Summary
Un protocole d’immunohistochimie détaillé est présenté ici pour identifier, valider et cibler les caspases fonctionnellement pertinentes dans les tissus complexes.
Abstract
La famille des caspases est connue pour arbitrer de nombreuses voies cellulaires au-delà de la mort cellulaire, y compris la différenciation cellulaire, la recherche axonale et la prolifération. Depuis l’identification de la famille des protéases de mort cellulaire, il y a eu une recherche d’outils pour identifier et élargir la fonction de membres spécifiques de la famille dans les états de développement, de santé et de maladie. Cependant, bon nombre des outils de caspase actuellement disponibles dans le commerce qui sont largement utilisés ne sont pas spécifiques pour les caspases ciblées. Dans ce rapport, nous décrivons l’approche que nous avons utilisée pour identifier, valider et cibler la caspase-9 dans le système nerveux à l’aide d’un nouvel inhibiteur et d’approches génétiques avec des lectures immunohistochimiques. Plus précisément, nous avons utilisé le tissu neuronal rétinien comme modèle pour identifier et valider la présence et la fonction des caspases. Cette approche permet l’interrogation des fonctions apoptotiques et non apoptotiques de caspase-9 spécifiques au type cellulaire et peut être appliquée à d’autres tissus complexes et caspases d’intérêt. Comprendre les fonctions des caspases peut aider à élargir les connaissances actuelles en biologie cellulaire et peut également être avantageux pour identifier des cibles thérapeutiques potentielles en raison de leur implication dans la maladie.
Introduction
Les caspases sont une famille de protéases qui régulent la mort cellulaire développementale, les réponses immunitaires et la mort cellulaire aberrante dans la maladie 1,2. Bien qu’il soit bien connu que les membres de la famille des caspases sont induits dans une variété de maladies neurodégénératives, comprendre quelle caspase est à l’origine de la pathologie de la maladie est plus difficile3. De telles études nécessitent des outils pour identifier, caractériser et valider la fonction des membres individuels de la famille des caspases. L’analyse des caspases individuelles pertinentes est importante tant d’un point de vue mécaniste que thérapeutique, car la littérature contient de nombreuses études fournissant des preuves des divers rôles des caspases 4,5. Ainsi, si l’objectif est de cibler une caspase dans une maladie pour un bénéfice thérapeutique, il est essentiel d’avoir un ciblage spécifique du ou des membres de la famille concernés. Les techniques traditionnelles de détection des niveaux de caspases dans les tissus comprennent le transfert Western et les approches enzymatiques et fluorométriques 3,6. Cependant, aucune de ces mesures ne permet la détection spécifique des niveaux de caspases par les cellules et, dans certains scénarios, les caspases clivées ne peuvent souvent pas être détectées par les mesures traditionnelles d’analyse des protéines. On sait que les caspases peuvent jouer différents rôles apoptotiques et non apoptotiques dans le même tissu7, c’est pourquoi une caractérisation minutieuse des niveaux de caspases spécifiques aux cellules est nécessaire pour une compréhension précise des voies de développement et de la maladie.
Cette étude montre l’activation et la fonction des caspases dans un modèle d’hypoxie-ischémie neurovasculaire - occlusion veineuse rétinienne (OVR)7,8. Dans un tissu complexe tel que la rétine, il existe plusieurs types de cellules qui peuvent être affectées par l’hypoxie-ischémie induite dans l’OVR, y compris les cellules gliales, les neurones et le système vasculaire7. Dans la rétine de souris adulte, il y a très peu d’expression des caspases évidente dans les tissus sains, telle que mesurée par immunohistochimie (IHC)7, mais ce n’est pas le cas au cours du développement9 ou dans les modèles de maladie rétinienne10,11. L’IHC est une technique bien établie dans la recherche biomédicale qui a permis de valider des cibles pathologiques et pathologiques pathologiques et d’identifier de nouveaux rôles grâce à la localisation spatiale et de quantifier les protéines. Dans les cas où les produits de caspases clivés ne peuvent pas être détectés par transfert Western ou analyse fluorométrique, ni par l’emplacement cellulaire spécifique de caspases distinctes ou l’interrogation des voies de signalisation des caspases par localisation, alors IHC devrait être utilisé.
Afin de déterminer la ou les caspases fonctionnellement pertinentes dans l’OVR, l’IHC a été utilisée avec des anticorps validés pour les caspases et les marqueurs cellulaires. Les études précédentes réalisées en laboratoire ont montré que la caspase-9 était rapidement activée dans un modèle d’AVC ischémique et d’inhibition de la caspase-9 avec un inhibiteur hautement spécifique protégé du dysfonctionnement neuronal et de la mort12. Parce que la rétine fait partie du système nerveux central (SNC), elle sert de système modèle pour interroger et étudier plus en détail le rôle de la caspase-9 dans les lésions neurovasculaires13. À cette fin, le modèle murin de RVO a été utilisé pour étudier l’emplacement et la distribution spécifiques des cellules de la caspase-9 et son implication dans les lésions neurovasculaires. La RVO est une cause fréquente de cécité chez les adultes en âge de travailler qui résulte d’une lésion vasculaire14. Il a été constaté que la caspase-9 était exprimée de manière non apoptotique dans les cellules endothéliales, mais pas dans les neurones.
En tant que tissu, la rétine a l’avantage d’être visualisée soit comme un montage plat, ce qui permet d’apprécier les réseaux vasculaires, soit comme des coupes transversales, ce qui met en évidence les couches neuronales de la rétine. La quantification de l’expression de la protéine caspase dans les coupes transversales fournit un contexte, en ce qui concerne la caspase potentiellement critique dans la connectivité neuronale rétinienne et la fonction de vision en identifiant la localisation de la ou des caspases dans la rétine. Après identification et validation, le ciblage de la caspase d’intérêt est réalisé en utilisant la délétion spécifique de la cellule inductible de la caspase identifiée. Pour les recherches thérapeutiques potentielles, la pertinence des caspases d’intérêt a été testée à l’aide d’outils spécifiques pour inhiber les caspases activées. Pour la caspase-9, un inhibiteur hautement sélectif de la permération cellulaire 7,15, Pen1-XBIR3 a été utilisé. Aux fins du présent rapport, on a utilisé la souche mâle C57BL/6J âgée de 2 mois et la souche knockout endothéliale inductible par le tamoxifène (iEC Casp9KO) avec un fond C57BL/6J. Ces animaux ont été exposés au modèle murin de RVO et C57BL/6J ont été traités avec l’inhibiteur sélectif de la caspase-9, Pen1-XBir3. La méthodologie décrite peut être appliquée à d’autres modèles de maladie dans les systèmes central et périphérique 7,15.
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Protocol
Ce protocole suit la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l’utilisation des animaux dans la recherche en ophtalmologie et en vision. Les expériences sur les rongeurs ont été approuvées et surveillées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université Columbia.
1. Préparation du tissu rétinien et cryosectionnement
- Euthanasier les animaux par administration d’anesthésie intrapéritonéale (kétamine (80-100 mg/kg) et xylazine (5-10 mg/kg)), et perfuser les souris soumises à la RVO (voir8 pour plus de détails) avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) à l’aide d’une pompe péristaltique.
REMARQUE : Pincez l’animal pour confirmer la profondeur de l’anesthésie avant de procéder à l’euthanasie et à la perfusion. Des détails sur la perfusion peuvent être trouvés dans16. - Récoltez les yeux par énucléation soigneuse à l’aide d’une pince et mettez le globe dans 1 mL de PFA à 4%. Laisser les yeux toute la nuit à 4 °C. Lavez les yeux trois fois pendant 10 minutes, en ajoutant 1 ml de 1x PBS et en les plaçant dans le shaker.
- Plonger les yeux dans 1 mL de saccharose à 30% pendant 3 jours, jusqu’à ce qu’ils se déposent au fond du tube, indiquant l’absorption du saccharose.
- Remplissez les yeux avec un composé à température de coupe optimale à l’aide d’une seringue de 30 G, jusqu’à ce que l’œil ait un aspect arrondi (environ 50 μL).
- Incorporer les yeux dans un cryomoule avec un composé à température de coupe optimale jusqu’à ce que les yeux soient couverts et congeler à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être cryosectionnés.
- Section a encastré les yeux à 20 μm sur des lames de verre à l’aide d’un cryostat.
- Retirez le bloc composé à température de coupe optimale du cryomoule.
- Placez-le sur le mandrin du cryostat en ajoutant un composé à température de coupe optimale et en plaçant le bloc sur le mandrin. Laissez-le à l’intérieur du cryostat jusqu’à ce qu’il gèle.
- Procéder à la coupe du bloc à 20 μm jusqu’à ce que le tissu rétinien soit visible.
REMARQUE: Cela peut être confirmé avec un microscope optique à grossissement 30x (objectif 3x, oculaires 10x). Les tissus peuvent être distingués des médias OCT par leur couleur et leur forme. - Recueillir le tissu rétinien dans des lames de microscope en une série de quatre sections par lame.
REMARQUE : Voir la figure 1A pour la mise en place suggérée de coupes rétiniennes.
- Étiquetez les lames avec un ID qui anonymise le traitement et le génotype.
- Conserver les lames à -20 °C jusqu’à coloration.
2. Immunohistochimie
REMARQUE: Utilisez des tissus cryoconservés fixes pour l’immunohistochimie afin de maintenir la morphologie cellulaire. Choisir des sections qui se trouvent au niveau des images de tomographie par cohérence optique (TCO) acquises in vivo7. Utilisez les deux premières séries de lames prélevées sur le cryostat ou des coupes de 150 μm dans le tissu rétinien.
- Placez les lames dans une chambre à glissière sombre et humide.
- Perméabilisation et blocage: Laver les sections transversales rétiniennes avec 300 μL de 1x PBS pendant 5 min pour enlever l’OCT et jeter après.
- Perméabiliser le tissu en ajoutant 300 μL de 1x PBS avec 0,1% de Triton X-100 pendant 2 h à température ambiante (RT) et jeter après.
- Bloquer le tissu en ajoutant 300 μL de tampon bloquant (10% de sérum de chèvre normal (NGS), 1% de sérum albumine bovine (BSA) dans 1x PBS, filtré) et laisser reposer toute la nuit à 4 °C.
- Anticorps primaires: Diluer les anticorps primaires dans le tampon de blocage. Les anticorps primaires utilisés comprennent l’anti-cl-caspase-9 à 1:800, l’anti-CD31 à 1:50 et l’anti-caspase-7-488 (anticorps marqué directement) à 1:150.
REMARQUE : Suivez les recommandations du fabricant pour la dilution appropriée des anticorps primaires.- Versez le tampon de blocage sur les sections et appliquez 100 μL du cocktail d’anticorps primaires sur les lames rétiniennes.
- Incuber les sections transversales pendant une nuit à 4 °C.
- Lavez les sections quatre fois pendant 5 min avec 300 μL de 1x PBS.
REMARQUE: Si les sections de tissu sont très fragiles, les lavages doivent être enlevés en capillarité en appliquant un mouchoir au coin de la lame pour éviter de déplacer les sections rétiniennes. - Pour éviter le marquage croisé des anticorps primaires élevés chez la même espèce hôte, complétez la coloration avec des anticorps secondaires avant d’appliquer les anticorps directement marqués.
- Anticorps secondaires: Diluer les anticorps secondaires dans un tampon de blocage à une concentration de 0,1%. Par exemple, pour détecter l’anti-cl-caspase-9, un anticorps élevé chez le lapin, utilisez chèvre-anti-lapin-568 secondaire.
- Appliquer 200 μL du cocktail d’anticorps secondaires sur les rétines.
- Incuber le tissu pendant 2 h à TA.
- Lavez les sections quatre fois pendant 5 min avec 300 μL de 1x PBS.
- Colorer les noyaux pendant 5 min avec 300 μL de DAPI à une dilution de 0,02%.
- Laver une fois pendant 5 min avec 300 μL de 1x PBS.
- Placez un bordereau sur les sections rétiniennes à l’aide de 500 μL de média fluoromount-G, qui préserve le signal fluorescent, et placez soigneusement le bordereau sur le dessus de la lame, en évitant les bulles.
3. Imagerie confocale
- Acquérir des images des coupes colorées avec la microscopie confocale.
- Allumez le microscope confocal.
- Placez la diapositive sur la scène.
- Ajustez la mise au point pour voir clairement la section rétinienne.
REMARQUE: Prenez au moins quatre images par section et imagez quatre sections par rétine. Voir le schéma d’imagerie rétinienne pour les zones d’imagerie suggérées (Figure 1B, C).
- Image de la caspase, de la coloration vasculaire et nucléaire à l’aide d’un microscope confocal doté d’une acquisition Z-stack, à l’aide d’un objectif 20x ou 40x.
REMARQUE : Les paramètres d’imagerie et la configuration du logiciel doivent être constants pour toutes les images d’une expérience. L’objectif 20x donne un aperçu des couches rétiniennes, qui sont bien définies par la coloration nucléaire. L’objectif 40x fournit plus de détails cellulaires.- Réglez les durées d’exposition et d’intensité laser appropriées par canal en cliquant sur Acquérir les paramètres.
- Réglez la pile Z pour visualiser toute la section en cliquant sur la série Z et configurez les paramètres pour couvrir la profondeur du tissu.
- Enregistrez les images en suivant l’ID masqué attribué lors de la cryosection.
4. Quantification des teneurs en caspases
- Faites glisser des fichiers image de 405, 470, 555 et 640 canaux vers la console FIJI.
- Cliquez sur Image > Couleur > Fusionner les couches.
- Attribuez des couleurs aux fichiers comme suit : rouge à 555, vert à 470, gris à 405, cyan à 640.
- Compressez la pile Z en cliquant sur Image > Pile > Projet Z.
- Cliquez sur Type de projection : intensité maximale.
- Ouvrez l’interface des canaux en cliquant sur l’outil Image > Canaux de couleur.
- Ouvrez l’interface Luminosité et contraste .
- Sélectionnez les paramètres par canal.
- Accédez à Canaux et sélectionnez un canal.
- Placez le curseur au-dessus de la cellule exprimée en caspase et annotez la valeur en pixels.
- Placez le curseur au-dessus de l’arrière-plan et annotez la valeur en pixels.
- Paramètres d’essai
- Accédez à l’interface Luminosité et contraste.
- Cliquez sur Sélectionner.
- Branchez la valeur minimale affichée (valeur en pixels annotée de la cellule exprimée en caspase).
- Branchez la valeur maximale affichée (valeur en pixels annotée de l’arrière-plan).
- Cliquez sur OK.
- Répétez les étapes 4.8 à 4.9 pour tous les canaux.
- Testez les paramètres en choisissant des images aléatoires à partir de tissus en aveugle.
REMARQUE: Modifiez les paramètres de luminosité et de contraste uniquement si la valeur d’arrière-plan n’est pas adéquate pour d’autres images. - Une fois les paramètres définis, ouvrez les fichiers image et compressez la pile Z.
- Ajoutez les paramètres de luminosité et de contraste pour le canal caspase et l’isolectine, canal marqueur vasculaire.
- Utilisez l’outil de points pour quantifier le nombre de zones vasculaires positives en utilisant la colocalisation du marqueur vasculaire avec l’expression de la caspase comme lecture des zones positives.
- Répétez l’étape 4.14 mais en utilisant Hoechst comme marqueur des zones neuronales positives.
- Annotez les valeurs sur une feuille de calcul par image.
- Faites la moyenne des valeurs par section.
- Faites la moyenne des valeurs de section - ce sera la lecture par œil.
5. Confirmation génétique de la pertinence de la cellule endothéliale caspase-9
- Utilisez des rétines obtenues à partir des souris Casp9FL/FL-VECad-CreERT2 qui ont été soumises à RVO7.
- Immunocolorer les rétines pour la caspase-9 (la caspase supprimée), la caspase-7 (une caspase effectrice en aval), les marqueurs vasculaires et le DAPI comme décrit ci-dessus dans la rubrique 2.
- Image et quantification comme décrit ci-dessus dans les sections 3 et 4.
6. Cibler la caspase-9 dans la RVO
- Obtenir des yeux de souris soumises à la RVO suivie de l’application topique de l’inhibiteur de la caspase-9 Pen1-XBir3 sur les yeux comme dans7.
- Immunocolorer les rétines pour la caspase-7 (une caspase effectrice en aval), les marqueurs vasculaires et le DAPI comme décrit ci-dessus à la rubrique 2.
- Image et quantification comme décrit ci-dessus dans les sections 3 et 4.
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Representative Results
Le protocole décrit permet à l’utilisateur d’analyser et de quantifier les niveaux de caspase-9 dans le tissu rétinien. En outre, il présente des outils pour identifier, valider et cibler spécifiquement la caspase-9 et les substrats en aval. Les étapes résumées permettent une analyse quantifiable des niveaux de caspases et de la spécificité cellulaire dans les photomicrographies fluorescentes. Toutes les figures montrent des photomicrographies représentatives et une quantification des niveaux de caspases indiqués dans la rétine totale, les cellules endothéliales et les neurones dans les coupes transversales de rétine P-RVO non blessées et 1 jour. La section efficace rétinienne permet de visualiser les noyaux rétiniens dans la couche ganglionnaire rétinienne (RGL), la couche nucléaire interne (INL) et la couche nucléaire externe (ONL) lorsqu’ils sont colorés avec Hoechst. De plus, les vaisseaux sanguins rétiniens sont visibles dans les couches plexiformes rétiniennes ou entre le RGL et l’INL, et entre l’INL et l’ONL. En raison de la nature histologique des vaisseaux sanguins, lorsque la rétine est sectionnée, les vaisseaux sanguins apparaîtront comme déconnectés et séparés, alimentant les couches plexiformes. La figure 2 identifie la caspase-9 comme étant hautement réglementée P-RVO sur 1 jour. La figure 3 valide la pertinence fonctionnelle de la caspase-9 endothéliale en utilisant des souris knock-out de cellules endothéliales inductibles. La figure 4 montre que le ciblage de la caspase-9 active bloque pharmacologiquement l’induction d’une cible en aval de la caspase-9-caspase-7. Le protocole identifie la localisation cellulaire des caspases et des couches rétiniennes neuronales dans lesquelles les caspases sont exprimées.
Figure 1 : Schéma d’imagerie rétinienne. (A) Placement recommandé des coupes rétiniennes dans la lame de microscope. (B) Vue d’ensemble des zones d’imagerie dans la rétine. (C) Représentation de la vue rétinienne à un objectif 20x. Couches rétiniennes : RGL = couche ganglionnaire rétinienne, INL = couche nucléaire interne, ONL = couche nucléaire externe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : L’OVR induit la caspase-9 dans les cellules endothéliales et les neurones. (A) Coupes transversales rétiniennes représentatives de P-RVO non blessé et 1 jour colorés avec cl-caspase-9 1:800 (vert), isolectine 1:200 (rouge) et DAPI (blanc). (B) Quantification du nombre de neurones avec cl-caspase-9 (voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur les anticorps). (C) Quantification du nombre de cellules endothéliales avec cl-caspase-9. (D) Nombre total de cellules exprimant la cl-caspase-9. Non blessé, n = 6; 1 jour P-RVO, n = 5. Les barres d’erreur représentent la moyenne ± MEB ; ANOVA unidirectionnelle, le test LSD de Fisher. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : La délétion des cellules endothéliales de la caspase-9 endothéliale bloque l’induction de l’OVR de la caspase-7. (A) Coupes transversales rétiniennes représentatives de souris iEC Casp9WT et iEC Casp9KO de souris de portée 1 jour colorées avec de la caspase-7 (vert), cl-caspase-9 (bleu), CD31, un marqueur vasculaire (rouge) et DAPI (blanc). (B) Quantification du nombre de cellules dans la rétine interne avec cl-caspase-9 et avec la caspase-7. (C) Quantification du nombre de cellules endothéliales avec cl-caspase-9 et avec la caspase-7. (D) Nombre total de cellules exprimant cl-caspase-9 ou caspase-7. iEC Casp9WT, n = 6-12; iEC Casp9KO, n = 3-8. Les barres d’erreur représentent la moyenne ± MEB ; ANOVA unidirectionnelle, le test LSD de Fisher. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : L’inhibition de l’activité de la caspase-9 inhibe l’expression de la caspase-7 P-RVO. (A) Coupes transversales rétiniennes représentatives de P-RVO non blessé et de 1 jour traité ou non traité avec Pen1-XBIR3 coloré avec de la caspase-7 (vert), de l’isolectine (rouge) et du DAPI (blanc). (B) Quantification du nombre de cellules endothéliales avec caspase-7. (C) Quantification du nombre de leucocytes avec la caspase-7. (D) Quantification du nombre de neurones par couche neuronale avec la caspase-7. (E) Nombre total de cellules exprimant la caspase-7. Pen1 saline non blessée, n = 6; Pen1-XBIR3 non blessé, n = 5; P-RVO Pen1 Saline 1 jour, n = 5; P-RVO Pen1-XBIR3 à 1 jour, n = 3. Les barres d’erreur représentent la moyenne ± MEB ; ANOVA unidirectionnelle, le test LSD de Fisher. Abréviations : RGL = couche ganglionnaire rétinienne, INL = couche nucléaire interne et ONL = couche nucléaire externe. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les caspases sont une famille de protéases à plusieurs membres mieux étudiées pour leurs rôles dans la mort cellulaire et l’inflammation; Cependant, plus récemment, diverses fonctions non liées au décès ont été découvertes pour certains membres de la famille 4,5. Une grande partie de notre compréhension de la fonction des caspases provient de travaux en culture cellulaire et de données inférentielles sur les maladies humaines. Bien qu’il soit reconnu qu’il existe une induction, une activation ou une inactivation aberrante des caspases dans la maladie, il a été difficile de déterminer fonctionnellement si les caspases sont à l’origine de la pathologie de la maladie. De nombreux outils utilisés pour évaluer des caspases spécifiques détectent plusieurs membres de la famille, ce qui nuit à la pertinence fonctionnelle des données obtenues avec ces réactifs17. Nous fournissons ici un protocole pour étudier les caspases dans les tissus complexes, en utilisant la rétine comme exemple. Dans le système nerveux, l’expression de la caspase est régulée à la baisse avant et après la naissance. Cela permet l’utilisation d’anticorps spécifiques pour tester les changements dans les niveaux de caspases dans un modèle de maladie.
Bien que le protocole soit axé sur le traitement et l’analyse d’images, le succès de la technique repose également sur une préparation minutieuse des tissus, ainsi que sur l’IHC et l’imagerie microscopique pour assurer la cohérence, la validité et la fiabilité des données. Il faut prendre soin d’utiliser les mêmes paramètres pour imager un ensemble de données entier. Des images de mauvaise qualité, un faible contraste et une mise au point floue ne fourniront pas de données fiables. Lors de la section et de l’imagerie des régions P-RVO de la rétine, les déchirures et le pliage doivent être évités car ces zones peuvent entraîner des artefacts. Les zones de dommages directs doivent également être évitées. L’investigateur qui effectue l’imagerie doit être aveuglé par le traitement du tissu. Pour l’analyse, il est recommandé que deux observateurs indépendants, en aveugle du groupe de traitement, effectuent l’analyse. En outre, les anticorps primaires de souris ne doivent pas être utilisés dans les modèles de lésions chez la souris, car les anticorps secondaires se lient de manière non spécifique au système vasculaire. Une alternative consiste à utiliser des anticorps primaires directement conjugués.
Une autre approche du comptage cellulaire consiste à quantifier le pourcentage de la zone d’expression. Cela peut être utilisé lorsque le comptage cellulaire n’est pas possible (par exemple, si l’expression de la caspase est localisée dans les processus neuronaux ou les segments photorécepteurs). La rétine centrale et périphérique est affectée différemment dans divers modèles de blessures. La méthode peut être adaptée pour analyser spécifiquement différentes régions de la rétine. Si vous effectuez une OBVR, les sections doivent être sélectionnées dans la partie blessée de l’œil. Le protocole prévoit également la coloration de différents marqueurs cellulaires pour identifier où la caspase est exprimée.
Les limites de la méthode comprennent qu’elle ne fait pas la différence entre les niveaux élevés et faibles de signal de caspase dans une cellule donnée. De plus, l’utilisation d’une coloration nucléaire pour identifier les couches neuronales est pratique mais n’indique pas définitivement l’expression neuronale (la glie et les leucocytes sont également présents dans ces couches). Des marqueurs neuronaux supplémentaires peuvent être utilisés pour valider l’expression neuronale. Il existe également une variété d’anticorps disponibles pour évaluer l’expression des caspases; Ceux-ci ont été mieux définis pour la caspase-9 humaine, où il existe des anticorps pour la caspase-9 pleine longueur / clivée (CL), la caspase-9 autoclivée et la caspase-3-clivée-9.
L’intensité moyenne du signal IHC est fréquemment rapportée comme méthode de quantification. Cependant, le bruit de fond ou l’autofluorescence des globules rouges peut produire des résultats inexacts. La quantification spécifique à la cellule permet de déterminer et de discriminer le fond, la coloration non spécifique et l’autofluorescence.
Ce protocole peut être utilisé pour mesurer les changements à l’échelle des tissus dans l’expression des caspases individuelles, les changements dans l’expression dans un type de cellule spécifique, comme une cellule endothéliale, et les changements dans des types de cellules spécifiques dans des endroits spécifiques, tels que les neurones dans différentes couches rétiniennes. Cette flexibilité permet à l’expérimentateur de se demander comment l’état de la maladie modifie les niveaux individuels de caspases. Les méthodes existantes / alternatives utilisent l’analyse Western blot pour la comparaison semi-quantitative de la signalisation des caspases, bien que les méthodes ne fournissent pas la séparation claire de la localisation cellulaire que ce protocole permet. Notamment, dans la figure 3D, l’inhibition de la caspase-9 est plus efficace pour réduire la caspase-9 neuronale dans l’INL et l’ONL, par rapport au RGL. Ce type de résolution est difficile à atteindre par d’autres méthodes. De plus, lorsqu’un tissu entier est analysé biochimiquement, les niveaux de caspases qui changent peuvent être trop faibles pour être détectés, car il existe de nombreux types de cellules différentes dans un tissu complexe.
Les anticorps, qui doivent être validés par l’utilisateur, apportent une spécificité pour la caspase sondée. Les caspases peuvent agir en cascades (c’est-à-dire que l’initiateur active l’effecteur et conduit ensuite à un résultat - mort, inflammation, signalisation cellulaire). Ce protocole peut être utilisé dans les échantillons prélevés à différents moments après les dommages; dans les exemples présentés ici, les échantillons sont prélevés à différents moments après l’AVR. Dans des travaux publiés précédemment, il a été constaté que la caspase-9 était augmentée dans les 1 h suivant la RVO7, ce qui a conduit à d’autres études de validation et de ciblage. Après avoir identifié la caspase-9 endothéliale comme un facteur potentiel de pathologie RVO, une souris avec une caspase-9KO à cellules endothéliales inductibles a été utilisée pour valider la caspase-9 endothéliale. L’utilisation de souris KO caspases spécifiques à cellules inductibles fournit un autre niveau de spécificité et évite la mort développementale observée avec la caspase-9KOconstitutive 18. Il évite également les changements compensatoires chez d’autres membres de la famille qui se sont produits chez les souris KO caspases constitutives19. De plus, l’utilisation de souris KO caspases inductibles spécifiques à la cellule permet d’identifier le type de cellule dans lequel la caspase régule la pathologie dans le tissu. Le protocole fournit également les étapes pour interroger l’efficacité d’une approche thérapeutique, ciblant la caspase-9 active dans l’OVR. Cette approche peut également être appliquée à d’autres tissus, y compris le cerveau.
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Disclosures
Les auteurs déclarent les intérêts concurrents suivants : C.M.T. a les demandes de brevet suivantes US20200164026, US20190142915 et US20150165061. C.M.T. et S.S. ont une demande de brevet US 20140024597. C.M.T., A.M.P. et M.I.A. ont une demande de brevet US2020058683. C.M.T. et Y.Y.J. ont une demande de brevet WO2018013519. M.I.A et C.M.T figurent sur la liste des inventeurs dans une demande de brevet WO/2020/223212 déposée par les administrateurs de l’Université Columbia dans la ville de New York. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la subvention DGE-1644869 du National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) et le National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) des National Institutes of Health (NIH), numéro de prix F99NS124180 NIH NINDS Diversity Specialized F99 (à CKCO), le National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (à AMP), le National Institute of Neurological Disorders and Stroke (RO1 NS081333, R03 NS099920 à CMT) et le ministère de la Défense de l’armée de terre / de l’armée de l’air (DURIP à CMT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-Caspase-7 488 | Novus Biologicals | NB-56529AF488 | use at 1:150 |
| anti-cl-Caspase-9 | Cell Signaling | 9505-S | use at 1:800 |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | 553370 | use at 1:50 |
| Confocal Spinning Disc Microscope | Biovision | ||
| FIJI 2.3.0 | open source | ||
| Fluormount G | Fisher | 50-187-88 | |
| Forcep | Roboz | RS-5015 | |
| iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Isolectin (594, 649) | Vector | DL-1207 | use at 1:200 |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Perfusion pump | Masterflex | ||
| Pen1-XBir3 | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Prism 9.1 | GraphPad | ||
| Tissue-Tek O.C.T. | Fisher | 14-373-65 | |
| Vis-a-View 4.0 | Visitron Systems | ||
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
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