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Neuroscience

रेटिना ऊतक में इम्यूनोस्टेन्ड कैस्पेज़ -9 का परिमाणीकरण

Published: July 25, 2022 doi: 10.3791/64237
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 3, 1, *1, *1,4,5
1Department of Pathology & Cell Biology, Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 2Department of Molecular Pharmacology and Therapeutics, Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 3NCI-designated Cancer Center, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 4Department of Neurology, Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 5The Taub Institute for Research on Alzheimer’s Disease and the Aging Brain, Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University
* These authors contributed equally

Summary

यहां प्रस्तुत जटिल ऊतकों में कार्यात्मक रूप से प्रासंगिक कैसपेस की पहचान, सत्यापन और लक्ष्य करने के लिए एक विस्तृत इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल है।

Abstract

कैसपेस का परिवार कोशिका मृत्यु से परे कई सेलुलर मार्गों को मध्यस्थ करने के लिए जाना जाता है, जिसमें सेल भेदभाव, अक्षीय पाथफाइंडिंग और प्रसार शामिल हैं। कोशिका मृत्यु प्रोटीज के परिवार की पहचान के बाद से, विकास, स्वास्थ्य और रोग की स्थिति में विशिष्ट परिवार के सदस्यों के कार्य को पहचानने और विस्तारित करने के लिए उपकरणों की खोज की गई है। हालांकि, वर्तमान में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कैसपेज़ उपकरणों में से कई जो व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं, लक्षित कैसपेज़ के लिए विशिष्ट नहीं हैं। इस रिपोर्ट में, हम इम्यूनोहिस्टोकेमिकल रीड-आउट के साथ एक नए अवरोधक और आनुवंशिक दृष्टिकोण का उपयोग करके तंत्रिका तंत्र में कैसपेज़ -9 को पहचानने, मान्य करने और लक्षित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले दृष्टिकोण को चित्रित करते हैं। विशेष रूप से, हमने कैसपेस की उपस्थिति और कार्य की पहचान और मान्य करने के लिए एक मॉडल के रूप में रेटिना न्यूरोनल ऊतक का उपयोग किया। यह दृष्टिकोण सेल-प्रकार विशिष्ट एपोप्टोटिक और गैर-एपोप्टोटिक कैसपेज़ -9 कार्यों की पूछताछ को सक्षम बनाता है और इसे अन्य जटिल ऊतकों और रुचि के कैसपेस पर लागू किया जा सकता है। कैसपेस के कार्यों को समझना सेल जीव विज्ञान में वर्तमान ज्ञान का विस्तार करने में मदद कर सकता है, और बीमारी में उनकी भागीदारी के कारण संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए भी फायदेमंद हो सकता है।

Introduction

कैसपेस प्रोटीज का एक परिवार है जो रोग 1,2 में विकासात्मक कोशिका मृत्यु, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और असामान्य कोशिका मृत्यु को नियंत्रित करता है। हालांकि यह अच्छी तरह से ज्ञात है कि कैसपेज़ परिवार के सदस्यों को विभिन्न प्रकार के न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में प्रेरित किया जाता है, यह समझना कि कौन सा कैसपेज़ रोग विकृति चलाता है, अधिक चुनौतीपूर्ण है। इस तरह के अध्ययनों में व्यक्तिगत कैसपेस परिवार के सदस्यों के कार्य को पहचानने, चिह्नित करने और मान्य करने के लिए उपकरणों की आवश्यकता होती है। प्रासंगिक व्यक्तिगत कैसपेस को पार्स करना एक यंत्रवत और चिकित्सीय दृष्टिकोण दोनों से महत्वपूर्ण है, क्योंकि साहित्य में कैसपेज़ 4,5 की विविध भूमिकाओं के प्रमाण प्रदान करने वाले कई अध्ययन हैं। इस प्रकार, यदि लक्ष्य चिकित्सीय लाभ के लिए किसी बीमारी में कैसपेस को लक्षित करना है, तो संबंधित परिवार के सदस्य (ओं) का विशिष्ट लक्ष्यीकरण करना महत्वपूर्ण है। ऊतक में कैसपेज़ के स्तर का पता लगाने के लिए पारंपरिक तकनीकों में पश्चिमी सोख्ता और एंजाइमेटिक और फ्लोरोमेट्रिक दृष्टिकोण 3,6 शामिल हैं। हालांकि, इनमें से कोई भी उपाय कैस्पेस स्तरों के सेल-विशिष्ट पता लगाने की अनुमति नहीं देता है, और कुछ परिदृश्यों में, क्लीवर कैसपेस को अक्सर पारंपरिक प्रोटीन विश्लेषण उपायों द्वारा पता नहीं लगाया जा सकता है। यह ज्ञात है कि कैसपेस एक ही ऊतक7 में विभिन्न एपोप्टोटिक और गैर-एपोप्टोटिक भूमिका निभा सकते हैं, इसलिए विकास और रोग मार्गों की सटीक समझ के लिए सेल-विशिष्ट कैसपेज़ स्तरों के सावधानीपूर्वक लक्षण वर्णन की आवश्यकता होती है।

यह अध्ययन न्यूरोवास्कुलर हाइपोक्सिया-इस्किमिया के एक मॉडल में कैसपेस सक्रियण और कार्य दिखाता है - रेटिना नस रोड़ा (आरवीओ) 7,8। रेटिना जैसे जटिल ऊतक में, कई सेल प्रकार होते हैं जो आरवीओ में प्रेरित हाइपोक्सिया-इस्केमिया से प्रभावित हो सकते हैं, जिसमें ग्लियल कोशिकाएं, न्यूरॉन्स और वास्कुलचर7 शामिल हैं। वयस्क माउस रेटिना में, स्वस्थ ऊतक में कैस्पेस की बहुत कम अभिव्यक्ति होती है, जैसा कि इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) 7 द्वारा मापा जाता है, लेकिन विकास9 के दौरान या रेटिना रोग10,11 के मॉडल में ऐसा नहीं है। आईएचसी एक ऐसी तकनीक है जो बायोमेडिकल अनुसंधान में अच्छी तरह से स्थापित है और रोग और पैथोलॉजिकल लक्ष्यों के सत्यापन, स्थानिक स्थानीयकरण के माध्यम से नई भूमिकाओं की पहचान और प्रोटीन की मात्रा का ठहराव की अनुमति दी है। ऐसे मामलों में जहां क्लीवर कैसपेज़ उत्पादों को पश्चिमी धब्बा या फ्लोरोमेट्रिक विश्लेषण द्वारा पता नहीं लगाया जा सकता है, न ही स्थानीयकरण के माध्यम से अलग-अलग कैसपेज़ के विशिष्ट सेल स्थान या कैसपेज़ सिग्नलिंग मार्गों की पूछताछ, तो आईएचसी का उपयोग किया जाना चाहिए।

आरवीओ में कार्यात्मक रूप से प्रासंगिक कैस्पेस (ओं) को निर्धारित करने के लिए, आईएचसी का उपयोग कैसपेस और सेलुलर मार्करों के लिए मान्य एंटीबॉडी के साथ किया गया था। प्रयोगशाला में किए गए पिछले अध्ययनों से पता चला है कि कैस्पेस -9 को इस्केमिक स्ट्रोक के एक मॉडल में तेजी से सक्रिय किया गया था और कैसपेज़ -9 के निषेध के साथ न्यूरोनल डिसफंक्शन और मृत्यु12 से संरक्षित एक अत्यधिक विशिष्ट अवरोधक था। क्योंकि रेटिना केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) का हिस्सा है, यह न्यूरोवास्कुलर चोटों13 में कैसपेज़ -9 की भूमिका को क्वेरी करने और आगे की जांच करने के लिए एक मॉडल सिस्टम के रूप में कार्य करता है। इसके लिए, आरवीओ के माउस मॉडल का उपयोग कैस्पेज़ -9 के सेल-विशिष्ट स्थान और वितरण और न्यूरोवास्कुलर चोट में इसके निहितार्थ का अध्ययन करने के लिए किया गया था। आरवीओ कामकाजी वृद्ध वयस्कों में अंधापन का एक सामान्य कारण है जो संवहनी चोट14 के परिणामस्वरूप होता है। यह पाया गया कि कैसपेज़ -9 को एंडोथेलियल कोशिकाओं में गैर-एपोप्टोटिक तरीके से व्यक्त किया गया था, लेकिन न्यूरॉन्स में नहीं।

एक ऊतक के रूप में, रेटिना को या तो एक फ्लैटमाउंट के रूप में कल्पना करने का लाभ होता है, जो संवहनी नेटवर्क की सराहना की अनुमति देता है, या क्रॉस-सेक्शन के रूप में, जो न्यूरोनल रेटिना परतों पर प्रकाश डालता है। क्रॉस-सेक्शन में कैसपेज़ प्रोटीन अभिव्यक्ति का परिमाणीकरण संदर्भ प्रदान करता है, जिसके बारे में रेटिना में कैसपेज़ (ओं) के स्थानीयकरण की पहचान करके रेटिना न्यूरोनल कनेक्टिविटी और दृष्टि समारोह में कैसपेज़ संभावित रूप से महत्वपूर्ण है। पहचान और सत्यापन के बाद, पहचाने गए कैसपेज़ के इंड्यूसेबल सेल विशिष्ट विलोपन का उपयोग करके रुचि के कैसपेज़ का लक्ष्यीकरण प्राप्त किया जाता है। संभावित चिकित्सीय पूछताछ के लिए, सक्रिय कैसपेज़ को रोकने के लिए विशिष्ट उपकरणों का उपयोग करके रुचि के कैसपेस की प्रासंगिकता का परीक्षण किया गया था। कैसपेज़ -9 के लिए एक सेल अत्यधिक चयनात्मक अवरोधक 7,15, पेन 1-एक्सबीआईआर 3 का उपयोग किया गया था। इस रिपोर्ट के लिए, सी 57बीएल / 6 जे पृष्ठभूमि के साथ 2 महीने के, पुरुष सी 57बीएल / 6 जे स्ट्रेन और टैमोक्सीफेन-इंड्यूसेबल एंडोथेलियल कैस्पेज़ -9 नॉकआउट (आईईसी कैस्प 9 केओ) स्ट्रेन का उपयोग किया गया था। इन जानवरों को आरवीओ के माउस मॉडल के संपर्क में लाया गया था और सी 57बीएल / 6 जे को कैसपेज़ -9 चयनात्मक अवरोधक, पेन 1-एक्सबीर 3 के साथ इलाज किया गया था। वर्णित पद्धति को केंद्रीय और परिधीय प्रणालियों 7,15 में रोग के अन्यमॉडलों पर लागू किया जा सकता है।

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Protocol

यह प्रोटोकॉल नेत्र और दृष्टि अनुसंधान में जानवरों के उपयोग के लिए एसोसिएशन फॉर रिसर्च इन विजन एंड ओप्थाल्मोलॉजी (एआरवीओ) बयान का पालन करता है। कृंतक प्रयोगों को कोलंबिया विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित और निगरानी की गई थी।

1. रेटिना ऊतक और क्रायोसेक्शनिंग की तैयारी

  1. इंट्रापरिटोनियल एनेस्थीसिया (केटामाइन (80-100 मिलीग्राम / किग्रा) और ज़ाइलज़िन (5-10 मिलीग्राम / किग्रा)) के प्रशासन द्वारा जानवरों को यूथेनाइज़ करें, और आरवीओ के अधीन चूहों को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ एक पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग करके 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए देखें)।
    नोट: यूथेनाइजेशन और छिड़काव के साथ आगे बढ़ने से पहले एनेस्थीसिया की गहराई की पुष्टि करने के लिए जानवर को पैर की अंगुली-चुटकी लें। छिड़काव के बारे में विवरण16 में पाया जा सकता है।
  2. बल का उपयोग करके सावधानीपूर्वक न्यूक्लियेशन द्वारा आंखों को काटें और ग्लोब को 4% पीएफए के 1 एमएल में डालें। आंखों को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें। आंखों को 10 मिनट के लिए तीन बार धोएं, 1 एमएल 1x पीबीएस जोड़ें और उन्हें शेकर में रखें।
  3. आंखों को 3 दिनों के लिए 30% सुक्रोज के 1 एमएल में डुबोएं, जब तक कि वे ट्यूब के तल पर नहीं बैठ जाते, सुक्रोज के अवशोषण का संकेत देते हैं।
  4. 30 जी सिरिंज का उपयोग करके इष्टतम काटने के तापमान यौगिक के साथ आंखों को भरें, जब तक कि आंख में गोल उपस्थिति (लगभग 50 μL) न हो।
  5. आंखों को इष्टतम काटने के तापमान यौगिक के साथ एक क्रायोमोल्ड में एम्बेड करें जब तक कि आंखें कवर न हों और क्रायोसेक्शन के लिए तैयार होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर जम जाएं।
  6. अनुभाग ने क्रायोस्टैट का उपयोग करके ग्लास स्लाइड पर 20 μm पर आंखों को एम्बेडेड किया।
    1. क्रायोमोल्ड से इष्टतम काटने के तापमान यौगिक ब्लॉक को हटा दें।
    2. इष्टतम काटने के तापमान यौगिक को जोड़कर और चक पर ब्लॉक रखकर इसे क्रायोस्टैट चक पर रखें। इसे क्रायोस्टैट के अंदर छोड़ दें जब तक कि यह जम न जाए।
    3. रेटिना ऊतक को देखने तक ब्लॉक को 20 μm पर काटने के लिए आगे बढ़ें।
      नोट: यह 30x आवर्धन (3x उद्देश्य, 10x आंखों के टुकड़े) पर प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ पुष्टि की जा सकती है। ऊतकों को रंग और आकार द्वारा ओसीटी मीडिया से अलग किया जा सकता है।
    4. प्रति स्लाइड चार खंडों की एक श्रृंखला में माइक्रोस्कोप स्लाइड में रेटिना ऊतक एकत्र करें।
      नोट: रेटिना अनुभागों के सुझाए गए स्थान के लिए चित्रा 1 ए देखें।
  7. स्लाइड्स को एक आईडी के साथ लेबल करें जो उपचार और जीनोटाइप की पहचान करता है।
  8. स्लाइड्स को -20 डिग्री सेल्सियस पर धुंधला होने तक स्टोर करें।

2. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

नोट: सेल आकृति विज्ञान को बनाए रखने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए निश्चित क्रायोप्रिजर्व्ड ऊतक का उपयोग करें। उन अनुभागों को चुनें जो विवो7 में प्राप्त ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी (ओसीटी) छवियों के स्तर पर हैं। रेटिना ऊतक में क्रायोस्टैट या 150 μm से अनुभागों से एकत्र की गई स्लाइडों की पहली दो श्रृंखलाओं का उपयोग करें।

  1. स्लाइड्स को एक अंधेरे और आर्द्र स्लाइड कक्ष में रखें।
  2. परमेबिलाइजेशन और ब्लॉकिंग: ओसीटी को हटाने के लिए 5 मिनट के लिए 1x PBS के 300 μL के साथ रेटिना क्रॉस-सेक्शन को धोएं और बाद में छोड़ दें।
  3. कमरे के तापमान (आरटी) पर 2 घंटे के लिए 0.1% ट्राइटन एक्स -100 के साथ 1x PBS के 300 μL जोड़कर ऊतक को स्थिर करें और बाद में छोड़ दें।
  4. 1x PBS में 300 μL ब्लॉकिंग बफर (10% सामान्य बकरी सीरम (NGS), 1% बोवाइन सीरम एल्बुमिन (बीएसए), फ़िल्टर किया गया) जोड़कर ऊतक को अवरुद्ध करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर छोड़ दें।
  5. प्राथमिक एंटीबॉडी: बफर को अवरुद्ध करने में प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें। उपयोग किए जाने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी में 1: 800 पर एंटी-सीएल-कैस्पेज़ -9, 1: 50 पर एंटी-सीडी 31 और 1: 150 पर एंटी-कैसपेज़ -7-488 (प्रत्यक्ष लेबल एंटीबॉडी) शामिल हैं।
    नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी के उचित कमजोर पड़ने के लिए निर्माता की सिफारिश का पालन करें।
    1. ब्लॉकिंग बफर ऑफ सेक्शन डालें और रेटिना स्लाइड्स पर प्राथमिक एंटीबॉडी कॉकटेल के 100 μL लागू करें।
    2. क्रॉस-सेक्शन को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  6. 1x PBS के 300 μL के साथ 5 मिनट के लिए अनुभागों को चार बार धोएं।
    नोट: यदि ऊतक अनुभाग बहुत नाजुक हैं, तो रेटिना वर्गों को विस्थापित करने से बचने के लिए स्लाइड के कोने में ऊतक लगाकर केशिका क्रिया का उपयोग करके वॉश को हटा दिया जाना चाहिए।
  7. एक ही मेजबान प्रजातियों में उठाए गए प्राथमिक एंटीबॉडी के क्रॉस-लेबलिंग से बचने के लिए, सीधे लेबल एंटीबॉडी को लागू करने से पहले द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ धुंधलापन पूरा करें।
  8. द्वितीयक एंटीबॉडी: 0.1% की एकाग्रता पर बफर को अवरुद्ध करने में द्वितीयक एंटीबॉडी को पतला करें। उदाहरण के लिए, खरगोश में उठाए गए एंटीबॉडी एंटी-सीएल-कैसपेज़ -9 का पता लगाने के लिए, बकरी-विरोधी खरगोश -568 द्वितीयक का उपयोग करें।
    1. रेटिना पर द्वितीयक एंटीबॉडी कॉकटेल के 200 μL लागू करें।
    2. आरटी में 2 घंटे के लिए ऊतक को इनक्यूबेट करें।
    3. 1x PBS के 300 μL के साथ 5 मिनट के लिए अनुभागों को चार बार धोएं।
    4. 0.02% की कमजोर पड़ने पर 300 μL DAPI के साथ 5 मिनट के लिए नाभिक को दाग दें।
  9. 1x PBS के 300 μL के साथ 5 मिनट के लिए एक बार धो लें।
  10. फ्लोरोमाउंट-जी मीडिया के 500 μL का उपयोग करके रेटिना अनुभागों पर एक कवरस्लिप रखें, जो फ्लोरोसेंट सिग्नल को संरक्षित करता है, और बुलबुले से बचते हुए स्लाइड के शीर्ष पर कवरस्लिप को सावधानीपूर्वक रखें।

3. कॉन्फोकल इमेजिंग

  1. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ दाग वाले वर्गों की छवियां प्राप्त करें।
    1. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप चालू करें।
    2. स्लाइड को मंच पर रखें।
    3. रेटिना अनुभाग को स्पष्ट रूप से देखने के लिए फ़ोकस समायोजित करें।
      नोट: प्रति अनुभाग कम से कम चार छवियां लें और प्रति रेटिना छवि चार खंड लें। सुझाए गए इमेजिंग क्षेत्रों के लिए रेटिना इमेजिंग योजनाबद्ध देखें (चित्रा 1 बी, सी)।
  2. 20x या 40x उद्देश्य का उपयोग करके, एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इमेज कैस्पेज़, संवहनी और परमाणु धुंधलापन जिसमें जेड-स्टैक अधिग्रहण होता है।
    नोट: इमेजिंग पैरामीटर और सॉफ्टवेयर सेटअप एक प्रयोग में सभी इमेजिंग के लिए स्थिर होना चाहिए। 20x उद्देश्य रेटिना परतों का अवलोकन प्रदान करता है, जो परमाणु धुंधलापन द्वारा अच्छी तरह से परिभाषित होते हैं। 40x उद्देश्य अधिक सेलुलर विवरण प्रदान करता है।
    1. सेटिंग्स प्राप्त करके प्रति चैनल उपयुक्त एक्सपोज़र और लेजर तीव्रता समय सेट करें।
    2. जेड-श्रृंखला पर क्लिक करके पूरे अनुभाग की कल्पना करने के लिए जेड-स्टैक सेट करें और ऊतक की गहराई को कवर करने के लिए पैरामीटर सेट करें।
  3. क्रायोसेक्शनिंग के दौरान असाइन की गई नकाबपोश आईडी के बाद छवियों को सहेजें।

4. कैसपेज़ स्तरों का परिमाणीकरण

  1. 405, 470, 555 और 640 चैनलों की छवि फ़ाइलों को FIJI के कंसोल पर खींचें।
  2. मर्ज चैनल > रंग > छवि क्लिक करें.
  3. फ़ाइलों को निम्नानुसार रंग असाइन करें: लाल से 555, हरा 470, ग्रे से 405, सियान से 640।
  4. छवि > स्टैक > जेड प्रोजेक्ट पर क्लिक करके जेड-स्टैक को संपीड़ित करें।
  5. प्रक्षेपण प्रकार पर क्लिक करें: अधिकतम तीव्रता.
  6. छवि > रंग चैनल उपकरण क्लिक करके चैनल इंटरफ़ेस खोलें।
  7. ब्राइटनेस और कंट्रास्ट इंटरफ़ेस खोलें।
  8. प्रति चैनल पैरामीटर का चयन करें.
    1. चैनलों पर जाएं और एक चैनल का चयन करें।
    2. कैस्पेस व्यक्त सेल के शीर्ष पर कर्सर रखें और पिक्सेल मान को एनोटेट करें।
    3. पृष्ठभूमि के शीर्ष पर कर्सर रखें और पिक्सेल मान को एनोटेट करें।
  9. परीक्षण पैरामीटर
    1. ब्राइटनेस और कंट्रास्ट इंटरफ़ेस पर जाएं।
    2. चुनें क्लिक करें.
    3. न्यूनतम प्रदर्शित मान (कैसपेज़ व्यक्त कक्ष का एनोटेटेड पिक्सेल मान) प्लग इन करें.
    4. अधिकतम प्रदर्शित मान (पृष्ठभूमि का एनोटेट पिक्सेल मान) प्लग इन करें.
    5. ठीक क्लिक करें.
  10. सभी चैनलों के लिए चरण 4.8-4.9 दोहराएँ।
  11. अंधे ऊतक से यादृच्छिक छवियों को चुनकर मापदंडों का परीक्षण करें।
    नोट: चमक और कंट्रास्ट पैरामीटर केवल तभी संपादित करें जब पृष्ठभूमि मान अन्य छवियों के लिए पर्याप्त नहीं है।
  12. एक बार पैरामीटर सेट हो जाने के बाद, छवि फ़ाइलों को खोलें और जेड-स्टैक को संपीड़ित करें।
  13. कैसपेज़ चैनल और आइसोलेक्टिन, संवहनी मार्कर चैनल के लिए चमक और कंट्रास्ट पैरामीटर जोड़ें।
  14. सकारात्मक क्षेत्रों के रीडआउट के रूप में कैसपेज़ अभिव्यक्ति के साथ संवहनी मार्कर के सह-स्थानीयकरण का उपयोग करके संवहनी सकारात्मक क्षेत्रों की संख्या निर्धारित करने के लिए बिंदु उपकरण का उपयोग करें।
  15. चरण 4.14 दोहराएं लेकिन न्यूरोनल सकारात्मक क्षेत्रों के मार्कर के रूप में होचस्ट का उपयोग करें।
  16. प्रति छवि स्प्रेडशीट पर मानों को एनोटेट करें।
  17. अनुभाग के अनुसार मानों का औसत निकालें.
  18. अनुभाग मानों का औसत- यह प्रति आंख रीडआउट होगा।

5. एंडोथेलियल सेल कैसपेज़ -9 की प्रासंगिकता की आनुवंशिक पुष्टि

  1. Casp9FL / FL-VECad-CreERT2 चूहों से प्राप्त रेटिना का उपयोग करें जो RVO7 के अधीन थे।
  2. इम्यूनोस्टेन कैसपेज़ -9 (हटाए गए कैसपेज़), कैसपेज़ -7 (एक डाउन-स्ट्रीम प्रभावक कैस्पेज़), संवहनी मार्कर, और डीएपीआई के लिए रेटिना जैसा कि अनुभाग 2 में ऊपर वर्णित है।
  3. खंड 3 और 4 में ऊपर वर्णित छवि और मात्रा।

6. आरवीओ में कैसपेज़ -9 को लक्षित करना

  1. आरवीओ के अधीन चूहों से आंखें प्राप्त करें, इसके बाद कैसपेज़ -9 अवरोधक पेन 1-एक्सबीआर 3 को आंखों के लिए शीर्ष रूप से लागूकिया जाता है।
  2. इम्यूनोस्टेन कैसपेज़ -7 (एक डाउन-स्ट्रीम प्रभावक कैसपेज़), संवहनी मार्कर, और डीएपीआई के लिए रेटिना जैसा कि अनुभाग 2 में ऊपर वर्णित है।
  3. खंड 3 और 4 में ऊपर वर्णित छवि और मात्रा।

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Representative Results

वर्णित प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता को रेटिना ऊतक में कैसपेज़ -9 के स्तर का विश्लेषण और मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, यह कैसपेज़ -9 और डाउनस्ट्रीम सब्सट्रेट्स को पहचानने, मान्य करने और विशेष रूप से लक्षित करने के लिए उपकरण प्रस्तुत करता है। सारांशित चरण फ्लोरोसेंट फोटोमाइक्रोग्राफ में कैसपेज़ स्तर और सेलुलर विशिष्टता के मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देते हैं। सभी आंकड़े कुल रेटिना, एंडोथेलियल कोशिकाओं और न्यूरॉन्स में संकेतित कैस्पेज़ स्तरों के प्रतिनिधि फोटोमाइक्रोग्राफ और परिमाणीकरण को दर्शाते हैं। रेटिना क्रॉस-सेक्शन होचस्ट के साथ दाग होने पर रेटिना गैंग्लियन परत (आरजीएल), आंतरिक परमाणु परत (आईएनएल), और बाहरी परमाणु परत (ओएनएल) में रेटिना नाभिक के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। इसके अलावा, रेटिना रक्त वाहिकाएं रेटिना प्लेक्सीफॉर्म परतों में या आरजीएल और आईएनएल के बीच और आईएनएल और ओएनएल के बीच दिखाई देती हैं। रक्त वाहिकाओं की हिस्टोलॉजिकल प्रकृति के कारण, जब रेटिना को विभाजित किया जाता है, तो रक्त वाहिकाएं डिस्कनेक्ट और अलग दिखाई देंगी, जिससे प्लेक्सीफॉर्म परतों की आपूर्ति होगी। चित्रा 2 कैसपेज़ -9 को अत्यधिक विनियमित 1-दिवसीय पी-आरवीओ के रूप में पहचानता है। चित्रा 3 इंड्यूसेबल एंडोथेलियल सेल नॉकआउट चूहों का उपयोग करके एंडोथेलियल कैसपेज़ -9 की कार्यात्मक प्रासंगिकता को मान्य करता है। चित्रा 4 से पता चलता है कि सक्रिय कैसपेज़ -9 को लक्षित करना औषधीय रूप से कैसपेज़ -9-कैसपेज़ -7 के डाउनस्ट्रीम लक्ष्य के प्रेरण को अवरुद्ध करता है। प्रोटोकॉल कैसपेस और न्यूरोनल रेटिना परतों के सेलुलर स्थानीयकरण की पहचान करता है जिसमें कैसपेस व्यक्त किए जाते हैं।

Figure 1
चित्र 1: रेटिना इमेजिंग योजना। (ए) माइक्रोस्कोप स्लाइड में रेटिना अनुभागों को रखने की सिफारिश की। (बी) रेटिना में इमेजिंग क्षेत्रों का अवलोकन। (ग) 20x उद्देश्य पर रेटिना दृश्य का प्रतिनिधित्व। रेटिना परतें: आरजीएल = रेटिना गैंग्लियन परत, आईएनएल = आंतरिक परमाणु परत, ओएनएल = बाहरी परमाणु परत। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: आरवीओ एंडोथेलियल कोशिकाओं और न्यूरॉन्स में कैसपेज़ -9 को प्रेरित करता है। (ए) सीएल-कैस्पेज़ -9 1: 800 (हरा), आइसोलेक्टिन 1: 200 (लाल), और डीएपीआई (सफेद) के साथ सना हुआ 1-दिवसीय पी-आरवीओ से प्रतिनिधि रेटिना क्रॉस-सेक्शन। (बी) सीएल-कैसपेज़ -9 के साथ न्यूरॉन्स की संख्या का परिमाणीकरण (एंटीबॉडी पर विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें)। (सी) सीएल-कैसपेज़ -9 के साथ एंडोथेलियल कोशिकाओं की संख्या का परिमाणीकरण। (डी) सीएल-कैसपेज़ -9 को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की कुल संख्या। घायल नहीं, एन = 6; 1-दिवसीय पी-आरवीओ, एन = 5। त्रुटि पट्टियाँ एसईएम के माध्य ± प्रतिनिधित्व करती हैं; एक तरफा एनोवा, फिशर का एलएसडी परीक्षण। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
(ए) आईईसी कैस्प 9डब्ल्यूटी और आईईसी कैस्प 9केओ लिटरमेट चूहों से प्रतिनिधि रेटिना क्रॉस-सेक्शन 1-दिवसीय पी-आरवीओ कैसपेज़ -7 (हरा), सीएल-कैसपेज़ -9 (नीला), सीडी 31, एक संवहनी मार्कर (लाल), और डीएपीआई (सफेद) से सना हुआ है। (बी) सीएल-कैसपेज़ -9 और कैसपेज़ -7 के साथ आंतरिक रेटिना में कोशिकाओं की संख्या का परिमाणीकरण। (सी) सीएल-कैसपेज़ -9 और कैसपेज़ -7 के साथ एंडोथेलियल कोशिकाओं की संख्या का परिमाणीकरण। (डी) सीएल-कैसपेज़ -9 या कैसपेज़ -7 को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की कुल संख्या। आईईसी कैस्प 9 डब्ल्यूटी, एन = 6-12; iEC Casp9KO, n = 3-8. त्रुटि पट्टियाँ एसईएम के माध्य ± प्रतिनिधित्व करती हैं; एक तरफा एनोवा, फिशर का एलएसडी परीक्षण। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: कैसपेज़ -9 गतिविधि का निषेध कैसपेज़ -7 अभिव्यक्ति पी-आरवीओ को रोकता है। (ए) कैस्पेज़ -7 (हरा), आइसोलेक्टिन (लाल), और डीएपीआई (सफेद) के साथ दाग वाले पेन 1-एक्सबीआईआर 3 के साथ इलाज या अनुपचारित और 1-दिवसीय पी-आरवीओ से प्रतिनिधि रेटिना क्रॉस-सेक्शन। (बी) कैसपेज़ -7 के साथ एंडोथेलियल कोशिकाओं की संख्या का परिमाणीकरण। (सी) कैसपेज़ -7 के साथ ल्यूकोसाइट्स की संख्या का परिमाणीकरण। (डी) कैसपेज़ -7 के साथ प्रति न्यूरोनल परत न्यूरॉन्स की संख्या का परिमाणीकरण। (ई) कैसपेज़ -7 को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की कुल संख्या। अघायल पेन 1 खारा, एन = 6; अघायल पेन 1-एक्सबीआईआर 3, एन = 5; 1-दिवसीय पी-आरवीओ पेन 1 खारा, एन = 5; 1-दिवसीय पी-आरवीओ पेन 1-एक्सबीआईआर 3, एन = 3। त्रुटि पट्टियाँ एसईएम के माध्य ± प्रतिनिधित्व करती हैं; एक तरफा एनोवा, फिशर का एलएसडी परीक्षण। संक्षेप: आरजीएल = रेटिना गैंग्लियन परत, आईएनएल = आंतरिक परमाणु परत, और ओएनएल = बाहरी परमाणु परत। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

कैसपेस प्रोटीज का एक बहु-सदस्यीय परिवार है जो कोशिका मृत्यु और सूजन में उनकी भूमिकाओं के लिए सबसे अच्छा अध्ययन किया जाता है; हालांकि, हाल ही में कुछ परिवारके सदस्यों के लिए विभिन्न प्रकार के गैर-मृत्यु कार्यों का खुलासा किया गया है। कैसपेज़ फ़ंक्शन की हमारी अधिकांश समझ सेल संस्कृति में काम से और मानव रोग से अनुमानित डेटा से प्राप्त होती है। हालांकि यह सराहना की जाती है कि बीमारी में कैसपेस का असामान्य प्रेरण, सक्रियण या निष्क्रियता है, कार्यात्मक रूप से यह निर्धारित करना चुनौतीपूर्ण रहा है कि कैसपेस रोग विकृति चला रहे हैं या नहीं। विशिष्ट कैसपेस का आकलन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले कई उपकरण कई परिवार के सदस्यों का पता लगाते हैं, इन अभिकर्मकों के साथ प्राप्त डेटा की कार्यात्मकप्रासंगिकता को कम करते हैं। यहां हम एक उदाहरण के रूप में रेटिना का उपयोग करते हुए जटिल ऊतक में कैसपेस का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। तंत्रिका तंत्र में, कैसपेज़ अभिव्यक्ति को पूर्व और प्रसवोत्तर रूप से डाउन-विनियमित किया जाता है। यह एक रोग मॉडल में कैसपेज़ स्तर में परिवर्तन का परीक्षण करने के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के उपयोग की अनुमति देता है।

जबकि प्रोटोकॉल का ध्यान छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण पर है, तकनीक की सफलता सावधानीपूर्वक ऊतक तैयारी, साथ ही डेटा की स्थिरता, वैधता और विश्वसनीयता सुनिश्चित करने के लिए आईएचसी और माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग पर भी निर्भर करती है। पूरे डेटा सेट की छवि बनाने के लिए समान मापदंडों का उपयोग करने के लिए सावधानी बरतनी चाहिए। खराब गुणवत्ता वाली छवियां, कम कंट्रास्ट और धुंधला फोकस विश्वसनीय डेटा प्रदान नहीं करेंगे। रेटिना के पी-आरवीओ क्षेत्रों को सेक्शनिंग और इमेजिंग करते समय, आँसू और फोल्डिंग से बचा जाना चाहिए क्योंकि इन क्षेत्रों के परिणामस्वरूप कलाकृतियां हो सकती हैं। प्रत्यक्ष क्षति वाले क्षेत्रों से भी बचना चाहिए। इमेजिंग करने वाले अन्वेषक को ऊतक के उपचार के लिए अंधा करने की आवश्यकता होती है। विश्लेषण के लिए, यह अनुशंसा की जाती है कि उपचार समूह में अंधे दो स्वतंत्र पर्यवेक्षक विश्लेषण करें। इसके अलावा, प्राथमिक माउस एंटीबॉडी का उपयोग माउस की चोट मॉडल में नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि द्वितीयक एंटीबॉडी गैर-विशेष रूप से वाहिका से बंधते हैं। एक विकल्प सीधे संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करना है।

सेल गिनती के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण अभिव्यक्ति के क्षेत्र के प्रतिशत का परिमाणीकरण है। इसका उपयोग तब किया जा सकता है जब सेल गिनती संभव नहीं होती है (उदाहरण के लिए, यदि कैसपेस अभिव्यक्ति न्यूरोनल प्रक्रियाओं या फोटोरिसेप्टर खंडों के लिए स्थानीयकृत है)। केंद्रीय और परिधीय रेटिना विभिन्न चोट मॉडल में अलग-अलग प्रभावित होते हैं। विधि को विशेष रूप से विभिन्न रेटिना क्षेत्रों का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यदि बीआरवीओ का प्रदर्शन कर रहे हैं, तो आंख के घायल हिस्से से वर्गों का चयन किया जाना चाहिए। प्रोटोकॉल यह पहचानने के लिए विभिन्न सेल मार्करों को धुंधला करने का भी प्रावधान करता है कि कैसपेस कहां व्यक्त किया गया है।

विधि की सीमाओं में शामिल है कि यह किसी दिए गए सेल में कैसपेज़ सिग्नल के उच्च और निम्न स्तर के बीच अंतर नहीं करता है। इसके अतिरिक्त, न्यूरोनल परतों की पहचान करने के लिए एक परमाणु दाग का उपयोग करना सुविधाजनक है लेकिन निश्चित रूप से न्यूरोनल अभिव्यक्ति का संकेत नहीं देता है (ग्लिया और ल्यूकोसाइट्स इन परतों में भी मौजूद हैं)। न्यूरोनल अभिव्यक्ति को मान्य करने के लिए अतिरिक्त न्यूरोनल मार्करों का उपयोग किया जा सकता है। कैसपेस अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए विभिन्न प्रकार के एंटीबॉडी भी उपलब्ध हैं; इन्हें मानव कैसपेज़ -9 के लिए सबसे अच्छी तरह से परिभाषित किया गया है, जहां पूर्ण लंबाई / क्लीवर (सीएल) कैसपेज़ -9, ऑटोक्लीवर कैसपेज़ -9 और कैसपेज़ -3-क्लीवर कैसपेज़ -9 के लिए एंटीबॉडी हैं।

आईएचसी सिग्नल की औसत तीव्रता को अक्सर परिमाणीकरण विधि के रूप में रिपोर्ट किया जाता है। हालांकि, लाल रक्त कोशिकाओं से पृष्ठभूमि शोर या ऑटोफ्लोरेसेंस गलत परिणाम उत्पन्न कर सकता है। सेल विशिष्ट परिमाणीकरण पृष्ठभूमि, गैर-विशिष्ट धुंधलापन और ऑटोफ्लोरेसेंस के निर्धारण और भेदभाव की अनुमति देता है।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग व्यक्तिगत कैसपेस की अभिव्यक्ति में ऊतक के व्यापक परिवर्तनों, एक विशिष्ट सेल प्रकार में अभिव्यक्ति में परिवर्तन, जैसे एंडोथेलियल सेल, और विशिष्ट स्थानों में विशिष्ट सेल प्रकारों में परिवर्तन, जैसे कि विभिन्न रेटिना परतों में न्यूरॉन्स को मापने के लिए किया जा सकता है। यह लचीलापन प्रयोगकर्ता को यह पूछने की अनुमति देता है कि रोग की स्थिति व्यक्तिगत कैसपेज़ स्तरों को कैसे बदल रही है। मौजूदा / वैकल्पिक तरीके कैसपेज़ सिग्नलिंग की अर्ध-मात्रात्मक तुलना के लिए पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण का उपयोग करते हैं, हालांकि विधियां सेलुलर स्थानीयकरण का स्पष्ट पृथक्करण प्रदान नहीं करेंगी जो इस प्रोटोकॉल में है। विशेष रूप से, चित्रा 3 डी में, कैसपेज़ -9 निषेध आरजीएल की तुलना में आईएनएल और ओएनएल में न्यूरोनल कैसपेज़ -9 को कम करने में अधिक प्रभावी है। इस तरह के संकल्प को अन्य तरीकों से प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, जब एक पूरे ऊतक का जैव रासायनिक रूप से विश्लेषण किया जाता है, तो कैस्पेस का स्तर जो बदलता है वह उठाने के लिए बहुत कम हो सकता है, क्योंकि एक जटिल ऊतक में कई अलग-अलग सेल प्रकार होते हैं।

एंटीबॉडी, जिसे उपयोगकर्ता द्वारा मान्य किया जाना चाहिए, कैस्पेस जांच के लिए विशिष्टता प्रदान करते हैं। कैसपेस कैस्केड में कार्य कर सकते हैं (यानी, सर्जक प्रभावक को सक्रिय करता है और फिर परिणाम - मृत्यु, सूजन, सेल सिग्नलिंग की ओर जाता है)। इस प्रोटोकॉल का उपयोग क्षति के बाद विभिन्न समय बिंदुओं पर एकत्र किए गए नमूनों में किया जा सकता है; यहां प्रस्तुत उदाहरणों में, नमूने आरवीओ के बाद अलग-अलग समय पर एकत्र किए जाते हैं। पहले प्रकाशित काम में, यह पाया गया है कि कैसपेज़ -9 को आरवीओ7 के बाद 1 घंटे के भीतर बढ़ाया गया था, जिससे आगे सत्यापन और लक्ष्यीकरण अध्ययन होता है। आरवीओ पैथोलॉजी के संभावित चालक के रूप में एंडोथेलियल कैस्पेज़ -9 की पहचान करने के बाद, एंडोथेलियल कैस्पेज़ -9 को मान्य करने के लिए इंड्यूसेबल एंडोथेलियल सेल कैस्पेज़ -9केओ के साथ एक माउस का उपयोग किया गया था। इंड्यूसेबल सेल विशिष्ट कैस्पेज़ केओ चूहों का उपयोग विशिष्टता का एक और स्तर प्रदान करता है और संवैधानिक कैस्पेज़ -9केओ18 के साथ देखी गई विकासात्मक मृत्यु से बचाता है। यह परिवार के अन्य सदस्यों में प्रतिपूरक परिवर्तनों से भी बचता है जो संवैधानिक कैसपेज़ केओ चूहों19 में होने के लिए दिखाए गए हैं। इसके अलावा, सेल विशिष्ट इंड्यूसेबल कैस्पेज़ केओ चूहों का उपयोग सेल प्रकार की पहचान की अनुमति देता है जिसमें कैसपेज़ ऊतक में विकृति को विनियमित कर रहा है। प्रोटोकॉल आरवीओ में सक्रिय कैसपेज़ -9 को लक्षित करते हुए, एक चिकित्सीय दृष्टिकोण की प्रभावकारिता से पूछताछ करने के लिए कदम भी प्रदान करता है। इस दृष्टिकोण को मस्तिष्क सहित अन्य ऊतकों पर भी लागू किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक निम्नलिखित प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा करते हैं: सीएमटी के पास निम्नलिखित पेटेंट आवेदन यूएस 20200164026, यूएस 20190142915 और यूएस 20150165061 हैं। सीएमटी और एसएस के पास एक पेटेंट आवेदन है जिसे अमेरिकी 20140024597 है। सी.एम.टी., ए.एम.पी., और एम.आई.ए. के पास पेटेंट आवेदन US2020058683 है। सीएमटी और वाईवाईजे के पास पेटेंट आवेदन डब्ल्यूओ 2018013519 है। एम.आई.ए. और सी.एम.टी को न्यूयॉर्क शहर में कोलंबिया विश्वविद्यालय के ट्रस्टियों द्वारा पेटेंट आवेदन डब्ल्यूओ /2020/223212 पर आविष्कारकों के रूप में सूचीबद्ध किया गया है। शेष लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

इस कार्य को नेशनल साइंस फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप प्रोग्राम (एनएसएफ-जीआरएफपी) अनुदान डीजीई - 1644869 और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर एंड स्ट्रोक (एनआईएनडीएस) द्वारा राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच), पुरस्कार संख्या एफ 99एनएस 124180 एनआईएच एनआईएनडीएस विविधता विशेष एफ 99 (सीकेसीओ को), राष्ट्रीय नेत्र संस्थान (एनईआई) 5 टी 32 ईवाई013933 (एएमपी के लिए), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर एंड स्ट्रोक (आरओ 1 एनएस 1 एनएस 1 एनएस 08) द्वारा समर्थित किया गया था। आर03 एनएस099920 से सीएमटी तक, और रक्षा सेना / वायु सेना विभाग (डीयूआरआईपी से सीएमटी)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-Caspase-7 488 Novus Biologicals NB-56529AF488 use at 1:150
anti-cl-Caspase-9 Cell Signaling 9505-S use at 1:800
anti-CD31 BD Pharmingen 553370 use at 1:50
Confocal Spinning Disc Microscope Biovision
FIJI 2.3.0 open source
Fluormount G Fisher 50-187-88
Forcep Roboz RS-5015
iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice lab generated see Avrutsky 2020
Isolectin (594, 649) Vector DL-1207 use at 1:200
Ketamine Hydrochloride Henry Schein NDC: 11695-0702-1
Perfusion pump  Masterflex
Pen1-XBir3 lab generated see Avrutsky 2020
Prism 9.1 GraphPad
Tissue-Tek O.C.T. Fisher 14-373-65
Vis-a-View 4.0 Visitron Systems
Xylazine Akorn NDCL 59399-110-20

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 185
रेटिना ऊतक में इम्यूनोस्टेन्ड कैस्पेज़ -9 का परिमाणीकरण
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Colón Ortiz, C. K., Potenski, A. M., Johnson, K. V., Chen, C. W., Snipas, S. J., Jean, Y. Y., Avrutsky, M. I., Troy, C. M. Quantification of Immunostained Caspase-9 in Retinal Tissue. J. Vis. Exp. (185), e64237, doi:10.3791/64237 (2022).

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