Summary
Hasta la fecha, el desarrollo de métodos de identificación de la glándula paratiroides (PG) está limitado por la falta de modelos animales en la investigación preclínica. Aquí, establecemos un modelo de rata simple y efectivo para imágenes intraoperatorias de PG y evaluamos su efectividad mediante el uso de nanopartículas de óxido de hierro como un nuevo agente de contraste de PG.
Abstract
La identificación de la glándula paratiroides (PG) es una necesidad crítica insatisfecha en la tiroidectomía. La identificación de la PG es un desafío en la cirugía de tiroides, ya que es similar en color a la glándula tiroides. La falta de modelos animales efectivos en la investigación preclínica es una limitación severa para el desarrollo de técnicas de identificación de PG. Este protocolo permite establecer un modelo de rata simple y eficaz para la identificación de PG. En este modelo, las nanopartículas de óxido de hierro negro (IONP) se inyectan localmente en la glándula tiroides y se difunden rápidamente dentro de la glándula tiroides, pero no en el PG. Un PG teñido negativamente y una glándula tiroides teñida positivamente se pueden identificar fácilmente a simple vista sin necesidad de microscopios externos. La posición del PG se puede identificar aumentando el contraste de color entre la glándula tiroides y el PG, basado en el color de los IONP negros. Este modelo de rata es de bajo costo y conveniente para la identificación de PG, y los IONP son un nuevo agente de contraste de PG.
Introduction
La glándula paratiroides (PG) son pequeñas glándulas endocrinas de forma ovalada ubicadas en el cuello de humanos y otros vertebrados, que producen y secretan hormonas paratiroideas para regular y equilibrar los niveles de calcio y fósforo en la sangre y en los huesos1. Los seres humanos generalmente tienen dos pares de PG ubicados detrás de los lóbulos de la glándula tiroides en ubicaciones variables; el tamaño de la PG humana mide típicamente 6 mm x 4 mm x 2 mm, con un peso de aproximadamente 35-40 mg2. La extirpación o el daño de la PG causa hipoparatiroidismo (HP), un trastorno endocrino caracterizado por hipocalcemia y niveles bajos o indetectables de hormonas paratiroideas, que causan una amplia gama de síntomas, desde espasmos similares a calambres hasta dientes malformados y enfermedades renales crónicas. Algunas de estas complicaciones son fatales (por ejemplo, insuficiencia cardíaca y convulsiones)3,4,5; por lo tanto, PG es esencial para regular el metabolismo del cuerpo y mantener la vida.
La HP es una de las complicaciones más comunes después de la cirugía anterior del cuello, especialmente en la tiroidectomía, un tratamiento curativo bien establecido para el cáncer de tiroides, que es el cáncer endocrino más común en todo el mundo 6,7. La HP posterior a la tiroidectomía es causada predominantemente por un traumatismo directo, isquemia o extirpación de la PG en la cirugía debido a una grave falta de capacidad para discriminar de manera confiable la PG de los lóbulos de la glándula tiroides y otros tejidos circundantes (por ejemplo, ganglios linfáticos y partículas de grasa periféricas) en tiempo real en la sala de operaciones. En 2021, Barrios et al. reportaron una tasa promedio de secciones erróneas de PG de 22.4% dentro de 1,114 casos de tiroidectomía, e incluso cirujanos experimentados que tenían una tasa de error mínima de 7.7%8. Estas altas tasas de secciones erróneas de PG son consistentes con otros informes similares 9,10,11. Por lo tanto, la paratiroidectomía incorrecta es un factor de riesgo independiente para la HP postoperatoria transitoria y permanente.
El desarrollo de métodos efectivos de identificación de PG intraoperatorios es la clave para abordar esta necesidad médica crítica no satisfecha; Sin embargo, se ha visto severamente limitado por la falta de modelos animales en la investigación preclínica. Hasta la fecha, la mayoría de las investigaciones de identificación de PG intraoperatorias se han realizado en pacientes humanos y animales grandes (por ejemplo, perros)12, que son costosos y difíciles de recibir aprobación ética, amplían el número de sujetos y repiten las pruebas. Mientras tanto, el ratón, el modelo de vertebrados más utilizado en la investigación biológica, tiene PG extremadamente pequeño, con un tamaño de menos de 1 mm13. Debido a esta limitación, los modelos de PG de ratón rara vez se han utilizado en la investigación intraoperatoria de identificación de PG.
Este artículo informa el establecimiento de un modelo de rata simple, directo y efectivo para estudios intraoperatorios de identificación de PG. Investigamos el uso de ratas nativas Sprague-Dawley (SD) sin ninguna modificación quirúrgica o ingeniería genética como un modelo animal confiable para probar un agente de contraste de imágenes PG, IONP, en una cirugía de tiroidectomía. Este modelo de rata demuestra una estructura fisiológica muy similar de PG y el microambiente circundante a la de los humanos, y el tamaño de PG de rata es lo suficientemente grande como para ser detectado visualmente en comparación con los de ratones. La mayoría de las ratas tienen un PG a cada lado de la glándula tiroides. La simplicidad y la eficacia de este modelo de rata se han demostrado mediante la realización de imágenes intraoperatorias de PG mejoradas con IONP en la cirugía de tiroidectomía.
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Protocol
Todos los estudios en animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Instituto de Medicina Básica y Cáncer de la Academia China de Ciencias. Esta es una cirugía de no supervivencia.
1. Animal
- Utilice una rata SD hembra de 6-8 semanas de edad, con un peso de 250 g, para la obtención de imágenes de PG intraoperatorias.
2. Anestesia
- Encienda la máquina de anestesia.
- Antes de comenzar, asegúrese de que el nivel de isoflurano esté lleno en el vaporizador de anestesia. Luego, encienda el oxígeno y ajuste el caudal a 0.4-0.8 L / min. Inducir la anestesia con isoflurano al 3-5% y mantener al 2% de isoflurano (caudal: 0,4-0,8 L/min).
- Coloque la rata SD en la caja de la máquina de anestesia y seleccione el modelo de canal para comenzar la anestesia animal.
- Observe la actividad de la rata en la caja. Cuando la rata cae en coma, muévala al cono de la nariz para mantener la anestesia (posición supina inconsciente sin reflejo del dolor y reflejo corneal).
- Use la máscara de anestesia para cubrir la nariz de la rata y cambie la máquina de anestesia al modo de máscara para mantener al animal bajo anestesia durante la cirugía.
3. Postura y fijación
- Transfiera la rata anestesiada a una cortina quirúrgica en una mesa de operaciones quirúrgicas. Coloque una almohadilla térmica precalentada debajo del animal para mantener la temperatura corporal del animal durante la cirugía.
- Use bandas elásticas para fijar las extremidades de la rata a la mesa de operaciones. Coloque una almohada cilíndrica hecha de cortina debajo del hombro de la rata para inclinar la cabeza hacia atrás, exponiendo completamente el área del cuello.
- Aplique ungüento de lágrimas artificiales en ambos ojos de la rata para evitar la sequedad durante la anestesia.
4. Depilación
- Aplicar crema depilatoria en la zona del cuello: hasta el espacio submandibular, hasta la apófisis xifoidea, y en ambos lados hasta el exterior del músculo esternocleidomastoideo.
- Después de 3 minutos, limpie suavemente el cabello y la crema depilatoria con un pañuelo desechable.
5. Esterilización
- Use una bola de algodón yodóforo para desinfectar el área de operación 3 veces desde la mitad del cuello hasta el área circundante. Solo desinfecte el área de la que se eliminó el vello.
6. Colocación quirúrgica de cortinas
- Use una cortina quirúrgica para cubrir el área de operación del cuello de la rata. Mantenga el orificio de la cortina quirúrgica alineado con el área de desinfección del animal.
7. Incisión
- Confirme el plano quirúrgico de la anestesia por falta de un reflejo de pellizco del dedo del pie antes de hacer la incisión. Luego, coloque la cuchilla en el bisturí y use el bisturí para hacer una incisión longitudinal en la línea media anterior del cuello de la rata. Asegúrese de que la longitud de la incisión sea de aproximadamente 5 cm y solo en la dermis.
8. Disección del tejido subcutáneo del músculo cervical anterior
- Levante la piel a lo largo de ambos lados de la incisión.
- Use una tijera para cortar longitudinalmente a lo largo de la línea alba cervicalis.
- Use fórceps para separar el músculo esternohioideo y el músculo esternotiroideo.
9. Fije los músculos anteriores del cuello a ambos lados
- Use fórceps vasculares para sujetar el músculo esternohioideo separado y el músculo esternotiroideo delante del cuello y tire del tejido sujetado hacia afuera.
- Use un retractor o la aguja para pasar la sutura (3-0#) a través del tejido sujetado, haga un nudo y fije la sutura a la cortina quirúrgica de la mesa de operaciones.
10. Localización de la glándula tiroides
- Localice el cartílago tiroides y el cartílago cricoides como el límite superior en el área de operación. Identifique el cartílago tiroides en función de su forma de escudo y el cartílago cricoides en función de su forma de anillo.
- Localice la tráquea como el límite inferior en el área de operación. Busque la tráquea en la parte frontal y media del cuello, según su forma de anillo de cartílago tubular.
- Localice la glándula tiroides entre los límites superior e inferior, una glándula roja en forma de mariposa en el lado opuesto de la tráquea.
11. Identificación visual de la PG
- Localice el PG en los lados superior y externo de la glándula tiroides. Busque dos PG en forma fusiforme de aproximadamente 1.2-2 mm de largo y 1.0-1.5 mm de ancho que sean rojizos pero más claros que la glándula tiroides circundante con un cierto límite.
- Tome una fotografía frontal de la PG con la tráquea, la tiroides y la laringe para comparar cuantitativamente los efectos de la IONP antes y después de la inyección.
- Diseccionar la parte posterior del esófago, luego use el retractor para exponer el lado derecho del PG. Tome una fotografía del lado derecho de la PG con la glándula tiroides y la tráquea.
- Cambie el retractor para exponer el lado opuesto del PG y tome una fotografía del lado izquierdo de ellos con la glándula tiroides y la tráquea.
12. Inyección tiroidea de los IONPs
- Use una jeringa de insulina para inyectar localmente 10 μL de suspensión de IONPs (20 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato) en el centro de la glándula tiroides. Presione suavemente el lugar de inyección con una gasa durante 5 s.
13. Identificación de la PG después de la inyección de IONPs
- Después de la inyección, observe la rápida difusión de los IONP dentro de las glándulas tiroides pero no en el PG, ya que tiñe negativamente el PG y los diferencia de la tiroides circundante.
- Tome una fotografía frontal de la PG teñida negativamente junto con la tráquea, la glándula tiroides y la laringe.
- Tome fotografías del lado izquierdo y derecho del PG teñido negativamente utilizando los mismos procedimientos mencionados anteriormente.
14. Resección de la garganta y la tráquea con la glándula tiroides y PG
- Una vez que las ratas hayan inhalado el exceso de isoflurano (isoflurano al 5% durante más de 5 min) y estén bajo anestesia profunda, eutanasia mediante inyección intracardíaca de 0,5 ml de solución saturada de cloruro de potasio.
- Postmortem, extirpar la garganta, la tráquea, la glándula tiroides y PG.
- Bajo una campana extractora, coloque las muestras de garganta, tráquea, glándula tiroides y PG extraídas en una solución de paraformaldehído al 4% durante 24 h.
15. Estudios histopatológicos
- Deshidratar los tejidos e incrustarlos en parafina. Cortar en secciones de 5 μm de espesor. Hornear las secciones a 37 °C en un horno durante la noche y a 65 °C durante 1 h.
- Manche las secciones con hematoxilina y eosina (H&E) después del lavado 3 x 5 min con alcohol de 75%, 95%, 100% de gradiente y lavado con agua a temperatura ambiente.
- Haga que los patólogos examinen las secciones teñidas con H&E bajo un microscopio óptico.
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Representative Results
En este modelo animal, incisimos quirúrgicamente el cuello de una rata SD para exponer la tráquea, la laringe y los tejidos circundantes. Luego, la glándula tiroides se ubicó visualmente a ambos lados de la tráquea; Tiene forma de mariposa y mide aproximadamente 3 mm x 5 mm. Un par de PG generalmente se encuentran en la parte superior de la glándula tiroides, y su color es muy similar al de los lóbulos de la glándula tiroides, lo que hace extremadamente difícil distinguirlos a simple vista (Figura 1).
Después de la inyección, el agente de contraste (Figura 1 y Figura 2), los IONPs, se difunden fácilmente dentro de la glándula tiroides y la tiñen de negro, pero no pueden infiltrarse en el PG debido a su alta densidad tisular. La distribución desequilibrada de los IONP entre el PG y la glándula tiroides produce un contraste sorprendente, que se puede visualizar fácilmente a simple vista sin necesidad de instrumentos externos. La Figura 2 muestra imágenes representativas de PG teñidas negativamente por IONPs en la tiroides izquierda de la rata, en las que el contraste entre la PG y la glándula tiroides fue notable, y se determinó que el tamaño de PG de rata era de aproximadamente 2 mm x 1 mm.
La autopsia, la laringe de rata y la tráquea, el esófago, la tiroides y la PG adyacentes se resecaron para la tinción histopatológica. Se obtuvieron secciones seriadas del tejido que contenía PG para realizar la tinción de H&E. Estas imágenes teñidas con H&E (Figura 3) revelaron que los PG están enriquecidos con células principales estrechamente alineadas, mientras que la glándula tiroides presenta muchos lúmenes sueltos que indican una densidad de tejido mucho menor.
Figura 1: La estructura fisiológica de PG y su microambiente. Ilustración esquemática de PG humana y glándula tiroides en la inyección pre- (A) y post-IONPs (B). Imágenes representativas de biopsia de tejidos cervicales anteriores de ratas, incluyendo PG, glándula tiroides, tráquea y laringe en la inyección pre- (C) y post-IONPs (D). Se han publicado imágenes adicionales en nuestro estudio anterior15. Abreviaturas: PG = glándulas paratiroides; IONPs = nanopartículas de óxido de hierro; IONP10 = IONPs de 10 nm de diámetro; La escala es en centímetros (cm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Identificación intraoperatoria de PG mejorada con IONPs. Imágenes representativas de lóbulos de la glándula tiroides de rata (A) y IONPs inyectados (B) no tratados en la inyección pre y post-IONPs. La eficacia de la identificación de PG mejorada con IONPs es consistente en reproducible en la inyección pre- (C) y post-IONPs (D). Abreviaturas: PG = glándula paratiroides; IONPs = nanopartículas de óxido de hierro; IONP10 = IONPs de 10 nm de diámetro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis histológico de una glándula tiroides inyectada por IONPs y su microambiente . (A) Fotografías ex vivo representativas de tejidos cervicales anteriores de ratas en la inyección posterior a la IONPs. (B) Imágenes representativas teñidas con H&E de rata PG. Barra de escala = 50 μm. (C) Imagen ampliada del cuadro rojo discontinuo en el panel B. Barra de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Demostramos una técnica de imagen negativa guiada por IONPs de PG de rata utilizando IONPs negros, que se inyectaron localmente en el centro de la glándula tiroides y se difundieron dentro de la glándula tiroides pero no en el PG. Permite la identificación clara del PG a simple vista sin la ayuda de ningún microscopio. Aunque se han descrito ratones transgénicos con proteína verde fluorescente expresada selectivamente en el PG13, el modelo descrito en este trabajo es más sencillo de realizar. Solo toma ~ 1 minuto por rata después de la inyección, y se puede observar una clara diferencia entre la glándula tiroides y PG a simple vista.
Además, otra ventaja de este modelo es que el costo y la dificultad operativa son considerablemente menores para este modelo de rata que para los modelos animales grandes (por ejemplo, perros12) utilizados actualmente en estudios preclínicos para evaluar nuevos métodos de identificación de PG. El costo promedio de una rata SD es cercano al de un ratón BALB/C, que es más de 30 veces más barato que un perro. Esta ventaja de bajo costo del modelo de rata permite expandir el número de sujetos y repetir las pruebas en la investigación preclínica, lo cual es difícil con modelos animales grandes. Mientras tanto, el peso corporal típico de una rata SD es de 300-350 g, que también es más de 66 veces más ligero que el de un perro (22-23 kg)14.
Una diferencia de peso corporal tan grande reduce enormemente la dificultad de operación en el modelo de rata sobre los modelos animales grandes, ya que realizar tiroidectomía en animales grandes como perros requiere procedimientos de anestesia y cirugía más complicados, lo que lo hace más difícil y técnicamente desafiante. El requisito de cirugía (se requieren habilidades quirúrgicas básicas) plantea una limitación para este modelo. Los IONP utilizados en este estudio han demostrado una excelente bioseguridad y biodegradabilidad como se informó anteriormente15. En última instancia, esperamos que este método de imagen negativa de PG en ratas utilizando IONP pueda proporcionar un modelo animal simple y efectivo para estudios preclínicos que involucren la identificación de PG, facilitando así el desarrollo de nuevas técnicas de identificación de PG.
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Disclosures
P.G. y W.Z. son coinventores de una solicitud de patente presentada por el Hospital del Cáncer de la Universidad de la Academia China de Ciencias (Hospital de Cáncer de Zhejiang) basada en el proyecto. Los demás autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC) (82172598), la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Zhejiang, China (LZ22H310001), el Proyecto de Capacitación de Talentos de Salud 551 de la Comisión de Salud de la provincia de Zhejiang, China, y el Proyecto de Ciencia y Tecnología Médica y de Salud de la provincia de Zhejiang, China (2021KY110).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alcohol | Li feng | 9400820067 | |
| anesthesia machine | RWD Company | R520IE | Machine number |
| blade | Daopian | TB-JZ-10# | |
| cylindrical pillow | made by ourselves | ||
| depilatory cream | Nair | TMG-001 | |
| electronic scale | Hong xingda | CN-HXD2 | |
| eosin | Thermo Fisher (Waltham, USA). | C0105S-2 | |
| erythromycin | Shuang ji (Beijing, China) | 200409 | |
| gauze | Fulanns | YY0331-2006 | |
| heating pad | Johon (ShenZhen,China) | JH-36-2006 | |
| hematoxylin | Thermo Fisher (Waltham, USA). | C0105S-1 | |
| insulin injection needle | Jiangyin NanquanMacromolecule | 20170702 | |
| iodophor cotton ball | HOYON | 19-6007 | |
| iron oxide nanoparticle solution | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag9110-05 | |
| isoflurane | Sigma Aldrich (St Louis USA). | 21112801 | |
| needle holder | Meijun | MH0587 | |
| operation table | BioJane | BJ-P-M | |
| paraformaldehyde solution | Biosharp | 21269333 | |
| rubber | G-CLONE | XT41050 |
|
| scanning machine | Olympus | Slideview VS200 | |
| surgical forceps | Suping | SPHC-0676 | |
| surgical knife handle | Aladdin | S3052-06-1EA | |
| surgical retractor | TOCYTO | 18-4010 | |
| surgical scissors | Suping | SPHC-0795 | |
| surgical towel | Along technology | YCKJ-RJ-036205 | |
| suture | Ethicon | SA84G | |
| suture with needle | Jinhuan (Shanghai,China) | F301 | |
| vascular forceps | Along technology | YCKJ-RJ-016218 | |
| Water Bath-Slide Drier | Hua su (Jinhua, China) | HS-1145 |
References
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