Summary
Hidtil er udviklingen af parathyroidkirtel (PG) identifikationsmetoder begrænset af manglen på dyremodeller i præklinisk forskning. Her etablerer vi en enkel og effektiv rottemodel til intraoperativ PG-billeddannelse og evaluerer dens effektivitet ved at bruge jernoxidnanopartikler som et nyt PG-kontrastmiddel.
Abstract
Parathyroidkirtel (PG) identifikation er et kritisk uopfyldt behov i thyroidektomi. Identifikationen af PG er udfordrende i skjoldbruskkirtlen kirurgi, da det er ens i farve til skjoldbruskkirtlen. Manglen på effektive dyremodeller i præklinisk forskning er en alvorlig begrænsning for udviklingen af PG-identifikationsteknikker. Denne protokol gør det muligt at etablere en enkel og effektiv rottemodel til PG-identifikation. I denne model injiceres sorte jernoxidnanopartikler (IONP'er) lokalt i skjoldbruskkirtlen og diffunderer hurtigt i skjoldbruskkirtlen, men ikke PG. En negativt farvet PG og en positivt farvet skjoldbruskkirtel kan let identificeres med det blotte øje uden at kræve eksterne mikroskoper. PG's position kan identificeres ved at øge farvekontrasten mellem skjoldbruskkirtlen og PG, baseret på farven på de sorte IONP'er. Denne rottemodel er billig og praktisk til PG-identifikation, og IONP'erne er et nyt PG-kontrastmiddel.
Introduction
Parathyroidkirtel (PG) er små, ovale formede endokrine kirtler placeret i nakken på mennesker og andre hvirveldyr, som producerer og udskiller parathyroideahormoner for at regulere og balancere calcium- og fosforniveauer i blodet og i knoglerne1. Mennesker har normalt to par PG placeret bag skjoldbruskkirtlen lobes på variable steder; størrelsen af human PG måler typisk 6 mm x 4 mm x 2 mm, med en vægt på ca. 35-40 mg2. Fjernelse eller beskadigelse af PG forårsager hypoparathyroidisme (HP), en endokrin lidelse præget af hypokalcæmi og lave eller uopdagelige niveauer af parathyroidhormoner, som forårsager en bred vifte af symptomer fra krampelignende spasmer til misdannede tænder til kroniske nyresygdomme. Nogle af disse komplikationer er dødelige (f.eks. hjertesvigt og krampeanfald)3,4,5; PG er således afgørende for at regulere kroppens stofskifte og opretholde livet.
HP er en af de mest almindelige komplikationer efter operation i forreste hals, især i thyroidektomi, en veletableret helbredende behandling af kræft i skjoldbruskkirtlen, som er den mest almindelige endokrine kræft på verdensplan 6,7. Post-thyroidektomi HP er overvejende forårsaget af direkte traumer, iskæmi eller fjernelse af PG i kirurgi på grund af en alvorlig mangel på evne til pålideligt at skelne PG fra skjoldbruskkirtellobes og andre omgivende væv (f.eks. lymfeknuder og perifere fedtpartikler) i realtid i operationsrummet. I 2021 rapporterede Barrios et al. en gennemsnitlig PG-fejlsektionsrate på 22.4% inden for 1,114 thyroidektomitilfælde og endda erfarne kirurger, der havde en minimumsfejlrate på 7.7%8. Sådanne høje PG-fejlsnitsrater er i overensstemmelse med andre lignende rapporter 9,10,11. Således er forkert parathyroidektomi en uafhængig risikofaktor for forbigående og permanent postoperativ HP.
Udvikling af effektive intraoperative PG-identifikationsmetoder er nøglen til at imødekomme dette kritiske uopfyldte medicinske behov; Det har dog været stærkt begrænset af manglen på dyremodeller i præklinisk forskning. Til dato er de fleste intraoperative PG-identifikationsundersøgelser blevet udført på humane patienter og store dyr (f.eks. hunde)12, som er dyre og vanskelige at modtage etisk godkendelse, udvide emnenumre og gentage tests. I mellemtiden har musen, den mest almindeligt anvendte hvirveldyrmodel i biologisk forskning, ekstremt lille PG med en størrelse på mindre end 1 mm13. På grund af denne begrænsning er muse-PG-modeller sjældent blevet brugt i intraoperativ PG-identifikationsforskning.
Dette papir rapporterer etableringen af en enkel, ligetil og effektiv rottemodel til intraoperative PG-identifikationsundersøgelser. Vi undersøgte brugen af indfødte Sprague-Dawley (SD) rotter uden kirurgiske ændringer eller genteknologi som en pålidelig dyremodel til test af et PG-billeddannende kontrastmiddel, IONP'er, i en thyroidektomioperation. Denne rottemodel viser en fysiologisk struktur, der i høj grad ligner PG og det omgivende mikromiljø som hos mennesker, og størrelsen af rottens PG er stor nok til at blive visuelt detekteret sammenlignet med mus. De fleste rotter har en PG på hver side af skjoldbruskkirtlen. Enkelheden og effektiviteten af denne rottemodel er blevet demonstreret ved at udføre intraoperativ IONP-forstærket PG-billeddannelse i thyroidektomikirurgi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg er godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Institute of Basic Medicine and Cancer, Chinese Academy of Sciences. Dette er en ikke-overlevelsesoperation.
1. Dyr
- Brug en 6-8 uger gammel SD-rotte, der vejer 250 g, til intraoperativ PG-billeddannelse.
2. Anæstesi
- Tænd anæstesimaskinen.
- Før du begynder, skal du sikre dig, at isofluranniveauet er fuldt i anæstesifordamperen. Tænd derefter for ilten, og indstil strømningshastigheden til 0,4-0,8 l/min. Inducer anæstesi med 3-5% isofluran og hold ved 2% isofluran (strømningshastighed: 0,4-0,8 l / min).
- Sæt SD-rotten i anæstesimaskinens kasse, og vælg kanalmodellen for at starte dyrebedøvelse.
- Overhold rotteaktiviteten i kassen. Når rotten falder i koma, skal du flytte den til næsekeglen for at opretholde anæstesi (ubevidst liggende stilling uden smerterefleks og hornhinderefleks).
- Brug anæstesimasken til at dække rottens næse og skift anæstesimaskinen til masketilstand for at holde dyret under anæstesi under operationen.
3. Kropsholdning og fiksering
- Overfør den bedøvede rotte til et kirurgisk gardin på et operationsbord. Placer en forvarmet varmepude under dyret for at opretholde dyrets kropstemperatur under operationen.
- Brug elastikker til at fastgøre rottens lemmer til operationsbordet. Placer en cylindrisk pude lavet af drapering under rottens skulder for at læne hovedet tilbage og helt udsætte nakkeområdet.
- Påfør kunstige tårer salve på begge øjne af rotten for at forhindre tørhed under anæstesi.
4. Hårfjerning
- Påfør hårfjerningscreme på nakkeområdet: op til det submandibulære rum, ned til xiphoid-processen og på begge sider til ydersiden af sternocleidomastoidmusklen.
- Efter 3 minutter skal du forsigtigt tørre håret og hårfjerningscremen med et væv.
5. Sterilisering
- Brug en Iodophor bomuldskugle til at desinficere operationsområdet 3 gange fra midten af halsen til det omkringliggende område. Desinficer kun det område, hvorfra håret blev fjernet.
6. Kirurgisk drapering lægning
- Brug en kirurgisk drapering til at dække operationsområdet for rottens hals. Hold hullet i det kirurgiske draperi på linje med dyrets desinfektionsområde.
7. Indsnit
- Bekræft det kirurgiske anæstesiplan via mangel på en tåklemmerefleks, inden snittet foretages. Sæt derefter bladet ind i skalpellen og brug skalpellen til at lave et langsgående snit i den forreste midterlinje af rottens hals. Sørg for, at snitlængden er ca. 5 cm og kun i dermis.
8. Dissektion af subkutant væv fra den forreste cervikale muskel
- Løft huden langs begge sider af snittet.
- Brug en saks til at skære i længderetningen langs linea alba cervicalis.
- Brug tang til at adskille sternohyoid muskel og sternothyroid muskel.
9. Fastgør de forreste nakkemuskler til begge sider
- Brug vaskulære tang til at klemme den adskilte sternohyoid muskel og sternothyroid muskel foran halsen og trække det fastspændte væv udenfor.
- Brug en retraktor eller nålen til at føre suturen (3-0#) gennem det fastspændte væv, lav en knude og fastgør suturen til operationsbordets kirurgiske drapering.
10. Lokalisering af skjoldbruskkirtlen
- Find skjoldbruskkirtlen brusk og cricoid brusk som den øvre grænse i operationsområdet. Identificer skjoldbruskkirtlen brusk baseret på dens skjoldform og cricoid brusk baseret på dens ringform.
- Find luftrøret som den nederste grænse i operationsområdet. Se efter luftrøret foran og midt på halsen, baseret på dets rørformede bruskringform.
- Find skjoldbruskkirtlen mellem de øvre og nedre grænser - en rød kirtel i form af en sommerfugl på den modsatte side af luftrøret.
11. Visuel identifikation af PG'en
- Find PG på den øvre og ydre side af skjoldbruskkirtlen. Se efter to PG i en fusiform form på ca. 1,2-2 mm i længden og 1,0-1,5 mm i bredden, der er rødlige, men lettere end den omgivende skjoldbruskkirtel med en vis grænse.
- Tag et frontalt billede af PG med luftrøret, skjoldbruskkirtlen og strubehovedet for kvantitativt at sammenligne virkningerne af IONP før og efter injektion.
- Disseker bagsiden af spiserøret, og brug derefter retraktoren til at udsætte højre side af PG. Tag et billede i højre side af PG med skjoldbruskkirtlen og luftrøret.
- Skift retraktoren for at udsætte den modsatte side af PG og tag et venstre billede af dem med skjoldbruskkirtlen og luftrøret.
12. Thyroid injektion af IONP'erne
- Brug en insulinsprøjte til lokalt at injicere 10 μL IONPs suspension (20 mg / ml i fosfatbufret saltvand) i midten af skjoldbruskkirtlen. Tryk forsigtigt på injektionsstedet med gasbind i 5 sekunder.
13. Identifikation af PG efter injektion af ionp'er
- Efter injektion skal du observere den hurtige diffusion af IONP'erne i skjoldbruskkirtlen, men ikke PG, da det negativt pletter PG og adskiller dem fra den omgivende skjoldbruskkirtel.
- Tag et frontbillede af den negativt farvede PG sammen med luftrøret, skjoldbruskkirtlen og strubehovedet.
- Tag venstre- og højresidefotografier af den negativt farvede PG ved hjælp af de samme procedurer som nævnt ovenfor.
14. Resektion af halsen og luftrøret med skjoldbruskkirtlen og PG
- Når rotterne har inhaleret overskydende isofluran (5% isofluran i mere end 5 min) og er under dyb bedøvelse, aflives de ved intrakardial injektion af 0,5 ml mættet kaliumchloridopløsning.
- Postmortem, fjern halsen, luftrøret, skjoldbruskkirtlen og PG.
- Under en røghætte anbringes den fjernede hals, luftrør, skjoldbruskkirtlen og PG-prøverne i 4% paraformaldehydopløsning i 24 timer.
15. Histopatologiske undersøgelser
- Dehydrere vævene og indlejre dem i paraffin. Skær i 5 μm tykke sektioner. Bages sektionerne ved 37 °C i en ovn natten over og ved 65 °C i 1 time.
- Plet sektionerne med hæmatoxylin og eosin (H&E) efter vask 3 x 5 min med 75%, 95%, 100% gradientalkohol og vandvask ved stuetemperatur.
- Få patologer til at undersøge de H&E-farvede sektioner under et lysmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne dyremodel indskar vi kirurgisk halsen på en SD-rotte for at afsløre luftrøret, strubehovedet og det omgivende væv. Derefter var skjoldbruskkirtlen visuelt placeret på begge sider af luftrøret; Den er sommerfuglformet og ca. 3 mm x 5 mm i størrelse. Et par PG er normalt placeret i den øverste del af skjoldbruskkirtlen, og deres farve ligner meget skjoldbruskkirtlen, hvilket gør det ekstremt vanskeligt at skelne dem med det blotte øje (figur 1).
Efter injektion diffunderer kontrastmidlet (figur 1 og figur 2), IONP'er, let i skjoldbruskkirtlen og pletter det sort, men kan ikke infiltrere PG på grund af deres høje vævstæthed. Den ubalancerede fordeling af IONP'erne mellem PG og skjoldbruskkirtlen giver en slående kontrast, som let kan visualiseres med det blotte øje uden at kræve eksterne instrumenter. Figur 2 viser repræsentative billeder af PG negativt farvet af IONP'er i rottens venstre skjoldbruskkirtel, hvor kontrasten mellem PG og skjoldbruskkirtlen var bemærkelsesværdig, og størrelsen af rotte PG blev bestemt til at være ca. 2 mm x 1 mm.
Postmortem blev rottestrubehovedet og det tilstødende luftrør, spiserør, skjoldbruskkirtel og PG resekteret til histopatologisk farvning. Serielle sektioner af vævet indeholdende PG blev opnået for at udføre H &E-farvning. Disse H&E-farvede billeder (figur 3) afslørede, at PG er beriget med tæt justerede hovedceller, mens skjoldbruskkirtlen har mange løse lumen, der indikerer meget lavere vævstæthed.
Figur 1: Den fysiologiske struktur af PG og deres mikromiljø. Skematisk illustration af human PG og skjoldbruskkirtlen ved injektion før (A) og efter ionp (B). Repræsentative biopsibilleder af rotte anterior cervikal væv, herunder PG, skjoldbruskkirtlen, luftrøret og strubehovedet ved præ- (C) og post-IONP'er injektion (D). Yderligere billeder er blevet offentliggjort i vores tidligere undersøgelse15. Forkortelser: PG = biskjoldbruskkirtler; IONP'er = nanopartikler af jernoxid; IONP10 = IONP'er med en diameter på 10 nm; Skalaen er i centimeter (cm). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Intraoperativ IONP-forbedret PG-identifikation. Repræsentative billeder af ubehandlede (A) og IONPs-injicerede (B) skjoldbruskkirtellapper hos rotter ved injektion før og efter ionp. Effekten af IONPs-forstærket PG-identifikation er konsistent i reproducerbar ved præ- (C) og post-IONP-injektion (D). Forkortelser: PG = biskjoldbruskkirtlen; IONP'er = nanopartikler af jernoxid; IONP10 = IONP'er med en diameter på 10 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Histologisk analyse af en IONP-injiceret skjoldbruskkirtel og dens mikromiljø. A) Repræsentative ex vivo-fotografier af rottens forreste livmoderhalsvæv ved injektion efter ionp. (B) Repræsentative H&E-farvede billeder af rotte PG. Skalabjælke = 50 μm. (C) Zoomet billede af den stiplede røde boks i panel B. Skalabjælke = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi demonstrerer en IONPs-guidet negativ billeddannelsesteknik af rotte PG ved hjælp af sorte IONP'er, som blev injiceret lokalt i midten af skjoldbruskkirtlen og diffunderet i skjoldbruskkirtlen, men ikke PG. Det muliggør klar identifikation af PG med blotte øjne uden hjælp af mikroskop. Selvom transgene mus med grønt fluorescerende protein selektivt udtrykt i PG er blevet rapporteret13, er modellen beskrevet i denne artikel mere ligetil at udføre. Det tager kun ~1 min pr. rotte efter injektion, og en klar forskel mellem skjoldbruskkirtlen og PG kan observeres med blotte øjne.
Derudover er en anden fordel ved denne model, at omkostningerne og driftsvanskelighederne er betydeligt lavere for denne rottemodel end for store dyremodeller (f.eks. hunde12), der i øjeblikket anvendes i prækliniske undersøgelser til evaluering af nye PG-identifikationsmetoder. Den gennemsnitlige pris for en SD-rotte er tæt på en BALB / C-mus, som er over 30 gange billigere end en hund. Denne billige fordel ved rottemodellen giver mulighed for at udvide forsøgspersonnumre og gentage forsøg i præklinisk forskning, hvilket er vanskeligt med store dyremodeller. I mellemtiden er den typiske kropsvægt for en SD-rotte 300-350 g, hvilket også er over 66 gange lettere end en hund (22-23 kg)14.
En så stor kropsvægtforskel reducerer operationsvanskeligheden i rottemodellen enormt i forhold til store dyremodeller, da udførelse af thyroidektomi på store dyr som hunde kræver mere kompliceret anæstesi og kirurgiske procedurer, hvilket gør det vanskeligere og teknisk udfordrende. Kravet om kirurgi (grundlæggende kirurgiske færdigheder er påkrævet) udgør en begrænsning for denne model. IONP'er, der anvendes i denne undersøgelse, har vist fremragende biosikkerhed og bionedbrydelighed som tidligere rapporteret15. I sidste ende håber vi, at denne metode til negativ billeddannelse af rotte-PG ved hjælp af IONP'er kan give en enkel og effektiv dyremodel til prækliniske undersøgelser, der involverer PG-identifikation, og derved lette udviklingen af nye PG-identifikationsteknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
P.G. og W.Z. er medopfindere af en patentansøgning indgivet af Cancer Hospital ved University of Chinese Academy of Sciences (Zhejiang Cancer Hospital) baseret på projektet. De øvrige forfattere erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (NSFC) (82172598), Natural Science Foundation of Zhejiang Province, Kina (LZ22H310001), 551 Health Talent Training Project of Health Commission of Zhejiang Province, Kina, og Medical and Health Science and Technology Project of Zhejiang Province, China (2021KY110).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alcohol | Li feng | 9400820067 | |
| anesthesia machine | RWD Company | R520IE | Machine number |
| blade | Daopian | TB-JZ-10# | |
| cylindrical pillow | made by ourselves | ||
| depilatory cream | Nair | TMG-001 | |
| electronic scale | Hong xingda | CN-HXD2 | |
| eosin | Thermo Fisher (Waltham, USA). | C0105S-2 | |
| erythromycin | Shuang ji (Beijing, China) | 200409 | |
| gauze | Fulanns | YY0331-2006 | |
| heating pad | Johon (ShenZhen,China) | JH-36-2006 | |
| hematoxylin | Thermo Fisher (Waltham, USA). | C0105S-1 | |
| insulin injection needle | Jiangyin NanquanMacromolecule | 20170702 | |
| iodophor cotton ball | HOYON | 19-6007 | |
| iron oxide nanoparticle solution | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag9110-05 | |
| isoflurane | Sigma Aldrich (St Louis USA). | 21112801 | |
| needle holder | Meijun | MH0587 | |
| operation table | BioJane | BJ-P-M | |
| paraformaldehyde solution | Biosharp | 21269333 | |
| rubber | G-CLONE | XT41050 |
|
| scanning machine | Olympus | Slideview VS200 | |
| surgical forceps | Suping | SPHC-0676 | |
| surgical knife handle | Aladdin | S3052-06-1EA | |
| surgical retractor | TOCYTO | 18-4010 | |
| surgical scissors | Suping | SPHC-0795 | |
| surgical towel | Along technology | YCKJ-RJ-036205 | |
| suture | Ethicon | SA84G | |
| suture with needle | Jinhuan (Shanghai,China) | F301 | |
| vascular forceps | Along technology | YCKJ-RJ-016218 | |
| Water Bath-Slide Drier | Hua su (Jinhua, China) | HS-1145 |
References
- Cope, O., Donaldson, G. A. Relation of thyroid and parathyroid glands to calcium and phosphorus metabolism. Study of a case with coexistent hypoparathyroidism and hyperthyroidism. The Journal of Clinical Investigation. 16 (3), 329-341 (1937).
- Mansberger, A. R., Wei, J. P. Surgical embryology and anatomy of the thyroid and parathyroid glands. Surgical Clinics of North America. 73 (4), 727-746 (1993).
- Koch, A., Hofbeck, M., Dorr, H. G., Singer, H. Hypocalcemia-induced heart failure as the initial symptom of hypoparathyroidism. Zeitschrift für Kardiologie. 88 (1), 10-13 (1999).
- Shoback, D. M., et al. Presentation of hypoparathyroidism: etiologies and clinical features. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 101 (6), 2300-2312 (2016).
- Arneiro, A. J., et al. Self-report of psychological symptoms in hypoparathyroidism patients on conventional therapy. Archives of Endocrinology Metabolism. 62 (3), 319-324 (2018).
- Olson, E., Wintheiser, G., Wolfe, K. M., Droessler, J., Silberstein, P. T. Epidemiology of thyroid cancer: a review of the national cancer database, 2000-2013. Cureus. 11 (2), 4127 (2019).
- Du, L., et al. Epidemiology of thyroid cancer: incidence and mortality in China, 2015. Frontiers in Oncology. 10, 1702 (2020).
- Barrios, L., et al. Incidental parathyroidectomy in thyroidectomy and central neck dissection. Surgery. 169 (5), 1145-1151 (2021).
- Sitges-Serra, A., et al. Inadvertent parathyroidectomy during total thyroidectomy and central neck dissection for papillary thyroid carcinoma. Surgery. 161 (3), 712-719 (2017).
- Sakorafas, G. H., et al. Incidental parathyroidectomy during thyroid surgery: an underappreciated complication of thyroidectomy. World Journal of Surgery. 29 (12), 1539-1543 (2005).
- Sahyouni, G., et al. Rate of incidental parathyroidectomy in a pediatric population. OTO Open. 5 (4), (2021).
- Erickson, A. K., et al. Incidence, survival time, and surgical treatment of parathyroid carcinomas in dogs: 100 cases (2010-2019). Journal of the American Veterinary Medical Association. 259 (11), 1309-1317 (2021).
- Bi, R., Fan, Y., Luo, E., Yuan, Q., Mannstadt, M. Two techniques to create hypoparathyroid mice: parathyroidectomy using GFP glands and diphtheria-toxin-mediated parathyroid ablation. Journal of Visualized Experiments. (121), e55010 (2017).
- Soulsby, S. N., Holland, M., Hudson, J. A., Behrend, E. N. Ultrasonographic evaluation of adrenal gland size compared to body weight in normal dogs. Veterinary Radiology & Ultrasound. 56 (3), 317-326 (2015).
- Zheng, W. H., et al. Biodegradable iron oxide nanoparticles for intraoperative parathyroid gland imaging in thyroidectomy. PNAS Nexus. 1 (3), 087 (2022).
