Summary
Denne protokollen beskriver en tilnærming for å legge til rette for presise knock-in-redigeringer i sebrafiskembryoer ved hjelp av CRISPR-Cas9-teknologi. En fenotypingspipeline presenteres for å demonstrere anvendeligheten av disse teknikkene for å modellere en Long QT Syndrome-assosiert genvariant.
Abstract
Grupperte regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) i dyremodeller muliggjør presis genetisk manipulasjon for studier av fysiologiske fenomener. Sebrafisk har blitt brukt som en effektiv genetisk modell for å studere en rekke spørsmål knyttet til arvelig sykdom, utvikling og toksikologi på hele organ- og organismenivå. På grunn av det godt kommenterte og kartlagte sebrafiskgenomet er det utviklet mange verktøy for genredigering. Imidlertid er effekten av å generere og enkelt å oppdage presise knock-in-redigeringer ved hjelp av CRISPR en begrensende faktor. Beskrevet her er en CRISPR-Cas9-basert knock-in tilnærming med enkel påvisning av presise redigeringer i et gen som er ansvarlig for hjerte-repolarisering og assosiert med den elektriske lidelsen, Long QT Syndrome (LQTS). Denne to-single-guide RNA (sgRNA) tilnærmingen excises og erstatter målsekvensen og kobler et genetisk kodet reportergen. Nytten av denne tilnærmingen er demonstrert ved å beskrive ikke-invasive fenotypiske målinger av hjertets elektriske funksjon i villtype og genredigerte sebrafisklarver. Denne tilnærmingen muliggjør effektiv studie av sykdomsassosierte varianter i en hel organisme. Videre gir denne strategien muligheter for innsetting av eksogene sekvenser av valg, for eksempel reportergener, ortologer eller genredaktører.
Introduction
CRISPR-baserte genredigeringsstrategier i dyremodeller muliggjør studier av genetisk arvelig sykdom, utvikling og toksikologi på hele organismenivå 1,2,3. Sebrafisk gir en kraftig modell som er nærmere i mange fysiologiske aspekter til mennesker enn murine eller menneskeavledede cellemodeller4. Et omfattende utvalg av genetiske verktøy og strategier har blitt brukt i sebrafisk forbåde fremover 5 og omvendt genetisk screening6. Omfattende genetisk kartlegging og annotering i sebrafisk har gjort det lettere å redigere genredigeringsmetoder som en primær teknikk for å konstruere målrettede gen knockouts (KOs) og presise knock-ins (KIs)7.
Til tross for dette er generering av presise KI-redigeringer i sebrafisk begrenset av lav effektivitet og vanskeligheten med nøyaktig deteksjon. Selv om transkripsjonsfaktorlignende effektornukleaser (TALENs) har blitt brukt og optimalisert for KIs8, gir CRISPR en forbedret genredigeringsstrategi med enklere sgRNA-målretting. Tallrike studier har brukt CRISPR til å generere presise KIer i sebrafisk 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, selv om disse redigeringene generert gjennom CRISPR-mediert homologi-rettet reparasjon (HDR) har en tendens til å være ineffektive med lav iboende suksess priser som krever genotyping som primærskjerm 9,10,14,21. Dette viser behovet for et effektivt KI CRISPR-system i sebrafisk, samt et pålitelig system med høy gjennomstrømning for å oppdage presise redigeringer.
Målet med denne studien var å beskrive en plattform for å generere et presist hjertegen KI i sebrafiskhjerter med enkel og høy gjennomstrømningsdeteksjon av vellykkede redigeringer. En CRISPR-Cas9-basert to-sgRNA eksonutskiftningsmetode er beskrevet, som er basert på en TALEN-tilnærming8. Denne tilnærmingen innebærer eksisjon av målsekvensen ved hjelp av to-sgRNA-guider og erstatning med en eksogen malsekvens som inneholder KI av interesse, samt et genetisk kodet intronisk reportergen (figur 1). Integrasjonen av en genetisk kodet fluorescerende reporter i målgenets introniske sekvens muliggjør effektiv påvisning av positive redigeringer. Deretter beskrives en fenotypingsplattform for vurdering av hjertets elektriske funksjon hos sebrafisklarver for ikke-invasiv karakterisering av genvariantene assosiert med arvelig LQTS, en hjerteelektrisk lidelse som disponerer individer for plutselig hjertedød.
Disse tilnærmingene vil forbedre tilgangen til og bruken av sebrafisk KI-genredigeringer for å modellere arvelige sykdommer og adressere biologiske og fysiologiske spørsmål, for eksempel kartlegging av genuttrykksmønstre og utviklingsregulering. Siden sebrafiskhjerter bedre parallelle menneskelige hjerteelektrofysiologiske egenskaper enn murine modeller, kan de være spesielt attraktive som et genetisk trekkbart system for hjertesykdomsmodellering 7,22,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studier med sebrafisk ble utført i samsvar med retningslinjene og prosedyrene til Simon Fraser University Animal Care Committee og Canadian Council of Animal Care og ble fullført under protokoll # 1264K-18.
1. Design av CRISPR-komponenter for presise redigeringer
- For å designe de to-sgRNA-guidene som vil bli brukt til å excise sekvensen som inneholder KI-målstedet, må du først identifisere sebrafiskortologen for genet av interesse.
MERK: Figur 2 gir en sammendragsoversikt over trinnene for å konstruere presise redigeringer ved hjelp av to-sgRNA CRISPR-Cas9-tilnærmingen. - Deretter bruker du et designprogramvareverktøy, for eksempel CRISPOR24, som inkluderer valg for Danio rerio som art og av Cas-enzymet som skal brukes.
MERK: Genet av interesse for denne studien var zkcnh6a (Ensembl Transcript ID: ENSDART00000090809.6; UniProt Protein ID: B3DJX4), og målmutasjonen var aminosyre, R56Q.- For to-sgRNA-tilnærmingen, velg en sgRNA-plassering som går foran måleksonet og en annen sgRNA som ligger innenfor den umiddelbare nedstrøms intronen.
- Forsikre deg om at de valgte sgRNA-ene har høy spesifisitet og lav forventet binding. Bruk CRISPOR-rangeringer til å identifisere guider med minimal off-target binding. Ikke vurder guider uten uoverensstemmelser i frøsekvensen av potensielle off-targets.
- Identifiser de mest sannsynlige potensielle off-target-nettstedene (basert på CRISPOR-score, velg de tre beste eksonpotensielle off-target-nettstedene) for PCR-basert Sanger-sekvenseringsgenotyping i trinn 6.1.3.
- Når de to sgRNAene er valgt, oppnå omvendt komplement for hver, slik at det er fire oligonukleotider som skal brukes: to komplementære oligoer som går foran mutasjonen og to komplementære oligoer som er nedstrøms.
- På hver av de fire oligoene, legg til kompatible begrensningssteder for inkorporering i et guideplasmid etter eget valg; for integrering i DR274-plasmidet, bruk et 5 'BsaI-begrensningssted for å opprette et overheng. Forsikre deg om at Bsa1-gjenkjenningsstedet er konstruert på 5'-enden av guiden valgt fra CRISPOR, og at Bsa1-gjenkjenningsstedet er konstruert i 5'-enden av de komplementære strengene for å sikre riktig orientering av veiledningene i DR274-plasmidet (se figur 3).
- For å designe den eksogene malen som brukes til HDR i sebrafisk (figur 1), velg to sekvensfragmenter som vil flankere mVenus YFP-reportergenet som ligger i pKHR5-plasmidet.
MERK: Den tiltenkte modifikasjonen / redigeringen kan inkluderes i enten oppstrøms eller nedstrøms fragment.- Bruk Ensembl, finn målstedet innenfor gensekvensen av interesse, inkludert omtrent 2 kb flankerende sekvens (homologiarm), som vil bli brukt til å lage malen.
MERK: Homologiarmene kan være symmetriske eller asymmetriske25,26 og ca. 1 kb hver, oppstrøms og nedstrøms for målstedet. - Del malen i to segmenter som skal settes inn på hver side av mVenus YFP-reportergenet (se figur 4). Forsikre deg om at det delte nettstedet er i en intron, slik at kodingssekvensen ikke blir avbrutt.
MERK: Hvis genet er godt karakterisert, se etter funksjonelle roller i intronet, for eksempel spleisingssteder eller regulatoriske regioner. Regioner nær 5 'eller 3' ender er oftere involvert i mRNA-spleising. - Innlemme modifikasjoner i malsekvensen som inkluderer i) stille mutasjoner i guideprotospacer tilstøtende motiv (PAM) eller frøsekvens (vær oppmerksom på alternative PAM-steder som Cas-enzymet kan målrette mot) for å forhindre Cas enzym recutting; ii) endring av interesse; iii) opprettelse av restriksjonsendonukleasesteder for å lette kloning i pKHR5-plasmidet, som inneholder mVenus YFP-reportergenet (se figur 3).
MERK: I denne studien inneholdt det første malsegmentet XhoI oppstrøms for R56Q-mutasjonsstedet og SalI nedstrøms, mens det andre malsegmentet hadde EcoRI oppstrøms for guidemålsekvensen og BamHI nedstrøms. Hvis noen av de valgte begrensningsstedene er til stede i malsekvensen, vil mutasjoner for å dempe disse være nødvendig, eller alternative tilnærminger som Gibson Assembly kan brukes.
- Bruk Ensembl, finn målstedet innenfor gensekvensen av interesse, inkludert omtrent 2 kb flankerende sekvens (homologiarm), som vil bli brukt til å lage malen.
2. Fremstilling av CRISPR-komponenter for embryomikroinjeksjon
- Klargjør Cas9 for mikroinjeksjon 1 uke før mikroinjeksjonene. Bruk Cas9-protein eller tilbered Cas9 mRNA via in vitro transkripsjon.
MERK: I denne studien ble Cas9 mRNA brukt, siden effektiviteten hadde en tendens til å være høyere.- Forsterk bakteriekulturer av kommersielt tilgjengelig XL1 Blå bakteriell agar stab (inneholder Cas9 plasmid) ved hjelp av et passende antibiotikum som ampicillin. Bruk 675 μL væskekultur (med 325 μL glyserol) for å lage et reserveglyserollager for langtidslagring ved -80 °C.
- Bruk resten av væskekulturen til en miniprep-rensing, i henhold til protokollen som fulgte med miniprep-settet. Resuspender det endelige rensede DNA i 50 μL av den medfølgende elueringsbufferen. Kvantifiser produktet via et spektrofotometer for å undersøke utbyttet og renheten.
- Linearize 2 μg av det rensede DNA via restriksjonsfordøyelse ved bruk av et passende restriksjonsenzym og bruk av passende buffer- og inkubasjonstid som oppført for enzymet av interesse.
- Rens det lineariserte plasmidet ved hjelp av et PCR-rensesett, resuspender det i 30 μL av den medfølgende elueringsbufferen.
- Etter å ha kvantifisert produktet, bruk dette som en mal for in vitro-transkripsjon ved å bruke riktig transkripsjonssett for arrangøren av interesse. Følg den medfølgende protokollen og rens via litiumkloridutfelling27. Resuspender det rensede RNA i 10 μL nukleasefrittH2O og kvantifisere det før det lagres ved -20 °C for bruk i mikroinjeksjonsblandingen.
- Forbered de to sgRNA-guidene.
- Forbered sgRNA-plasmidet med et stillas ved å forsterke bakteriekulturer fra den kommersielt tilgjengelige XL1 Blue bakterielle agarstikken (se materialtabellen for detaljer) på samme måte som MLM3613 ovenfor (trinn 2.1.1), bortsett fra bruk kanamycin i stedet for ampicillin.
- Anneal de to parene komplementære enkeltstrengede oligonukleotider (ssODNs) for sgRNA-guidene designet ovenfor ved først å resuspendere ssODN-ene i 1x annealingbuffer til en konsentrasjon på 100 μM.
- I separate reaksjoner for hver av de to sgRNAene, anneal paret komplementære ssODNer ved hjelp av en termisk syklus. Bland 2 μg av hvert komplementære ssODN-par med 50 μL glødebuffer og inkuber ved 95 °C i 2 minutter, avkjøl deretter til 25 °C over 45 min.
- Fordøye et kommersielt tilgjengelig plasmid som inneholder et gRNA-stillas. Fordøye 2 μg av DR274-plasmidet ved bruk av 1 μL BsaI, 2 μL passende buffer og ddH2O til 20 μL ved 37 ° C i 1 time. Bekreft linearisering (valgfritt: rens ved hjelp av et PCR-rensesett) ved bruk av gelelektroforese28.
- I to separate ligeringsreaksjoner (en for hvert sgRNA), ligate de glødede ssODN-ene med det lineariserte DR274-plasmidet. Bruk en molar insert:vector ratio på 3:1, og beregne riktig masse gjennom en online ligeringskalkulator. Bland den nødvendige massen av innsatsen og vektoren med 1 μL T4 DNA-ligase, 2 μL ligeringsbuffer og ddH2O til 12 μL og inkuber ved romtemperatur i 12 timer.
- Transformer 2 μL av det ligerte produktet til passende kompetente celler (for eksempel 10β celler) ved hjelp av standard tilnærminger, og forsterk og rens deretter produktet ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig Miniprep Kit. Valgfritt: Lag et glyserollager av dette produktet.
- Transkriber de to sgRNAene ved å linearisere 2 μg av hver guide ved hjelp av et 3 'nedstrøms begrensningssted som er så nær slutten av romsekvensen som mulig. For DR274-plasmidet, lineariser med HindIII, og rens deretter RNA-malen ved hjelp av et PCR-rensesett, resuspendering i 30 μL av elueringsbufferen.
- Transkriber de to guidene ved hjelp av et RNA-transkripsjonssett. Følg produsentens protokoll og rens via litiumkloridutfelling27. Resuspender de to rensede sgRNA-guidene i 10 μL nukleasefri H2O, kvantifisere og lagre ved -20 ° C for bruk i mikroinjeksjonsblandingen.
MERK: RNA-transkripsjonssettet kan ikke inneholde en 5 'hette eller poly-A hale.
- Forbered den dobbeltstrengede, eksogene HDR-reportermalen.
MERK: Malen er syntetisert i to deler, en oppstrøms og en nedstrøms for mVenus YFP reporter genet. Disse to segmentene er syntetiske konstruksjoner bestilt gjennom en kommersiell leverandør og deretter ligert inn i pKHR5 (som inneholder mVenus YFP) plasmid sekvensielt.- Forbered pKHR5-plasmidet ved å forsterke bakteriekulturer fra den kommersielt tilgjengelige DH5α-bakteriestammen (se Materialtabell for detaljer) på samme måte som MLM3613 ovenfor (trinn 2.1.1).
MERK: pKHR5-plasmidet inneholder mVenus YFP-reportergensekvensen. - Resuspender de to malsegmentene designet ovenfor til 100 μM i TE-buffer og transformer deretter til 10β-celler.
- Fordøye det første malsegmentet (det ene oppstrøms for mVenus YFP-reportergenet) og pKHR5-plasmidet ved hjelp av restriksjonsenzymene valgt i trinn 1.3.3.
MERK: Sekvensiell fordøyelse av pKHR5 er nødvendig på grunn av nærheten til de valgte begrensningsstedene i MCS. - For å forberede pKHR5-plasmidet for oppstrøms malsegmentet, fordøye 4 μg pKHR5 (i henhold til trinn 2.2.4) med SalI og rens deretter ved hjelp av et PCR-rensesett. Resuspender i 30 μL ddH2O og bruk dette som en mal for den andre fordøyelsesreaksjonen med XhoI. Rens produktet ved hjelp av PCR-rensesettet.
- Forbered det første malsegmentet ved å fordøye 2 μg av malsegmentet (trinn 2.3.2), 1 μL XhoI, 1 μL SalI, 2 μL passende buffer og ddH2O til 20 μL i 1 time ved 37 °C og gelrense produktet.
- Ligate oppstrøms malsegmentet fra trinn 2.3.5 inn i den forberedte pKHR5 ved hjelp av reaksjonsbetingelsene beskrevet i trinn 2.2.5. Forvandle det ligerte produktet til kompetente 10β-celler, forsterk og rens ved hjelp av en miniprep (valgfritt: lag et glyserollager av dette produktet).
- Bruk det ligerte produktet fra trinn 2.3.6 (som inneholder det første malsegmentet ligert i pKHR5-plasmid oppstrøms for mVenus YFP-reportergenet) og fordøye for å forberede det andre (nedstrøms for mVenus reporter) malsegmentet. Fordøye 4 μg av det ligerte produktet (fra trinn 2.3.6, som i trinn 2.2.4) med BamHI, og rens deretter ved hjelp av et PCR-rensesett. Resuspender i 30 μL ddH2O og bruk dette som mal for den andre fordøyelsesreaksjonen med EcoRI. Rens produktet ved hjelp av PCR-rensesettet.
- Forbered det andre malsegmentet ved å fordøye 2 μg av malsegmentet (trinn 2.3.2), 1 μL BamHI, 1 μL EcoRI, 2 μL passende buffer og ddH2O til 20 μL i 1 time ved 37 °C og gelrense produktet.
- Ligate nedstrømsmalsegmentet i den forberedte pKHR5 (fra trinn 2.3.7) ved hjelp av reaksjonsbetingelsene beskrevet i trinn 2.2.5. Forvandle det ligerte produktet til kompetente celler, forsterk og rens ved hjelp av et miniprep-sett. Lag et glyserollager av dette sluttproduktet, som inneholder begge malsegmentene ligert på hver side av mVenus YFP-reportergenet i pKHR5.
- Forbered pKHR5-plasmidet ved å forsterke bakteriekulturer fra den kommersielt tilgjengelige DH5α-bakteriestammen (se Materialtabell for detaljer) på samme måte som MLM3613 ovenfor (trinn 2.1.1).
- Forbered mikroinjeksjonsblandingen ved hjelp av Cas9 mRNA, to sgRNA og den eksogene HDR-reportermalen.
- Bland 200 ng / μL Cas9 mRNA, 100 ng / μL av hvert sgRNA og 200 ng / μL eksogen HDR-reportermal i 1x injeksjonsbuffer til et endelig volum på 20 μL.
- Oppbevar mikroinjeksjonsblandingen ved -20 °C og kast den ubrukte blandingen etter tre fryse-tine-sykluser.
MERK: Bruk 4 nL av denne mikroinjeksjonsblandingen til mikroinjeksjon i eggeplommesekken til hvert embryo.
3. Avl av sebrafisk og embryomikroinjeksjon
MERK: Protokoller for sebrafiskavl og mikroinjeksjon av encellede embryoer er beskrevet tidligere 29,30,31.
- For avl, bruk sebrafisk av AB-stammen og det er 6-12 måneder. Injiser embryoene i encellestadiet ca. 40 minutter etter befruktning (se figur 5).
MERK: Det biologiske kjønnet til de injiserte embryoene var ikke kjent. Seksuell dimorfisme er ikke tydelig før ca. 3 måneders alder32.
4. Reporter genscreening av CRISPR-Cas9-redigert larvesebrafisk
- Visualiser YFP-integrasjon i sebrafisklarver etter mikroinjeksjon av CRISPR-Cas9-komponenter for å skjerme for vellykkede HDR-redigeringer.
- I en 25 mm petriskål bedøver du 24 sebrafisklarver 3 dager etter befruktning (dpf) i 0,3% trikainmetansulfonat (MS-222, bufret til pH 7,0-7,4 med HEPES og natriumhydroksid) til de mister sin selvrettende refleks (typisk 1-2 min). Når den er bedøvet, overfør hver larve til en individuell brønn på en 24-brønnsplate.
- Ved hjelp av et mikroskop som er i stand til å oppdage GFP / YFP, skjerm for reportergenfluorescens i øynene til hver enkelt larve.
- Ta bilder av hver larve og dokumenter tilstedeværelsen eller fraværet av reportergenuttrykk.
5. Fenotyping av CRISPR-Cas9-redigert larvesebrafisk
- Etter reportergenscreening, utfør hjertefenotyping (hjertefrekvens, perikardiale dimensjoner, EKG) på hver larve. Fenotype like mange reportergenpositive og -negative larver.
- Bruk et CCD-kamera (f.eks. Blackfly USB3) og programvare for video- og bildeopptak (f.eks. Micromanager for ImageJ) til å måle hjertefrekvens og perikardiale dimensjoner mens larvene bedøves.
- For å måle hjertefrekvensen, bruk Micromanager, opprett et interesseområde (ROI) for å fange hjertet og ekskludere andre strukturer.
- Importer videoen til ImageJ som en bildesekvens, og sørg for at riktig antall bilder er angitt under antall bilder.
- Når filen er åpen, bruker du verktøyet for valg av rektangel til å tegne en ROI i hjertet, men ekskludert andre bevegelige elementer, og lagre avkastningen i ROI-behandleren (analyser | verktøy | ROI manager).
- Klikk på plugins | installere, og velg hjertefrekvensalgoritmen for å installere koden i standardmappen, og velg deretter plugin-modulen nederst på plugin-modulfanen . Ta opp slagene per minutt (bpm) fra popup-vinduet.
MERK: Bildedeteksjonsalgoritmer ble spesialskrevet for å oppdage hjertefrekvens ved å måle individuelle pikseldensitetsendringer assosiert med ventrikulær systolisk sammentrekning. Koden finner du på https://github.com/dpoburko/zFish_HR.
- Mål perikardiale dimensjoner ved hjelp av et gratis verktøy som ImageJ for å frigjøre avkastningen rundt perikardialsekken og ett av øynene. Åpne bildet i ImageJ og bruk mangekantmerkingsverktøyet til å tegne en ROI først rundt perikardialsekken, lagre den i ROI-behandleren som i trinn 5.1.2, og gjenta for øyet. Velg disse to avkastningene i ROI manager, og klikk deretter på measure. Registrer området for hver for senere å beregne arealet av perikardial sac normalisert til øyet området i hver larve.
- Etter hjertefrekvens og perikardiale målinger, registrer EKG fra individuelle larver.
MERK: Protokoller for registrering av sebrafisk-EKG er tidligere beskrevet33,34,35,36.
6. Genotyping av CRISPR-Cas9-redigert larvesebrafisk
- Etter fenotypiske analyser, utfør on- og potensiell off-target genotyping for å bekrefte nøyaktig og presis HDR-genredigering.
- Bedøv hver 3 dpf larve i 0,3% MS-222 og haleklemme for å isolere gDNA ved hjelp av HOTShot-metoden37. Inkuber hver utskåret haleklemme i 15 μL på 25 mM NaOH ved 95 °C i 20 minutter. Nøytraliser deretter med 1,5 μL Tris-HCl og sentrifuge ved 13 800 x g i 30 s. Behold supernatanten, som inneholder ekstrahert gDNA.
- Gjenopprett larvene i E3-medier og returner dem til boligsystemet hvis videre utvikling eller studier er ment.
- Bruk det ekstraherte gDNA som en mal, utfør PCR-basert Sanger-sekvensering av on-target og potensielle off-target-nettsteder.
MERK: Valgfritt: En nestet PCR-tilnærming kan være gunstig for noen genregioner. - Forsikre deg om at primerdesignet på målet fanger mutasjonsstedet og nærmeste sgRNA-bindingssted. Design en separat sekvenseringsprimer for å oppdage overgangen fra den innsatte homologiarmen og målgenet for å bekrefte integrasjon i genet av interesse. Design primere for å sekvensere de tre beste potensielle off-target-nettstedene identifisert i trinn 1.2.3.
MERK: Guide-design programmer foreslår ofte primere å bruke, men tilpasning kan være nødvendig for å oppnå optimale resultater. - Kompiler on- og off-target genotyping, hjertefrekvens, perikardiale dimensjoner, EKG-fenotyping og reportergendata som er identifiserbare for hver sebrafisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den vellykkede bruken av denne to-sgRNA-eksonutskiftningen CRISPR-tilnærmingen fremheves av introduksjonen og den enkle deteksjonen av en presis redigering for å konstruere den LQTS-assosierte varianten, R56Q, i zkcnh6a-genet i sebrafisk. Figur 6 viser representative 3 dpf larver injisert på encellet embryostadium med CRISPR-komponenter som beskrevet ovenfor. Figur 6A viser tilstedeværelsen av YFP mVenus reporter genuttrykk i øyelinsen som en positiv reporter for vellykket malintegrasjon. Figur 6B, C viser Sanger-sekvensering av kromatogrammer hentet fra genomisk DNA isolert fra haleklippprøver av henholdsvis villtype og reportergenpositiv fisk. Reporter genpositive fisk ble funnet å ha den nøyaktige redigeringen, G til A, som introduserer R56Q-varianten i zkcnh6a. Genotyping viste en 100% korrelasjon mellom YFP reporter genuttrykk og tilstedeværelsen av den nøyaktige R56Q-genredigeringen, og validerte dette fluorescensscreeningsverktøyet.
Fenotyping av genredigerte sebrafisklarver ble utført ved 3 dpf. Figur 7 viser representative resultater fra villtype- og R56Q-genredigerte larver. Hjertefrekvensen ble oppdaget ved videoopptak som beskrevet ovenfor. Et eksempel på måling av perikardiale dimensjoner som et forhold mellom øyeområdet er vist (figur 7A). Figur 7B plotter hjertefrekvens mot normaliserte perikardiale dimensjoner, og fremhever en trend med bradykardi med økende perikardialt ødem, som er forbundet med forstyrrelser i hjerte-repolarisering hos sebrafisk 8,38,39,40. Figur 7C viser et representativt eksempel på EKG-registreringer fra 3 dpf larver. Standardintervaller (QT, QRS) ble målt fra gjennomsnittlige EKG-signaler.
Figur 1: Integrering av HDR-mal i sebrafiskgenomet. Mørkegrå, homologiarmer; grønn, sgRNA guide mål med stille mutasjon for å forhindre Cas9 recutting; lysegrå, målekson av interesse; rød linje, punktmutasjon; gul, mVenus YFP reporter gen under en α-krystallinsk promotor; stiplede linjer indikerer homologi. Her var den målrettede presise redigeringen R56Q i ekson 2 av zkcnh6a-genet . Forkortelser: HDR = homologi-rettet reparasjon; sgRNA = single-guide RNA; YFP = gult fluorescerende protein; DSB = dobbeltstrenget pause; WT = vill type. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Sammendrag av trinn for å konstruere presise redigeringer i sebrafiskgener ved hjelp av to-sgRNA CRISPR-Cas9-tilnærmingen (relaterte protokolltrinnnumre er angitt i parentes). Forkortelser: sgRNA = single-guide RNA; YFP = gult fluorescerende protein; gDNA = genomisk DNA; EKG = elektrokardiogram; dpf = dager etter befruktning; MS-222 = trikaine metansulfonat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Fremstilling av eksogene malfragmenter og sgRNA-guider . (A) Sekvensiell fordøyelse og ligering av malfragmenter oppstrøms og nedstrøms for mVenus YFP-reportergensekvensen i pKHR5. (B) Annealing av komplementære sgRNA-par med begrensningsoverheng for ligering i DR274. Forkortelser: sgRNA = single-guide RNA; YFP = gult fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Konstruksjon av HDR-mal. Mørkegrå, homologiarmer; grønn, sgRNA guide mål med stille mutasjon for å forhindre Cas9 recutting; lysegrå, målekson av interesse; rød linje, punktmutasjon; gul, mVenus YFP reporter gen under en α-krystallinsk promotor; mørk blå linje, lagt til begrensningssider. De to malfragmentene er integrert i pKHR5-plasmiddonoren. Forkortelser: HDR = homologi-rettet reparasjon; sgRNA = single-guide RNA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Mikroinjeksjon av encellede sebrafiskembryoer med CRISPR-Cas9-komponenter. Skala bar = 0,5 mm. Forkortelser: HDR = homologi-rettet reparasjon; sgRNA = single-guide RNA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Enkel påvisning av mVenus YFP reportergen fluorescens indikerer positiv HDR eksogen malintegrasjon i målgenet. (A) Eksempel på mVenus YFP-uttrykk i et sebrafiskøye (pil) i en redigert sebrafisklarve. (B) Vellykkede redigeringer bekreftes ved sekvensering av kromatogrammer (venstre, WT; høyre, R56Q-redigering). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Fenotypisk analyse av hjertekonsekvenser hos 3 dpf sebrafisk etter den nøyaktige R56Q-redigeringen i zkcnh6a-målgenet. (A) Bildedeteksjon av perikardiale dimensjoner i forhold til øyestørrelse ved hjelp av polygonverktøyet i ImageJ. Grensene til perikardial sac ble merket av brukeren fra en enkelt opptaksramme basert på endringer i gjennomskinnelighet og pigmentering. Eksempler på normale perikardiale dimensjoner og perikardial effusjon er vist. Skala bar = 0,5 mm. (B) Korrelasjon mellom perikardiale dimensjoner (i forhold til øyedimensjon) og hjertefrekvens, R2 = 0,33. (C) Eksempel på EKG-registrering fra et 3 dpf sebrafisk larvehjerte (venstre) og gjennomsnittlige komplekser (høyre). Hjertefrekvens, 131 bpm; hjertefrekvenskorrigert QTc-intervall, 460 ms. Forkortelser: dpf = dager etter befruktning; EKG = elektrokardiogram. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prosjekteringen av presise genredigeringer ved hjelp av CRISPR-Cas9 utfordres av den lave effektiviteten til HDR-mekanismer og deres effektive deteksjon. Her beskrives en CRISPR-Cas9-basert to-sgRNA eksonutskiftningsmetode som gir presise redigeringer i sebrafisk med enkel visuell deteksjon av positive redigeringer. Effekten av denne tilnærmingen er demonstrert ved å generere presise redigeringer i zkcnh6a-genet . Denne artikkelen viser hvordan hjertefunksjonen hos genredigerte sebrafisklarver kan vurderes ved hjelp av ikke-invasive fenotypiske målinger av hjertefrekvens, perikardiale dimensjoner og EKG-morfologi. Denne tilnærmingen, fra å introdusere en genredigering til fenotypisk evaluering, kan fullføres fra start til slutt innen ca. 1 uke.
Fordelene med ovennevnte redigerings- og fenotypingsmetode er den enkle CRISPR-modifikasjonsdesignen, den brede anvendeligheten i flere fysiologiske systemer, evnen til å sette inn store gener eller genfragmenter, og evnen til å spore varianteffekter i lengderetningen gjennom utvikling og generasjoner. Suksessen til presise redigeringer i denne tilnærmingen kan være relatert til kombinasjonen av den store malstørrelsen (på grunn av reportergeninnsatsen og lange homologiarmer), som har vist seg å øke effektiviteten av redigeringer i sebrafisk14, og to-sgRNA-guider-strategien, som har blitt brukt effektivt i sebrafisk TALEN-induserte redigeringer8.
En spesiell styrke ved den beskrevne tilnærmingen er evnen til å sette inn store gener eller genfragmenter. Dette kan for eksempel være nyttig for å sette inn menneskelige ortologer41, noe som muliggjør mer klinisk oversettbar karakterisering og sammenligning mellom ortologer. Alternativt kan gener som koder for Cas-enzymer også settes inn, noe som muliggjør en linje med sebrafisk med in vivo CRISPR-redigeringsmekanismer, noe som gir et induserbart system. På samme måte kan alternative CRISPR-mekanismer, for eksempel primeredigering, integreres og resultere i en linje med sebrafisk som lett redigeres nøyaktig og effektivt.
Til tross for fordelene med denne tilnærmingen, er det noen begrensninger. For det første har bare et enkelt gen og lokus blitt modifisert, og videre testing på andre steder eller i andre gener er nødvendig for å evaluere hvor bredt anvendelig denne tilnærmingen er. På grunn av de lange homologiarmene som kreves, er maldesignkostnadene høyere; Dette kan imidlertid oppveies av effektiv screening. En annen begrensning er at screening-tilnærmingen krever fluorescensdeteksjonsevne. Imidlertid er optiske krav relativt lave og kan spesialbygges eller kommersielt kjøpes til en rimelig lav pris. Ved å bruke en to-sgRNA-tilnærming øker antall potensielle off-target-hendelser; Dette reduseres imidlertid sannsynligvis av den lavere sannsynligheten for at de to sgRNA-guidene begge vil anneal på en måte som letter inkorporeringen av malen for å gi reportergenuttrykk. Til slutt kan bruk av Cas9 mRNA føre til mosaikk, da Cas9 ikke er aktiv før senere utviklingsstadier. Dette kan forklares ved sekvensering av bestemte vevstyper; Men gitt størrelsen på sebrafisklarvene, er dette teknisk utfordrende.
Oppsummert muliggjør denne CRISPR-Cas9 to-sgRNA presise redigeringsmetoden i sebrafisk enkel visuell påvisning av positive redigeringer og kan tilpasses for å innlemme store gener av interesse på ethvert sted. Kombinert med fenotypiske tiltak gir dette en pålitelig og høy gjennomstrømningsplattform for å studere klinisk relevante hjertevarianter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av et kanadisk institutt for helseforskningsprosjekt (TWC) og Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery grants (TWC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Program | |||
| CRISPOR | TEFOR Infrastructure | ||
| ENSEMBL | European Bioinformatics Institute | ||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
| Micro-Manager | Open Source (Github) | ||
| NEBiocalculator | New England Biolabs (NEB) | ||
| EQUIPMENT | |||
| 24-well Plate | VWR | ||
| 25 mm Petri Dish | VWR | ||
| Blackfly USB3 Camera | Teledyne FLIR | ||
| C1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Centrifuge 5415C | Eppendorf | ||
| EZNA Gel Extraction Kit | Omega Biotek | ||
| MAXIscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | ||
| MaxQ 5000 Incubator | Barnstead Lab Line | ||
| Miniprep Kit | Qiagen | ||
| mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit | Invitrogen | ||
| ND1000 Spectrophotometer | Nanodrop | ||
| PCR Purification Kit | Qiagen | ||
| PLI 100A Picoinjector | Harvard Apparatus | ||
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | ||
| Stemi 305 Steroscope | Zeiss | ||
| Wide Mini Sub Cell GT Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| ZebTec Zebrafish Housing System | Tecniplast | ||
| SERVICES | |||
| Gene Synthesis | Genewiz | ||
| Sanger Sequencing | Genewiz | ||
| REAGENTS | |||
| 10β Competent Cells | NEB | ||
| 10X PCR Buffer | Qiagen | ||
| 100 mM Nucleotide Mixture | ABM | ||
| Ampicillin | Sigma | ||
| BamHI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| BsaI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| DR274 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| EcoRI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Glycerol | |||
| HEPES | Sigma | ||
| HindIII Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Kanamycin | Sigma | ||
| Methylene Blue | Sigma | ||
| MLM3613 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| MS-222 (Tricaine) | Sigma | ||
| pKHR5 Plasmid (DH5α bacterial agar stab) | Addgene | ||
| PmeI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| SalI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma | ||
| T4 Ligase w/ buffer | Sigma | ||
| Taq Polymerase | Qiagen | ||
| TE Buffer | Sigma | ||
| Tris Hydrochloride | Sigma | ||
| XhoI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| RECIPES | |||
| Solution | Component | Supplier | |
| Annealing Buffer (pH 7.5-8.0) | 10 mM Tris | Sigma | |
| 50 mM NaCl | Sigma | ||
| 1 mM EDTA | Sigma | ||
| E3 Media (pH 7.2) | 5 mM NaCl | Sigma | |
| 0.17 mM KCl | Sigma | ||
| 0.33 mM CaCl2 | Sigma | ||
| 0.33 mM MgSO4 | Sigma | ||
| Injection Buffer (pH 7.5) | 20 mM HEPES | Sigma | |
| 150 mM KCl | Sigma |
References
- Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082 (2019).
- Lee, H., Yoon, D. E., Kim, K. Genome editing methods in animal models. Animal Cells and Systems. 24 (1), 8-16 (2020).
- Li, Q., et al. Applications of genome editing technology in animal disease modeling and gene therapy. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 689-698 (2019).
- Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. Little fish, big data: Zebrafish as a model for cardiovascular and metabolic disease. Physiological Reviews. 97 (3), 889-938 (2017).
- Kegel, L., et al. Forward genetic screen using zebrafish to identify new genes involved in myelination. Oligodendrocytes: Methods and Protocols. 1936, 185-209 (2019).
- Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
- González-Rosa, J. M. Zebrafish models of cardiac disease: From fortuitous mutants to precision medicine. Circulation Research. 130 (12), 1803-1826 (2022).
- Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. Precise editing of the Zebrafish genome made simple and efficient. Developmental Cell. 36 (6), 654-667 (2016).
- Albadri, S., Del Bene, F., Revenu, C. Genome editing using CRISPR/Cas9-based knock-in approaches in zebrafish. Methods. 121-122, 77-85 (2017).
- Armstrong, G. A. B., et al. Homology directed knockin of point mutations in the zebrafish tardbp and fus genes in ALS using the CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 11 (3), 0150188 (2016).
- Bai, H., et al. CRISPR/Cas9-mediated precise genome modification by a long ssDNA template in zebrafish. BMC Genomics. 21 (1), 67 (2020).
- de Vrieze, E., et al. Efficient generation of knock-in zebrafish models for inherited disorders using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9429 (2021).
- Eschstruth, A., Schneider-Maunoury, S., Giudicelli, F. Creation of zebrafish knock-in reporter lines in the nefma gene by Cas9-mediated homologous recombination. Genesis. 58 (1), 23340 (2020).
- Irion, U., Krauss, J., Nüsslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4 (1), 6545 (2014).
- Levic, D. S., Yamaguchi, N., Wang, S., Knaut, H., Bagnat, M. Knock-in tagging in zebrafish facilitated by insertion into non-coding regions. Development. 148 (19), (2021).
- Prykhozhij, S. V., et al. Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9. Nucleic Acids Research. 46 (17), 102 (2018).
- Wierson, W. A., et al. Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells. eLife. 9, 53968 (2020).
- Boel, A., et al. CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair by ssODNs in zebrafish induces complex mutational patterns resulting from genomic integration of repair-template fragments. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Tessadori, F., et al. Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Zhang, Y., Zhang, Z., Ge, W. An efficient platform for generating somatic point mutations with germline transmission in the zebrafish by CRISPR/Cas9-mediated gene editing. The Journal of Biological Chemistry. 293 (17), 6611-6622 (2018).
- Vornanen, M., Hassinen, M. Zebrafish heart as a model for human cardiac electrophysiology. Channels. 10 (2), 101-110 (2016).
- Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Precipitation of Large RNAs with Lithium Chloride. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 3. E.15. , Cold Spring Harbor Laboratory. Long Island, NY. (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Agarose Gel Electrophoresis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 1. , Cold Spring Harbor Laboratory. Long Island, NY. 3-20 (1989).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Kossack, M. E., Draper, B. W. Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio). Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).
- Tanaka, Y., et al. Functional analysis of KCNH2 gene mutations of type 2 long QT syndrome in larval zebrafish using microscopy and electrocardiography. Heart and Vessels. 34 (1), 159-166 (2019).
- Dhillon, S. S., et al. Optimisation of embryonic and larval ECG measurement in zebrafish for quantifying the effect of QT prolonging drugs. PLoS One. 8 (4), 60552 (2013).
- Yu, F., et al. Evolving cardiac conduction phenotypes in developing zebrafish larvae: Implications to drug sensitivity. Zebrafish. 7 (4), 325-331 (2010).
- Hurst, R. M. Development and optimization of tools for embryonic electrocardiograph recording for heart dysfunction in zebrafish. , University of Birmingham. PhD thesis (2018).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. BioTechniques. 43 (5), 610-614 (2007).
- Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).
- Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish. Circulation. 107 (10), 1355-1358 (2003).
- Langheinrich, U., Vacun, G., Wagner, T. Zebrafish embryos express an orthologue of HERG and are sensitive toward a range of QT-prolonging drugs inducing severe arrhythmia. Toxicology and Applied Pharmacology. 193 (3), 370-382 (2003).
- MacRae, C. A. Cardiac arrhythmia: In vivo screening in the zebrafish to overcome complexity in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (7), 619-632 (2010).
