Summary
ATAC-seq är en DNA-sekvenseringsmetod som använder det hyperaktiva mutanttransposaset, Tn5, för att kartlägga förändringar i kromatintillgänglighet medierad av transkriptionsfaktorer. ATAC-seq möjliggör upptäckt av de molekylära mekanismer som ligger bakom fenotypiska förändringar i cancerceller. Detta protokoll beskriver optimeringsprocedurer för ATAC-seq i epitelcelltyper, inklusive cancerceller.
Abstract
Analysen för transposastillgängligt kromatin med ATAC-seq-sonder med hög genomströmningssekvensering (ATAC-seq) tillgänglighet deoxiribonukleinsyra (DNA) med hjälp av det hyperaktiva Tn5-transposaset. Tn5 skär och ligerar adaptrar för sekvensering med hög genomströmning inom tillgängliga kromatinregioner. I eukaryota celler förpackas genomiskt DNA i kromatin, ett komplex av DNA, histoner och andra proteiner, som fungerar som en fysisk barriär mot transkriptionsmaskineriet. Som svar på yttre signaler rekryterar transkriptionsfaktorer kromatinombyggnadskomplex för att möjliggöra tillgång till transkriptionsmaskineriet för genaktivering. Därför är det användbart att identifiera öppna kromatinregioner vid övervakning av förstärkare och genpromotoraktiviteter under biologiska händelser som cancerprogression. Eftersom detta protokoll är lätt att använda och har ett lågt cellinmatningskrav har ATAC-seq antagits allmänt för att definiera öppna kromatinregioner i olika celltyper, inklusive cancerceller. För framgångsrik datainsamling måste flera parametrar beaktas vid förberedelse av ATAC-seq-bibliotek. Bland dem är valet av celllysbuffert, titreringen av Tn5-enzymet och startvolymen av celler avgörande för ATAC-seq-biblioteksberedning i cancerceller. Optimering är viktigt för att generera data av hög kvalitet. Här ger vi en detaljerad beskrivning av ATAC-seq-optimeringsmetoderna för epitelcelltyper.
Introduction
Kromatintillgänglighet är ett viktigt krav för reglering av genuttryck på en genomomfattande skala1. Förändringar i kromatin tillgänglighet är ofta förknippade med flera sjukdomstillstånd, inklusive cancer 2,3,4. Under årens lopp har många tekniker utvecklats för att göra det möjligt för forskare att undersöka kromatinlandskapet genom att kartlägga regioner med kromatintillgänglighet. Några av dem inkluderar DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)5, FAIRE-seq (formaldehydassisterad isolering av regulatoriska element)6, MAPit (methyltransferase accessibility protocol for individual templates)7, och fokus i detta dokument, ATAC-seq (assay for transposase-accessible chromatin)8. DNase-seq kartlägger tillgängliga regioner genom att använda en nyckelfunktion hos DNase, nämligen den föredragna matsmältningen av naket DNA fritt från histoner och andra proteiner såsom transkriptionsfaktorer5. FAIRE-seq, liknande ChIP-seq, använder formaldehyd tvärbindning och ultraljudsbehandling, förutom att ingen immunoprecipitation är inblandad, och de nukleosomfria regionerna isoleras genom fenol-kloroformextraktion6. MAPit-metoden använder ett GC-metyltransferas för att undersöka kromatinstrukturen vid enmolekylär upplösning7. ATAC-seq förlitar sig på det hyperaktiva transposaset, Tn58. Tn5-transposaset binder företrädesvis till öppna kromatinregioner och sätter in sekvenseringsadaptrar i tillgängliga regioner. Tn5 fungerar genom en DNA-medierad "klipp och klistra" -mekanism, varigenom transposaset förinstallerat med adaptrar binder till öppna kromatinställen, skär DNA och ligerar adaptrarna8. Tn5-bundna regioner återvinns genom PCR-förstärkning med hjälp av primers som glödgas till dessa adaptrar. FAIRE-seq och DNase-seq kräver en stor mängd utgångsmaterial (~ 100 000 celler till 225 000 celler) och ett separat biblioteksförberedelsesteg före sekvensering9. Å andra sidan är ATAC-seq-protokollet relativt enkelt och kräver ett litet antal celler (<50 000 celler)10. Till skillnad från FAIRE-seq- och DNase-seq-teknikerna är sekvenseringsbiblioteksberedningen av ATAC-seq relativt enkel, eftersom det isolerade DNA-provet redan taggas med sekvenseringsadaptrarna av Tn5. Därför behövs endast PCR-förstärkningssteget med lämpliga primers för att slutföra biblioteksförberedelsen, och de tidigare bearbetningsstegen som slutreparation och adapterligering behöver inte utföras, vilket sparar tid11. För det andra undviker ATAC-seq behovet av bisulfitomvandling, kloning och förstärkning med regionspecifika primers som krävs för MAPit7. På grund av dessa fördelar har ATAC-seq blivit en enormt populär metod för att definiera öppna kromatinregioner. Även om ATAC-seq-metoden är enkel kräver flera steg optimering för att få högkvalitativa och reproducerbara data. Detta manuskript diskuterar optimeringsprocedurer för standard ATAC-seq-biblioteksberedning, särskilt med betoning på tre parametrar: (1) lysbuffertkomposition, (2) Tn5-transposaskoncentration och (3) cellnummer. Dessutom ger detta papper exempeldata från optimeringsförhållandena med både cancerösa och icke-cancerösa vidhäftande epitelceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelser innan experimentet påbörjas
- Förbered lysbuffertlager.
OBS: Den optimala kärnisoleringsbufferten kan vara olika för varje celltyp. Vi rekommenderar att du testar både den hypotoniska bufferten som används i originalpapper8 och en CSK-buffert12,13 för varje celltyp med trypanblå färgning.- För att förbereda hypotonisk buffert (Greenleaf-buffert), blanda 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 och 0,1% NP-40.
- För att förbereda CSK-buffert, blanda 10 mM PIPES pH 6,8, 100 mM NaCl, 300 mM sackaros, 3 mM MgCl2 och 0,1% Triton X-100.
- Se till att cellodlingsförhållandena är optimala; Undersök cellerna under ett ljusmikroskop för att se till att det inte finns några förhöjda nivåer av apoptos.
- Slå på centrifugen så att den når 4 °C.
2. Cellskörd
- Aspirera media från en cellodling vid <80% sammanflöde. Celler odlas vanligtvis i en 35 mm eller 60 mm skål, baserat på antalet celler som behövs, behandlingar etc.
- Tvätta cellerna med 1 ml eller 3 ml PBS.
- Tillsätt 0,5 ml eller 1 ml trypsin och inkubera i 2-3 minuter (beroende på celltyperna). Använd försiktigt en 1 ml pipett för att blanda väl.
- Tillsätt 1 ml eller 2 ml media till plattan och blanda väl. Överför till ett 15 ml koniskt rör. Centrifugera cellerna i ett 15 ml rör i 3 min vid 300 x g.
OBS: En svängande skoprotor rekommenderas för att minimera cellförlusten. - Aspirera mediet och återsuspendera cellerna i 1 ml eller 2 ml medium.
OBS: Det är viktigt att förbereda en homogen encellslösning. För vävnader kan en Dounce-homogenisator användas för att homogenisera vävnader och minimera stora cellklumpar eller aggregat. Vissa vävnader kräver filtrering (t.ex. cellsilar) och / eller FACS-cellsortering för att isolera livskraftiga celler och få en enda celllösning. - Räkna cellerna med hjälp av en cellräknare.
OBS: I denna studie användes en automatiserad cellräknare (Materialtabell). - Centrifugera den erforderliga cellvolymen (t.ex. en volym som innehåller 1 x 106 celler baserat på cellantal) vid 300 x g i 3 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Återsuspendera cellpelleten som innehåller 1 x 106 celler i 1 ml kall PBS.
OBS: Om cellnumren är mindre än 1 x 10 6 celler, minska den kalla PBS-volymen för att förbereda celllösningen i samma koncentration (1 x 106 celler / ml).
3. Celllys
- Överför 25 μL (= 2,5 x 104 celler) till ett nytt 1,7 ml mikrocentrifugrör. Centrifugera i 5 minuter vid 500 x g vid 4 °C och kassera supernatanten försiktigt
OBS: En svängande skoprotor rekommenderas för att minimera cellförlusten. Lämna cirka 3 μl supernatant för att säkerställa att cellerna inte kasseras. - Tillsätt 25 μl lysbuffert och återsuspendera cellerna genom att försiktigt pipettera upp och ner. Inkubera på is i 5 min
- Centrifugera i 5 minuter vid 500 x g vid 4 °C och kasta supernatanten försiktigt.
OBS: En svängande skoprotor rekommenderas för att minimera cellförlusten. Lämna cirka 3 μl supernatant för att säkerställa att cellerna inte kasseras.
4. Tn5-taggning
- Återsuspendera omedelbart pelleten i 25 μl Tn5-reaktionsblandning. Tn5-reaktionsblandningen är som följer: 12,5 μL 2x Tagmentation DNA-buffert (TD-buffert), 1,25-5 μL Tn5-transposas och 11,25-7,5 μL nukleasfritt vatten.
OBS: Standardkoncentrationen av Tn5 är 2,5 μL för 2,5 x 104 celler. - Inkubera i 30 minuter vid 37 °C.
OBS: Blanda lösningen var 10: e minut.
5. DNA-rening
OBS: Rening krävs före förstärkning. DNA-rening görs med hjälp av MinElute PCR-reningssats (materialtabell).
- Tillsätt 5 μl 3 M natriumacetat (pH 5,2).
- Tillsätt omedelbart 125 μL buffert PB och blanda väl.
- Följ PCR-reningssatsprotokollet från och med steg 2.
- Placera spinnkolonnen i ett 2 ml uppsamlingsrör.
- Applicera provet på centrifugeringskolonnen och centrifugera i 1 min vid 17 900 x g vid RT.
- Kasta genomströmningen och placera tillbaka spinnkolonnen i samma uppsamlingsrör.
- Tillsätt 750 μl buffert-PE till centrifugeringskolonnen och centrifugera i 1 min vid 17 900 x g vid RT.
- Kasta genomströmningen och placera tillbaka spinnkolonnen i samma uppsamlingsrör.
- Centrifugera centrifugeringen i 5 minuter för att torka membranet helt.
- Kassera genomströmningen och placera spinnkolonnen i ett nytt 1,7 ml mikrocentrifugrör.
- Eluera DNA-fragmenten med 10 μL buffert EB.
- Låt kolonnen stå i 1 min vid RT.
- Centrifugera i 1 min vid 17 900 x g vid RT för att eluera DNA:t.
6. PCR-förstärkning
OBS: PCR-förstärkning av transponerade (tagmenterade) DNA är nödvändig för sekvensering. Nextera-kitadaptrar (materialtabell) användes i det här exemplet. De primers som används i denna studie listas i tabell 1.
- Ställ in följande PCR-reaktion i 200 μl PCR-rör (50 μL för varje prov). PCR-reaktionsblandningen är som följer: 10 μL eluerat DNA (steg 5.), 2,5 μL 25 mM Adapter 1, 2,5 μL 25 mM Adapter 2, 25 μL 2x PCR-masterblandning och 10 μL nukleasfritt vatten
- Utför PCR-förstärkningsprogram del 1 (tabell 2).
OBS: För initial förstärkning används samma förhållanden för alla prover som använder en vanlig termisk cykler. - QPCR i realtid (totalt 14,5 μL per prov)
- Använd 5 μL av produkten från PCR-förstärkningen del 1 (steg 6.2.), ställ in följande reaktion, den här gången inklusive SYBR-guld och detektion i en PCR-maskin i realtid.
- Bered PCR-reaktionsblandningen enligt följande: 5 μL PCR-produkt från steg 6.2., 0,75 μL SYBR-guld (1000x utspädd), 5 μL 2x PCR-masterblandning och 3,75 μL nukleasfritt vatten.
OBS: De exakta cykelnumren för biblioteksförstärkning innan mättnad uppnås för varje prov bestäms av qPCR (tabell 3) för att minska GC och storleksförskjutningen i PCR10. SYBR Gold späddes ut med nukleasfritt vatten. För att göra den utspädda lösningen tillsattes 1 μL SYBR Gold (lagerkoncentration 10 000x) till 999 μl nukleasfritt vatten. Körtiden för RT-qPCR som nämns i tabell 3 är cirka 60 minuter.
- Bestäm önskat antal ytterligare PCR-cykler med hjälp av körparametrarna från steg 6.3.
- Antal cykler = 1/4 maximal (mättad) fluorescensintensitet (vanligtvis 3 eller 4 PCR-cykler)
- PCR-förstärkningsprogram del 2 (volym = 45 μL; Tabell 4: När du har bestämt cykelnumret ställer du in PCR med ytterligare cykler beräknade i steg 6.4.1. Till exempel, om cykelnumret beräknat är 3, ställ in 3 cykler i programmet nedan. De totala cyklerna skulle vara 8 (5 i steg 6.2., plus ytterligare 3 cykler i steg 6.5.)
7. Pärlor rening
OBS: Här användes AMPure XP (Materialtabell) pärlor.
- Till de PCR-produkter som förstärktes i föregående steg, tillsätt 150 μL pärlor vid RT.
OBS: Hemlagade AMPure-pärlor14 kan användas i denna process. - Inkubera i 15 minuter vid RT.
- Placera rören på ett magnetiskt stativ i 5 minuter.
- Ta försiktigt bort supernatanten.
- Tvätta pärlorna med 200 μl 80% etanol.
OBS: 80% etanol bör beredas färskt. - Upprepa steg 7.4.
- Ta bort etanolen helt.
- Lufttorka proverna i 10 minuter vid RT.
- Återsuspendera med 50 μl elueringsbuffert (10 mM Tris-HCL pH 8,0).
- Upprepa pärlornas rening (steg 7.1.-7.9.) för att ytterligare minimera primerförorening.
8. DNA-koncentration och kvalitetskontroll
- Mät DNA-koncentrationen med hjälp av ett nukleinsyrakvantifieringssats (Materialförteckning).
- Kontrollera de förstärkta DNA-fragmenten med gelelektrofores med SYBR Gold (0,5x TBE, 1,5% agarosgel) eller ett automatiserat elektroforessystem (t.ex. TapeStation, bioanalysator).
9. Sekvensering
- Utför sekvensering med hög genomströmning med hjälp av de förstärkta DNA-proverna12,13.
OBS: Förstärkta DNA-prover är redo för sekvensering med hög genomströmning. För att behålla nukleosomal DNA-fragmentinformation rekommenderas sekvensering i parkopplad ände över sekvensering i en ände. Båda ändarna av DNA-fragmenten indikerar var transposaset binder. För kartläggning av öppna kromatinregioner är 30 miljoner läsningar/prov vanligtvis tillräckliga.
10. Dataanalys
- Datafiltrering baserat på basanropskvalitet: Ange lägsta genomsnittliga baskvalitetspoäng till 20 (99 % noggrannhet).
- Adaptertrimning: Ta bort adaptersekvenserna med ett lämpligt verktyg.
Omslagsverktyget Trim Galore (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) användes för att ta bort adaptersekvenser. För ATAC-seq-bibliotek framställda av Illumina Tn5 används följande sekvens som en adaptersekvens: CTGTCTCTTATACACATCT. Den minsta sekvenslängden för att känna igen adapterkontaminering är inställd på 5. - Genomkartläggning: Mappa läsningarna till lämpligt genom med Bowtie med hjälp av följande parametrar "-I 0 -X 2000 -m 1"15. Ett exempel på kartläggningskvalitet från MDA-MB-231 basala bröstcancerceller är nedan:
Läser med minst en rapporterad justering: 52,79%
Läsningar som inte kunde justeras: 13,10 %
Läser med justeringar undertryckta på grund av -m: 34,11% - Deduplicering: Markera PCR-dubbletterna med Picard-verktyg16.
- Generera en genomtäckningsfil för datavisualisering: Konvertera de deduplicerade parkopplade läsningarna till läsfragment med en ände. Genomtäckningsspår erhålls med hjälp av genomtäckningBed från sängkläder17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att få framgångsrika och högkvalitativa ATAC-seq-data är det viktigt att optimera de experimentella förhållandena. ATAC-seq-biblioteksberedning kan separeras i de fem huvudstegen (figur 1), nämligen celllys, tagmentation (fragmentering och adapterinsättning med Tn5), genomisk DNA-rening, PCR-förstärkning och dataanalys. Som en första process måste celllysbufferten (kärnisolering) först optimeras för varje celltyp. Antingen den hypotoniska bufferten som beskrivs i det ursprungliga ATAC-seq-papperet8 eller CSK-bufferten12,13 användes för att lysera bröstcancerceller. Trypan blå färgning kan användas för att bekräfta kärnisolering18. För ATAC-seq-biblioteksberedning i humana cancercellinjer såsom MDA-MB-231, T47D-, MCF7- och A375-celler har CSK-buffert använts av flera grupper12,13,19,20. CSK-buffert användes också för ATAC-seq-biblioteksberedning i andra celltyper såsom embryonala stamceller 21,22 och Drosophila S2-celler 23. För lysbuffertoptimering är Trypan blå färgning användbar för att bedöma celllyseffektiviteten. När NMuMG, icke-cancerösa bröstkörtelceller från mus, behandlades med hypotonisk buffert8 (se steg 1) och CSK-buffert observerades högre celllyseffektivitet i CSK-behandlade celler (figur 2). För frysta vävnader har Omni-ATAC visat sig förbättra ATAC-seq-signaler24. I Omni-ATAC används en buffert som innehåller 0,1% NP40, 0,1% Tween-20 och 0,01% Digitonin för celllys. Även om den Digitonin-baserade bufferten är känd för att minska fraktionen av mitokondriellt DNA, visade sig signal-brusförhållandena och TSS-läsantalet från ATAC-seq med CSK-buffert vara bättre än de från Omni-ATAC i bröstcancerceller12. Därför är resten av detta manuskript huvudsakligen inriktat på resultaten från ATAC-seq-data med CSK-buffert.
Efter bestämningen av de bästa celllysbuffertförhållandena (kärnisolering) är det viktigt att optimera förhållandena mellan ingångscellsnummer och Tn5-transposaskoncentration12,25. Vanligtvis kan Tn5-koncentrationen titreras genom att variera volymen Tn5 från 1,25 μL, 2,5 μL, till 5 μL i en total volym av 25 μL reaktionsblandning. Alternativt kan ingångscellsnummer ändras (t.ex. från 10 000 till 100 000), samtidigt som Tn5-enzymet bibehålls oförändrat vid 2,5 μL för att optimera Tn5-tagmentationsreaktionen. För att utvärdera kvaliteten på ATAC-seq-bibliotek och effektiviteten hos Tn5-inducerad kromatinsmältning kan bibliotekets PCR-produkter analyseras genom agarosgelelektrofores. Bild 3 visar exempel på lyckade ATAC-seq-bibliotek. Vanligtvis resulterar PCR-förstärkning av 8 eller 9 cykler (totala PCR-cykler inklusive initial PCR) i 3-6 ng / μL ATAC-seq-bibliotekskoncentration. Eftersom Tn5 företrädesvis "attackerar" nukleosomfria områden vid öppet kromatin (figur 1), bör nukleosomstegarna vara uppenbara på gelbilden (figur 3). Etidiumbromid eller SYBR Gold kan användas för att detektera förstärkta DNA på agarosgelén.
Därefter kan qPCR-analys med hjälp av ATAC-seq-bibliotek användas för att kortfattat kontrollera bibliotekens kvalitet och fragmentanrikningen vid öppna kromatinregioner, såsom promotorer av aktiva gener (figur 4). Primers kan utformas för att generera <80 bp amplicons med hjälp av promotorer av kända aktiva gener som positiva kontroller och kända "slutna" (inaktiva) kromatinregioner som negativa kontroller (figur 4A). Bland de testade förhållandena observerades högre anrikning i T47D ATAC-seq-biblioteken med CSK-buffert (figur 4B). Som förväntat fann vi mer anrikning med primers K och L vid östrogenreceptorns alfa (ESR1) genpromotorregion i förhållande till ett slutet område uppströms ESR1 med primer C (figur 4B)26. Figur 5 visar exempel på ATAC-seq-data med olika Tn5-koncentrationer (25 000 celler användes). I detta fall detekterades högre bakgrundsbrus i det lägsta (1,25 μL av Tn5) Tn5-tillståndet (figur 5, vertikala staplar). ATAC-seq-data från 2,5 μL eller 5 μL Tn5 visade liknande nivåer av ATAC-seq-signaler vid öppna kromatinregioner med lägre bakgrundssignaler. Med tanke på den potentiella översmältningen av Tn5 vid den högre koncentrationen kan man dra slutsatsen att 2,5 μL Tn5 är lämplig för denna celltyp.
Vi utförde också ATAC-seq med hjälp av olika cellnummer i NMuMG-celler, som ofta används för att studera epitelial-mesenkymal övergång (figur 6). För att optimera startvolymen användes fyra olika cellnummer (25 000, 50 000, 75 000 och 100 000) för ATAC-seq-biblioteksoptimeringen. Cellerna lyserades med CSK-buffert och kärnor inkuberades med 2,5 μL Tn5-transposas i 25 μL av reaktionsblandningen. För att utforska effekten av Tn5-matsmältning och nukleosomala stegar analyserades storleksfördelningen av införda DNA bioinformatiskt (figur 6A). När lägre cellnummer användes berikades nukleosomfria DNA-fragment (<100 bp) mer i sekvenseringsdata. Å andra sidan var fraktionen av mono-nukleosomala DNA-fragment (175-225 bp) mindre i lågcellsinmatningsproverna (25 000 celler och 50 000 celler) jämfört med högre cellinmatningsförhållanden (75 000 celler och 100 000 celler). Även om differentiella DNA-fragmentmönster observerades mellan proverna, verkar ingångscellsnummer ha minimal inverkan på anrikningen av ATAC-seq-signaler vid promotorer och andra öppna kromatinregioner (figur 6B). För att ytterligare undersöka effekten av indatacellnummer på nedströmsanalys definierades ATAC-seq-toppar. ATAC-seq-topparna bestämdes av PeaKDEck-toppanropsprogrammet27 med hjälp av följande parametrar: -sig 0,0001 -bin 300 -back 3,000 -npBack 2,500,000. Från ~ 4,9 miljoner unikt kartlagda läsningar observerades 38 878, 43 832, 41 509 och 45 530 toppar i ATAC-seq-data från 25 000, 50 000, 75 000 respektive 100 000 cellinmatningar. Inmatningstillståndet på 100 000 celler visade det högsta antalet toppar. Eftersom TSS-anrikningspoängen (Transcription Start Site) har använts för att bedöma kvaliteten på ATAC-seq-data beräknades TSS-poängen för varje ATAC-seq-villkor med hjälp av GitHub-programmet: Jiananlin/TSS_enrichment_score_calculation28. TSS-poängen för 25 000, 50 000, 75 000 och 100 000 cellinmatningsförhållanden var 9,03, 9,02, 8,82 respektive 8,28 (TSS-anrikningspoängen anses vara idealisk om den är större än 728). Detta indikerade en gradvis minskning av TSS-anrikningspoängen med ökande cellantal. Medan det största topptalet observerades i tillståndet för 100 000 cellinmatning, gav 25 000 cellinmatningstillstånd en bättre TSS-poäng. Toppannoteringsanalys av Homer29 indikerade att majoriteten av de ökade topparna kategoriseras som promotoriska distala toppar (figur 6C). Baserat på dessa resultat kan man dra slutsatsen att de högre cellnummerinmatningarna kan ge ett högre antal toppar och oftare upptäcka icke-promotortoppar jämfört med de lägre cellnummerinmatningarna i detta tillstånd.
Figur 1: Översikt över ATAC-seq-metoden. (A) ATAC-seq mäter kromatintillgängligheten med hjälp av ett hyperaktivt Tn5-transposas förinstallerat med framåt- och bakåtadaptrar. De olika stegen i processen inkluderar (B) celllys (inklusive optimering av lysbuffertkomposition, titrering av Tn5 och antalet celler som används); C) Införlivande (bindning av Tn5 till öppet/tillgängligt kromatin). D) Tagmentation av kromatin. (E) DNA-fragmentrening och förstärkning av bibliotek, och (F) sekvensering av bibliotek och dataanalys. Fragmentlängdsfördelningsanalys av ATAC-seq-bibliotek visar vanligtvis en initial topp runt ~ 50 bp (nukleosomfria regioner) och en annan topp vid ~ 200 bp (mono-nukleosom). Därför, utan beräknings- eller experimentell storleksfiltrering, innehåller ATAC-seq-signaler både nukleosomfria och nukleosomala regioner i öppet kromatin. Skapad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Jämförelse av celllyseffektivitet med trypanblått. (A) NMuMG-celler behandlades med den hypotoniska bufferten8 och färgades med trypanblått. (B) NMuMG-celler behandlades med CSK-buffert och färgades med trypanblått. Skalstrecken anger 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Förstärkt DNA-fragmentanalys av ATAC-seq-bibliotek. ATAC-seq-bibliotek framställdes från MDA-MB-231 bröstcancerceller. (A) Efter PCR-förstärkning analyserades PCR-produkter på en 0,5x TBE, 1,5% agarosgel före och efter pärlrening. Primers avlägsnas mestadels genom den ursprungliga pärlreningen. DNA-bandmönster från (B) 1x TAE, 1% agarosgelelektrofores och (C) en automatiserad elektrofores indikeras också. SYBR Gold användes för att visualisera DNA-fragmenten som visas i A och B. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Anrikningsanalys av ATAC-seq-bibliotek . (A) Genom-webbläsarspår som visar ESR1-locus. Genomtäckningen av ATAC-seq-data i T47D-celler20 visas. Primers från en tidigare publikation användes26, och deras målregioner är markerade med gult. (B) Stapeldiagram som visar primerampliconberikning i ATAC-seq-bibliotek. ATAC-seq-bibliotek framställdes av hypotonisk buffert eller CSK-buffert. Olika koncentrationer av Tn5 användes också för att generera ATAC-seq-bibliotek. 1 ng av varje bibliotek användes för att utföra qPCR. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Genomwebbläsarvisualisering för ATAC-seq-optimering. Olika mängder Tn5-transposas tillsattes under biblioteksförberedelserna. Tn5-villkoret på 1,25 μL visar högre bakgrundssignaler (markerade med gult), medan de andra två villkoren ser lika ut. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Fördelning av DNA-fragmentstorlek för ATAC-seq-bibliotek. (A) ATAC-seq-bibliotek framställdes med hjälp av de angivna cellnumren. ATAC-seq-data från 25 000 cellinmatningstillståndet visade den högsta anrikningen av nukleosomfria fragment, medan 100 000 cellinmatningstillstånd presenterade de högsta mono-nukleosomala DNA: erna. (B) Genomwebbläsarspår som visar ATAC-seq-data från olika cellnummer. (C) Analys av Homeros toppnotering. Varje topp klassificerades som en promotor-proximal eller distal topp av Homer29. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Namn | Sekvens |
| ESR1 C framåt | TGGTGACTCATATTTGAACAAGCC |
| ESR1 C Omvänd | CTCCTCCGTTGAATGTGTCTCC |
| ESR1 K framåt | TGTGGCTGGCTGCGTATG |
| ESR1 K Omvänd | TGTCTCTCTTTCTGTTTTTTCCC |
| ESR1 L framåt | TGTGCCTGGAGTGATGTTTAAG |
| ESR1 L Omvänd | CATTACAAAGGTGCTGGAGGAC |
Tabell 1: Lista över primers som används i denna studie.
| Trappsteg | Temperatur | Tid | Cykel |
| Fylla luckor | 72 °C | 5 minuter | 1 |
| Inledande denaturering | 98 °C | 30 sekunder | 1 |
| Denaturering | 98 °C | 10 sekunder | 5 |
| Glödgning | 63 °C | 30 sekunder | |
| Förlängning | 72 °C | 1 minuter | |
| Hålla | 4 °C | alltid |
Tabell 2: PCR-förstärkningsprogram del 1.
| Trappsteg | Temperatur | Cykel |
| Inledande denaturering | 98 °C 30 s | 1 |
| Denaturering | 98 °C 10 s | 20 |
| Glödgning | 63 °C 30 s | |
| Förlängning | 72 °C 1 minuter | |
| Plattan läses |
Tabell 3: qPCR-inställningar.
| Trappsteg | Temperatur | Tid | Cykel |
| Inledande denaturering | 98 °C | 30 sekunder | 1 |
| Denaturering | 98 °C | 10 sekunder | Totalt antal cykler beräknade i steg 6.4 |
| Glödgning | 63 °C | 30 sekunder | |
| Förlängning | 72 °C | 1 minuter | |
| Hålla | 4 °C | alltid |
Tabell 4: PCR-förstärkningsprogram del 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ATAC-seq har använts i stor utsträckning för kartläggning av öppna och aktiva kromatinregioner. Cancercellsprogression drivs ofta av genetiska förändringar och epigenetisk omprogrammering, vilket resulterar i förändrad kromatintillgänglighet och genuttryck. Ett exempel på denna omprogrammering ses under epitelial-till-mesenkymal övergång (EMT) och dess omvända process, mesenkymal-till-epitelial övergång (MET), som är kända för att vara viktiga cellulära omprogrammeringsprocesser under tumörmetastaser30. Ett annat exempel är förvärvet av läkemedelsresistens mot hormonbehandlingar observeras ofta i luminala brösttumörer31. ATAC-seq är användbart för att övervaka sådana cellfenotypiska förändringar på kromatinnivå och kan användas för att förutsäga en ursprungscell och cancersubtyper4.
För att exakt mäta kromatinombyggnad med ATAC-seq är upprättandet av ett reproducerbart och konsekvent protokoll nödvändigt. I detta manuskript beskrivs en standardstrategi för ATAC-seq-biblioteksoptimering. ATAC-seq-data från MDA-MB-231- och NMuMG-cellinjer används som exempel på optimeringsprocesser. NMuMG-celler har använts för att studera EMT, och MDA-MB-231-celler har använts för att studera dess omvända process, MET. Dessa cellulära modeller har tidigare använts för att studera epigenetiska förändringar under EMT och MET 13,32. Användningen av en lämplig buffert för celllys och Tn5-koncentration är nyckelkomponenten i framgångsrik ATAC-seq-biblioteksberedning. Förutom dessa komponenter är en hög procentandel (>90%) av cellviabiliteten, lämpliga koncentrationer av tvättmedel i lysbufferten och beredningen av encellssuspensionen också mycket viktiga. När Tn5-rötningseffektiviteten skiljer sig avsevärt mellan prover är det utmanande att korrigera datavariationer. Detta beror på bristen på interna och externa kontroller för att kvantitativt bedöma matsmältningseffektiviteten. Cellulära egenskaper eller egenskaper kan också skilja sig åt mellan cellerna från kontrollgruppen jämfört med cellerna från testgruppen. Därför är noggrant övervägande av de experimentella betingelserna, inklusive valet av lysbuffert, nödvändigt för att erhålla högkvalitativa ATAC-seq-data från båda experimentgrupperna (figur 5 och figur 6).
Förutom öppen kromatinprofilering har ATAC-seq använts för att identifiera transkriptionsfaktoravtryck och nukleosompositionering 8,33. Det är viktigt att notera att sådan information mestadels härrör från öppna kromatinregioner (figur 1F). Därför skulle resultaten vara partiska mot öppna kromatinregioner. Ändå är ATAC-seq ett kraftfullt verktyg för att studera kromatinarkitektur. Detta revolutionerande verktyg har nyligen antagits för encellsgenomik och fortsätter att bidra till att förbättra vår förståelse för genreglering och kromatinbiologi.
DATA TILLGÄNGLIGHET:
De data som presenteras i detta protokoll finns tillgängliga på Gene Expression Omnibus under anslutningsnummer GSE202791. ATAC-seq-data från GSE72141 och GSE99479 användes också i analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att det inte finns några relevanta eller materiella ekonomiska intressen som hänför sig till den forskning som beskrivs i detta dokument.
Acknowledgments
Vi erkänner tacksamt UND Genomics Core-anläggningen för enastående tekniskt bistånd.
Detta arbete finansierades av National Institutes of Health [P20GM104360 till M.T., P20 GM104360 till AD] och startmedel från University of North Dakota School of Medicine and Health Sciences, Institutionen för biomedicinska vetenskaper [till MT].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-3810 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1182-1830 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-1840 | Filtered and low-retention. Beveled Grade |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | |
| 20 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1183-1810 | Filtered and low-retention |
| 200 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1180-8810 | Filtered and low-retention |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Fisherbrand | 06-443-19 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Genetic Analysis Grade |
| All the cell lines used in this study are obtained from ATCC | ATCC | ||
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Bead purification kit |
| CellDrop Cell Counter | DeNovix | CellDrop FL | Cell counter |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| Ethanol 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Anhydrous; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products |
| Fetal Bovine Serum - TET Tested | R&D Systems | S10350 | Triple 0.1 µm filtered |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Gibco Trypsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0.25%), phenol red |
| Glycerol | IBI Scientific | 56-81-5 | |
| Glycine | MilliporeSigma | G8898 | |
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous) |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD and Tn5 Transposase |
| NP - 40 (IGEPAL CA-630) | MilliporeSigma | I8896 | for molecular biology |
| PCR Detection System | BioRad | 1855484 | CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler |
| PIPES | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance Certified, suitable for cell culture |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit |
| Quibit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| Sodium Acetate | Homemade | - | pH 5.2 |
| Sucrose | IBI Scientific | 57-50-1 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Green Supermix, 1.25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips | USA Scientific | 1402-4700 | Flex-free, natural, polypropylene |
| TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | Single notch. Natural polypropylene |
| Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Grade |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit | Illumina | PE-121-1003 | paired-end |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, viscous liquid |
| Water | MilliporeSigma | W3500 | sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
References
- Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
- Liu, Y. Clinical implications of chromatin accessibility in human cancers. Oncotarget. 11 (18), 1666-1678 (2020).
- Sanghi, A., et al. Chromatin accessibility associates with protein-RNA correlation in human cancer. Nature Communications. 12 (1), 5732 (2021).
- Corces, M. R., et al. The chromatin accessibility landscape of primary human cancers. Science. 362 (6413), (2018).
- Boyle, A. P., et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome. Cell. 132 (2), 311-322 (2008).
- Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
- Pardo, C. E., Nabilsi, N. H., Darst, R. P., Kladde, M. P. Integrated DNA methylation and chromatin structural analysis at single-molecule resolution. Methods in Molecular Biology. 1288, 123-141 (2015).
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. , 1 (2015).
- Mehrmohamadi, M., Sepehri, M. H., Nazer, N., Norouzi, M. R. A comparative overview of epigenomic profiling methods. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 714687 (2021).
- Fujiwara, S., Baek, S., Varticovski, L., Kim, S., Hager, G. L. High quality ATAC-Seq data recovered from cryopreserved breast cell lines and tissue. Scientific Reports. 9 (1), 516 (2019).
- Takaku, M., et al. GATA3-dependent cellular reprogramming requires activation-domain dependent recruitment of a chromatin remodeler. Genome Biology. 17, 36 (2016).
- Rohland, N., Reich, D. C. ost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), 25 (2009).
- Picard Toolkit Broad Institute, GitHub Repository. , Available from: https://broadinstitute.github.io/picard/ (2022).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
- Zhou, B., et al. INO80 governs superenhancer-mediated oncogenic transcription and tumor growth in melanoma. Genes & Development. 30 (12), 1440-1453 (2016).
- Takaku, M., et al. GATA3 zinc finger 2 mutations reprogram the breast cancer transcriptional network. Nature Communications. 9 (1), 1059 (2018).
- Oldfield, A. J., et al. NF-Y controls fidelity of transcription initiation at gene promoters through maintenance of the nucleosome-depleted region. Nature Communications. 10 (1), 3072 (2019).
- Langer, L. F., Ward, J. M., Archer, T. K. Tumor suppressor SMARCB1 suppresses super-enhancers to govern hESC lineage determination. Elife. 8, 45672 (2019).
- Elrod, N. D., et al. The integrator complex attenuates promoter-proximal transcription at protein-coding genes. Molecular Cell. 76 (5), 738-752 (2019).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Porter, J. R., et al. Global inhibition with specific activation: How p53 and MYC redistribute the transcriptome in the DNA double-strand break response. Molecular Cell. 67 (6), 1013-1025 (2017).
- Dhasarathy, A., Kajita, M., Wade, P. A. The transcription factor snail mediates epithelial to mesenchymal transitions by repression of estrogen receptor-alpha. Molecular Endocrinology. 21 (12), 2907-2918 (2007).
- McCarthy, M. T., O'Callaghan, C. A. PeaKDEck: A kernel density estimator-based peak calling program for DNaseI-seq data. Bioinformatics. 30 (9), 1302-1304 (2014).
- Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nature Protocols. 7 (6), 1518-1552 (2022).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Garcia-Martinez, L., Zhang, Y., Nakata, Y., Chan, H. L., Morey, L. Epigenetic mechanisms in breast cancer therapy and resistance. Nature Communications. 12 (1), 1786 (2021).
- Bhattacharya, A., et al. The calcium channel proteins ORAI3 and STIM1 mediate TGF-β induced Snai1 expression. Oncotarget. 9 (50), 29468-29483 (2018).
- Schep, A. N., et al. Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions. Genome Research. 25 (11), 1757-1770 (2015).
