Summary
ATAC-seq è un metodo di sequenziamento del DNA che utilizza la trasposasi mutante iperattiva, Tn5, per mappare i cambiamenti nell'accessibilità della cromatina mediati da fattori di trascrizione. ATAC-seq consente la scoperta dei meccanismi molecolari alla base delle alterazioni fenotipiche nelle cellule tumorali. Questo protocollo delinea le procedure di ottimizzazione per ATAC-seq nei tipi di cellule epiteliali, comprese le cellule tumorali.
Abstract
Il test per la cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alto rendimento (ATAC-seq) sonda l'accessibilità dell'acido desossiribonucleico (DNA) utilizzando la trasposasi Tn5 iperattiva. Tn5 taglia e lega gli adattatori per il sequenziamento ad alta produttività all'interno di regioni di cromatina accessibili. Nelle cellule eucariotiche, il DNA genomico è impacchettato in cromatina, un complesso di DNA, istoni e altre proteine, che funge da barriera fisica al meccanismo trascrizionale. In risposta a segnali estrinseci, i fattori di trascrizione reclutano complessi di rimodellamento della cromatina per consentire l'accesso al meccanismo trascrizionale per l'attivazione genica. Pertanto, l'identificazione delle regioni aperte della cromatina è utile quando si monitorano le attività del potenziatore e del promotore genico durante eventi biologici come la progressione del cancro. Poiché questo protocollo è facile da usare e ha un basso requisito di input cellulare, ATAC-seq è stato ampiamente adottato per definire regioni aperte della cromatina in vari tipi di cellule, comprese le cellule tumorali. Per una corretta acquisizione dei dati, è necessario considerare diversi parametri durante la preparazione delle librerie ATAC-seq. Tra questi, la scelta del tampone di lisi cellulare, la titolazione dell'enzima Tn5 e il volume iniziale delle cellule sono cruciali per la preparazione della libreria ATAC-seq nelle cellule tumorali. L'ottimizzazione è essenziale per generare dati di alta qualità. Qui, forniamo una descrizione dettagliata dei metodi di ottimizzazione ATAC-seq per i tipi di cellule epiteliali.
Introduction
L'accessibilità della cromatina è un requisito chiave per la regolazione dell'espressione genica su scala genomica1. I cambiamenti nell'accessibilità della cromatina sono frequentemente associati a diversi stati patologici, incluso il cancro 2,3,4. Nel corso degli anni, sono state sviluppate numerose tecniche per consentire ai ricercatori di sondare il paesaggio della cromatina mappando le regioni di accessibilità della cromatina. Alcuni di essi includono DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)5, FAIRE-seq (formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements)6, MAPit (methyltransferase accessibility protocol for individual templates)7 e il focus di questo articolo, ATAC-seq (assay for transposase-accessible chromatin)8. DNase-seq mappa le regioni accessibili impiegando una caratteristica chiave della DNasi, vale a dire la digestione preferenziale del DNA nudo privo di istoni e altre proteine come i fattori di trascrizione5. FAIRE-seq, simile a ChIP-seq, utilizza la reticolazione e la sonicazione della formaldeide, tranne che non è coinvolta alcuna immunoprecipitazione e le regioni prive di nucleosomi sono isolate mediante estrazione fenolo-cloroformio6. Il metodo MAPit utilizza una metiltransferasi GC per sondare la struttura della cromatinaalla risoluzione 7 della singola molecola. ATAC-seq si basa sulla trasposasi iperattiva, Tn58. La trasposasi Tn5 si lega preferenzialmente alle regioni aperte della cromatina e inserisce adattatori di sequenziamento in regioni accessibili. Tn5 opera attraverso un meccanismo "taglia e incolla" mediato dal DNA, in base al quale la trasposasi precaricata con adattatori si lega ai siti aperti della cromatina, taglia il DNA e lega gli adattatori8. Le regioni legate a Tn5 vengono recuperate mediante amplificazione PCR utilizzando primer che ricottura a questi adattatori. FAIRE-seq e DNase-seq richiedono una grande quantità di materiale di partenza (~ 100.000 celle a 225.000 celle) e una fase di preparazione della libreria separata prima del sequenziamento9. D'altra parte, il protocollo ATAC-seq è relativamente semplice e richiede un piccolo numero di cellule (<50.000 cellule)10. A differenza delle tecniche FAIRE-seq e DNase-seq, la preparazione della libreria di sequenziamento di ATAC-seq è relativamente semplice, poiché il campione di DNA isolato viene già taggato con gli adattatori di sequenziamento da Tn5. Pertanto, è necessaria solo la fase di amplificazione PCR con primer appropriati per completare la preparazione della libreria e non è necessario eseguire le fasi di elaborazione precedenti come la riparazione finale e la legatura dell'adattatore, risparmiando così tempo11. In secondo luogo, ATAC-seq evita la necessità di conversione, clonazione e amplificazione del bisolfito con primer specifici per regione richiesti per MAPit7. Grazie a questi vantaggi, ATAC-seq è diventato un metodo estremamente popolare per definire regioni di cromatina aperte. Sebbene il metodo ATAC-seq sia semplice, più passaggi richiedono l'ottimizzazione per ottenere dati di alta qualità e riproducibili. Questo manoscritto discute le procedure di ottimizzazione per la preparazione della libreria ATAC-seq standard, evidenziando in particolare tre parametri: (1) composizione del tampone di lisi, (2) concentrazione di Tn5 trasposasi e (3) numero di cellule. Inoltre, questo documento fornisce dati di esempio dalle condizioni di ottimizzazione utilizzando cellule epiteliali aderenti sia cancerose che non cancerose.
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Protocol
1. Preparativi prima di iniziare l'esperimento
- Preparare la scorta tampone di lisi.
NOTA: il buffer di isolamento nucleare ottimale può essere diverso per ogni tipo di cella. Si consiglia di testare sia il tampone ipotonico utilizzato nell'articolo originale8 che un tampone CSK12,13 per ciascun tipo di cellula utilizzando la colorazione blu tripano.- Per preparare il tampone ipotonico (tampone Greenleaf), mescolare 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 e 0,1% NP-40.
- Per preparare il tampone CSK, miscelare 10 mM PIPES pH 6,8, 100 mM NaCl, 300 mM saccarosio, 3 mM MgCl2 e 0,1% Triton X-100.
- Assicurarsi che le condizioni della coltura cellulare siano ottimali; Esaminare le cellule al microscopio ottico per assicurarsi che non ci siano livelli elevati di apoptosi.
- Accendere la centrifuga per farla raggiungere i 4 °C.
2. Prelievo cellulare
- Aspirare il mezzo da una coltura di cellule al <80% di confluenza. Le cellule vengono tipicamente coltivate in un piatto da 35 mm o 60 mm, in base al numero di cellule necessarie, ai trattamenti, ecc.
- Lavare le cellule con 1 mL o 3 mL di PBS.
- Aggiungere 0,5 ml o 1 ml di tripsina e incubare per 2-3 minuti (a seconda dei tipi di cellule). Utilizzare con cautela una pipetta da 1 mL per miscelare bene.
- Aggiungere 1 mL o 2 mL di supporto alla piastra e mescolare bene. Trasferire in un tubo conico da 15 ml. Centrifugare le celle in una provetta da 15 ml per 3 minuti a 300 x g.
NOTA: si consiglia un rotore a benna oscillante per ridurre al minimo la perdita di celle. - Aspirare il mezzo e risospendere le cellule in 1 mL o 2 mL di terreno.
NOTA: È fondamentale preparare una soluzione unicellulare omogenea. Per i tessuti, un omogeneizzatore Dounce può essere utilizzato per omogeneizzare i tessuti e ridurre al minimo i grumi o gli aggregati di grandi cellule. Alcuni tessuti richiedono filtrazione (ad esempio, filtri cellulari) e / o selezione cellulare FACS per isolare le cellule vitali e ottenere una soluzione a singola cellula. - Contare le celle usando un contatore di celle.
NOTA: In questo studio, è stato utilizzato un contatore automatico di celle (Table of Materials). - Centrifugare il volume cellulare richiesto (ad esempio, un volume contenente 1 x 106 cellule in base alla conta cellulare) a 300 x g per 3 minuti a temperatura ambiente (RT).
- Risospendere il pellet cellulare contenente 1 x 106 cellule in 1 mL di PBS freddo.
NOTA: Se il numero di cellule è inferiore a 1 x 10 6 cellule, diminuire il volume di PBS freddo per preparare la soluzione cellulare alla stessa concentrazione (1 x 106 cellule/ml).
3. Lisi cellulare
- Trasferire 25 μL (= 2,5 x 104 celle) in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,7 ml. Centrifugare per 5 minuti a 500 x g a 4 °C ed eliminare accuratamente il surnatante
NOTA: si consiglia un rotore a benna oscillante per ridurre al minimo la perdita di celle. Lasciare circa 3 μL di surnatante per assicurarsi che le cellule non vengano scartate. - Aggiungere 25 μL di tampone di lisi e risospendere le cellule mediante pipettaggio delicato su e giù. Incubare su ghiaccio per 5 minuti
- Centrifugare per 5 minuti a 500 x g a 4 °C ed eliminare con cautela il surnatante.
NOTA: si consiglia un rotore a benna oscillante per ridurre al minimo la perdita di celle. Lasciare circa 3 μL di surnatante per assicurarsi che le cellule non vengano scartate.
4. Tagmentazione Tn5
- Risospendere immediatamente il pellet in 25 μL di miscela di reazione Tn5. La miscela di reazione Tn5 è la seguente: 12,5 μL di 2x tampone DNA di Tagmentazione (tampone TD), 1,25-5 μL di Tn5 trasposasi e 11,25-7,5 μL di acqua priva di nucleasi.
NOTA: La concentrazione standard di Tn5 è di 2,5 μL per 2,5 x 104 cellule. - Incubare per 30 minuti a 37 °C.
NOTA: Mescolare la soluzione ogni 10 minuti.
5. Purificazione del DNA
NOTA: La purificazione è necessaria prima dell'amplificazione. La purificazione del DNA viene eseguita utilizzando il kit di purificazione MinElute PCR (Table of Materials).
- Aggiungere 5 μL di acetato di sodio 3 M (pH 5,2).
- Aggiungere immediatamente 125 μL di Buffer PB e mescolare bene.
- Seguire il protocollo del kit di purificazione PCR a partire dal passaggio 2.
- Posizionare la colonna di rotazione in un tubo di raccolta da 2 ml.
- Applicare il campione alla colonna di centrifuga e centrifugare per 1 minuto a 17.900 x g a RT.
- Scartare il flusso passante e riposizionare la colonna di rotazione nello stesso tubo di raccolta.
- Aggiungere 750 μL di Buffer PE alla colonna di centrifuga e centrifugare per 1 minuto a 17.900 x g a RT.
- Scartare il flusso passante e riposizionare la colonna di rotazione nello stesso tubo di raccolta.
- Centrifugare la colonna di centrifuga per 5 minuti per asciugare completamente la membrana.
- Scartare il flusso passante e posizionare la colonna di rotazione in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,7 ml.
- Eluire i frammenti di DNA con 10 μL di Buffer EB.
- Lasciare riposare la colonna per 1 minuto a RT.
- Centrifugare per 1 minuto a 17.900 x g a RT per eluire il DNA.
6. Amplificazione PCR
NOTA: l'amplificazione PCR dei DNA trasposti (taggati) è necessaria per il sequenziamento. In questo esempio sono stati utilizzati adattatori del kit Nextera (Table of Materials). I primer utilizzati in questo studio sono elencati nella Tabella 1.
- Impostare la seguente reazione PCR in provette da 200 μL di PCR (50 μL per ciascun campione). La miscela di reazione PCR è la seguente: 10 μL di DNA eluito (fase 5.), 2,5 μL di 25 mM Adapter 1, 2,5 μL di 25 mM Adapter 2, 25 μL di 2x PCR master mix e 10 μL di acqua priva di nucleasi
- Eseguire il programma di amplificazione PCR parte 1 (Tabella 2).
NOTA: Per l'amplificazione iniziale, le stesse condizioni vengono utilizzate per tutti i campioni che utilizzano un termociclatore standard. - QPCR in tempo reale (totale di 14,5 μL per campione)
- Utilizzando 5 μL del prodotto dall'amplificazione PCR parte 1 (fase 6.2.), impostare la seguente reazione, questa volta includendo SYBR gold e il rilevamento in una macchina PCR in tempo reale.
- Preparare la miscela di reazione PCR come segue: 5 μL di prodotto PCR dalla fase 6.2., 0,75 μL di oro SYBR (1000x diluito), 5 μL di 2x miscela master PCR e 3,75 μL di acqua priva di nucleasi.
NOTA: I numeri di ciclo precisi per l'amplificazione della libreria prima di raggiungere la saturazione per ciascun campione sono determinati da qPCR (Tabella 3) per ridurre la distorsione GC e dimensionale nella PCR10. SYBR Gold è stato diluito con acqua priva di nucleasi. Per ottenere la soluzione diluita, 1 μL di SYBR Gold (concentrazione di riserva 10.000x) è stato aggiunto a 999 μL di acqua priva di nucleasi. Il tempo di esecuzione di RT-qPCR menzionato nella Tabella 3 è di circa 60 minuti.
- Determinare il numero richiesto di cicli PCR aggiuntivi utilizzando i parametri di esecuzione del passaggio 6.3.
- Numero di cicli = 1/4 di intensità di fluorescenza massima (satura) (tipicamente 3 o 4 cicli PCR)
- Programma di amplificazione PCR parte 2 (volume = 45 μL; Tabella 4): Una volta determinato il numero di ciclo, impostare PCR con cicli aggiuntivi calcolati al punto 6.4.1. Ad esempio, se il numero di cicli calcolato è 3, impostare 3 cicli nel programma seguente. I cicli totali sarebbero 8 (5 nel passo 6.2., più 3 cicli aggiuntivi nel passo 6.5.)
7. Purificazione delle perline
NOTA: Qui sono state utilizzate perline AMPure XP (Table of Materials).
- Ai prodotti PCR amplificati nella fase precedente, aggiungere 150 μL di perline a RT.
NOTA: Le perline AMPure fatte in casa14 possono essere utilizzate in questo processo. - Incubare per 15 minuti a RT.
- Posizionare i tubi su un supporto magnetico per 5 minuti.
- Rimuovere con attenzione il surnatante.
- Lavare le perle con 200 μL di etanolo all'80%.
NOTA: l'80% di etanolo deve essere preparato fresco. - Ripetere il passaggio 7.4.
- Rimuovere completamente l'etanolo.
- Asciugare all'aria i campioni per 10 minuti a RT.
- Risospendere con 50 μL di tampone di eluizione (10 mM Tris-HCL pH 8,0).
- Ripetere la purificazione delle perline (passaggi 7.1.-7.9.) per ridurre ulteriormente la contaminazione del primer.
8. Concentrazione del DNA e controllo di qualità
- Misurare la concentrazione di DNA utilizzando un kit di quantificazione dell'acido nucleico (Table of Materials).
- Controllare i frammenti di DNA amplificati mediante elettroforesi su gel utilizzando SYBR Gold (0,5x TBE, 1,5% gel di agarosio) o un sistema di elettroforesi automatizzato (ad esempio, TapeStation, bioanalizzatore).
9. Sequenziamento
- Eseguire il sequenziamento ad alta produttività utilizzando i campioni di DNA amplificati12,13.
NOTA: i campioni di DNA amplificato sono pronti per il sequenziamento ad alta produttività. Per conservare le informazioni sui frammenti di DNA nucleosomiali, si raccomanda il sequenziamento a estremità accoppiata rispetto al sequenziamento a estremità singola. Entrambe le estremità dei frammenti di DNA indicano dove si lega la trasposasi. Per mappare le regioni aperte della cromatina, 30 milioni di letture/campione sono in genere sufficienti.
10. Analisi dei dati
- Filtraggio dei dati in base alla qualità della chiamata di base: imposta il punteggio medio minimo di qualità di base su 20 (precisione del 99%).
- Rifilatura adattatore: rimuovere le sequenze dell'adattatore utilizzando uno strumento appropriato.
NOTA: lo strumento avvolgitore Trim Galore (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) è stato utilizzato per rimuovere le sequenze dell'adattatore. Per le librerie ATAC-seq preparate da Illumina Tn5, la seguente sequenza viene utilizzata come sequenza adattatore: CTGTCTCTTATACACATCT. La lunghezza minima della sequenza per riconoscere la contaminazione dell'adattatore è impostata su 5. - Mappatura del genoma: mappare le letture al genoma appropriato con Bowtie utilizzando i seguenti parametri "-I 0 -X 2000 -m 1"15. Di seguito è riportato un esempio di qualità della mappatura delle cellule di carcinoma mammario basale MDA-MB-231:
Leggi con almeno un allineamento segnalato: 52,79%
Letture che non sono riuscite ad allinearsi: 13,10%
Letture con allineamenti soppressi a causa di -m: 34,11% - Deduplicazione: contrassegnare i duplicati PCR con gli strumenti Picard16.
- Generazione di un file di copertura del genoma per la visualizzazione dei dati: convertire le letture accoppiate deduplicate in frammenti di lettura single-end. Le tracce di copertura del genoma sono ottenute utilizzando genomeCoverageBed da bedtools17.
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Representative Results
Per ottenere dati ATAC-seq di successo e di alta qualità, è importante ottimizzare le condizioni sperimentali. La preparazione della libreria ATAC-seq può essere suddivisa nelle cinque fasi principali (Figura 1), vale a dire lisi cellulare, tagmentazione (frammentazione e inserimento dell'adattatore da parte di Tn5), purificazione del DNA genomico, amplificazione PCR e analisi dei dati. Come processo iniziale, il tampone di lisi cellulare (isolamento nucleare) deve essere prima ottimizzato per ciascun tipo di cellula. O il tampone ipotonico descritto nel documento originale ATAC-seq8 o il tampone CSK12,13 è stato utilizzato per lisare le cellule del cancro al seno. La colorazione blu di Trypan può essere utilizzata per confermare l'isolamento dei nuclei18. Per la preparazione della libreria ATAC-seq in linee cellulari tumorali umane come MDA-MB-231, T47D, MCF7 e A375, il buffer CSK è stato utilizzato da più gruppi12,13,19,20. Il tampone CSK è stato utilizzato anche per la preparazione della libreria ATAC-seq in altri tipi di cellule come le cellule staminali embrionali 21,22 e le cellule Drosophila S2 23. Per l'ottimizzazione del tampone di lisi, la colorazione blu di Trypan è utile per valutare l'efficienza della lisi cellulare. Quando NMuMG, cellule epiteliali della ghiandola mammaria di topo non cancerose, sono state trattate con il tampone ipotonico8 (vedere fase 1) e tampone CSK, è stata osservata una maggiore efficienza di lisi cellulare nelle cellule trattate con CSK (Figura 2). Per i tessuti congelati, Omni-ATAC ha dimostrato di migliorare i segnali ATAC-seq24. Nell'Omni-ATAC, un tampone contenente 0,1% NP40, 0,1% Tween-20 e 0,01% Digitonina viene utilizzato per la lisi cellulare. Sebbene sia noto che il tampone basato sulla digitonina riduce la frazione di DNA mitocondriale, i rapporti segnale-rumore e i conteggi di lettura TSS da ATAC-seq con tampone CSK si sono dimostrati migliori di quelli di Omni-ATAC nelle cellule di cancro al seno12. Pertanto, il resto di questo manoscritto si concentra principalmente sui risultati dei dati ATAC-seq con buffer CSK.
Dopo aver determinato le migliori condizioni di tampone di lisi cellulare (isolamento nucleare), è importante ottimizzare i rapporti tra il numero di cellule in ingresso e la concentrazione di Tn5 trasposasi12,25. Tipicamente, la concentrazione di Tn5 può essere titolata variando il volume di Tn5 da 1,25 μL, 2,5 μL, a 5 μL in un volume totale di 25 μL di miscela di reazione. In alternativa, il numero delle cellule di input può essere modificato (ad esempio, da 10.000 a 100.000), mantenendo l'enzima Tn5 invariato a 2,5 μL per ottimizzare la reazione di tagmentazione Tn5. Per valutare la qualità delle librerie ATAC-seq e l'efficienza della digestione della cromatina indotta da Tn5, i prodotti PCR della libreria possono essere analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio. La Figura 3 mostra esempi di librerie ATAC-seq di successo. Tipicamente, l'amplificazione della PCR di 8 o 9 cicli (cicli totali di PCR inclusa la PCR iniziale) determina una concentrazione della libreria ATAC-seq di 3-6 ng/μL. Poiché Tn5 "attacca" preferenzialmente le regioni prive di nucleosomi a cromatina aperta (Figura 1), le scale nucleosomiche dovrebbero essere evidenti sull'immagine del gel (Figura 3). Il bromuro di etidio o SYBR Gold può essere utilizzato per rilevare DNA amplificati sul gel di agarosio.
Successivamente, l'analisi qPCR utilizzando librerie ATAC-seq può essere utilizzata per verificare brevemente la qualità delle librerie e l'arricchimento dei frammenti in regioni aperte della cromatina come i promotori di geni attivi (Figura 4). I primer possono essere progettati per generare ampliconi di <80 bp utilizzando promotori di geni attivi noti come controlli positivi e regioni note della cromatina "chiuse" (inattive) come controlli negativi (Figura 4A). Tra le condizioni testate, è stato osservato un arricchimento più elevato nelle librerie T47D ATAC-seq con buffer CSK (Figura 4B). Come previsto, abbiamo trovato un maggiore arricchimento utilizzando i primer K e L nella regione del promotore del gene del recettore degli estrogeni alfa (ESR1) rispetto a una regione chiusa a monte di ESR1 con primer C (Figura 4B) 26. La Figura 5 mostra esempi di dati ATAC-seq con diverse concentrazioni di Tn5 (sono state utilizzate 25.000 cellule). In questo caso, è stato rilevato un rumore di fondo più elevato nella condizione Tn5 più bassa (1,25 μL di Tn5) (figura 5, barre verticali). I dati ATAC-seq da 2,5 μL o 5 μL di Tn5 hanno mostrato livelli simili di segnali ATAC-seq in regioni aperte della cromatina con segnali di fondo più bassi. Considerando la potenziale sovradigestione da parte di Tn5 alla concentrazione più elevata, si può concludere che 2,5 μL di Tn5 sono adatti per questo tipo di cellula.
Abbiamo anche eseguito l'ATAC-seq utilizzando diversi numeri di cellule nelle cellule NMuMG, frequentemente utilizzate per studiare la transizione epiteliale-mesenchimale (Figura 6). Per ottimizzare il volume iniziale, sono stati utilizzati quattro diversi numeri di celle (25.000, 50.000, 75.000 e 100.000) per l'ottimizzazione della libreria ATAC-seq. Le cellule sono state lisate con tampone CSK e i nuclei sono stati incubati con 2,5 μL di Tn5 trasposasi in 25 μL della miscela di reazione. Per esplorare l'efficacia della digestione Tn5 e delle scale nucleosomiali, la distribuzione dimensionale dei DNA inseriti è stata analizzata bioinformaticamente (Figura 6A). Quando sono stati utilizzati numeri cellulari più bassi, i frammenti di DNA privi di nucleosomi (<100 bp) erano più arricchiti nei dati di sequenziamento. D'altra parte, la frazione di frammenti di DNA mono-nucleosomico (175-225 bp) era inferiore nei campioni a basso input cellulare (25.000 cellule e 50.000 cellule) rispetto a condizioni di input cellulare più elevate (75.000 cellule e 100.000 cellule). Sebbene siano stati osservati modelli differenziali di frammenti di DNA tra i campioni, il numero di cellule di input sembra avere un impatto minimo sull'arricchimento dei segnali ATAC-seq ai promotori e ad altre regioni aperte della cromatina (Figura 6B). Per studiare ulteriormente l'impatto dei numeri delle celle di input sull'analisi a valle, sono stati definiti i picchi ATAC-seq. I picchi ATAC-seq sono stati determinati dal programma di chiamata dei picchi PeaKDEck27 utilizzando i seguenti parametri: -sig 0.0001 -bin 300 -back 3.000 -npBack 2.500.000. Da ~ 4,9 milioni di letture mappate in modo univoco, 38.878, 43.832, 41.509 e 45.530 picchi sono stati osservati nei dati ATAC-seq da 25.000, 50.000, 75.000 e 100.000 input di celle, rispettivamente. La condizione di input di 100.000 celle ha mostrato il maggior numero di picchi. Poiché il punteggio di arricchimento del sito di inizio trascrizione (TSS) è stato utilizzato per valutare la qualità dei dati ATAC-seq, il punteggio TSS di ciascuna condizione ATAC-seq è stato calcolato utilizzando il programma GitHub: Jiananlin/TSS_enrichment_score_calculation28. I punteggi TSS per le condizioni di input cellulare 25.000, 50.000, 75.000 e 100.000 erano rispettivamente 9,03, 9,02, 8,82 e 8,28 (il punteggio di arricchimento TSS è considerato ideale se è maggiore di 728). Ciò ha indicato una graduale diminuzione del punteggio di arricchimento TSS con l'aumentare del numero di cellule. Mentre il numero di picco più grande è stato osservato nella condizione di input di 100.000 celle, la condizione di input di 25.000 celle ha dato un punteggio TSS migliore. L'analisi dell'annotazione dei picchi di Homer29 ha indicato che la maggior parte dei picchi aumentati sono classificati come picchi distali del promotore (Figura 6C). Sulla base di questi risultati, si può concludere che gli input con numero di celle più elevato possono produrre un numero maggiore di picchi e rilevare più frequentemente picchi non promotori rispetto agli input di numero di celle più bassi in questa condizione.
Figura 1: Schema del metodo ATAC-seq. (A) ATAC-seq misura l'accessibilità della cromatina utilizzando una trasposasi Tn5 iperattiva precaricata con adattatori avanti e indietro. Le varie fasi del processo includono la lisi cellulare (B) (compresa l'ottimizzazione della composizione del tampone di lisi, la titolazione di Tn5 e il numero di cellule utilizzate); (C) recepimento (legame di Tn5 alla cromatina aperta/accessibile); D) marcatura della cromatina; (E) purificazione dei frammenti di DNA e amplificazione delle librerie, e (F) sequenziamento delle librerie e analisi dei dati. L'analisi della distribuzione della lunghezza dei frammenti delle librerie ATAC-seq mostra tipicamente un picco iniziale intorno a ~50 bp (regioni prive di nucleosomi) e un altro picco a ~200 bp (mononucleosoma). Pertanto, senza filtrazione dimensionale computazionale o sperimentale, i segnali ATAC-seq contengono sia regioni prive di nucleosomi che nucleosomiche in cromatina aperta. Creato con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Confronto dell'efficienza di lisi cellulare utilizzando il blu di tripano. (A) Le cellule NMuMG sono state trattate con il tampone ipotonico8 e colorate con blu di tripano. (B) Le cellule NMuMG sono state trattate con tampone CSK e colorate con blu tripano. Le barre della scala indicano 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi amplificata di frammenti di DNA delle librerie ATAC-seq. Le librerie ATAC-seq sono state preparate da cellule di cancro al seno MDA-MB-231. (A) Dopo l'amplificazione della PCR, i prodotti PCR sono stati analizzati su un gel di agarosio TBE 0,5x e 1,5% prima e dopo la purificazione delle perle. I primer vengono per lo più rimossi dalla purificazione iniziale delle perline. Sono indicati anche pattern di bande di DNA da (B) 1x TAE, elettroforesi su gel di agarosio all'1% e (C) un'elettroforesi automatica. SYBR Gold è stato utilizzato per visualizzare i frammenti di DNA mostrati in A e B. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Analisi di arricchimento delle librerie ATAC-seq . (A) Traccia del browser del genoma che mostra il locus ESR1. Viene mostrata la copertura genomica dei dati ATAC-seq nelle cellule T47D20 . I primer di una precedente pubblicazione sono stati utilizzati26 e le loro regioni target sono evidenziate in giallo. (B) Grafico a barre raffigurante l'arricchimento dell'amplicone di primer nelle librerie ATAC-seq. Le librerie ATAC-seq sono state preparate dal buffer ipotonico o buffer CSK. Diverse concentrazioni di Tn5 sono state utilizzate anche per generare librerie ATAC-seq. 1 ng di ogni libreria è stato utilizzato per eseguire qPCR. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Visualizzazione del browser del genoma per l'ottimizzazione ATAC-seq. Diverse quantità di trasposasi Tn5 sono state aggiunte durante la preparazione della libreria. La condizione di 1,25 μL di Tn5 mostra segnali di fondo più elevati (evidenziati in giallo), mentre le altre due condizioni sembrano simili. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Distribuzione delle dimensioni dei frammenti di DNA delle librerie ATAC-seq. (A) Le librerie ATAC-seq sono state preparate utilizzando i numeri di cella indicati. I dati ATAC-seq della condizione di input di 25.000 cellule hanno mostrato il più alto arricchimento di frammenti privi di nucleosomi, mentre la condizione di input di 100.000 cellule ha presentato il più alto DNA mono-nucleosomiale. (B) Tracce del browser del genoma che mostrano i dati ATAC-seq da diversi numeri di cellula. (C) Analisi delle annotazioni del picco di Homer. Ogni picco è stato classificato come picco prossimale o distale da Omero29. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Nome | Sequenza |
| ESR1 C Avanti | TGGTGACTCATATTTGAACAAGCC |
| ESR1 C Retromarcia | CTCCTCCGTTGAATGTGTCTCC |
| ESR1 K Avanti | TGTGGCTGGCTGCGTATG |
| ESR1 K Retromarcia | TGTCTCTCTCTCTGTTTGATTCCC |
| ESR1 L Avanti | TGTGCCTGGAGTGATGTTTAAG |
| ESR1 L Retromarcia | CATTACAAAGGTGCTGGAGGAC |
Tabella 1: Elenco dei primer utilizzati in questo studio.
| Passi | Temperatura | Ore | Ciclo |
| Riempimento delle lacune | 72 °C | 5 minuti | 1 |
| Denaturazione iniziale | 98 °C | 30 secondi | 1 |
| Denaturazione | 98 °C | 10 secondi | 5 |
| Ricottura | 63 °C | 30 secondi | |
| Estensione | 72 °C | 1 min | |
| Tenere | 4 °C | per sempre |
Tabella 2: Programma di amplificazione PCR parte 1.
| Passi | Temperatura | Ciclo |
| Denaturazione iniziale | 98 °C 30 s | 1 |
| Denaturazione | 98 °C 10 s | 20 |
| Ricottura | 63 °C 30 s | |
| Estensione | 72 °C 1 min | |
| Lettura della targa |
Tabella 3: impostazioni qPCR.
| Passi | Temperatura | Ore | Ciclo |
| Denaturazione iniziale | 98 °C | 30 secondi | 1 |
| Denaturazione | 98 °C | 10 secondi | Cicli totali calcolati al punto 6.4 |
| Ricottura | 63 °C | 30 secondi | |
| Estensione | 72 °C | 1 min | |
| Tenere | 4 °C | per sempre |
Tabella 4: Programma di amplificazione PCR parte 2.
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Discussion
ATAC-seq è stato ampiamente utilizzato per mappare regioni di cromatina aperte e attive. La progressione delle cellule tumorali è spesso guidata da alterazioni genetiche e riprogrammazione epigenetica, con conseguente alterazione dell'accessibilità della cromatina e dell'espressione genica. Un esempio di questa riprogrammazione è visto durante la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) e il suo processo inverso, la transizione mesenchimale-epiteliale (MET), che sono noti per essere processi chiave di riprogrammazione cellulare durante le metastasi tumorali30. Un altro esempio è l'acquisizione di resistenza ai farmaci contro le terapie ormonali è spesso osservata nei tumori luminali della mammella31. ATAC-seq è utile per monitorare tali alterazioni fenotipiche cellulari a livello della cromatina e può essere utilizzato per prevedere una cellula di origine e i sottotipi di cancro4.
Per misurare con precisione il rimodellamento della cromatina mediante ATAC-seq, è necessario stabilire un protocollo riproducibile e coerente. In questo manoscritto viene descritta una strategia standard per l'ottimizzazione della libreria ATAC-seq. I dati ATAC-seq delle linee cellulari MDA-MB-231 e NMuMG sono utilizzati come esempi di processi di ottimizzazione. Le cellule NMuMG sono state utilizzate per studiare EMT e le cellule MDA-MB-231 sono state utilizzate per studiare il suo processo inverso, MET. Questi modelli cellulari sono stati precedentemente utilizzati per studiare le alterazioni epigenetiche durante EMT e MET13,32. L'uso di un tampone appropriato per la lisi cellulare e la concentrazione di Tn5 è la componente chiave del successo della preparazione della libreria ATAC-seq. Oltre a questi componenti, sono molto importanti anche un'alta percentuale (>90%) di vitalità cellulare, concentrazioni appropriate di detergente nel tampone di lisi e la preparazione della sospensione unicellulare. Quando l'efficienza della digestione Tn5 è significativamente diversa tra i campioni, è difficile correggere le variazioni dei dati. Ciò è dovuto alla mancanza di controlli interni ed esterni per valutare quantitativamente l'efficienza della digestione. Le caratteristiche o le proprietà cellulari potrebbero anche essere diverse tra le cellule del gruppo di controllo rispetto alle cellule del gruppo di test. Pertanto, è necessaria un'attenta considerazione delle condizioni sperimentali, compresa la scelta del tampone di lisi, per ottenere dati ATAC-seq di alta qualità da entrambi i gruppi sperimentali (Figura 5 e Figura 6).
Oltre al profilo aperto della cromatina, ATAC-seq è stato utilizzato per identificare le impronte dei fattori di trascrizione e il posizionamento dei nucleosomi 8,33. È importante notare che tali informazioni derivano principalmente da regioni aperte della cromatina (Figura 1F). Pertanto, i risultati sarebbero sbilanciati verso regioni aperte della cromatina. Tuttavia, ATAC-seq è un potente strumento per studiare l'architettura della cromatina. Questo strumento rivoluzionario è stato recentemente adottato per la genomica a singola cellula e continua a contribuire a migliorare la nostra comprensione della regolazione genica e della biologia della cromatina.
DISPONIBILITÀ DEI DATI:
I dati presentati in questo protocollo sono disponibili su Gene Expression Omnibus con il numero di adesione GSE202791. Nell'analisi sono stati utilizzati anche i dati ATAC-seq di GSE72141 e GSE99479.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che non ci sono interessi finanziari rilevanti o materiali relativi alla ricerca descritta in questo documento.
Acknowledgments
Riconosciamo con gratitudine la struttura UND Genomics Core per l'eccezionale assistenza tecnica.
Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health [P20GM104360 to M.T., P20 GM104360 to A.D.] e dai fondi start-up forniti dalla University of North Dakota School of Medicine and Health Sciences, Department of Biomedical Sciences [to M.T.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-3810 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1182-1830 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-1840 | Filtered and low-retention. Beveled Grade |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | |
| 20 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1183-1810 | Filtered and low-retention |
| 200 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1180-8810 | Filtered and low-retention |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Fisherbrand | 06-443-19 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Genetic Analysis Grade |
| All the cell lines used in this study are obtained from ATCC | ATCC | ||
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Bead purification kit |
| CellDrop Cell Counter | DeNovix | CellDrop FL | Cell counter |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| Ethanol 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Anhydrous; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products |
| Fetal Bovine Serum - TET Tested | R&D Systems | S10350 | Triple 0.1 µm filtered |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Gibco Trypsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0.25%), phenol red |
| Glycerol | IBI Scientific | 56-81-5 | |
| Glycine | MilliporeSigma | G8898 | |
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous) |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD and Tn5 Transposase |
| NP - 40 (IGEPAL CA-630) | MilliporeSigma | I8896 | for molecular biology |
| PCR Detection System | BioRad | 1855484 | CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler |
| PIPES | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance Certified, suitable for cell culture |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit |
| Quibit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| Sodium Acetate | Homemade | - | pH 5.2 |
| Sucrose | IBI Scientific | 57-50-1 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Green Supermix, 1.25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips | USA Scientific | 1402-4700 | Flex-free, natural, polypropylene |
| TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | Single notch. Natural polypropylene |
| Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Grade |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit | Illumina | PE-121-1003 | paired-end |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, viscous liquid |
| Water | MilliporeSigma | W3500 | sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
References
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