. Caspase: Pharmacological manipulation of cell death. Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2665-2672 (2005).
- Degterev, A., Boyce, M., Yuan, J. A decade of caspases. Oncogene. 22 (53), 8543-8567 (2003).
- Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: Activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).
- Zamaraev, A. V., Kopeina, G. S., Prokhorova, E. A., Zhivotovsky, B., Lavrik, I. N. Post-translational modification of caspases: The other side of apoptosis regulation. Trends in Cell Biology. 27 (5), 322-339 (2017).
- Pearlman, S. M., Serber, Z., Ferrell, J. E. A mechanism for the evolution of phosphorylation sites. Cell. 147 (4), 934-946 (2011).
- Zamaraev, A. V., et al. Requirement for Serine-384 in Caspase-2 processing and activity. Cell Death and Disease. 11 (10), 825 (2020).
- Dagbay, K. B., Hill, M. E., Barrett, E., Hardy, J. A. Tumor-associated mutations in caspase-6 negatively impact catalytic efficiency. Biochemistry. 56 (34), 4568-4577 (2017).
- Ando, M., et al. Cancer-associated missense mutations of caspase-8 activate nuclear factor-κB signaling. Cancer Science. 104 (8), 1002-1008 (2013).
- Case, D. A., et al. . AMBER 2020. , (2020).
- Salomon-Ferrer, R., Case, D. A., Walker, R. C. An overview of the Amber biomolecular simulation package. WIREs Computational Molecular Science. 3 (2), 198-210 (2013).
- Roe, D. R., Cheatham, T. E. PTRAJ and CPPTRAJ: Software for processing and analysis of molecular dynamics trajectory data. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (7), 3084-3095 (2013).
- Maier, J. A., et al. ff14SB: Improving the accuracy of protein side chain and backbone parameters from ff99SB. Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (8), 3696-3713 (2015).
- Salomon-Ferrer, R., Götz, A. W., Poole, D., Le Grand, S., Walker, R. C. Routine microsecond molecular dynamics simulations with AMBER on GPUs. 2. Explicit solvent particle mesh ewald. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (9), 3878-3888 (2013).
- Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
- Burley, S. K., et al. RCSB Protein Data Bank: Powerful new tools for exploring 3D structures of biological macromolecules for basic and applied research and education in fundamental biology, biomedicine, biotechnology, bioengineering and energy sciences. Nucleic Acids Research. 49, 437-451 (2021).
- Martinez, X., et al. Molecular graphics: Bridging structural biologists and computer scientists. Structure. 27 (11), 1617-1623 (2019).
- Lee, T. S., et al. GPU-accelerated molecular dynamics and free energy methods in Amber18: Performance enhancements and new features. Journal of Chemical Information and Modeling. 58 (10), 2043-2050 (2018).
- Jäger, R., Zwacka, R. M. The enigmatic roles of caspases in tumor development. Cancers. 2 (4), 1952-1979 (2010).
