Summary
Aquí se presenta un protocolo detallado de inmunohistoquímica para identificar, validar y apuntar a caspasas funcionalmente relevantes en tejidos complejos.
Abstract
Se sabe que la familia de caspasas media muchas vías celulares más allá de la muerte celular, incluida la diferenciación celular, la búsqueda de caminos axonales y la proliferación. Desde la identificación de la familia de proteasas de muerte celular, se han buscado herramientas para identificar y ampliar la función de miembros específicos de la familia en estados de desarrollo, salud y enfermedad. Sin embargo, muchas de las herramientas de caspasa disponibles comercialmente actualmente que se utilizan ampliamente no son específicas para la caspasa dirigida. En este informe, delineamos el enfoque que hemos utilizado para identificar, validar y atacar la caspasa-9 en el sistema nervioso utilizando un nuevo inhibidor y enfoques genéticos con lecturas inmunohistoquímicas. Específicamente, utilizamos el tejido neuronal retiniano como modelo para identificar y validar la presencia y función de las caspasas. Este enfoque permite la interrogación de las funciones apoptóticas y no apoptóticas específicas de tipo celular caspasa-9 y se puede aplicar a otros tejidos complejos y caspasas de interés. Comprender las funciones de las caspasas puede ayudar a ampliar el conocimiento actual en biología celular, y también puede ser ventajoso para identificar posibles objetivos terapéuticos debido a su participación en la enfermedad.
Introduction
Las caspasas son una familia de proteasas que regulan la muerte celular del desarrollo, las respuestas inmunes y la muerte celular aberrante en la enfermedad 1,2. Si bien es bien sabido que los miembros de la familia de las caspasas son inducidos en una variedad de enfermedades neurodegenerativas, comprender qué caspasa impulsa la patología de la enfermedad es más difícil3. Tales estudios requieren herramientas para identificar, caracterizar y validar la función de los miembros individuales de la familia de caspasas. El análisis de las caspasas individuales relevantes es importante tanto desde un punto de vista mecanicista como terapéutico, ya que la literatura tiene múltiples estudios que proporcionan evidencia de los diversos roles de las caspasas 4,5. Por lo tanto, si el objetivo es apuntar a una caspasa en una enfermedad para obtener un beneficio terapéutico, es fundamental tener una orientación específica de los miembros relevantes de la familia. Las técnicas tradicionales para detectar los niveles de caspasa en el tejido incluyen Western blot y enfoques enzimáticos y fluorométricos 3,6. Sin embargo, ninguna de estas medidas permite la detección específica de células de los niveles de caspasas, y en algunos escenarios, las caspasas escindidas a menudo no pueden detectarse mediante las medidas tradicionales de análisis de proteínas. Se sabe que las caspasas pueden desempeñar diferentes funciones apoptóticas y no apoptóticas en el mismo tejido7, por lo tanto, se necesita una caracterización cuidadosa de los niveles de caspasa específicos de las células para una comprensión precisa de las vías de desarrollo y enfermedad.
Este estudio muestra la activación y función de la caspasa en un modelo de hipoxia-isquemia neurovascular - oclusión de la vena retiniana (OVR)7,8. En un tejido complejo como la retina, hay múltiples tipos de células que pueden verse afectadas por la hipoxia-isquemia inducida en la OVR, incluidas las células gliales, las neuronas y la vasculatura7. En la retina del ratón adulto, hay muy poca expresión de caspasas evidentes en el tejido sano, medida por inmunohistoquímica (IHC)7, pero ese no es el caso durante el desarrollo9 o en modelos de enfermedad retiniana10,11. IHQ es una técnica bien establecida en la investigación biomédica y ha permitido la validación de dianas patológicas y de enfermedades, la identificación de nuevos roles a través de la localización espacial y la cuantificación de proteínas. En los casos en que los productos de caspasa escindidos no puedan detectarse mediante Western blot o análisis fluorométrico, ni la ubicación celular específica de distintas caspasas o la interrogación de las vías de señalización de caspasas a través de la localización, entonces se debe usar IHQ.
Para determinar la(s) caspasa(s) funcional(es) relevante(s) en la RVO, se utilizó IHQ con anticuerpos validados para caspasas y marcadores celulares. Los estudios previos realizados en el laboratorio mostraron que la caspasa-9 se activó rápidamente en un modelo de accidente cerebrovascular isquémico e inhibición de caspasa-9 con un inhibidor altamente específico protegido de la disfunción neuronal y la muerte12. Debido a que la retina es parte del sistema nervioso central (SNC), sirve como un sistema modelo para consultar e investigar más a fondo el papel de la caspasa-9 en las lesiones neurovasculares13. Con este fin, se utilizó el modelo de ratón de RVO para estudiar la ubicación y distribución específica de la célula de la caspasa-9 y su implicación en la lesión neurovascular. La OVR es una causa común de ceguera en adultos en edad laboral que resulta de una lesión vascular14. Se encontró que la caspasa-9 se expresó de manera no apoptótica en las células endoteliales, pero no en las neuronas.
Como tejido, la retina tiene la ventaja de ser visualizada como un montaje plano, que permite la apreciación de las redes vasculares, o como secciones transversales, que resaltan las capas neuronales de la retina. La cuantificación de la expresión de la proteína caspasa en secciones transversales proporciona un contexto con respecto a qué caspasa es potencialmente crítica en la conectividad neuronal de la retina y la función de la visión mediante la identificación de la localización de la caspasa (s) en la retina. Después de la identificación y validación, la focalización de la caspasa de interés se logra mediante la deleción inducible específica de la célula de la caspasa identificada. Para posibles indagaciones terapéuticas, se probó la relevancia de las caspasas de interés utilizando herramientas específicas para inhibir la caspasa activada. Para la caspasa-9 se utilizó un inhibidor altamente selectivo 7,15 de la célula que significaba Pen1-XBIR3. Para este informe, se utilizó cepa C57BL/6J masculina de 2 meses de edad y cepa knockout endotelial 9 inducible por tamoxifeno (iEC Casp9KO) con antecedentes C57BL/6J. Estos animales fueron expuestos al modelo de ratón de RVO y C57BL / 6J fueron tratados con el inhibidor selectivo de caspasa-9, Pen1-XBir3. La metodología descrita puede ser aplicada a otros modelos de enfermedad en los sistemas central y periférico 7,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Este protocolo sigue la declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión. Los experimentos con roedores fueron aprobados y monitoreados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Columbia.
1. Preparación de tejido retiniano y criosección
- Eutanasia a los animales mediante la administración de anestesia intraperitoneal (ketamina (80-100 mg/kg) y xilazina (5-10 mg/kg)), y perfundir a los ratones sometidos a RVO (ver8 para más detalles) con paraformaldehído al 4% (PFA) utilizando una bomba peristáltica.
NOTA: Pellizque el dedo del pie al animal para confirmar la profundidad de la anestesia antes de proceder con la eutanasia y la perfusión. Los detalles sobre la perfusión se pueden encontrar en16. - Cosechar los ojos mediante enucleación cuidadosa con fórceps y poner el globo en 1 ml de PFA al 4%. Dejar los ojos durante la noche a 4 °C. Lave los ojos tres veces durante 10 minutos, agregando 1 ml de 1x PBS y colocándolos en la coctelera.
- Sumerja los ojos en 1 ml de sacarosa al 30% durante 3 días, hasta que se asienten en el fondo del tubo, lo que indica la absorción de la sacarosa.
- Llene los ojos con un compuesto de temperatura de corte óptima con una jeringa de 30 G, hasta que el ojo tenga una apariencia redondeada (aproximadamente 50 μL).
- Incrustar los ojos en un criomold con un compuesto de temperatura de corte óptimo hasta que los ojos estén cubiertos y congelar a -80 °C hasta que estén listos para la criosección.
- La sección incrustó los ojos a 20 μm en portaobjetos de vidrio usando un criostato.
- Retire el bloque compuesto de temperatura de corte óptima del criomolde.
- Colóquelo en el mandril de criostato agregando un compuesto de temperatura de corte óptimo y colocando el bloque en el mandril. Déjelo dentro del criostato hasta que se congele.
- Proceda a cortar el bloque a 20 μm hasta que se vea el tejido retiniano.
NOTA: Esto se puede confirmar con un microscopio óptico con un aumento de 30x (objetivo 3x, oculares 10x). Los tejidos se pueden distinguir de los medios OCT por color y forma. - Recoja el tejido de la retina en portaobjetos de microscopio en una serie de cuatro secciones por portaobjetos.
NOTA: Consulte la Figura 1A para la colocación sugerida de secciones retinianas.
- Etiquete las diapositivas con una identificación que desidentifique el tratamiento y el genotipo.
- Conservar los portaobjetos a -20 °C hasta que se tiñen.
2. Inmunohistoquímica
NOTA: Utilice tejido criopreservado fijo para inmunohistoquímica para mantener la morfología celular. Seleccionar secciones que estén al nivel de las imágenes de tomografía de coherencia óptica (OCT) adquiridas in vivo7. Utilice las dos primeras series de portaobjetos recogidos del criostato o secciones de 150 μm en el tejido de la retina.
- Coloque las guías en una cámara de corredera oscura y húmeda.
- Perpermeabilización y bloqueo: Lavar las secciones transversales de la retina con 300 μL de 1x PBS durante 5 min para eliminar la OCT y desechar después.
- Permeabilizar el tejido añadiendo 300 μL de 1x PBS con Triton X-100 al 0,1% durante 2 h a temperatura ambiente (RT) y desechar después.
- Bloquear el tejido añadiendo 300 μL de tampón de bloqueo (10% de suero normal de cabra (NGS), 1% de albúmina sérica bovina (BSA) en 1x PBS, filtrado) y dejar toda la noche a 4 °C.
- Anticuerpos primarios: diluyen los anticuerpos primarios en el tampón de bloqueo. Los anticuerpos primarios utilizados incluyen anti-cl-caspasa-9 en 1:800, anti-CD31 en 1:50 y anti-caspasa-7-488 (anticuerpo marcado directamente) en 1:150.
NOTA: Siga las recomendaciones del fabricante para la dilución adecuada de anticuerpos primarios.- Vierta las secciones del tampón de bloqueo y aplique 100 μL del cóctel de anticuerpos primarios a los portaobjetos de la retina.
- Incubar las secciones transversales durante la noche a 4 °C.
- Lave las secciones cuatro veces durante 5 min con 300 μL de 1x PBS.
NOTA: Si las secciones de tejido son muy frágiles, los lavados deben eliminarse mediante acción capilar aplicando un pañuelo de papel en la esquina del portaobjetos para evitar el desplazamiento de las secciones de la retina. - Para evitar el marcado cruzado de anticuerpos primarios criados en la misma especie huésped, complete la tinción con anticuerpos secundarios antes de aplicar los anticuerpos directamente marcados.
- Anticuerpos secundarios: diluir los anticuerpos secundarios en tampón de bloqueo a una concentración de 0.1%. Por ejemplo, para detectar anti-cl-caspasa-9, un anticuerpo criado en conejo, use cabra-anti-conejo-568 secundario.
- Aplicar 200 μL del cóctel de anticuerpos secundarios a las retinas.
- Incubar el tejido durante 2 h en RT.
- Lave las secciones cuatro veces durante 5 min con 300 μL de 1x PBS.
- Teñir los núcleos durante 5 min con 300 μL de DAPI a una dilución del 0,02%.
- Lavar una vez durante 5 min con 300 μL de 1x PBS.
- Coloque un cubreobjetos en las secciones de la retina utilizando 500 μL de medios fluoromount-G, que preservan la señal fluorescente, y coloque cuidadosamente el cubreobjetos en la parte superior del portaobjetos, evitando burbujas.
3. Imágenes confocales
- Adquirir imágenes de las secciones teñidas con microscopía confocal.
- Encienda el microscopio confocal.
- Coloque la diapositiva en el escenario.
- Ajuste el enfoque para ver claramente la sección retiniana.
NOTA: Tome al menos cuatro imágenes por sección y la imagen cuatro secciones por retina. Consulte el esquema de imágenes de la retina para ver las áreas de imágenes sugeridas (Figura 1B, C).
- Imagen de tinción caspasa, vascular y nuclear utilizando un microscopio confocal que tiene adquisición de pila Z, utilizando un objetivo de 20x o 40x.
NOTA: Los parámetros de imagen y la configuración del software deben ser constantes para todas las imágenes en un experimento. El objetivo 20x proporciona una visión general de las capas retinianas, que están bien definidas por la tinción nuclear. El objetivo 40x proporciona más detalles celulares.- Establezca los tiempos de exposición e intensidad láser adecuados por canal haciendo clic en adquirir configuración.
- Configure la pila Z para visualizar toda la sección haciendo clic en la serie Z y configure parámetros hacia arriba y hacia abajo para cubrir la profundidad del tejido.
- Guarde las imágenes siguiendo el ID enmascarado asignado durante la criosección.
4. Cuantificación de los niveles de caspasa
- Arrastre archivos de imagen de 405, 470, 555 y 640 canales a la consola de FIJI.
- Haga clic en Imagen > Color > Combinar canales.
- Asigne colores a los archivos de la siguiente manera: rojo a 555, verde a 470, gris a 405, cian a 640.
- Comprima la pila Z haciendo clic en Imagen > Pila > Proyecto Z.
- Haga clic en Tipo de proyección: Intensidad máxima.
- Abra la interfaz de canales haciendo clic en Imagen > herramienta Canales de color.
- Abra la interfaz Brillo y contraste .
- Seleccione parámetros por canal.
- Ve a Canales y selecciona un canal.
- Coloque el cursor encima de la celda expresada en la caspasa y anote el valor del píxel.
- Coloque el cursor encima del fondo y anote el valor del píxel.
- Parámetros de prueba
- Vaya a la interfaz Brillo y contraste.
- Haga clic en Seleccionar.
- Introduzca el valor mínimo mostrado (valor de píxeles anotado de la celda expresada por la caspasa).
- Introduzca el valor máximo mostrado (valor de píxeles anotado del fondo).
- Haga clic en Aceptar.
- Repita los pasos 4.8-4.9 para todos los canales.
- Pruebe los parámetros eligiendo imágenes aleatorias de tejido cegado.
NOTA: Edite los parámetros de brillo y contraste sólo si el valor de fondo no es adecuado para otras imágenes. - Una vez establecidos los parámetros, abra los archivos de imagen y comprima la pila Z.
- Agregue los parámetros de brillo y contraste para el canal de caspasa y la isolectina, canal marcador vascular.
- Utilice la herramienta de puntos para cuantificar el número de áreas vasculares positivas utilizando la colocalización del marcador vascular con la expresión de caspasa como lectura de áreas positivas.
- Repita el paso 4.14 pero usando Hoechst como marcador de áreas neuronales positivas.
- Anota los valores de una hoja de cálculo por imagen.
- Promedie los valores por sección.
- Promedie los valores de la sección: esta será la lectura por ojo.
5. Confirmación genética de la relevancia de la caspasa-9 de las células endoteliales
- Utilice retinas obtenidas de los ratones Casp9FL/FL-VECad-CreERT2 que fueron sometidos a RVO7.
- Inmunoteñir las retinas para caspasa-9 (la caspasa eliminada), caspasa-7 (una caspasa efectora aguas abajo), marcadores vasculares y DAPI como se describe anteriormente en la sección 2.
- Imagen y cuantificación como se describe anteriormente en las secciones 3 y 4.
6. Apuntando a la caspasa-9 en RVO
- Obtener ojos de los ratones sometidos a RVO seguido de la aplicación del inhibidor de caspasa-9 Pen1-XBir3 tópicamente a los ojos como en7.
- Inmunoteñir las retinas para caspasa-7 (una caspasa efectora aguas abajo), marcadores vasculares y DAPI como se describe anteriormente en la sección 2.
- Imagen y cuantificación como se describe anteriormente en las secciones 3 y 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El protocolo descrito permite al usuario analizar y cuantificar los niveles de caspasa-9 en el tejido retiniano. Además, presenta herramientas para identificar, validar y apuntar específicamente a la caspasa-9 y los sustratos aguas abajo. Los pasos resumidos permiten un análisis cuantificable de los niveles de caspasa y la especificidad celular en fotomicrografías fluorescentes. Todas las figuras muestran fotomicrografías representativas y cuantificación de los niveles indicados de caspasa en la retina total, las células endoteliales y las neuronas en secciones transversales de retina P-RVO no lesionadas y de 1 día. La sección transversal retiniana permite la visualización de los núcleos de la retina en la capa ganglionar de la retina (RGL), la capa nuclear interna (INL) y la capa nuclear externa (ONL) cuando se tiñen con Hoechst. Además, los vasos sanguíneos de la retina son visibles en las capas plexiformes de la retina o entre la RGL y la INL, y entre la LIN y la LN. Debido a la naturaleza histológica de los vasos sanguíneos, cuando se secciona la retina, los vasos sanguíneos aparecerán como desconectados y separados, suministrando las capas plexiformes. La Figura 2 identifica la caspasa-9 como una OVR-P altamente regulada de 1 día. La Figura 3 valida la relevancia funcional de la caspasa-9 endotelial mediante el uso de ratones knockout de células endoteliales inducibles. La Figura 4 muestra que la focalización de la caspasa-9 activa bloquea farmacológicamente la inducción de una diana aguas abajo de la caspasa-9-caspasa-7. El protocolo identifica la localización celular de las caspasas y las capas neuronales de la retina en las que se expresan las caspasas.
Figura 1: Esquema de imágenes de la retina . (A) Colocación recomendada de secciones retinianas en el portaobjetos del microscopio. (B) Descripción general de las áreas de imágenes en la retina. (C) Representación de la vista retiniana en un objetivo 20x. Capas retinianas: RGL = capa ganglionar retiniana, INL = capa nuclear interna, ONL = capa nuclear externa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: RVO induce caspasa-9 en células endoteliales y neuronas. (A) Cortes transversales retinianos representativos de no lesionados y 1 día de P-RVO teñidos con cl-caspasa-9 1:800 (verde), isolectina 1:200 (rojo) y DAPI (blanco). (B) Cuantificación del número de neuronas con cl-caspasa-9 (ver Tabla de materiales para detalles sobre los anticuerpos). (C) Cuantificación del número de células endoteliales con cl-caspasa-9. (D) Número total de células que expresan cl-caspasa-9. Ilesos, n = 6; 1 día P-RVO, n = 5. Las barras de error representan la media ± SEM; ANOVA unidireccional, prueba de LSD de Fisher. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La deleción celular endotelial de la caspasa-9 endotelial bloquea la inducción de la RVO-inducción de la caspasa-7. (A) Secciones transversales retinianas representativas de ratones compañeros de camada iEC Casp9WT e iEC Casp9KO 1-día P-RVO teñidos con caspasa-7 (verde), cl-caspasa-9 (azul), CD31, un marcador vascular (rojo) y DAPI (blanco). (B) Cuantificación del número de células de la retina interna con cl-caspasa-9 y con caspasa-7. (C) Cuantificación del número de células endoteliales con cl-caspasa-9 y con caspasa-7. (D) Número total de células que expresan cl-caspasa-9 o caspasa-7. iEC Casp9WT, n = 6-12; iEC Casp9KO, n = 3-8. Las barras de error representan la media ± SEM; ANOVA unidireccional, prueba de LSD de Fisher. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La inhibición de la actividad de la caspasa-9 inhibe la expresión de caspasa-7 P-RVO. (A) Secciones transversales retinianas representativas de P-RVO no lesionadas y de 1 día tratadas o no tratadas con Pen1-XBIR3 teñidas con caspasa-7 (verde), isolectina (rojo) y DAPI (blanco). (B) Cuantificación del número de células endoteliales con caspasa-7. (C) Cuantificación del número de leucocitos con caspasa-7. (D) Cuantificación del número de neuronas por capa neuronal con caspasa-7. (E) Número total de células que expresan caspasa-7. Solución salina no lesionada1 Pen1, n = 6; Pen1-XBIR3 ileso, n = 5; 1 día P-RVO Pen1 Saline, n = 5; P-RVO Pen1-XBIR3 de 1 día, n = 3. Las barras de error representan la media ± SEM; ANOVA unidireccional, prueba de LSD de Fisher. Abreviaturas: RGL = capa ganglionar retiniana, INL = capa nuclear interna y ONL = capa nuclear externa. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Las caspasas son una familia de proteasas de varios miembros mejor estudiada por su papel en la muerte celular y la inflamación; Sin embargo, más recientemente se han descubierto una variedad de funciones no mortales para algunos miembros de la familia 4,5. Gran parte de nuestra comprensión de la función de la caspasa se deriva del trabajo en cultivo celular y de datos inferenciales de enfermedades humanas. Si bien se aprecia que hay inducción, activación o inactivación aberrantes de caspasas en la enfermedad, ha sido un desafío determinar funcionalmente si las caspasas están impulsando la patología de la enfermedad. Muchas herramientas utilizadas para evaluar caspasas específicas detectan múltiples miembros de la familia, socavando la relevancia funcional de los datos obtenidos con estos reactivos17. Aquí proporcionamos un protocolo para estudiar caspasas en tejido complejo, utilizando la retina como ejemplo. En el sistema nervioso, la expresión de caspasa se regula a la baja antes y después del parto. Esto permite el uso de anticuerpos específicos para probar los cambios en los niveles de caspasa en un modelo de enfermedad.
Si bien el protocolo se centra en el procesamiento y análisis de imágenes, el éxito de la técnica también se basa en la preparación cuidadosa del tejido, así como en la IHQ y las imágenes microscópicas para garantizar la consistencia, validez y confiabilidad de los datos. Se debe tener cuidado de utilizar los mismos parámetros para obtener imágenes de un conjunto de datos completo. Las imágenes de baja calidad, el bajo contraste y el enfoque borroso no proporcionarán datos confiables. Al seccionar e imaginar regiones P-RVO de la retina, se deben evitar los desgarros y el plegamiento, ya que estas áreas pueden dar lugar a artefactos. También deben evitarse las áreas de daño directo. El investigador que realiza la obtención de imágenes debe estar cegado al tratamiento del tejido. Para el análisis, se recomienda que dos observadores independientes, cegados al grupo de tratamiento, realicen el análisis. Además, los anticuerpos primarios de ratón no deben usarse en modelos de lesión de ratón, ya que los anticuerpos secundarios se unen de forma no específica a la vasculatura. Una alternativa es usar anticuerpos primarios directamente conjugados.
Un enfoque alternativo al recuento celular es la cuantificación del porcentaje del área de expresión. Esto se puede usar cuando el recuento celular no es posible (por ejemplo, si la expresión de caspasa se localiza en procesos neuronales o segmentos fotorreceptores). La retina central y periférica se ven afectadas diferencialmente en varios modelos de lesión. El método se puede adaptar para analizar específicamente diferentes regiones de la retina. Si se realiza la ORVR, se deben seleccionar secciones de la parte lesionada del ojo. El protocolo también prevé la tinción de diferentes marcadores celulares para identificar dónde se expresa la caspasa.
Las limitaciones del método incluyen que no diferencia entre niveles altos y bajos de señal de caspasa en una célula dada. Además, el uso de una tinción nuclear para identificar las capas neuronales es conveniente, pero no indica definitivamente la expresión neuronal (la glía y los leucocitos también están presentes en estas capas). Se pueden usar marcadores neuronales adicionales para validar la expresión neuronal. También hay una variedad de anticuerpos disponibles para evaluar la expresión de caspasas; Estos se han definido mejor para la caspasa-9 humana, donde hay anticuerpos para la caspasa-9 de longitud completa / escindida (Cl), la caspasa-9 autoescindida y la caspasa-3-escindida en caspasa-9.
La intensidad media de la señal IHQ se informa con frecuencia como método de cuantificación. Sin embargo, el ruido de fondo o la autofluoresencia de los glóbulos rojos pueden producir resultados inexactos. La cuantificación específica de células permite la determinación y discriminación de antecedentes, tinción no específica y autofluoresencia.
Este protocolo se puede utilizar para medir los cambios en todo el tejido en la expresión de caspasas individuales, los cambios en la expresión en un tipo de célula específico, como una célula endotelial, y los cambios en tipos de células específicas en lugares específicos, como las neuronas en diferentes capas de la retina. Esta flexibilidad permite al experimentador consultar cómo el estado de la enfermedad está alterando los niveles individuales de caspasas. Los métodos existentes/alternativos utilizan el análisis Western Blotting para la comparación semicuantitativa de la señalización de caspasas, aunque los métodos no proporcionarán la clara separación de la localización celular que este protocolo logra. En particular, en la Figura 3D, la inhibición de la caspasa-9 es más efectiva para reducir la caspasa-9 neuronal en el INL y el ONL, en comparación con la RGL. Este tipo de resolución es difícil de lograr por otros métodos. Además, cuando un tejido completo se analiza bioquímicamente, los niveles de caspasas que cambian pueden ser demasiado bajos para recogerlos, ya que hay muchos tipos de células diferentes en un tejido complejo.
Los anticuerpos, que deben ser validados por el usuario, proporcionan especificidad para la caspasa sondeada. Las caspasas pueden actuar en cascadas (es decir, el efector activador del iniciador y luego conduce al resultado: muerte, inflamación, señalización celular). Este protocolo se puede utilizar en muestras recogidas en diferentes puntos de tiempo después del daño; en los ejemplos presentados aquí, las muestras se recogen en diferentes momentos después de la OVR. En trabajos publicados anteriormente, se ha encontrado que la caspasa-9 aumentó dentro de 1 h después de la OVR7, lo que condujo a estudios adicionales de validación y focalización. Después de identificar la caspasa-9 endotelial como un conductor potencial de la patología RVO, se utilizó un ratón con caspasa-9KO de células endoteliales inducibles para validar la caspasa-9 endotelial. El uso de ratones KO de caspasa específica de células inducibles proporciona otro nivel de especificidad y evita la muerte del desarrollo observada con la caspasa-9KO constitutiva18. También evita cambios compensatorios en otros miembros de la familia que se ha demostrado que ocurren en ratones caspasa constitutivosKO 19. Además, el uso de ratones KO de caspasa inducible específica de células permite la identificación del tipo de célula en la que la caspasa está regulando la patología en el tejido. El protocolo también proporciona los pasos para interrogar la eficacia de un enfoque terapéutico, dirigido a la caspasa-9 activa en la OVR. Este enfoque también se puede aplicar a otros tejidos, incluido el cerebro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran los siguientes intereses en conflicto: C.M.T. tiene las siguientes solicitudes de patente US20200164026, US20190142915 y US20150165061. C.M.T. y S.S. tienen una solicitud de patente US 20140024597. C.M.T., A.M.P. y M.I.A. tienen una solicitud de patente US2020058683. C.M.T. y Y.Y.J. tienen una solicitud de patente WO2018013519. M.I.A y C.M.T figuran como inventores en una solicitud de patente WO/2020/223212 por los fideicomisarios de la Universidad de Columbia en la ciudad de Nueva York. Los autores restantes declaran que no hay intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Programa de Becas de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias (NSF-GRFP) subvención DGE - 1644869 y el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH), número de premio F99NS124180 NIH NINDS Diversity Specialized F99 (a CKCO), el Instituto Nacional del Ojo (NEI) 5T32EY013933 (a AMP), el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (RO1 NS081333, R03 NS099920 a CMT), y el Departamento de Defensa del Ejército / Fuerza Aérea (DURIP a CMT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-Caspase-7 488 | Novus Biologicals | NB-56529AF488 | use at 1:150 |
| anti-cl-Caspase-9 | Cell Signaling | 9505-S | use at 1:800 |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | 553370 | use at 1:50 |
| Confocal Spinning Disc Microscope | Biovision | ||
| FIJI 2.3.0 | open source | ||
| Fluormount G | Fisher | 50-187-88 | |
| Forcep | Roboz | RS-5015 | |
| iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Isolectin (594, 649) | Vector | DL-1207 | use at 1:200 |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Perfusion pump | Masterflex | ||
| Pen1-XBir3 | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Prism 9.1 | GraphPad | ||
| Tissue-Tek O.C.T. | Fisher | 14-373-65 | |
| Vis-a-View 4.0 | Visitron Systems | ||
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
- Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. Caspases in cell death, inflammation, and disease. Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).
- Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. A primer on caspase mechanisms. Seminars in Cell & Developmental Biology. 82, Academic Press. 79-85 (2018).
- Troy, C. M., Jean, Y. Y. Caspases: therapeutic targets in neurologic disease. Neurotherapeutics. 12 (1), 42-48 (2015).
- Avrutsky, M. I., Troy, C. M. Caspase-9: a multimodal therapeutic target with diverse cellular expression in human disease. Frontiers in Pharmacology. 12, 1728 (2021).
- Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147 (4), 742-758 (2011).
- Troy, C. M., Akpan, N., Jean, Y. Y. Regulation of caspases in the nervous system: implications for functions in health and disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 99, 265-305 (2011).
- Avrutsky, M. I., et al. Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion. Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).
- Colon Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J. M., Smart, J., Troy, C. M. Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability. Journal of Visualized Experiments. (174), e62980 (2021).
- Tisch, N., et al. Caspase-8 modulates physiological and pathological angiogenesis during retina development. The Journal of Clinical Investigation. 129 (12), 5092-5107 (2019).
- Chi, W., et al. HMGB1 promotes the activation of NLRP3 and caspase-8 inflammasomes via NF-kappaB pathway in acute glaucoma. Journal of Neuroinflammation. 12, 137 (2015).
- Thomas, C. N., et al. Caspase-2 mediates site-specific retinal ganglion cell death after blunt ocular injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (11), 4453-4462 (2018).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. Journal of Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nature Reviews Neurology. 9 (1), 44-53 (2013).
- Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors. Journal of Global Health. 9 (1), 010427 (2019).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. The Journal of neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death & Differentiation. 15 (2), 322-331 (2007).
- Kuida, K., et al. Reduced apoptosis and cytochrome c-mediated caspase activation in mice lacking caspase 9. Cell. 94 (3), 325-337 (1998).
- Troy, C. M., et al. Death in the balance: alternative participation of the caspase-2 and -9 pathways in neuronal death induced by nerve growth factor deprivation. Journal of Neuroscience. 21 (14), 5007-5016 (2001).
