Summary
ATAC-seq - это метод секвенирования ДНК, который использует гиперактивную мутантную транспозазу Tn5 для отображения изменений доступности хроматина, опосредованных факторами транскрипции. ATAC-seq позволяет обнаружить молекулярные механизмы, лежащие в основе фенотипических изменений в раковых клетках. Этот протокол описывает процедуры оптимизации для ATAC-seq в типах эпителиальных клеток, включая раковые клетки.
Abstract
Анализ на транспозаз-доступный хроматин с высокопроизводительным секвенированием (ATAC-seq) проверяет доступность дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) с использованием гиперактивной транспозазы Tn5. Адаптеры Tn5 для резки и лигата для высокопроизводительного секвенирования в доступных областях хроматина. В эукариотических клетках геномная ДНК упакована в хроматин, комплекс ДНК, гистонов и других белков, который действует как физический барьер для транскрипционного механизма. В ответ на внешние сигналы транскрипционные факторы рекрутируют комплексы ремоделирования хроматина, чтобы обеспечить доступ к транскрипционному механизму активации генов. Поэтому идентификация открытых областей хроматина полезна при мониторинге активности энхансера и генного промотора во время биологических событий, таких как прогрессирование рака. Поскольку этот протокол прост в использовании и имеет низкую потребность во входе клеток, ATAC-seq был широко принят для определения открытых областей хроматина в различных типах клеток, включая раковые клетки. Для успешного сбора данных при подготовке библиотек ATAC-seq необходимо учитывать несколько параметров. Среди них выбор буфера лизиса клеток, титрование фермента Tn5 и начальный объем клеток имеют решающее значение для подготовки библиотеки ATAC-seq в раковых клетках. Оптимизация необходима для получения высококачественных данных. Здесь мы приводим подробное описание методов оптимизации ATAC-seq для типов эпителиальных клеток.
Introduction
Доступность хроматина является ключевым требованием для регуляции экспрессии генов по общегеномной шкале1. Изменения доступности хроматина часто связаны с несколькими болезненными состояниями, включая рак 2,3,4. На протяжении многих лет были разработаны многочисленные методы, позволяющие исследователям исследовать ландшафт хроматина путем картирования областей доступности хроматина. Некоторые из них включают DNase-seq (секвенирование гиперчувствительных сайтов DNase I)5, FAIRE-seq (формальдегидная изоляция регуляторных элементов)6, MAPit (протокол доступности метилтрансферазы для отдельных шаблонов)7 и фокус данной статьи, ATAC-seq (анализ для транспозаз-доступного хроматина)8. DNase-seq отображает доступные области, используя ключевую особенность ДНКазы, а именно предпочтительное переваривание голой ДНК, свободной от гистонов и других белков, таких как факторы транскрипции5. FAIRE-seq, подобно ChIP-seq, использует сшивание формальдегида и обработку ультразвуком, за исключением того, что иммунопреципитация не участвует, а области, свободные от нуклеосом, выделяются экстракцией фенол-хлороформа6. Метод MAPit использует GC метилтрансферазу для исследования структуры хроматина с одномолекулярным разрешением7. ATAC-seq полагается на гиперактивную транспозазу, Tn58. Транспозаза Tn5 предпочтительно связывается с открытыми областями хроматина и вставляет адаптеры секвенирования в доступные области. Tn5 работает через ДНК-опосредованный механизм «вырезать и вставить», в результате чего транспозаза, предварительно загруженная адаптерами, связывается с открытыми участками хроматина, разрезает ДНК и лицензирует адаптеры8. Связанные с Tn5 области восстанавливаются путем амплификации ПЦР с использованием праймеров, которые отжигают эти адаптеры. FAIRE-seq и DNase-seq требуют большого количества исходного материала (~ 100 000 клеток до 225 000 клеток) и отдельного этапа подготовки библиотеки перед секвенированием9. С другой стороны, протокол ATAC-seq относительно прост и требует небольшого количества ячеек (<50 000 ячеек)10. В отличие от методов FAIRE-seq и DNase-seq, подготовка библиотеки секвенирования ATAC-seq относительно проста, так как изолированный образец ДНК уже помечен адаптерами секвенирования Tn5. Таким образом, для завершения подготовки библиотеки требуется только этап амплификации ПЦР с соответствующими праймерами, а предварительные этапы обработки, такие как конечный ремонт и лигирование адаптера, не должны выполняться, что экономит время11. Во-вторых, ATAC-seq позволяет избежать необходимости конверсии, клонирования и усиления бисульфита с помощью региональных праймеров, необходимых для MAPit7. Благодаря этим преимуществам ATAC-seq стал чрезвычайно популярным методом определения открытых областей хроматина. Хотя метод ATAC-seq прост, несколько шагов требуют оптимизации для получения высококачественных и воспроизводимых данных. В этой рукописи обсуждаются процедуры оптимизации для подготовки стандартной библиотеки ATAC-seq, особенно выделяются три параметра: (1) состав буфера лизиса, (2) концентрация транспозазы Tn5 и (3) номер клетки. Кроме того, в данной работе приведены примеры данных из условий оптимизации с использованием как раковых, так и нераковых адгезивных эпителиальных клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка перед началом эксперимента
- Подготовьте буферный запас лизиса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальный буфер ядерной изоляции может быть различным для каждого типа клеток. Мы рекомендуем тестировать как гипотонический буфер, используемый в оригинальной статье8, так и буфер CSK12,13 для каждого типа клеток с использованием окрашивания трипан-синим цветом.- Для получения гипотонического буфера (зеленолистного буфера) смешайте 10 мМ Tris-HCl pH 7,4, 10 мМ NaCl, 3 мМMgCl2 и 0,1% NP-40.
- Для приготовления буфера ЦСК смешайте 10 мМ PIPES pH 6,8, 100 мМ NaCl, 300 мМ сахарозы, 3 мМ MgCl2 и 0,1% тритона X-100.
- Убедитесь, что условия культивирования клеток являются оптимальными; исследуйте клетки под световым микроскопом, чтобы убедиться в отсутствии повышенных уровней апоптоза.
- Включите центрифугу, чтобы она достигла 4 °C.
2. Сбор клеток
- Аспиратные среды из культуры клеток при слиянии <80%. Клетки обычно выращиваются в чашке диаметром 35 мм или 60 мм в зависимости от количества необходимых клеток, лечения и т. Д.
- Промыть ячейки 1 мл или 3 мл PBS.
- Добавляют 0,5 мл или 1 мл трипсина и инкубируют в течение 2-3 мин (в зависимости от типов клеток). Осторожно используйте пипетку 1 мл, чтобы хорошо перемешать.
- Добавьте в тарелку 1 мл или 2 мл среды и хорошо перемешайте. Переложить в коническую трубку объемом 15 мл. Центрифугирование клеток в пробирке 15 мл в течение 3 мин при 300 х г.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для минимизации потерь ячеек рекомендуется использовать качающийся ротор ковша. - Аспирировать среду и повторно суспендировать клетки в 1 мл или 2 мл среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно приготовить однородный одноклеточный раствор. Для тканей гомогенизатор Dounce может использоваться для гомогенизации тканей и минимизации крупных клеточных сгустков или агрегатов. Некоторые ткани требуют фильтрации (например, клеточных сетчатых фильтров) и/или сортировки клеток FACS для выделения жизнеспособных клеток и получения одного клеточного раствора. - Подсчитайте ячейки с помощью счетчика ячеек.
ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании использовался автоматизированный счетчик ячеек (Таблица материалов). - Центрифугировать требуемый объем ячейки (например, объем, содержащий 1 х 106 ячеек в зависимости от количества ячеек) при 300 х г в течение 3 мин при комнатной температуре (RT).
- Повторно суспендируют ячейку гранулы, содержащие 1 х 106 клеток в 1 мл холодного PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если количество клеток меньше 1 х 106 клеток, уменьшите объем холодного PBS, чтобы приготовить клеточный раствор в той же концентрации (1 х 106 клеток/мл).
3. Лизис клеток
- Перенесите 25 мкл (= 2,5 х 104 ячейки) в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,7 мл. Центрифуга в течение 5 мин при 500 х г при 4 °C и осторожно выбросьте супернатант
ПРИМЕЧАНИЕ: Для минимизации потерь ячеек рекомендуется использовать качающийся ротор ковша. Оставьте около 3 мкл супернатанта, чтобы убедиться, что клетки не выбрасываются. - Добавьте 25 мкл буфера лизиса и повторно суспендируйте клетки путем мягкой пипетки вверх и вниз. Инкубировать на льду в течение 5 мин
- Центрифугу в течение 5 мин при 500 х г при 4 °С и осторожно выбрасывайте супернатант.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для минимизации потерь ячеек рекомендуется использовать качающийся ротор ковша. Оставьте около 3 мкл супернатанта, чтобы убедиться, что клетки не выбрасываются.
4. Тегментация Tn5
- Немедленно повторно суспендировать гранулу в 25 мкл реакционной смеси Tn5. Реакционная смесь Tn5 выглядит следующим образом: 12,5 мкл 2-кратного буфера тагментационной ДНК (буфер TD), 1,25-5 мкл транспозазы Tn5 и 11,25-7,5 мкл воды без нуклеазы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартная концентрация Tn5 составляет 2,5 мкл для 2,5 х 104 клеток. - Инкубировать в течение 30 мин при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перемешивать раствор каждые 10 мин.
5. Очистка ДНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Очистка требуется перед усилением. Очистка ДНК осуществляется с помощью набора для очистки MinElute PCR (Таблица материалов).
- Добавьте 5 мкл 3 М ацетата натрия (рН 5,2).
- Сразу же добавьте 125 мкл буферного ПБ и хорошо перемешайте.
- Следуйте протоколу набора для очистки ПЦР, начиная с шага 2.
- Поместите отжимную колонну в трубку для сбора 2 мл.
- Нанесите образец на спиновую колонну и центрифугу в течение 1 мин при 17 900 х г при РТ.
- Отбросьте проточную трубу и поместите отжимную колонну обратно в ту же коллекторную трубку.
- Добавьте 750 мкл буферного ПЭ в спиновую колонну и центрифугу в течение 1 мин при 17 900 х г при RT.
- Отбросьте проточную трубу и поместите отжимную колонну обратно в ту же коллекторную трубку.
- Центрифугируйте спиновую колонну в течение 5 мин, чтобы полностью высушить мембрану.
- Отбросьте проточную колонну и поместите спиновую колонну в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,7 мл.
- Элюируют фрагменты ДНК 10 мкл буфера EB.
- Дайте колонке постоять 1 минуту на RT.
- Центрифуга в течение 1 мин при 17 900 х г при RT для элюирования ДНК.
6. ПЦР-амплификация
ПРИМЕЧАНИЕ: ПЦР-амплификация транспонированных (помеченных) ДНК необходима для секвенирования. В этом примере использовались адаптеры комплекта Nextera (Таблица материалов). Грунтовки, используемые в данном исследовании, перечислены в таблице 1.
- Настройте следующую реакцию ПЦР в 200 мкл ПЦР-пробирках (50 мкл для каждого образца). Реакционная смесь ПЦР выглядит следующим образом: 10 мкл элюированной ДНК (стадия 5.), 2,5 мкл адаптера 25 мМ 1, 2,5 мкл адаптера 25 мМ, 25 мкл 2x ПЦР-мастер-смеси и 10 мкл воды без нуклеазы
- Выполнение программы ПЦР-амплификации часть 1 (табл. 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для начального усиления используются одинаковые условия для всех образцов с использованием стандартного теплового циклера. - qPCR в реальном времени (всего 14,5 мкл на образец)
- Используя 5 мкл продукта из части 1 амплификации ПЦР (шаг 6.2.), настройте следующую реакцию, на этот раз включающую золото SYBR и обнаружение в аппарате ПЦР в режиме реального времени.
- Приготовьте реакционную смесь ПЦР следующим образом: 5 мкл продукта ПЦР со стадии 6.2., 0,75 мкл золота SYBR (1000x разбавленного), 5 мкл 2x ПЦР-мастер-смеси и 3,75 мкл воды без нуклеазы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Точные номера циклов для библиотечного амплификации до достижения насыщения для каждого образца определяются с помощью qPCR (таблица 3) для уменьшения смещения GC и размера вPCR 10. SYBR Gold разбавляли водой без нуклеаз. Для получения разбавленного раствора 1 мкл золота SYBR (концентрация запаса 10 000x) добавляли к 999 мкл воды без нуклеазы. Время работы RT-qPCR, упомянутое в таблице 3 , составляет около 60 минут.
- Определите необходимое количество дополнительных циклов ПЦР, используя параметры запуска из шага 6.3.
- Количество циклов = 1/4 максимальной (насыщенной) интенсивности флуоресценции (обычно 3 или 4 цикла ПЦР)
- Программа амплификации ПЦР часть 2 (объем = 45 мкл; Таблица 4): После определения числа циклов настройте ПЦР с дополнительными циклами, рассчитанными на этапе 6.4.1. Например, если вычисляемое число циклов равно 3, настройте 3 цикла в программе ниже. Общее число циклов составит 8 (5 на этапе 6.2., плюс 3 дополнительных цикла на этапе 6.5).
7. Очистка бисера
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь использовались бусины AMPure XP (Таблица материалов).
- К продуктам ПЦР, усиленным на предыдущем этапе, добавляют 150 мкл бусин при РТ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Самодельные бусины AMPure14 могут быть использованы в этом процессе. - Инкубировать в течение 15 мин на RT.
- Поместите трубки на магнитную подставку на 5 мин.
- Осторожно удалите супернатант.
- Вымойте шарики 200 мкл 80% этанола.
ПРИМЕЧАНИЕ: 80% этанола следует готовить в свежем виде. - Повторите шаг 7.4.
- Полностью удалите этанол.
- Высушите образцы на воздухе в течение 10 мин на RT.
- Ресуспенд с 50 мкл буфера элюирования (10 мМ Tris-HCL pH 8,0).
- Повторите очистку шариков (этапы 7.1.-7.9.), чтобы еще больше свести к минимуму загрязнение грунтовки.
8. Проверка концентрации и качества ДНК
- Измерьте концентрацию ДНК с помощью набора для количественной оценки нуклеиновых кислот (Таблица материалов).
- Проверьте амплифицированные фрагменты ДНК с помощью гелевого электрофореза с помощью SYBR Gold (0,5x TBE, 1,5% агарозного геля) или автоматизированной системы электрофореза (например, TapeStation, биоанализатор).
9. Секвенирование
- Выполняйте высокопроизводительное секвенирование с использованием амплифицированных образцов ДНК12,13.
ПРИМЕЧАНИЕ: Амплифицированные образцы ДНК готовы к высокопроизводительному секвенированию. Чтобы сохранить информацию о фрагменте нуклеосомной ДНК, рекомендуется парное секвенирование над односторонним секвенированием. Оба конца фрагментов ДНК указывают, где транспозаз связывается. Для картирования открытых областей хроматина обычно достаточно 30 миллионов считываний на образец.
10. Анализ данных
- Фильтрация данных на основе качества базового вызова: установите минимальный средний базовый показатель качества равным 20 (точность 99%).
- Обрезка адаптера: удалите последовательности адаптеров с помощью соответствующего инструмента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инструмент-оболочка Trim Galore (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) использовался для удаления последовательностей адаптеров. Для библиотек ATAC-seq, подготовленных Illumina Tn5, в качестве последовательности адаптера используется следующая последовательность: CTGTCTCTTATACACATCT. Минимальная длина последовательности для распознавания загрязнения адаптера установлена равной 5. - Картирование генома: Сопоставьте показания с соответствующим геномом с помощью Bowtie, используя следующие параметры "-I 0 -X 2000 -m 1"15. Пример качества картирования базальных клеток рака молочной железы MDA-MB-231 приведен ниже:
Считывает по крайней мере с одним заявленным выравниванием: 52,79%
Показания, которые не удалось выровнять: 13,10%
Считывает данные с выравниванием, подавленным из-за -m: 34,11% - Дедупликация: пометьте дубликаты ПЦР инструментами Пикара16.
- Создание файла покрытия генома для визуализации данных: преобразование дедуплицированных парных считываний в односторонние фрагменты чтения. Треки покрытия генома получены с помощью genomeCoverageBed из надкроватных стульев17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для получения успешных и качественных данных ATAC-seq важно оптимизировать условия эксперимента. Подготовка библиотеки ATAC-seq может быть разделена на пять основных этапов (рисунок 1), а именно лизис клеток, тегментация (фрагментация и вставка адаптера Tn5), геномная очистка ДНК, амплификация ПЦР и анализ данных. В качестве начального процесса буфер лизиса (ядерной изоляции) клеток должен быть сначала оптимизирован для каждого типа клеток. Гипотонический буфер, описанный в оригинальной статье ATAC-seq8, или буфер CSK12,13 использовали для лизирования клеток рака молочной железы. Окрашивание трипановым синим цветом может быть использовано для подтверждения выделения ядер18. Для подготовки библиотеки ATAC-seq в клеточных линиях рака человека, таких как MDA-MB-231, T47D, MCF7 и A375, буфер CSK использовался несколькими группами 12,13,19,20. Буфер CSK также использовался для подготовки библиотеки ATAC-seq в других типах клеток, таких как эмбриональные стволовые клетки21,22 и клетки Drosophila S223. Для оптимизации буфера лизиса окрашивание в синий цвет Trypan полезно для оценки эффективности лизиса клеток. Когда NMuMG, нераковые эпителиальные клетки молочной железы мыши, обрабатывали гипотоническим буфером8 (см. шаг 1) и буфером CSK, в клетках, обработанных CSK, наблюдалась более высокая эффективность лизиса клеток (рисунок 2). Было показано, что для замороженных тканей Omni-ATAC улучшает сигналы ATAC-seq24. В Omni-ATAC для лизиса клеток используется буфер, содержащий 0,1% NP40, 0,1% Tween-20 и 0,01% Digitonin. Хотя известно, что буфер на основе дигитонина уменьшает долю митохондриальной ДНК, было показано, что соотношение сигнал-шум и количество считываний TSS из ATAC-seq с буфером CSK лучше, чем у Omni-ATAC в клетках рака молочной железы12. Поэтому остальная часть этой рукописи в основном сосредоточена на результатах данных ATAC-seq с буфером CSK.
После определения наилучших условий буфера лизиса клеток (ядерной изоляции) важно оптимизировать соотношения между числом входных клеток и концентрацией транспозазы Tn512,25. Как правило, концентрацию Tn5 можно титровать путем изменения объема Tn5 от 1,25 мкл, 2,5 мкл, до 5 мкл в общем объеме реакционной смеси 25 мкл. Альтернативно, входные номера клеток могут быть изменены (например, от 10 000 до 100 000), сохраняя при этом фермент Tn5 неизменным при 2,5 мкл для оптимизации реакции тагментации Tn5. Для оценки качества библиотек ATAC-seq и эффективности Tn5-индуцированного переваривания хроматина библиотека продуктов ПЦР может быть проанализирована методом электрофореза агарозного геля. На рисунке 3 показаны примеры успешных библиотек ATAC-seq. Как правило, амплификация ПЦР в течение 8 или 9 циклов (общие циклы ПЦР, включая начальную ПЦР) приводит к концентрации библиотеки ATAC-seq 3-6 нг/мкл. Поскольку Tn5 преимущественно «атакует» свободные от нуклеосом области при открытом хроматине (рисунок 1), нуклеосомные лестницы должны быть очевидны на изображении геля (рисунок 3). Бромид этидия или SYBR Gold могут быть использованы для обнаружения амплифицированных ДНК на агарозном геле.
Затем qPCR-анализ с использованием библиотек ATAC-seq может быть использован для краткой проверки качества библиотек и обогащения фрагментов в открытых областях хроматина, таких как промоторы активных генов (рисунок 4). Праймеры могут быть спроектированы для генерации ампликонов <80 bp с использованием промоторов известных активных генов в качестве положительных контрольных и известных «закрытых» (неактивных) областей хроматина в качестве отрицательных контрольных элементов (рисунок 4A). Среди протестированных условий наблюдалось более высокое обогащение в библиотеках T47D ATAC-seq с буфером CSK (рисунок 4B). Как и ожидалось, мы обнаружили большее обогащение с использованием праймеров K и L в области промотора гена эстрогенного рецептора (ESR1) относительно закрытой области выше ESR1 с праймером C (рисунок 4B)26. На рисунке 5 показаны примеры данных ATAC-seq с различными концентрациями Tn5 (было использовано 25 000 клеток). В этом случае более высокий фоновый шум был обнаружен в самом низком (1,25 мкл Tn5) состоянии Tn5 (рисунок 5, вертикальные полосы). Данные ATAC-seq из 2,5 мкл или 5 мкл Tn5 показали аналогичные уровни сигналов ATAC-seq в открытых областях хроматина с более низкими фоновыми сигналами. Учитывая потенциальное переваривание Tn5 при более высокой концентрации, можно сделать вывод, что 2,5 мкл Tn5 подходит для этого типа клеток.
Мы также выполнили ATAC-seq с использованием различных номеров клеток в клетках NMuMG, часто используемых для изучения эпителиально-мезенхимального перехода (рисунок 6). Для оптимизации начального объема для оптимизации библиотеки ATAC-seq использовались четыре разных номера ячеек (25 000, 50 000, 75 000 и 100 000). Клетки лизировали буфером CSK, а ядра инкубировали с 2,5 мкл транспозазы Tn5 в 25 мкл реакционной смеси. Для изучения эффективности пищеварения Tn5 и нуклеосомных лестниц было биоинформативно проанализировано распределение по размерам вставленных ДНК (рисунок 6A). Когда использовались более низкие числа клеток, фрагменты ДНК без нуклеосом (<100 bp) были более обогащены данными секвенирования. С другой стороны, доля мононуклеосомных фрагментов ДНК (175-225 bp) была меньше в образцах с низким входом клеток (25 000 клеток и 50 000 клеток) по сравнению с более высокими условиями ввода клеток (75 000 клеток и 100 000 клеток). Хотя между образцами наблюдались дифференциальные паттерны фрагментов ДНК, входное количество клеток, по-видимому, оказывает минимальное влияние на обогащение сигналов ATAC-seq у промоторов и других открытых областей хроматина (рисунок 6B). Для дальнейшего изучения влияния входных чисел ячеек на последующий анализ были определены пики ATAC-seq. Пики ATAC-seq определялись программой вызова пиков PeaKDEck27 с использованием следующих параметров: -sig 0.0001 -bin 300 -back 3,000 -npBack 2,500,000. Из ~ 4,9 миллиона уникально нанесенных на карту считываний в данных ATAC-seq наблюдалось 38 878, 43 832, 41 509 и 45 530 пиков из 25 000, 50 000, 75 000 и 100 000 клеточных входов соответственно. Входное условие в 100 000 ячеек показало наибольшее количество пиков. Поскольку для оценки качества данных ATAC-seq использовалась оценка обогащения сайта transion Start Site (TSS), оценка TSS каждого условия ATAC-seq была рассчитана с использованием программы GitHub: Jiananlin/TSS_enrichment_score_calculation28. Оценки TSS для условий ввода 25 000, 50 000, 75 000 и 100 000 ячеек составляли 9,03, 9,02, 8,82 и 8,28 соответственно (показатель обогащения TSS считается идеальным, если он больше 728). Это указывало на постепенное снижение показателя обогащения СТШ с увеличением количества клеток. В то время как наибольшее пиковое число наблюдалось в состоянии ввода 100 000 ячеек, условие ввода 25 000 клеток дало лучшую оценку TSS. Анализ аннотаций пиков Гомера29 показал, что большинство увеличенных пиков классифицируются как дистальные пики промотора (рисунок 6C). Основываясь на этих результатах, можно сделать вывод, что входы с более высоким числом клеток могут производить большее количество пиков и чаще обнаруживать непромоторные пики по сравнению с входами с более низким числом клеток в этом состоянии.
Рисунок 1: Схема метода ATAC-seq. (A) ATAC-seq измеряет доступность хроматина с помощью гиперактивной транспозазы Tn5, предварительно загруженной прямым и обратным адаптерами. Различные этапы процесса включают (B) лизис клеток (включая оптимизацию буферной композиции лизиса, титрование Tn5 и количество используемых клеток); (C) транспозиция (связывание Tn5 с открытым/доступным хроматином); (D) маркировка хроматина; (E) очистка фрагментов ДНК и амплификация библиотек и (F) секвенирование библиотек и анализ данных. Анализ распределения длины фрагментов библиотек ATAC-seq обычно показывает начальный пик около ~ 50 bp (области, свободные от нуклеосом) и другой пик в ~ 200 bp (мононуклеосома). Таким образом, без вычислительной или экспериментальной фильтрации размеров сигналы ATAC-seq содержат как свободные от нуклеосом, так и нуклеосомные области в открытом хроматине. Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Сравнение эффективности лизиса клеток с использованием трипан-синего цвета. (A) Клетки NMuMG обрабатывали гипотоническим буфером8 и окрашивали трипан-синим. (B) Клетки NMuMG обрабатывали буфером CSK и окрашивали трипановым синим цветом. Шкалы указывают на 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Анализ амплифицированных фрагментов ДНК библиотек ATAC-seq. Библиотеки ATAC-seq были подготовлены из клеток рака молочной железы MDA-MB-231. (A) После амплификации ПЦР продукты ПЦР анализировали на 0,5x TBE, 1,5% агарозном геле до и после очистки шариков. Грунтовки в основном удаляются путем первоначальной очистки бусин. Также показаны паттерны полос ДНК из (B) 1x TAE, 1% электрофореза агарозного геля и (C) автоматизированного электрофореза. SYBR Gold использовался для визуализации фрагментов ДНК, показанных в A и B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Анализ обогащения библиотек ATAC-seq. (A) Трек браузера генома, показывающий локус ESR1. Показан охват генома данных ATAC-seq в клетках T47D20 . Грунтовок из предыдущей публикации было использовано26, а их целевые области выделены желтым цветом. (B) Гистограмма, изображающая обогащение ампликона праймера в библиотеках ATAC-seq. Библиотеки ATAC-seq были подготовлены гипотоническим буфером или буфером CSK. Различные концентрации Tn5 также использовались для создания библиотек ATAC-seq. 1 нг каждой библиотеки использовался для выполнения qPCR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Визуализация генома браузера для оптимизации ATAC-seq. Различные количества транспозазы Tn5 были добавлены во время подготовки библиотеки. Условие Tn5 объемом 1,25 мкл показывает более высокие фоновые сигналы (выделенные желтым цветом), в то время как два других условия выглядят аналогично. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Распределение фрагментов ДНК по размерам библиотек ATAC-seq. (A) Библиотеки ATAC-seq были подготовлены с использованием указанных номеров клеток. Данные ATAC-seq из состояния ввода 25 000 клеток показали самое высокое обогащение фрагментов без нуклеосом, в то время как условие ввода 100 000 клеток представляло собой самые высокие мононуклеосомные ДНК. (B) Треки браузера генома, показывающие данные ATAC-seq из разных номеров клеток. (C) Анализ аннотаций пика Гомера. Каждый пик был классифицирован гомером29 как промоторно-проксимальный или дистальный пик. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Имя | Последовательность |
| ESR1 C Вперед | TGGTGACTCATATTTGAACAAGCC |
| ESR1 C Реверс | CTCCTCCGTTGAATGTCTCC |
| ESR1 K Вперед | TGTGGCTGGCTGCGTATG |
| ESR1 K Реверс | TGTCTCTCTCTTTTTTTGATTCCC |
| ESR1 L Вперед | TGTGCCTGGAGTGATGTTTAAG |
| ESR1 L Реверс | CATTACAAAGGTGCTGGAGGAC |
Таблица 1: Список грунтовок, используемых в данном исследовании.
| Стремянка | Температура | Время | Цикл |
| Заполнение пробелов | 72 °С | 5 мин | 1 |
| Начальная денатурация | 98 °С | 30 с | 1 |
| Денатурация | 98 °С | 10 с | 5 |
| Отжиг | 63 °С | 30 с | |
| Расширение | 72 °С | 1 мин | |
| Держать | 4 °С | Навсегда |
Таблица 2: Программа амплификации ПЦР, часть 1.
| Стремянка | Температура | Цикл |
| Начальная денатурация | 98 °C 30 с | 1 |
| Денатурация | 98 °C 10 с | 20 |
| Отжиг | 63 °C 30 с | |
| Расширение | 72 °C 1 мин | |
| Считывание пластин |
Таблица 3: Параметры qPCR.
| Стремянка | Температура | Время | Цикл |
| Начальная денатурация | 98 °С | 30 с | 1 |
| Денатурация | 98 °С | 10 с | Общее количество циклов, рассчитанных на шаге 6.4 |
| Отжиг | 63 °С | 30 с | |
| Расширение | 72 °С | 1 мин | |
| Держать | 4 °С | Навсегда |
Таблица 4: Программа ПЦР-амплификации, часть 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ATAC-seq широко используется для картирования открытых и активных областей хроматина. Прогрессирование раковых клеток часто обусловлено генетическими изменениями и эпигенетическим перепрограммированием, что приводит к изменению доступности хроматина и экспрессии генов. Пример такого перепрограммирования наблюдается во время эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМТ) и его обратного процесса, мезенхимального перехода в эпителиальный (МЕТ), которые, как известно, являются ключевыми процессами клеточного перепрограммирования во время метастазирования опухоли30. Другим примером является приобретение лекарственной устойчивости против гормональной терапии, часто наблюдаемой при просветных опухолях молочной железы31. ATAC-seq полезен для мониторинга таких клеточных фенотипических изменений на уровне хроматина и может быть использован для прогнозирования клеток происхождения и подтипов рака4.
Для точного измерения ремоделирования хроматина с помощью ATAC-seq необходимо создание воспроизводимого и согласованного протокола. В данной рукописи описана стандартная стратегия оптимизации библиотеки ATAC-seq. В качестве примеров процессов оптимизации используются данные ATAC-seq из клеточных линий MDA-MB-231 и NMuMG. Клетки NMuMG были использованы для изучения EMT, а клетки MDA-MB-231 были использованы для изучения его обратного процесса, MET. Эти клеточные модели ранее использовались для изучения эпигенетических изменений во время EMT и MET13,32. Использование соответствующего буфера для лизиса клеток и концентрации Tn5 является ключевым компонентом успешной подготовки библиотеки ATAC-seq. В дополнение к этим компонентам также очень важен высокий процент (>90%) жизнеспособности клеток, соответствующие концентрации моющего средства в буфере лизиса и приготовление одноклеточной суспензии. Когда эффективность переваривания Tn5 значительно отличается в разных образцах, трудно исправить вариации данных. Это связано с отсутствием внутреннего и внешнего контроля для количественной оценки эффективности пищеварения. Клеточные характеристики или свойства также могут отличаться между клетками из контрольной группы и клетками из тестовой группы. Поэтому для получения высококачественных данных ATAC-seq от обеих экспериментальных групп необходимо тщательное рассмотрение экспериментальных условий, включая выбор буфера лизиса (рис. 5 и рисунок 6).
Помимо открытого профилирования хроматина, ATAC-seq был использован для идентификации следов транскрипционного фактора и позиционирования нуклеосом 8,33. Важно отметить, что такая информация в основном получена из открытых областей хроматина (рисунок 1F). Поэтому результаты будут смещены в сторону открытых областей хроматина. Тем не менее, ATAC-seq является мощным инструментом для изучения архитектуры хроматина. Этот революционный инструмент был принят для одноклеточной геномики и продолжает способствовать улучшению нашего понимания регуляции генов и биологии хроматина.
ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ:
Данные, представленные в этом протоколе, доступны в Gene Expression Omnibus под номером присоединения GSE202791. В анализе также использовались данные ATAC-seq из GSE72141 и GSE99479.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что нет никаких релевантных или материальных финансовых интересов, которые относятся к исследованию, описанному в данной статье.
Acknowledgments
Мы с признательностью выражаем признательность механизму UND Genomics Core за выдающуюся техническую помощь.
Эта работа финансировалась Национальными институтами здравоохранения [P20GM104360 to M.T., P20 GM104360 to A.D.] и стартовыми фондами, предоставленными Школой медицины и наук о здоровье Университета Северной Дакоты, Департамент биомедицинских наук [до M.T.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-3810 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1182-1830 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-1840 | Filtered and low-retention. Beveled Grade |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | |
| 20 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1183-1810 | Filtered and low-retention |
| 200 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1180-8810 | Filtered and low-retention |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Fisherbrand | 06-443-19 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Genetic Analysis Grade |
| All the cell lines used in this study are obtained from ATCC | ATCC | ||
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Bead purification kit |
| CellDrop Cell Counter | DeNovix | CellDrop FL | Cell counter |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| Ethanol 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Anhydrous; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products |
| Fetal Bovine Serum - TET Tested | R&D Systems | S10350 | Triple 0.1 µm filtered |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Gibco Trypsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0.25%), phenol red |
| Glycerol | IBI Scientific | 56-81-5 | |
| Glycine | MilliporeSigma | G8898 | |
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous) |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD and Tn5 Transposase |
| NP - 40 (IGEPAL CA-630) | MilliporeSigma | I8896 | for molecular biology |
| PCR Detection System | BioRad | 1855484 | CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler |
| PIPES | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance Certified, suitable for cell culture |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit |
| Quibit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| Sodium Acetate | Homemade | - | pH 5.2 |
| Sucrose | IBI Scientific | 57-50-1 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Green Supermix, 1.25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips | USA Scientific | 1402-4700 | Flex-free, natural, polypropylene |
| TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | Single notch. Natural polypropylene |
| Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Grade |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit | Illumina | PE-121-1003 | paired-end |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, viscous liquid |
| Water | MilliporeSigma | W3500 | sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
References
- Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
- Liu, Y. Clinical implications of chromatin accessibility in human cancers. Oncotarget. 11 (18), 1666-1678 (2020).
- Sanghi, A., et al. Chromatin accessibility associates with protein-RNA correlation in human cancer. Nature Communications. 12 (1), 5732 (2021).
- Corces, M. R., et al. The chromatin accessibility landscape of primary human cancers. Science. 362 (6413), (2018).
- Boyle, A. P., et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome. Cell. 132 (2), 311-322 (2008).
- Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
- Pardo, C. E., Nabilsi, N. H., Darst, R. P., Kladde, M. P. Integrated DNA methylation and chromatin structural analysis at single-molecule resolution. Methods in Molecular Biology. 1288, 123-141 (2015).
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. , 1 (2015).
- Mehrmohamadi, M., Sepehri, M. H., Nazer, N., Norouzi, M. R. A comparative overview of epigenomic profiling methods. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 714687 (2021).
- Fujiwara, S., Baek, S., Varticovski, L., Kim, S., Hager, G. L. High quality ATAC-Seq data recovered from cryopreserved breast cell lines and tissue. Scientific Reports. 9 (1), 516 (2019).
- Takaku, M., et al. GATA3-dependent cellular reprogramming requires activation-domain dependent recruitment of a chromatin remodeler. Genome Biology. 17, 36 (2016).
- Rohland, N., Reich, D. C. ost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), 25 (2009).
- Picard Toolkit Broad Institute, GitHub Repository. , Available from: https://broadinstitute.github.io/picard/ (2022).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
- Zhou, B., et al. INO80 governs superenhancer-mediated oncogenic transcription and tumor growth in melanoma. Genes & Development. 30 (12), 1440-1453 (2016).
- Takaku, M., et al. GATA3 zinc finger 2 mutations reprogram the breast cancer transcriptional network. Nature Communications. 9 (1), 1059 (2018).
- Oldfield, A. J., et al. NF-Y controls fidelity of transcription initiation at gene promoters through maintenance of the nucleosome-depleted region. Nature Communications. 10 (1), 3072 (2019).
- Langer, L. F., Ward, J. M., Archer, T. K. Tumor suppressor SMARCB1 suppresses super-enhancers to govern hESC lineage determination. Elife. 8, 45672 (2019).
- Elrod, N. D., et al. The integrator complex attenuates promoter-proximal transcription at protein-coding genes. Molecular Cell. 76 (5), 738-752 (2019).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Porter, J. R., et al. Global inhibition with specific activation: How p53 and MYC redistribute the transcriptome in the DNA double-strand break response. Molecular Cell. 67 (6), 1013-1025 (2017).
- Dhasarathy, A., Kajita, M., Wade, P. A. The transcription factor snail mediates epithelial to mesenchymal transitions by repression of estrogen receptor-alpha. Molecular Endocrinology. 21 (12), 2907-2918 (2007).
- McCarthy, M. T., O'Callaghan, C. A. PeaKDEck: A kernel density estimator-based peak calling program for DNaseI-seq data. Bioinformatics. 30 (9), 1302-1304 (2014).
- Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nature Protocols. 7 (6), 1518-1552 (2022).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Garcia-Martinez, L., Zhang, Y., Nakata, Y., Chan, H. L., Morey, L. Epigenetic mechanisms in breast cancer therapy and resistance. Nature Communications. 12 (1), 1786 (2021).
- Bhattacharya, A., et al. The calcium channel proteins ORAI3 and STIM1 mediate TGF-β induced Snai1 expression. Oncotarget. 9 (50), 29468-29483 (2018).
- Schep, A. N., et al. Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions. Genome Research. 25 (11), 1757-1770 (2015).
