Summary
本プロトコルは、生体分子シミュレーションパッケージを使用し、野生型カスパーゼおよびその変異形態をモデル化するための分子動力学(MD)アプローチを記載する。MD法は、カスパーゼ構造の動的進化および突然変異または翻訳後修飾の潜在的な影響を評価することを可能にする。
Abstract
アポトーシスは、損傷した細胞を排除し、多細胞生物の発生と組織の恒常性を制御するプログラムされた細胞死の一種です。システインプロテアーゼのファミリーであるカスパーゼは、アポトーシスの開始と実行において重要な役割を果たします。カスパーゼの成熟とその活性は、非常に動的な方法で翻訳後修飾によって微調整されます。翻訳後変化の影響を評価するために、潜在的な部位は、修飾に永続的な残基で日常的に変異されます。例えば、セリン残基はアラニンまたはアスパラギン酸で置換される。しかし、そのような置換はカスパーゼ活性部位の立体構造を変化させ、触媒活性および細胞機能の障害をもたらす可能性がある。さらに、重要な位置に位置する他のアミノ酸残基の突然変異もカスパーゼの構造と機能を破壊し、アポトーシス摂動を引き起こす可能性があります。変異残基を採用することの難しさを回避するために、分子モデリングアプローチを容易に適用して、カスパーゼ構造に対するアミノ酸置換の潜在的な影響を推定することができます。本プロトコルは、生物分子シミュレーションパッケージ(Amber)とスーパーコンピューター機能を使用して野生型カスパーゼとその変異型の両方をモデル化し、タンパク質の構造と機能に対する突然変異の影響をテストすることを可能にします。
Introduction
アポトーシスは、多細胞生物の形態形成と組織恒常性を調節する最も広く研究されている細胞プロセスの1つです。アポトーシスは、死受容体の活性化、細胞周期シグナルの乱れ、DNA損傷、小胞体(ER)ストレス、さまざまな細菌およびウイルス感染など、広範囲の外部または内部刺激によって開始される可能性があります1。カスパーゼ(主要なアポトーシスプレーヤー)は、ドメイン構造とカスパーゼカスケード2,3の場所に応じて、従来、イニシエーター(カスパーゼ-2、カスパーゼ-8、カスパーゼ-9、およびカスパーゼ-10)とエフェクター(カスパーゼ-3、カスパーゼ-6、およびカスパーゼ-7)の2つのグループに分類されます。細胞死シグナルにより、開始剤カスパーゼはアダプター分子と相互作用し、近接誘導二量体化および自動処理を促進して活性酵素を形成します。エフェクターカスパーゼは、開始剤カスパーゼによる切断を介して活性化され、複数の細胞基質4を切断することによって下流の実行ステップを実行する。
開始剤およびエフェクターカスパーゼの成熟および機能は、多数の異なる細胞内メカニズムによって調節されており、その中で翻訳後修飾は細胞死調節に不可欠な役割を果たす5。修飾基(リン酸化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化)またはタンパク質(ユビキチン化またはSUMO化)の付加は、カスパーゼの酵素活性またはアポトーシスを調節するタンパク質の立体構造および安定性を変化させます。部位特異的突然変異誘発は、潜在的な翻訳後修飾部位を調査し、それらの役割を識別するために広く適用されています。推定修飾部位は通常、別のアミノ酸に置き換えられますが、これはさらに修飾することはできません。したがって、潜在的にリン酸化されたセリンおよびスレオニンはアラニンに変異し、リジンユビキチン化部位はアルギニンに置換される。別の戦略は、特に翻訳後修飾を模倣するアミノ酸を置換することを含む(例えば、リン酸化セリンまたはスレオニンを模倣するために使用されているグルタミン酸およびアスパラギン酸)6。しかし、活性部位の高い近傍または臨界位置に位置するこれらの置換のいくつかは、カスパーゼ構造を変化させ、触媒活性を乱し、アポトーシス細胞死を抑制する可能性があります7。同様の効果は、カスパーゼ遺伝子における腫瘍関連ミスセンス変異の場合にも観察され得る。例えば、カスパーゼ−6−R259H−の腫瘍関連変異は、基質結合ポケット内のループの立体構造変化をもたらし、基質8の効率的な触媒代謝回転を減少させた。頭頸部扁平上皮癌で同定されたカスパーゼ-8のG325Aアミノ酸置換は、カスパーゼ-8活性を阻害し、核因子-kB(NF-kB)シグナル伝達の調節につながり、腫瘍形成を促進しました9。
カスパーゼの構造と機能に対するアミノ酸置換の潜在的な影響を評価するために、分子モデリングを適用することができます。分子動力学(MD)アプローチは、生体分子シミュレーションパッケージ(Amber)を使用して野生型カスパーゼとその変異型をモデル化するためのこの研究で説明されています。MD法は、突然変異の導入後のタンパク質構造の動的進化のビューを提供します。もともとPeter Kollmanのグループによって開発されたAmberパッケージは、生体分子シミュレーション用の最も人気のあるソフトウェアツールの1つになりました10,11,12,13。このソフトウェアは2つの部分に分かれています:(1)AmberTools、システムの準備(原子タイプの割り当て、水素と明示的な水分子の追加など)と軌道分析に日常的に使用されるプログラムのコレクション。(2)pmemdシミュレーションプログラムを中心とするアンバー。AmberTools は無料のパッケージ (および Amber 自体をインストールするための前提条件) ですが、Amber は別のライセンスと料金体系で配布されます。スーパーコンピュータ上での並列シミュレーションやグラフィックスプロセッシングユニット(GPU)の使用により、タンパク質構造ダイナミクスの科学的研究のパフォーマンスを大幅に向上させることができます14。利用可能な最新のソフトウェアバージョンはAmberTools21とAmber20ですが、説明されているプロトコルは以前のバージョンでも使用できます。
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Protocol
1. システムの準備
注:天然および変異タンパク質形態の分子モデルは、タンパク質データバンク15,16から得られた適切な結晶構造に基づいて構築されています。
- 選択したPDB構造を取得するには、[ ファイルのダウンロード ]ドロップダウンリストを使用して、[ PDB形式]をクリックします。注釈と接続データを削除し、PDB ファイル内の個別のタンパク質鎖の間に TER カードを挿入します。必要に応じて、残基名HISをHIE、HID、またはHIP(補足ファイル1)に置き換えて、ヒスチジン残基のプロトン化状態を設定します。
注 : 結晶学的に分解された水分子 (PDB ファイルに存在する場合) を除去しないのが妥当です。 - 開始モデルを準備するには、tleap プログラム (AmberTools パッケージ) を起動し、 tleap オブジェクトを操作するコマンドを入力します。
- プログラムを起動します: tleap。分子力学でタンパク質を記述するためにff14SB力場をロードします: ソースleaprc.protein.ff14SB>。
- 水分子と原子イオン(Na+、Cl-)の荷重力場:>源leaprc.water.tip3p。
- PDB ファイルをロードし、水素の座標を構築して、mol: > mol = loadpdb protein.pdb という名前のオブジェクトを作成します。
- 問題を引き起こす可能性のある内部の不整合を確認します。 > mol.
注: ジスルフィド ブリッジが存在する場合は、手動で指定する必要があります。共有結合したシステインCYSの名前をCYXに置き換え、 tleap で次のコマンドを入力して、SG原子間に結合を作成します: 結合 mol.X.SG mol.Y.SG (XとYはシステイン残基数です)。 - タンパク質の周囲に溶媒ボックスを作成します(TIP3P水、12 Å距離): >溶媒和ボックスモルTIP3PBOX 12.0。
- 総電荷を確認します: >モルを充電し、対イオン(Na + またはCl-)を追加してシステムを中和します。
> 添加モルNa+ 0。 - トポロジ prmtop ファイルと座標 inpcrd ファイル (シミュレーションを実行するための入力) を作成します。 > saveamberparm mol protein.prmtop protein.inpcrd.tleap プログラムを終了する: >終了します。
注:アンバー形式の座標ファイルは、 ambpdb ツールを使用してPDB形式に簡単に変換できます(ユーザーズマニュアル、 材料表を参照)。
2. エネルギー最小化
注意: エネルギー最小化は、MDの実行時に不安定になる始動システム内の原子間の悪い接触やオーバーラップを取り除くために必要です。
- エネルギー最小化の第1段階(最急降下アルゴリズムの2,500ステップ+共役勾配アルゴリズムの2,500ステップ)を実行して、重原子の位置拘束によってタンパク質座標を固定したまま、追加された水素原子と水分子の位置を最適化します。
- 次のように pmemd プログラムを実行します。
pmemd -O -i min1.in -p protein.prmtop -c protein.inpcrd -o protein_min1.out
-r protein_min1.rst -ref protein.inpcrd. - 必要な引数に従ってください: -i FILE 制御データ;-p FILE分子トポロジー、力場パラメータ、原子名。-c ファイルの初期座標;-o FILE ユーザーが読み取り可能なログ出力。-r ファイルの最終座標;-ref FILE 位置拘束の参照座標。
- 入力ファイル min1.in でオプションを指定します。
&cntrl
imin=1, maxcyc = 5000, ncyc=2500,
カット= 10.0、NTB = 1、
NTC = 1、NTF = 1、
ntpr=10、
ntr=1、
restraintmask=':1-517 & !@H=',
restraint_wt=2.0
/
注:入力オプション:imin = 1は最小化を実行します。maxcyc=5000 最小化サイクルの最大数。NCYC = 2500最小化法は、NCYCサイクル後に最急降下から共役勾配に切り替えられます。カット= 10.0非結合カットオフ(Å);ntb = 1周期的な境界が課され、一定のボリュームがあります。ntc=1 結合長に制約は適用されません(エネルギー収束を改善するため)。NTF = 1すべての相互作用が計算されます。NTPR = 10 エネルギー情報は、NTPR ステップごとに OUT ファイルに出力されます。調和ポテンシャルを使用して特定の原子を抑制するためのntr = 1フラグ。restraintmask=':1-517 & !@H=' は拘束された原子を指定する。位置拘束のためのrestraint_wt = 2.0重量(kcal / mol∙Å2)。
- 次のように pmemd プログラムを実行します。
- エネルギー最小化の第2段階(最も急な降下ステップ5,000ステップ+共役勾配ステップ5,000)を拘束なしで実行して、システム全体を最適化します。
- min2.in と protein_min1.rst を入力として使用します。pmemd -O -i min2.in -p protein.prmtop
-c protein_min1.rst -o protein_min2.out -r protein_min2.rst. - 入力ファイル min2.in でオプションを指定します。
&cntrl
imin=1, maxcyc=10000, ncyc=5000,
カット= 10.0、NTB = 1、
NTC = 1、NTF = 1、
ntpr=10
/
- min2.in と protein_min1.rst を入力として使用します。pmemd -O -i min2.in -p protein.prmtop
3.暖房
注:この段階は、システムを0 Kから300 Kに加熱することを目的としています。 PDBファイルに基づく開始モデルには速度情報が含まれていないため、初期速度は原子に割り当てられます。
- タンパク質原子の位置拘束(50ps、定容)で加熱処理を行います。
- heat.in と protein_min2.rst を入力として使用します。pmemd -O -i heat.in -p protein.prmtop
-c protein_min2.rst -o protein_heat.out
-r protein_heat.rst -x protein_heat.mdcrd -ref protein_min2.rst - 必要な引数に従います: -x FILE 座標セットは、MD 軌道上に保存されます。
- 入力ファイル heat.in でオプションを指定します。
&cntrl
imin=0, irest=0, ntx=1,
nstlim=25000, dt=0.002,
NTC = 2、NTF = 2、
カット= 10.0、NTB = 1、
NTPR = 500、NTWX = 500、
NTT = 3, gamma_ln = 2.0,
tempi=0.0, temp0=300.0,
NTR=1, 拘束マスク=':1-517',
restraint_wt=1.0、
nmropt=1
/
&wt 型='TEMP0',
istep1=0, istep2=25000,
値 1=0.1、値 2=300.0 /
&wt タイプ='終了' /
メモ: 入力オプション: imin=0 は MD を実行します。irest=0 新しいシミュレーションを実行します。ntx=1 RST ファイルから初期速度は読み取られません。nstlim=25000 MD ステップ数。dt=0.002 時間ステップ (ps);水素を含むntc = 2結合は、SHAKEアルゴリズムを使用して拘束されます。拘束された結合のNTF = 2力は計算されません。NTWX = 500座標は、NTWXステップごとにMDCRDファイルに書き込まれます。NTT=3ランジュバン温度調節;gamma_ln=2.0 ランジュバンダイナミクスの衝突頻度 (ps−1);温度= 0.0初期温度;温度0 = 300.0基準温度;&wt 名前リストに指定された nmropt=1 パラメーターが読み取られます。TYPE='TEMP0' は目標温度を変化させます。
- heat.in と protein_min2.rst を入力として使用します。pmemd -O -i heat.in -p protein.prmtop
4.平衡化
注:この段階は、水の密度を調整し、タンパク質の平衡状態を取得するために必要です。
- 拘束なしで300 Kで平衡化を実行します(500 ps、定圧)。
- equil.in と protein_heat.rst を入力として使用します。pmemd -O -i equil.in -p protein.prmtop
-c protein_heat.rst -o protein_equil.out -r protein_equil.rst -x protein_equil.mdcrd. - 入力ファイル equil.in でオプションを指定します。
&cntrl
imin=0, irest=1, ntx=5,
nstlim=250000、
dt=0.002、
NTC = 2、NTF = 2、
カット= 10.0、NTB = 2、NTP = 1、タウプ= 2.0、
NTPR = 1000、NTWX = 1000、NTWR = 50000、
NTT = 3, gamma_ln = 2.0,
温度0=300.0
/
注: 入力オプション: irest=1 シミュレーションを再起動します。 NTX = 5 の座標と速度は、以前に生成された RST ファイルから読み取られます。 NTB = 2 周期的な境界が課され、一定の圧力がかかります。 NTP = 1 等方性圧力スケーリング; タウプ=2.0 圧力緩和時間(ps); ntwr=50000 NTWR ステップごとに RST ファイルが書き込まれ、クラッシュから確実に回復します。
- equil.in と protein_heat.rst を入力として使用します。pmemd -O -i equil.in -p protein.prmtop
5.生産ダイナミクス
- 平衡が達成されたら、一定の圧力で生産MDシミュレーション(10ns以上)を実行し、その後のタンパク質構造の解析のために軌道ファイルを生成します。
- prod.in と protein_equil.rst を入力として使用します。pmemd -O -i prod.in -p protein.prmtop
-c protein_equil.rst -o protein_prod.out -r protein_prod.rst -x protein_prod.mdcrd. - 入力ファイル prod.in でオプションを指定します。
&cntrl
imin=0, irest=1, ntx=5,
nstlim=5000000,
dt=0.002、
NTC = 2、NTF = 2、
カット= 10.0、NTB = 2、NTP = 1、タウプ= 2.0、
NTPR = 1000、NTWX = 1000、NTWR = 50000、
NTT = 3, gamma_ln = 2.0,
温度0=300.0, ig=-1
/
注: pmemd の並列バージョン (pmemd.MPI) または GPU アクセラレーション バージョン (pmemd.cuda) は、コンピューター クラスターおよびスーパーコンピューターで使用できます。長いMDシミュレーションは、いくつかのセグメントに分割され、順番に実行される場合があります。シミュレーションを再起動するたびにig=-1(ランダムシードオプション)を設定することを強くお勧めします。ptraj または cppptraj プログラムは、座標軌道の解析と処理に使用できます。詳細については、ソフトウェアのユーザーズマニュアルを参照してください。
- prod.in と protein_equil.rst を入力として使用します。pmemd -O -i prod.in -p protein.prmtop
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Representative Results
本プロトコルは、カスパーゼまたは病原性変異の翻訳後修飾の研究に容易に適用することができる。このセクションでは、カスパーゼ-2の研究で成功裏に使用されているMDモデリングワークフローが示されています(図1)。潜在的なリン酸化部位(Ser/ThrからAla)のin vitro部位特異的突然変異誘発と生化学的アプローチを使用して、Ser384Ala変異がカスパーゼ-2プロセシングを妨げ、酵素活性とアポトーシス細胞死の誘導をブロックすることが実証されました(補足図1)。しかし、質量分析もPhos-Tag技術も、Ser384がリン酸化を受けることを確認しませんでした7。Ser384がカスパーゼ-2活性をどのように調節するかを理解するために、3次元タンパク質構造のMDモデリングを実施しました(図1)。
1pyo結晶構造を用いてカスパーゼ-2の野生型および変異型の分子モデルを構築した(利用可能なカスパーゼ-2構造は 別表1に記載)。Ser384Ala変異体は、Ser384残基のO γ原子を除去して作成された(PDBにおいて、 Ser残基およびAla残基はOγ 原子を有することで区別される)。水素座標は通常、結晶構造には存在しません。そこで、タンパク質の構造に水素原子を付加し、さらに陽解な溶媒シミュレーションを可能にするために、12 Åの厚さのTIP3P水によって溶媒和しました。ナトリウムイオンを添加して系を中和した。得られたカスパーゼ-2の出発モデルは、 min1.in、 min2.in、 heat.in、 equil.in、および prod.in 制御データファイルを使用して、MDモデリングプロトコルに従ってエネルギー最小化、平衡化、およびその後の10nsMDシミュレーションにかけられました。
カスパーゼ-2の結晶構造では、Ser384がArg219およびArg378とともに、活性サイトでの空洞表面の形成に関与しています。Arg219とArg378は基質のカルボキシル基と水素結合を形成しますが、Ser384は基質との直接的な相互作用には介入しません。MDシミュレーションでは、Ser384Ala置換は触媒残基Cys320(求核剤)およびHis277(一般塩基)に影響を与えなかったが、Arg378に大きな立体構造変化を誘導することが確認された。そのグアニジニウム基はバルク溶媒に向かったため、Nε 原子は基板のカルボキシル基と必須の水素結合を形成できませんでした(図1)。天然酵素では、Ser384のOγ 原子(部分的な負電荷)とArg378グアニジニウム基(正電荷)との間に静電相互作用が起こる。しかしながら、セリン置換は明らかにこの相互作用を混乱させる。したがって、Ser384Ala置換は、カスパーゼ-2活性部位のアルギニン残基による基質認識に影響を与え、酵素活性とアポトーシス細胞死を引き起こす能力を損なうことが示されました。発見されたメカニズムは進化的に保存されており、他のカスパーゼファミリーのメンバーにも共通しているようです。このように、MDシミュレーションの実施により、生化学的結果を確認し、カスパーゼの活性中心の分子構造に関する新たな洞察を得ることができました。
図1:カスパーゼ構造の研究に使用されるMDモデリングワークフロー。 野生型カスパーゼ-2およびそのSer384Ala変異体を、プロトコルセクションの指示に従って調査しました。Ser384Ala置換は、活性部位残基Arg378の重要な立体構造変化を誘導することが明らかになった。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:細胞死におけるカスパーゼ-2の機能。 外因性および内因性の刺激に応答して、野生型カスパーゼ-2は自己タンパク質分解機構によって活性化され得る。活性カスパーゼ-2はBidを切断し、ミトコンドリア外膜透過処理とアポトーシス細胞死を促進します。Ser384Ala変異は、カスパーゼ-2の活性化と細胞死の誘導を防ぎます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表1:タンパク質データバンクで利用可能なカスパーゼ-2構造。 構造はリリース日でソートされます。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:PDBファイルの編集のさまざまな手順。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
記載されたMDアプローチは、生体分子シミュレーションパッケージを使用して、野生型および変異型の両方のカスパーゼをモデル化することを可能にする。ここでは、方法論のいくつかの重要な問題について説明します。まず、カスパーゼの代表的な結晶構造をタンパク質データバンクから選択する必要があります。重要なことに、カスパーゼの単量体および二量体形態の両方が許容される。欠落残基の数を最小限に抑えた高解像度の構造を選択することをお勧めします。一部の残基のプロトン化状態は、入力PDBファイルで手動で設定できます。例えば、図1において、触媒残基His277のNε2原子(HIE型)に水素原子が結合していた。次に、さらなる陽解法溶媒シミュレーションのために、タンパク質の周囲に溶媒ボックスを作成する必要があります。追加された水素原子と水分子の座標を最適化するには、エネルギーの最小化が必要です。第三に、加熱と平衡化は、生産ダイナミクスシミュレーションの前に実行する必要があります。加熱段階では、タンパク質表面の空洞と結合ポケットが水分子で満たされていることを確認する必要があります(必要に応じて、MDステップの数を増やすことができます)。平衡化段階では、タンパク質の平衡立体配座の獲得は、初期位置からのその骨格原子の二乗平均平方根偏差を分析することによって確認される必要がある12。第四に、生産動態シミュレーション中にタンパク質構造の立体構造変化を監視する必要があります。そのためには、骨格原子をフィッティングして軌道系を出発構造に重ね合わせ、分子可視化ツール(VMD、PyMOLなど)を用いて立体構造変化を解析する必要があります。17. 必要に応じて、MDステップの数を増やしたり、シミュレーションを複数のセグメントに分割して順番に実行したりできます。第五に、MDシミュレーションプログラムのGPUアクセラレーションバージョン(pmemd.cuda)を使用することが推奨されており、そのパフォーマンスは従来のCPU実装で達成可能なパフォーマンスを大幅に上回っています14,18。
記載された方法の考えられる制限は、タンパク質データバンクにおける特定のカスパーゼ構造の可用性である。しかし、「カスパーゼ」要求の下で900を超えるPDBエントリが見つかり、カスパーゼ構造が詳細に調査されたことを示しています。結晶構造が低分解能(すなわち、粗い詳細レベル)で得られる場合、またはカスパーゼ機能にとって重要ないくつかの断片を欠く場合、いくつかの困難が生じる可能性があります。
要約すると、MDモデリングアプローチは、遺伝子の突然変異、修飾、または分子間相互作用後のタンパク質の構造変化を予測するのに効果的であることが証明されています。細胞死の分野におけるMDシミュレーションの適用は、翻訳後修飾によるカスパーゼ制御の分子メカニズムを研究する大きな機会を開きます。この点に関して、長期MDシミュレーションは、機能領域の動的挙動およびアミノ酸置換の潜在的な影響を評価し、変異または修飾されたカスパーゼ-2および他のカスパーゼに関連する分子的原因を解明することができる。例えば、イニシエーターカスパーゼ遺伝子(カスパーゼ-2/カスパーゼ-8/カスパーゼ-9/カスパーゼ-10)のミスセンス変異は、消化器癌および中枢神経系および末梢神経系の腫瘍において検出された19。同時に、カスパーゼのMDモデリングは、プログラムされた細胞死および関連する障害を制御するメカニズムを理解し、新しい効果的な治療法を開発するための強力な インシリコ アプローチです。
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Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、ロシア科学財団(17-75-20102、プロトコル開発)からの助成金によってサポートされました。代表的な結果のセクション(リン酸化の分析)に記載されている実験は、ストックホルム(181301)およびスウェーデン(190345)癌協会によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amber20 | University of California, San Francisco | Software for molecular dynamics simulation http://ambermd.org |
|
| AmberTools21 | University of California, San Francisco | Software for molecular modeling and analysis http://ambermd.org |
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