Summary
Præsenteret her er en detaljeret immunohistokemiprotokol til at identificere, validere og målrette funktionelt relevante caspaser i komplekse væv.
Abstract
Familien af caspaser er kendt for at formidle mange cellulære veje ud over celledød, herunder celledifferentiering, axonal pathfinding og spredning. Siden identifikationen af familien af celledødsproteaser har der været en søgning efter værktøjer til at identificere og udvide funktionen af specifikke familiemedlemmer i udviklings-, sundheds- og sygdomstilstande. Imidlertid er mange af de aktuelt kommercielt tilgængelige caspase-værktøjer, der er meget udbredt, ikke specifikke for den målrettede caspase. I denne rapport afgrænser vi den tilgang, vi har brugt til at identificere, validere og målrette caspase-9 i nervesystemet ved hjælp af en ny hæmmer og genetiske tilgange med immunohistokemiske udlæsninger. Specifikt brugte vi det retinale neuronale væv som en model til at identificere og validere tilstedeværelsen og funktionen af caspaser. Denne tilgang muliggør forhør af celletypespecifikke apoptotiske og ikke-apoptotiske caspase-9-funktioner og kan anvendes på andre komplekse væv og caspaser af interesse. At forstå caspasernes funktioner kan bidrage til at udvide den nuværende viden inden for cellebiologi og kan også være en fordel at identificere potentielle terapeutiske mål på grund af deres involvering i sygdom.
Introduction
Caspaserne er en familie af proteaser, der regulerer udviklingscelledød, immunrespons og afvigende celledød i sygdom 1,2. Mens det er velkendt, at medlemmer af caspase-familien induceres i en række neurodegenerative sygdomme, er det mere udfordrende at forstå, hvilken caspase der driver sygdomspatologi3. Sådanne undersøgelser kræver værktøjer til at identificere, karakterisere og validere funktionen af individuelle caspase-familiemedlemmer. Det er vigtigt at analysere de relevante individuelle caspaser både fra et mekanistisk og et terapeutisk synspunkt, da litteraturen har flere undersøgelser, der giver bevis for caspases forskellige roller 4,5. Hvis målet er at målrette en caspase i en sygdom til en terapeutisk fordel, er det således afgørende at have specifik målretning af det eller de relevante familiemedlemmer. Traditionelle teknikker til påvisning af caspaseniveauer i væv omfatter western blotting og enzymatiske og fluorometriske tilgange 3,6. Ingen af disse foranstaltninger tillader imidlertid cellespecifik påvisning af caspaseniveauer, og i nogle scenarier kan spaltede caspaser ofte ikke påvises ved traditionelle proteinanalyseforanstaltninger. Det er kendt, at caspaser kan spille forskellige apoptotiske og ikke-apoptotiske roller i samme væv7, derfor er omhyggelig karakterisering af cellespecifikke caspaseniveauer nødvendig for nøjagtig forståelse af udviklings- og sygdomsveje.
Denne undersøgelse viser caspaseaktivering og funktion i en model af neurovaskulær hypoxi-iskæmi - retinal veneokklusion (RVO)7,8. I et komplekst væv som nethinden er der flere celletyper, der kan påvirkes af hypoxi-iskæmi induceret i RVO, herunder gliaceller, neuroner og vaskulatur7. I den voksne musenethinde er der meget lidt udtryk for caspaser tydeligt i sundt væv, målt ved immunhistokemi (IHC)7, men det er ikke tilfældet under udvikling9 eller i modeller af retinal sygdom10,11. IHC er en teknik, der er veletableret i biomedicinsk forskning og har muliggjort validering af sygdoms- og patologiske mål, identifikation af nye roller gennem rumlig lokalisering og kvantificering af proteiner. I tilfælde, hvor spaltede caspaseprodukter ikke kan påvises ved western blot eller fluorometrisk analyse, eller den specifikke celleplacering af forskellige caspaser eller forhør af caspase-signalveje gennem lokalisering, skal IHC anvendes.
For at bestemme de caspase(s), der er funktionelt relevante i RVO, blev IHC anvendt med validerede antistoffer mod caspaser og cellulære markører. De tidligere undersøgelser udført i laboratoriet viste, at caspase-9 hurtigt blev aktiveret i en model af iskæmisk slagtilfælde og hæmning af caspase-9 med en meget specifik hæmmer beskyttet mod neuronal dysfunktion og død12. Fordi nethinden er en del af centralnervesystemet (CNS), fungerer det som et modelsystem til at forespørge og yderligere undersøge caspase-9's rolle i neurovaskulære skader13. Til dette formål blev musemodellen af RVO brugt til at studere den cellespecifikke placering og fordeling af caspase-9 og dens implikation i neurovaskulær skade. RVO er en almindelig årsag til blindhed hos voksne i den erhvervsaktive alder, der skyldes vaskulær skade14. Det blev konstateret, at caspase-9 blev udtrykt på en ikke-apoptotisk måde i endotelceller, men ikke i neuroner.
Som væv har nethinden den fordel, at den visualiseres som enten en fladmonteret, der tillader påskønnelse af de vaskulære netværk, eller som tværsnit, der fremhæver de neuronale retinale lag. Kvantificering af caspaseproteinekspression i tværsnit giver kontekst, om hvilken caspase der potentielt er kritisk i retinal neuronal forbindelse og synsfunktion ved at identificere lokaliseringen af caspase (r) i nethinden. Efter identifikation og validering opnås målretning af den caspase af interesse ved hjælp af inducerbar cellespecifik sletning af den identificerede caspase. For potentielle terapeutiske undersøgelser blev relevansen af de interesserede caspaser testet ved hjælp af specifikke værktøjer til at hæmme den aktiverede caspase. Til caspase-9 blev der anvendt en celle permeant meget selektiv hæmmer 7,15, Pen1-XBIR3. Til denne rapport blev der anvendt 2 måneder gammel, mandlig C57BL/6J-stamme og tamoxifen-inducerbar endotelcaspase-9 knockout (iEC Casp9KO) stamme med en C57BL/6J-baggrund. Disse dyr blev udsat for musemodellen af RVO, og C57BL/6J blev behandlet med den selektive caspase-9-hæmmer, Pen1-XBir3. Den beskrevne metode kan anvendes på andre sygdomsmodeller i de centrale og perifere systemer 7,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol følger Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) erklæring til brug af dyr i oftalmisk og synsforskning. Gnaverforsøg blev godkendt og overvåget af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Columbia University.
1. Fremstilling af retinalt væv og kryosektion
- Aflivning af dyrene ved administration af intraperitonealbedøvelse (ketamin (80-100 mg/kg) og xylazin (5-10 mg/kg)) og perfusér musene udsat for RVO (se8 for detaljer) med 4% paraformaldehyd (PFA) ved hjælp af en peristaltisk pumpe.
BEMÆRK: Tå-klem dyret for at bekræfte dybden af anæstesi, før du fortsætter med aflivning og perfusion. Detaljer om perfusion findes i16. - Høst øjnene ved omhyggelig enukleation ved hjælp af tang og sæt kloden i 1 ml 4% PFA. Lad øjnene overnatte ved 4 °C. Vask øjnene tre gange i 10 min, tilsæt 1 ml 1x PBS og læg dem i shakeren.
- Dyp øjnene i 1 ml 30% saccharose i 3 dage, indtil de sætter sig til bunden af røret, hvilket indikerer absorption af saccharose.
- Fyld øjnene med optimal skæretemperaturforbindelse med en 30 G sprøjte, indtil øjet har et afrundet udseende (ca. 50 μL).
- Integrer øjnene i en cryomold med optimal skæretemperaturforbindelse, indtil øjnene er dækket, og frys ved -80 °C, indtil de er klar til kryosektion.
- Sektion indlejrede øjnene ved 20 μm på glasrutschebaner ved hjælp af en kryostat.
- Fjern den optimale skæretemperaturforbindelsesblok fra cryomold.
- Placer den på kryostatpatronen ved at tilføje optimal skæretemperaturforbindelse og placere blokken på borepatronen. Lad det være inde i kryotet, indtil det fryser.
- Fortsæt med at skære blokken ved 20 μm, indtil nethindevævet ses.
BEMÆRK: Dette kan bekræftes med et lysmikroskop ved 30x forstørrelse (3x mål, 10x okularer). Væv kan skelnes fra OCT-medierne ved farve og form. - Indsaml retinalvævet i mikroskopglider i en serie på fire sektioner pr. Dias.
BEMÆRK: Se figur 1A for foreslået placering af nethindeafsnit.
- Mærk diasene med et ID, der afidentificerer behandlingen og genotypen.
- Lysbillederne opbevares ved -20 °C indtil farvning.
2. Immunohistokemi
BEMÆRK: Brug fast kryopræserveret væv til immunhistokemi for at opretholde cellemorfologi. Vælg sektioner, der er på niveau med de optiske kohærenstomografi (OCT) billeder, der er erhvervet i vivo7. Brug de to første serier af dias opsamlet fra kryostaten eller sektioner fra 150 μm ind i nethinden.
- Placer lysbillederne i et mørkt og fugtigt glidekammer.
- Permeabilisering og blokering: Vask nethindetværsnittene med 300 μL 1x PBS i 5 minutter for at fjerne OCT og kasseres efter.
- Permeabiliser vævet ved at tilsætte 300 μL 1x PBS med 0,1% Triton X-100 i 2 timer ved stuetemperatur (RT) og kasseres efter.
- Vævet blokeres ved at tilsætte 300 μL blokerende buffer (10% Normal Goat Serum (NGS), 1% Bovine Serum Albumin (BSA) i 1x PBS, filtreret) og lad det stå natten over ved 4 °C.
- Primære antistoffer: Fortynd primære antistoffer i blokerende buffer. Primære antistoffer, der anvendes, omfatter anti-cl-caspase-9 ved 1:800, anti-CD31 ved 1:50 og anti-caspase-7-488 (direkte mærket antistof) ved 1:150.
BEMÆRK: Følg producentens anbefaling for passende fortynding af primære antistoffer.- Hæld blokeringsbufferen af sektioner og påfør 100 μL af den primære antistofcocktail på nethindediasene.
- Inkubere tværsnittene natten over ved 4 °C.
- Sektionerne vaskes fire gange i 5 minutter med 300 μL 1x PBS.
BEMÆRK: Hvis vævssektionerne er meget skrøbelige, skal vask fjernes ved hjælp af kapillær virkning ved at påføre et væv på hjørnet af diaset for at undgå at forskyde nethindesektionerne. - For at undgå krydsmærkning af primære antistoffer, der er opdrættet i den samme værtsart, skal farvningen færdiggøres med sekundære antistoffer, inden de direkte mærkede antistoffer påføres.
- Sekundære antistoffer: Fortynd de sekundære antistoffer i blokerende buffer i en koncentration på 0,1%. For eksempel at detektere anti-cl-caspase-9, et antistof opdrættet i kanin, skal du bruge ged-anti-kanin-568 sekundær.
- Påfør 200 μL af den sekundære antistofcocktail på nethinden.
- Inkuber vævet i 2 timer ved RT.
- Sektionerne vaskes fire gange i 5 minutter med 300 μL 1x PBS.
- Plet kernerne i 5 minutter med 300 μL DAPI ved en fortynding på 0,02%.
- Vask en gang i 5 minutter med 300 μL 1x PBS.
- Placer en dækslip på nethindesektionerne ved hjælp af 500 μL fluoromount-G-medier, som bevarer det fluorescerende signal, og placer forsigtigt dækslippen på toppen af diaset, så du undgår bobler.
3. Konfokal billeddannelse
- Få billeder af de farvede sektioner med konfokal mikroskopi.
- Tænd for det konfokale mikroskop.
- Placer diaset på scenen.
- Juster fokus for at se nethinden tydeligt.
BEMÆRK: Tag mindst fire billeder pr. sektion og billede fire sektioner pr. Nethinde. Se nethindebilledskemaet for foreslåede billeddannelsesområder (figur 1B, C).
- Billedkaspase, vaskulær og nuklear farvning ved hjælp af et konfokalmikroskop, der har Z-stack-erhvervelse, ved hjælp af et 20x eller 40x mål.
BEMÆRK: Billedparametrene og softwareopsætningen skal være konstant for al billeddannelse i et eksperiment. 20x-målet giver et overblik over nethindelagene, som er veldefinerede af kernefarvningen. 40x-målet giver flere cellulære detaljer.- Indstil passende eksponerings- og laserintensitetstider pr. kanal ved at klikke på hentningsindstillinger.
- Indstil Z-stakken til at visualisere hele sektionen ved at klikke på Z-serien og indstil op og ned parametre for at dække dybden af vævet.
- Gem billederne efter det maskerede ID, der er tildelt under kryosektion.
4. Kvantificering af caspaseniveauer
- Træk billedfiler med 405, 470, 555 og 640 kanaler til FIJI's konsol.
- Klik på Billede > farve > flette kanaler.
- Tildel farver til filerne som følger: rød til 555, grøn til 470, grå til 405, cyan til 640.
- Komprimer Z-stakken ved at klikke på Billede > stak > Z-projekt.
- Klik på Projektionstype: Maks. intensitet.
- Åbn kanalgrænsefladen ved at klikke på Værktøj Billed- > farvekanaler.
- Åbn grænsefladen Lysstyrke og kontrast .
- Vælg parametre pr. kanal.
- Gå til Kanaler , og vælg én kanal.
- Sæt markøren oven på caspase-ekspressionscellen, og annoter pixelværdien.
- Sæt markøren oven på baggrunden, og anmærk pixelværdien.
- Test parametre
- Gå til grænsefladen Lysstyrke og kontrast.
- Klik på Vælg.
- Tilslut den mindste viste værdi (kommenteret pixelværdi for den caspase-udtrykte celle).
- Tilslut den maksimale viste værdi (kommenteret pixelværdi for baggrunden).
- Klik på Ok.
- Gentag trin 4.8-4.9 for alle kanaler.
- Test parametrene ved at vælge tilfældige billeder fra blindet væv.
BEMÆRK: Rediger kun lysstyrke- og kontrastparametre, hvis baggrundsværdien ikke er tilstrækkelig til andre billeder. - Når parametrene er indstillet, skal du åbne billedfilerne og komprimere Z-stakken.
- Tilføj lysstyrke- og kontrastparametrene for caspasekanalen og isolectin, vaskulær markørkanal.
- Brug punktværktøjet til at kvantificere antallet af vaskulære positive områder ved hjælp af colokalisering af den vaskulære markør med caspase-ekspression som aflæsning af positive områder.
- Gentag trin 4.14, men brug Hoechst som markør for neuronale positive områder.
- Anmærk værdierne i et regneark pr. billede.
- Gennemsnit af værdierne efter sektion.
- Gennemsnit af sektionsværdierne - dette vil være udlæsningen pr. Øje.
5. Genetisk bekræftelse af relevansen af endotelcellecaspase-9
- Brug nethinder fra Casp9FL/FL-VECad-CreERT2-musene, der blev udsat for RVO7.
- Immunostain nethinden for caspase-9 (den slettede caspase), caspase-7 (en down-stream effector caspase), vaskulære markører og DAPI som beskrevet ovenfor i afsnit 2.
- Billede og kvantificer som beskrevet ovenfor i afsnit 3 og 4.
6. Målretning mod caspase-9 i RVO
- Få øjne fra musene udsat for RVO efterfulgt af påføring af caspase-9-hæmmeren Pen1-XBir3 topisk på øjnene som i7.
- Immunostain nethinden for caspase-7 (en down-stream effektor caspase), vaskulære markører og DAPI som beskrevet ovenfor i punkt 2.
- Billede og kvantificer som beskrevet ovenfor i afsnit 3 og 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrevne protokol giver brugeren mulighed for at analysere og kvantificere caspase-9 niveauer i retinalvævet. Derudover præsenterer den værktøjer til yderligere at identificere, validere og specifikt målrette caspase-9 og downstream substrater. De opsummerede trin muliggør kvantificerbar analyse af caspaseniveauer og cellulær specificitet i fluorescerende fotomikrografer. Alle tal viser repræsentative fotomikrografer og kvantificering af de angivne caspaseniveauer i den samlede nethinde, endotelceller og neuroner i uskadte og 1-dages P-RVO nethindetværsnit. Retinaltværsnittet tillader visualisering af retinale kerner i retinal ganglionlaget (RGL), det indre nukleare lag (INL) og det ydre nukleare lag (ONL), når det farves med Hoechst. Derudover er retinale blodkar synlige i retinal plexiformlagene eller mellem RGL og INL og mellem INL og ONL. På grund af blodkarens histologiske karakter, når nethinden er sektioneret, vil blodkar fremstå som afbrudt og adskilt og forsyne plexiformlagene. Figur 2 identificerer caspase-9 som stærkt reguleret 1-dages P-RVO. Figur 3 validerer den funktionelle relevans af endotelcaspase-9 ved hjælp af inducerbare endotelcelle knockoutmus. Figur 4 viser, at målretning af aktiv caspase-9 farmakologisk blokerer induktionen af et downstream-mål for caspase-9-caspase-7. Protokollen identificerer den cellulære lokalisering af caspaserne og de neuronale retinale lag, hvori caspaserne udtrykkes.
Figur 1: Retinal billeddannelse . (A) Anbefalet placering af retinale sektioner i mikroskopglasset. (B) Oversigt over billeddannelsesområderne i nethinden. (C) Repræsentation af retinal visning ved 20x mål. Retinale lag: RGL = retinalt ganglionlag, INL = indre nukleart lag, ONL = ydre nukleare lag. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: RVO inducerer caspase-9 i endotelceller og neuroner. (A) Repræsentative retinale tværsnit fra uskadt og 1-dags P-RVO farvet med cl-caspase-9 1:800 (grøn), isolectin 1:200 (rød) og DAPI (hvid). (B) Kvantificering af antallet af neuroner med cl-caspase-9 (se materialetabel for detaljer om antistofferne). (C) Kvantificering af antallet af endotelceller med cl-caspase-9. (D) Samlet antal celler, der udtrykker cl-caspase-9. Uskadt, n = 6; 1-dages P-RVO, n = 5. Fejllinjer repræsenterer middelværdien ± SEM; Envejs ANOVA, Fishers LSD-test. Skala bar = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Endotelcelle deletion af endotel caspase-9 blokke RVO-induktion af caspase-7. (A) Repræsentative retinale tværsnit fra iEC Casp9WT og iEC Casp9KO kuldmate mus 1-dages P-RVO farvet med caspase-7 (grøn), cl-caspase-9 (blå), CD31, en vaskulær markør (rød) og DAPI (hvid). (B) Kvantificering af antallet af celler i den indre nethinde med cl-caspase-9 og med caspase-7. (C) Kvantificering af antallet af endotelceller med cl-caspase-9 og med caspase-7. (D) Samlet antal celler, der udtrykker cl-caspase-9 eller caspase-7. iEC Casp9WT, n = 6-12; iEC Casp9KO, n = 3-8. Fejllinjer repræsenterer middelværdien ± SEM; Envejs ANOVA, Fishers LSD-test. Skala bar = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Hæmning af caspase-9-aktivitet hæmmer caspase-7-ekspression P-RVO. (A) Repræsentative retinale tværsnit fra uskadte og 1-dages P-RVO behandlet eller ubehandlet med Pen1-XBIR3 farvet med caspase-7 (grøn), isolectin (rød) og DAPI (hvid). (B) Kvantificering af antallet af endotelceller med caspase-7. (C) Kvantificering af antallet af leukocytter med caspase-7. (D) Kvantificering af antallet af neuroner pr. neuronalt lag med caspase-7. (E) Samlet antal celler, der udtrykker caspase-7. Uskadt Pen1 saltvand, n = 6; uskadt Pen1-XBIR3, n = 5; 1-dages P-RVO Pen1 saltvand, n = 5; 1-dages P-RVO Pen1-XBIR3, n = 3. Fejllinjer repræsenterer middelværdien ± SEM; Envejs ANOVA, Fishers LSD-test. Forkortelser: RGL = retinalt ganglionlag, INL = indre nukleart lag og ONL = ydre nukleare lag. Skala bar = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Caspaser er en flermedlemsfamilie af proteaser, der bedst studeres for deres roller i celledød og betændelse; for nylig er der imidlertid blevet afdækket en række ikke-dødsfunktioner for nogle familiemedlemmer 4,5. Meget af vores forståelse af caspase-funktion stammer fra arbejde i cellekultur og fra inferentielle data fra menneskelig sygdom. Mens det er værdsat, at der er afvigende induktion, aktivering eller inaktivering af caspaser i sygdom, har det været udfordrende at funktionelt afgøre, om caspaserne driver sygdomspatologi. Mange værktøjer, der bruges til at vurdere specifikke caspaser, registrerer flere familiemedlemmer, hvilket undergraver den funktionelle relevans af data opnået med disse reagenser17. Her giver vi en protokol til at studere caspaser i komplekst væv ved hjælp af nethinden som et eksempel. I nervesystemet er caspase-ekspression nedreguleret før og postnatalt. Dette gør det muligt at bruge specifikke antistoffer til at teste ændringer i caspaseniveauer i en sygdomsmodel.
Mens protokollens fokus er på billedbehandling og analyse, er teknikkens succes også afhængig af omhyggelig vævsforberedelse samt IHC og mikroskopisk billeddannelse for at sikre konsistens, validitet og pålidelighed af dataene. Man skal passe på at bruge de samme parametre til at afbilde et helt datasæt. Billeder af dårlig kvalitet, lav kontrast og sløret fokus giver ikke pålidelige data. Ved sektionering og billeddannelse af P-RVO-regioner på nethinden bør tårer og foldning undgås, da disse områder kan resultere i artefakter. Områder med direkte skade bør også undgås. Efterforskeren, der udfører billeddannelsen, skal være blindet for behandlingen af vævet. Til analyse anbefales det, at to uafhængige observatører, blindet for behandlingsgruppen, udfører analysen. Derudover bør primære museantistoffer ikke anvendes i modeller for museskader, da de sekundære antistoffer binder ikke-specifikt til vaskulaturen. Et alternativ er at bruge direkte konjugerede primære antistoffer.
En alternativ tilgang til celletælling er kvantificering af procentdelen af ekspressionsområdet. Dette kan bruges, når celletælling ikke er mulig (f.eks. Hvis caspaseekspression er lokaliseret til neuronale processer eller fotoreceptorsegmenter). Central og perifer nethinden påvirkes forskelligt i forskellige skademodeller. Metoden kan tilpasses til specifikt at analysere forskellige retinale regioner. Hvis du udfører BRVO, skal sektioner vælges fra den skadede del af øjet. Protokollen giver også mulighed for farvning af forskellige cellemarkører for at identificere, hvor caspasen udtrykkes.
Metodens begrænsninger inkluderer, at den ikke skelner mellem høje og lave niveauer af caspasesignal i en given celle. Derudover er det praktisk at bruge en nuklear plet til at identificere neuronale lag, men indikerer ikke endeligt neuronal ekspression (glia og leukocytter er også til stede i disse lag). Yderligere neuronale markører kan bruges til at validere neuronal ekspression. Der er også en række antistoffer til rådighed til evaluering af caspase-ekspression; Disse er bedst defineret for human caspase-9, hvor der er antistoffer for fuld længde / spaltet (CL) Caspase-9, Autocleaved Caspase-9 og Caspase-3-cleaved Caspase-9.
Den gennemsnitlige intensitet af IHC-signalet rapporteres ofte som en kvantificeringsmetode. Baggrundsstøj eller autofluorescens fra røde blodlegemer kan dog give unøjagtige resultater. Cellespecifik kvantificering muliggør bestemmelse og diskrimination af baggrund, ikke-specifik farvning og autofluorescens.
Denne protokol kan bruges til at måle vævsbrede ændringer i ekspressionen af individuelle caspaser, ændringer i ekspression i en bestemt celletype, såsom en endotelcelle, og ændringer i specifikke celletyper på bestemte steder, såsom neuroner i forskellige retinale lag. Denne fleksibilitet gør det muligt for eksperimentatoren at forespørge, hvordan sygdomstilstanden ændrer individuelle caspaseniveauer. Eksisterende /alternative metoder bruger western blotting-analyse til semikvantitativ sammenligning af caspase-signalering, selvom metoder ikke vil give den klare adskillelse af cellulær lokalisering, som denne protokol acheives. Især i figur 3D er caspase-9-hæmning mere effektiv til at reducere neuronal caspase-9 i INL og OLL sammenlignet med RGL. Denne form for opløsning er udfordrende at opnå ved hjælp af andre metoder. Derudover, når et helt væv analyseres biokemisk, kan niveauerne af caspaser, der ændrer sig, være for lave til at afhente, da der er mange forskellige celletyper i et komplekst væv.
Antistofferne, som skal valideres af brugeren, giver specificitet for caspase-sonden. Caspaser kan virke i kaskader (dvs. initiator, der aktiverer effektor og derefter fører til udfald - død, betændelse, cellesignalering). Denne protokol kan bruges i prøver indsamlet på forskellige tidspunkter efter skaden; i de eksempler, der præsenteres her, indsamles prøver på forskellige tidspunkter efter RVO. I tidligere offentliggjort arbejde har det vist sig, at caspase-9 blev øget inden for 1 time efter RVO7, hvilket førte til yderligere validerings- og målretningsundersøgelser. Efter at have identificeret endotelcaspase-9 som en potentiel drivkraft for RVO-patologi, blev der anvendt en mus med inducerbar endotelcelle caspase-9KO til validering af endotelcaspase-9. Brugen af inducerbare cellespecifikke caspase KO-mus giver et andet niveau af specificitet og undgår den udviklingsmæssige død, der ses med konstitutiv caspase-9KO18. Det undgår også kompenserende ændringer hos andre familiemedlemmer, der har vist sig at forekomme i konstitutive caspase KO-mus19. Desuden tillader brugen af cellespecifikke inducerbare caspase KO-mus identifikation af den celletype, hvor caspasen regulerer patologi i vævet. Protokollen giver også trinene til at forhøre effektiviteten af en terapeutisk tilgang, rettet mod aktiv caspase-9 i RVO. Denne tilgang kan også anvendes på andre væv, herunder hjernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer følgende konkurrerende interesser: C.M.T. har følgende patentansøgninger US20200164026, US20190142915 og US20150165061. C.M.T. og S.S. har en patentansøgning US 20140024597. C.M.T., A.M.P. og M.I.A. har en patentansøgning US2020058683. C.M.T. og Y.Y.J. har en patentansøgning WO2018013519. M.I.A og C.M.T er opført som opfindere på en patentansøgning WO / 2020 / 223212 af trustees of Columbia University i Byen New York. De resterende forfattere erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) tilskud DGE - 1644869 og National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) fra National Institutes of Health (NIH), tildelingsnummer F99NS124180 NIH NINDS Diversity Specialized F99 (til CKCO), National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (til AMP), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (RO1 NS081333, R03 NS099920 til CMT) og Forsvarsministeriets Hær/Luftvåben (DURIP til CMT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-Caspase-7 488 | Novus Biologicals | NB-56529AF488 | use at 1:150 |
| anti-cl-Caspase-9 | Cell Signaling | 9505-S | use at 1:800 |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | 553370 | use at 1:50 |
| Confocal Spinning Disc Microscope | Biovision | ||
| FIJI 2.3.0 | open source | ||
| Fluormount G | Fisher | 50-187-88 | |
| Forcep | Roboz | RS-5015 | |
| iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Isolectin (594, 649) | Vector | DL-1207 | use at 1:200 |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Perfusion pump | Masterflex | ||
| Pen1-XBir3 | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Prism 9.1 | GraphPad | ||
| Tissue-Tek O.C.T. | Fisher | 14-373-65 | |
| Vis-a-View 4.0 | Visitron Systems | ||
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
- Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. Caspases in cell death, inflammation, and disease. Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).
- Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. A primer on caspase mechanisms. Seminars in Cell & Developmental Biology. 82, Academic Press. 79-85 (2018).
- Troy, C. M., Jean, Y. Y. Caspases: therapeutic targets in neurologic disease. Neurotherapeutics. 12 (1), 42-48 (2015).
- Avrutsky, M. I., Troy, C. M. Caspase-9: a multimodal therapeutic target with diverse cellular expression in human disease. Frontiers in Pharmacology. 12, 1728 (2021).
- Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147 (4), 742-758 (2011).
- Troy, C. M., Akpan, N., Jean, Y. Y. Regulation of caspases in the nervous system: implications for functions in health and disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 99, 265-305 (2011).
- Avrutsky, M. I., et al. Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion. Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).
- Colon Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J. M., Smart, J., Troy, C. M. Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability. Journal of Visualized Experiments. (174), e62980 (2021).
- Tisch, N., et al. Caspase-8 modulates physiological and pathological angiogenesis during retina development. The Journal of Clinical Investigation. 129 (12), 5092-5107 (2019).
- Chi, W., et al. HMGB1 promotes the activation of NLRP3 and caspase-8 inflammasomes via NF-kappaB pathway in acute glaucoma. Journal of Neuroinflammation. 12, 137 (2015).
- Thomas, C. N., et al. Caspase-2 mediates site-specific retinal ganglion cell death after blunt ocular injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (11), 4453-4462 (2018).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. Journal of Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nature Reviews Neurology. 9 (1), 44-53 (2013).
- Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors. Journal of Global Health. 9 (1), 010427 (2019).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. The Journal of neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death & Differentiation. 15 (2), 322-331 (2007).
- Kuida, K., et al. Reduced apoptosis and cytochrome c-mediated caspase activation in mice lacking caspase 9. Cell. 94 (3), 325-337 (1998).
- Troy, C. M., et al. Death in the balance: alternative participation of the caspase-2 and -9 pathways in neuronal death induced by nerve growth factor deprivation. Journal of Neuroscience. 21 (14), 5007-5016 (2001).
