Summary
ATAC-seq, transkripsiyon faktörlerinin aracılık ettiği kromatin erişilebilirliğindeki değişiklikleri haritalamak için hiperaktif mutant transpozaz Tn5'i kullanan bir DNA dizileme yöntemidir. ATAC-seq, kanser hücrelerinde fenotipik değişikliklerin altında yatan moleküler mekanizmaların keşfedilmesini sağlar. Bu protokol, kanser hücreleri de dahil olmak üzere epitel hücre tiplerinde ATAC-seq için optimizasyon prosedürlerini özetlemektedir.
Abstract
Yüksek verimli dizileme (ATAC-seq) ile transpozaz erişimli kromatin testi, hiperaktif Tn5 transpozaz kullanılarak deoksiribonükleik asit (DNA) erişilebilirliğini araştırır. Tn5, erişilebilir kromatin bölgelerinde yüksek verimli dizileme için adaptörleri keser ve bağlar. Ökaryotik hücrelerde, genomik DNA, transkripsiyonel makineye fiziksel bir bariyer görevi gören DNA, histonlar ve diğer proteinlerden oluşan bir kompleks olan kromatine paketlenir. Dışsal sinyallere yanıt olarak, transkripsiyon faktörleri, gen aktivasyonu için transkripsiyonel makinelere erişimi sağlamak için kromatin yeniden şekillendirme komplekslerini işe alır. Bu nedenle, açık kromatin bölgelerinin tanımlanması, kanser progresyonu gibi biyolojik olaylar sırasında arttırıcı ve gen promotör aktivitelerini izlerken yararlıdır. Bu protokolün kullanımı kolay olduğundan ve düşük hücre girişi gereksinimine sahip olduğundan, ATAC-seq, kanser hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinde açık kromatin bölgelerini tanımlamak için yaygın olarak benimsenmiştir. Başarılı veri toplama için, ATAC-seq kütüphaneleri hazırlanırken birkaç parametrenin dikkate alınması gerekir. Bunlar arasında, hücre lizis tamponunun seçimi, Tn5 enziminin titrasyonu ve hücrelerin başlangıç hacmi, kanser hücrelerinde ATAC-seq kütüphanesinin hazırlanması için çok önemlidir. Optimizasyon, yüksek kaliteli veriler oluşturmak için gereklidir. Burada, epitel hücre tipleri için ATAC-seq optimizasyon yöntemlerinin ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz.
Introduction
Kromatin erişilebilirliği, genom çapında bir ölçekte gen ekspresyonunun düzenlenmesi için anahtar bir gerekliliktir1. Kromatin erişilebilirliğindeki değişiklikler sıklıkla kanser 2,3,4 dahil olmak üzere çeşitli hastalık durumlarıyla ilişkilidir. Yıllar geçtikçe, araştırmacıların kromatin erişilebilirliğinin bölgelerini haritalayarak kromatin manzarasını araştırmalarını sağlamak için çok sayıda teknik geliştirilmiştir. Bunlardan bazıları DNase-seq (DNase I aşırı duyarlı bölgeler dizilimi)5, FAIRE-seq (düzenleyici elemanların formaldehit destekli izolasyonu)6, MAPit (bireysel şablonlar için metiltransferaz erişilebilirlik protokolü)7 ve bu makalenin odak noktası, ATAC-seq (transpozaz erişilebilir kromatin için tahlil)8'i içerir. DNase-seq, DNaz'ın temel bir özelliğini, yani histonlardan ve transkripsiyonfaktörleri 5 gibi diğer proteinlerden arındırılmış çıplak DNA'nın tercihli sindirimini kullanarak erişilebilir bölgeleri haritalandırır. ChIP-seq'e benzer şekilde FAIRE-seq, immünopresipitasyon söz konusu olmadığı sürece formaldehit çapraz bağlama ve sonikasyon kullanır ve nükleozomsuz bölgeler fenol-kloroform ekstraksiyonu6 ile izole edilir. MAPit yöntemi, tek moleküllü çözünürlük7'de kromatin yapısını araştırmak için bir GC metiltransferaz kullanır. ATAC-seq, hiperaktif transpozaz, Tn58'e dayanır. Tn5 transpozaz, tercihen açık kromatin bölgelerine bağlanır ve sıralama adaptörlerini erişilebilir bölgelere yerleştirir. Tn5, DNA aracılı bir "kes ve yapıştır" mekanizması ile çalışır, böylece adaptörlerle önceden yüklenmiş transpozaz kromatin bölgelerini açmaya bağlanır, DNA'yı keser ve adaptörleribağlar 8. Tn5'e bağlı bölgeler, bu adaptörleri besleyen primerler kullanılarak PCR amplifikasyonu ile geri kazanılır. FAIRE-seq ve DNase-seq,9'u sıralamadan önce büyük miktarda başlangıç malzemesi (~ 100.000 hücre ila 225.000 hücre) ve ayrı bir kütüphane hazırlama adımı gerektirir. Öte yandan, ATAC-seq protokolü nispeten basittir ve az sayıda hücre gerektirir (<50.000 hücre)10. FAIRE-seq ve DNase-seq tekniklerinin aksine, ATAC-seq'in dizileme kütüphanesi hazırlığı nispeten kolaydır, çünkü izole DNA örneği zaten Tn5 tarafından dizileme adaptörleri ile etiketlenmiştir. Bu nedenle, kütüphane hazırlığını tamamlamak için sadece uygun primerlere sahip PCR amplifikasyon adımına ihtiyaç vardır ve son onarım ve adaptör ligasyonu gibi önceki işlem adımlarının gerçekleştirilmesine gerek yoktur, böylece zamandan tasarruf edilir11. İkincisi, ATAC-seq, MAPit7 için gerekli olan bölgeye özgü primerlerle bisülfit dönüşümü, klonlama ve amplifikasyon ihtiyacını ortadan kaldırır. Bu avantajlardan dolayı, ATAC-seq açık kromatin bölgelerini tanımlamak için oldukça popüler bir yöntem haline gelmiştir. ATAC-seq yöntemi basit olmasına rağmen, yüksek kaliteli ve tekrarlanabilir veriler elde etmek için birden fazla adım optimizasyon gerektirir. Bu makalede, standart ATAC-seq kütüphanesi hazırlığı için optimizasyon prosedürleri tartışılmakta ve özellikle üç parametre vurgulanmaktadır: (1) lizis tampon bileşimi, (2) Tn5 transpozaz konsantrasyonu ve (3) hücre sayısı. Ek olarak, bu makale hem kanserli hem de kanserli olmayan yapışkan epitel hücrelerini kullanan optimizasyon koşullarından örnek veriler sunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Deneye başlamadan önce hazırlıklar
- Lizis tampon stoğu hazırlayın.
NOT: Optimum nükleer izolasyon tamponu her hücre tipi için farklı olabilir. Hem orijinal kağıt8'de kullanılan hipotonik tamponu hem de her hücre tipi için CSK tamponu12,13'ü tripan mavisi boyama kullanarak test etmenizi öneririz.- Hipotonik tampon (Greenleaf tamponu) hazırlamak için 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 ve% 0.1 NP-40 karıştırın.
- CSK tamponu hazırlamak için 10 mM BORULAR pH 6.8, 100 mM NaCl, 300 mM sakaroz, 3 mM MgCl2 ve %0.1 Triton X-100'ü karıştırın.
- Hücre kültürü koşullarının optimal olduğundan emin olun; Yüksek apoptoz seviyeleri olmadığından emin olmak için hücreleri bir ışık mikroskobu altında inceleyin.
- Santrifüjü 4 ° C'ye ulaşması için açın.
2. Hücre hasadı
- Ortamları% <80 oranında bir hücre kültüründen aspire edin. Hücreler tipik olarak, ihtiyaç duyulan hücre sayısına, tedavilere vb. bağlı olarak 35 mm veya 60 mm'lik bir tabakta yetiştirilir.
- Hücreleri 1 mL veya 3 mL PBS ile yıkayın.
- 0,5 mL veya 1 mL Tripsin ekleyin ve 2-3 dakika kuluçkaya yatırın (hücre tiplerine bağlı olarak). İyice karıştırmak için 1 mL'lik bir pipeti dikkatlice kullanın.
- Plakaya 1 mL veya 2 mL ortam ekleyin ve iyice karıştırın. 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Hücreleri 15 mL'lik bir tüpte 300 x g'da 3 dakika boyunca santrifüj edin.
NOT: Hücre kaybını en aza indirmek için sallanan bir kova rotoru önerilir. - Medyayı aspire edin ve hücreleri 1 mL veya 2 mL ortamda yeniden askıya alın.
NOT: Homojen tek hücreli bir çözelti hazırlamak çok önemlidir. Dokular için, dokuları homojenize etmek ve büyük hücre kümelerini veya agregalarını en aza indirmek için bir Dounce homojenizatörü kullanılabilir. Bazı dokular, canlı hücreleri izole etmek ve tek bir hücre çözeltisi elde etmek için filtrasyon (örneğin, hücre süzgeçleri) ve / veya FACS hücre sıralama gerektirir. - Bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.
NOT: Bu çalışmada otomatik hücre sayacı (Malzeme Tablosu) kullanılmıştır. - Gerekli hücre hacmini (örneğin, hücre sayısına göre 1 x 106 hücre içeren bir hacim) oda sıcaklığında (RT) 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın.
- 1 mL soğuk PBS'de 1 x 106 hücre içeren hücre peletini yeniden askıya alın.
NOT: Hücre sayıları 1 x 10 6 hücreden azsa, hücre çözeltisini aynı konsantrasyonda (1 x 106 hücre/mL) hazırlamak için soğuk PBS hacmini azaltın.
3. Hücre lizisi
- 25 μL (= 2,5 x 104 hücre) yeni bir 1,7 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 4 °C'de 500 x g'de 5 dakika santrifüj yapın ve süpernatantı dikkatlice atın
NOT: Hücre kaybını en aza indirmek için sallanan bir kova rotoru önerilir. Hücrelerin atılmadığından emin olmak için yaklaşık 3 μL süpernatant bırakın. - 25 μL lizis tamponu ekleyin ve yukarı ve aşağı hafifçe pipetleme yaparak hücreleri yeniden askıya alın. 5 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatın
- 4 ° C'de 500 x g'de 5 dakika santrifüj yapın ve süpernatanı dikkatlice atın.
NOT: Hücre kaybını en aza indirmek için sallanan bir kova rotoru önerilir. Hücrelerin atılmadığından emin olmak için yaklaşık 3 μL süpernatant bırakın.
4. Tn5 etiketleme
- Peleti derhal 25 μL Tn5 reaksiyon karışımında yeniden askıya alın. Tn5 reaksiyon karışımı aşağıdaki gibidir: 12.5 μL 2x Tagmentasyon DNA tamponu (TD tamponu), 1.25-5 μL Tn5 transpozaz ve 11.25-7.5 μL nükleaz içermeyen su.
NOT: Tn5'in standart konsantrasyonu, 2,5 x 10 4 hücre için 2,5μL'dir . - 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: Çözeltiyi her 10 dakikada bir karıştırın.
5. DNA saflaştırma
NOT: Amplifikasyondan önce saflaştırma gereklidir. DNA saflaştırma, MinElute PCR saflaştırma kiti (Malzeme Tablosu) kullanılarak yapılır.
- 5 μL 3 M sodyum asetat (pH 5.2) ekleyin.
- Hemen 125 μL Tampon PB ekleyin ve iyice karıştırın.
- 2. adımdan itibaren PCR saflaştırma kiti protokolünü takip edin.
- Döndürme kolonunu 2 mL'lik bir toplama tüpüne yerleştirin.
- Numuneyi döndürme kolonuna uygulayın ve RT'de 17.900 x g'de 1 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Akışı atın ve sıkma kolonunu aynı toplama tüpüne geri yerleştirin.
- Döndürme kolonuna 750 μL Tampon PE ekleyin ve RT'de 17.900 x g'de 1 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Akışı atın ve sıkma kolonunu aynı toplama tüpüne geri yerleştirin.
- Membranı tamamen kurutmak için sıkma kolonunu 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Akışı atın ve sıkma kolonunu yeni bir 1,7 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
- DNA fragmanlarını 10 μL Tampon EB ile etkisiz hale getirin.
- Kolonun RT'de 1 dakika beklemesine izin verin.
- DNA'yı sulandırmak için RT'de 17.900 x g'da 1 dakika santrifüj yapın.
6. PCR amplifikasyonu
NOT: Transpoze (etiketli) DNA'ların PCR amplifikasyonu dizileme için gereklidir. Bu örnekte Nextera kit adaptörleri (Malzeme Tablosu) kullanılmıştır. Bu çalışmada kullanılan primerler Tablo 1'de listelenmiştir.
- 200 μL PCR tüplerinde aşağıdaki PCR reaksiyonunu ayarlayın (her numune için 50 μL). PCR reaksiyon karışımı aşağıdaki gibidir: 10 μL salınımlı DNA (adım 5.), 2,5 μL 25 mM Adaptör 1, 2,5 μL 25 mM Adaptör 2, 25 μL 2x PCR ana karışımı ve 10 μL nükleaz içermeyen su
- PCR amplifikasyon programı bölüm 1 (Tablo 2) gerçekleştirin.
NOT: İlk amplifikasyon için, standart bir termal döngüleyici kullanan tüm numuneler için aynı koşullar kullanılır. - Gerçek zamanlı qPCR (numune başına toplam 14,5 μL)
- PCR amplifikasyon bölümü 1'deki (adım 6.2.) ürünün 5 μL'sini kullanarak, bu kez SYBR altını ve gerçek zamanlı bir PCR makinesinde algılama dahil olmak üzere aşağıdaki reaksiyonu ayarlayın.
- PCR reaksiyon karışımını aşağıdaki gibi hazırlayın: Adım 6.2.'den 5 μL PCR ürünü, 0.75 μL SYBR altın (1000x seyreltilmiş), 5 μL 2x PCR ana karışımı ve 3.75 μL nükleaz içermeyen su.
NOT: Her numune için doygunluğa ulaşmadan önce kütüphane amplifikasyonu için kesin döngü numaraları, PCR10'daki GC ve boyut yanlılığını azaltmak için qPCR (Tablo 3) ile belirlenir. SYBR Gold, nükleaz içermeyen su ile seyreltildi. Seyreltilmiş çözeltiyi yapmak için, 999 μL nükleaz içermeyen suya 1 μL SYBR Gold (stok konsantrasyonu 10.000x) ilave edildi. Tablo 3'te belirtilen RT-qPCR ürününün çalışma süresi yaklaşık 60 dakikadır.
- Adım 6.3'teki çalıştırma parametrelerini kullanarak gerekli ek PCR döngüsü sayısını belirleyin.
- Döngü sayısı = 1/4 maksimum (doymuş) floresan yoğunluğu (tipik olarak 3 veya 4 PCR döngüsü)
- PCR amplifikasyon programı bölüm 2 (hacim = 45 μL; Tablo 4): Döngü numarasını belirledikten sonra, adım 6.4.1'de hesaplanan ek döngülerle PCR'leri ayarlayın. Örneğin, hesaplanan döngü sayısı 3 ise, aşağıdaki programda 3 döngü ayarlayın. Toplam döngü 8 olacaktır (adım 6.2'de 5, artı adım 6.5'te 3 ek döngü.)
7. Boncuk saflaştırma
NOT: Burada AMPure XP (Malzeme Tablosu) boncukları kullanılmıştır.
- Önceki adımda güçlendirilmiş PCR ürünlerine, RT'de 150 μL boncuk ekleyin.
NOT: Bu işlemde ev yapımı AMPure boncuklar14 kullanılabilir. - RT'de 15 dakika boyunca kuluçkaya yatın.
- Tüpleri 5 dakika boyunca manyetik bir stand üzerine yerleştirin.
- Süper natantı dikkatlice çıkarın.
- Boncukları 200 μL% 80 etanol ile yıkayın.
NOT: %80 etanol taze hazırlanmalıdır. - 7.4 adımını yineleyin.
- Etanol tamamen çıkarın.
- RT'de numuneleri 10 dakika boyunca hava ile kurutun.
- 50 μL elüsyon tamponu (10 mM Tris-HCL pH 8.0) ile yeniden askıya alın.
- Astar kontaminasyonunu daha da azaltmak için boncuk saflaştırmayı tekrarlayın (adım 7.1.-7.9.)
8. DNA konsantrasyonu ve kalite kontrolü
- DNA konsantrasyonunu bir nükleik asit niceleme kiti kullanarak ölçün (Malzeme Tablosu).
- SYBR Gold (0.5x TBE,% 1.5 agaroz jeli) veya otomatik bir elektroforez sistemi (örneğin, TapeStation, biyoanalizör) kullanarak jel elektroforezi ile güçlendirilmiş DNA fragmanlarını kontrol edin.
9. Sıralama
- Güçlendirilmiş DNA örnekleri12,13'ü kullanarak yüksek verimli dizileme gerçekleştirin.
NOT: Güçlendirilmiş DNA örnekleri, yüksek verimli dizileme için hazırdır. Nükleozomal DNA fragmanı bilgisini korumak için, tek uçlu dizileme yerine çift uçlu dizileme önerilir. DNA fragmanlarının her iki ucu da transpozazın nereye bağlandığını gösterir. Açık kromatin bölgelerini haritalamak için genellikle 30 milyon okuma/örnek yeterlidir.
10. Veri analizi
- Temel çağrı kalitesine dayalı veri filtreleme: Minimum ortalama temel kalite puanını 20 olarak ayarlayın (%99 doğruluk).
- Adaptör kırpma: Uygun bir alet kullanarak adaptör dizilerini çıkarın.
NOT: Adaptör dizilerini kaldırmak için Trim Galore sarmalayıcı aracı (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) kullanılmıştır. Illumina Tn5 tarafından hazırlanan ATAC-seq kütüphaneleri için, adaptör dizisi olarak aşağıdaki sıra kullanılır: CTGTCTCTTATACACATCT. Adaptör kontaminasyonunu tanımak için minimum sıra uzunluğu 5 olarak ayarlanır. - Genom haritalama: Aşağıdaki parametreleri kullanarak okumaları Bowtie ile uygun genoma eşleyin "-I 0 -X 2000 -m 1"15. MDA-MB-231 bazal meme kanseri hücrelerinden haritalama kalitesine bir örnek aşağıdadır:
Bildirilen en az bir hizalamayla okumalar: %52,79
Hizalanamayan okumalar: %13,10
-m nedeniyle hizalamaları bastırılmış okumalar: %34,11 - Tekilleştirme: Picard araçları16 ile PCR kopyalarını işaretleyin.
- Veri görselleştirme için bir genom kapsama dosyası oluşturma: Tekkilleştirilmiş çift uçlu okumaları tek uçlu okuma parçalarına dönüştürün. Genom kapsama izleri, genomeCoverageBed kullanılarak yatak aletlerinden elde edilir17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Başarılı ve yüksek kaliteli ATAC-seq verileri elde etmek için, deneysel koşulları optimize etmek önemlidir. ATAC-seq kütüphanesi hazırlığı beş ana adıma ayrılabilir (Şekil 1), yani hücre lizisi, tagmentasyon (Tn5 ile parçalanma ve adaptör yerleştirme), genomik DNA saflaştırma, PCR amplifikasyonu ve veri analizi. İlk işlem olarak, hücre lizisi (nükleer izolasyon) tamponu önce her hücre tipi için optimize edilmelidir. Meme kanseri hücrelerini lize etmek için orijinal ATAC-seq kağıt8'de tanımlanan hipotonik tampon veya CSK tamponu12,13 kullanıldı. Tripan mavisi boyama, çekirdek izolasyonunu doğrulamak için kullanılabilir18. MDA-MB-231, T47D, MCF7 ve A375 hücreleri gibi insan kanser hücresi hatlarında ATAC-seq kütüphanesi hazırlığı için, CSK tamponu birden fazla grup tarafından kullanılmıştır12,13,19,20. CSK tamponu, embriyonik kök hücreler 21,22 ve Drosophila S2 hücreleri23 gibi diğer hücre tiplerinde ATAC-seq kütüphanesinin hazırlanması için de kullanılmıştır. Lizis tamponu optimizasyonu için, Tripan mavisi boyama, hücre lizis verimliliğini değerlendirmek için yararlıdır. Kanserli olmayan fare meme bezi epitel hücreleri olan NMuMG, hipotonik tampon8 (bkz. adım 1) ve CSK tamponu ile tedavi edildiğinde, CSK ile tedavi edilen hücrelerde daha yüksek hücre lizis etkinliği gözlenmiştir (Şekil 2). Dondurulmuş dokular için, Omni-ATAC'ın ATAC-seq sinyalleriniiyileştirdiği gösterilmiştir 24. Omni-ATAC'da, hücre lizisi için% 0.1 NP40,% 0.1 Ara-20 ve% 0.01 Digitonin içeren bir tampon kullanılır. Digitonin bazlı tamponun mitokondriyal DNA fraksiyonunu azalttığı bilinmesine rağmen, CSK tamponlu ATAC-seq'ten sinyal-gürültü oranları ve TSS okuma sayımlarının, meme kanseri hücrelerinde Omni-ATAC'tan daha iyi olduğu gösterilmiştir12. Bu nedenle, bu makalenin geri kalanı esas olarak CSK tamponlu ATAC-seq verilerinden elde edilen sonuçlara odaklanmıştır.
En iyi hücre lizis tamponu (nükleer izolasyon) koşullarının belirlenmesini takiben, giriş hücresi sayısı ile Tn5 transpozaz konsantrasyonu12,25 arasındaki oranların optimize edilmesi önemlidir. Tipik olarak, Tn5 konsantrasyonu, toplam 25 μL reaksiyon karışımı hacminde Tn5'in hacmini 1.25 μL, 2.5 μL'den 5 μL'ye değiştirerek titre edilebilir. Alternatif olarak, giriş hücresi numaraları değiştirilebilir (örneğin, 10.000'den 100.000'e), Tn5 etiketleme reaksiyonunu optimize etmek için Tn5 enzimi değişmeden 2.5 μL'de tutulurken. ATAC-seq kütüphanelerinin kalitesini ve Tn5 kaynaklı kromatin sindiriminin verimliliğini değerlendirmek için, kütüphane PCR ürünleri agaroz jel elektroforezi ile analiz edilebilir. Şekil 3'te başarılı ATAC-seq kitaplıklarının örnekleri gösterilmektedir. Tipik olarak, 8 veya 9 döngünün PCR amplifikasyonu (başlangıç PCR dahil toplam PCR döngüleri) 3-6 ng / μL ATAC-seq kütüphanesi konsantrasyonu ile sonuçlanır. Tn5 tercihen açık kromatinde nükleozomsuz bölgelere "saldırdığından" (Şekil 1), nükleozom merdivenleri jel görüntüsünde belirgin olmalıdır (Şekil 3). Ethidium bromür veya SYBR Gold, agaroz jeli üzerindeki güçlendirilmiş DNA'ları tespit etmek için kullanılabilir.
Daha sonra, ATAC-seq kütüphanelerini kullanarak qPCR analizi, kütüphanelerin kalitesini ve aktif genlerin promotörleri gibi açık kromatin bölgelerindeki fragman zenginleştirmesini kısaca kontrol etmek için kullanılabilir (Şekil 4). Primerler, pozitif kontroller olarak bilinen aktif genlerin promotörlerini ve negatif kontroller olarak bilinen "kapalı" (inaktif) kromatin bölgelerini kullanarak <80 bp amplikonlar üretmek üzere tasarlanabilir (Şekil 4A). Test edilen koşullar arasında, CSK tamponlu T47D ATAC-seq kütüphanelerinde daha yüksek zenginleştirme gözlenmiştir (Şekil 4B). Beklendiği gibi, Östrojen Reseptör alfa (ESR1 ) gen promotör bölgesinde primerler K ve L kullanarak, primer C ile ESR1'in yukarı akışındaki kapalı bir bölgeye göre daha fazla zenginleştirme bulduk (Şekil 4B)26. Şekil 5 , farklı Tn5 konsantrasyonlarına sahip ATAC-seq verilerinin örneklerini göstermektedir (25.000 hücre kullanılmıştır). Bu durumda, en düşük (1.25 μL Tn5) Tn5 koşulunda (Şekil 5, dikey çubuklar) daha yüksek arka plan gürültüsü tespit edildi. Tn5'in 2.5 μL veya 5 μL'sinden gelen ATAC-seq verileri, daha düşük arka plan sinyallerine sahip açık kromatin bölgelerinde benzer seviyelerde ATAC-seq sinyalleri gösterdi. Tn5'in daha yüksek konsantrasyonda potansiyel aşırı sindirimi göz önüne alındığında, 2.5 μL Tn5'in bu hücre tipi için uygun olduğu sonucuna varılabilir.
Ayrıca ATAC-seq'i, epitelyal-mezenkimal geçişi incelemek için sıklıkla kullanılan NMuMG hücrelerinde farklı hücre numaraları kullanarak gerçekleştirdik (Şekil 6). Başlangıç hacmini optimize etmek için, ATAC-seq kitaplık optimizasyonu için dört farklı hücre numarası (25.000, 50.000, 75.000 ve 100.000) kullanılmıştır. Hücreler CSK tamponu ile lize edildi ve çekirdekler, reaksiyon karışımının 25 μL'sinde 2.5 μL Tn5 transpozaz ile inkübe edildi. Tn5 sindiriminin ve nükleozomal merdivenlerin etkinliğini araştırmak için, yerleştirilen DNA'ların boyut dağılımı biyoinformatik olarak analiz edildi (Şekil 6A). Daha düşük hücre sayıları kullanıldığında, nükleozomsuz DNA fragmanları (<100 bp) dizileme verilerinde daha zenginleştirilmiştir. Öte yandan, mono-nükleozomal DNA fragmanlarının (175-225 bp) fraksiyonu, düşük hücre giriş örneklerinde (25.000 hücre ve 50.000 hücre) daha yüksek hücre giriş koşullarına (75.000 hücre ve 100.000 hücre) kıyasla daha azdı. Örnekler arasında diferansiyel DNA fragman paternleri gözlenmesine rağmen, giriş hücresi numarasının promotörlerde ve diğer açık kromatin bölgelerinde ATAC-seq sinyallerinin zenginleşmesi üzerinde minimum etkiye sahip olduğu görülmektedir (Şekil 6B). Giriş hücresi sayılarının aşağı akış analizi üzerindeki etkisini daha fazla araştırmak için, ATAC-seq zirveleri tanımlanmıştır. ATAC-seq zirveleri, PeaKDEck tepe çağrı programı27 tarafından aşağıdaki parametreler kullanılarak belirlenmiştir: -sig 0.0001 -bin 300 -back 3.000 -npBack 2.500.000. Yaklaşık 4.9 milyon benzersiz olarak eşlenmiş okumadan, ATAC-seq verilerinde sırasıyla 25.000, 50.000, 75.000 ve 100.000 hücre girişinden 38.878, 43.832, 41.509 ve 45.530 zirve gözlendi. 100.000 hücreli giriş koşulu en yüksek tepe noktası sayısını gösterdi. ATAC-seq verilerinin kalitesini değerlendirmek için Transkripsiyon Başlangıç Sitesi (TSS) zenginleştirme puanı kullanıldığından, her ATAC-seq koşulunun TSS puanı GitHub programı kullanılarak hesaplanmıştır: Jiananlin/TSS_enrichment_score_calculation28. 25.000, 50.000, 75.000 ve 100.000 hücre giriş koşulları için TSS puanları sırasıyla 9.03, 9.02, 8.82 ve 8.28 idi (TSS zenginleştirme puanı 728'den büyükse ideal kabul edilir). Bu, artan hücre sayıları ile TSS zenginleştirme skorunda kademeli bir düşüşe işaret etti. En büyük tepe sayısı 100.000 hücre giriş koşulunda gözlenirken, 25.000 hücre giriş koşulu daha iyi bir TSS puanı verdi. Homer29 tarafından yapılan tepe ek açıklama analizi, artan piklerin çoğunun promotör distal pikler olarak kategorize edildiğini göstermiştir (Şekil 6C). Bu sonuçlara dayanarak, daha yüksek hücre sayısı girdilerinin daha yüksek sayıda pik üretebileceği ve bu durumda daha düşük hücre numarası girişlerine kıyasla promotör olmayan pikleri daha sık tespit edebileceği sonucuna varılabilir.
Şekil 1: ATAC-seq yönteminin ana hatları. (A) ATAC-seq, ileri ve geri adaptörlerle önceden yüklenmiş hiperaktif bir Tn5 transpozaz kullanarak kromatin erişilebilirliğini ölçer. İşlemdeki çeşitli adımlar arasında (B) hücre lizisi (lizis tamponu bileşiminin optimizasyonu, Tn5'in titrasyonunun ve kullanılan hücre sayısının eklenmesi dahil); (C) transpozisyon (Tn5'in açık/erişilebilir kromatine bağlanması); (D) kromatinin etiketlenmesi; (E) DNA fragmanının saflaştırılması ve kütüphanelerin çoğaltılması ve (F) kütüphanelerin dizilimi ve veri analizi. ATAC-seq kütüphanelerinin parça uzunluğu dağılım analizi tipik olarak ~ 50 bp (nükleozomsuz bölgeler) civarında bir başlangıç zirvesi ve ~ 200 bp'de (mono-nükleozom) başka bir tepe noktası gösterir. Bu nedenle, hesaplamalı veya deneysel boyut filtrasyonu olmadan, ATAC-seq sinyalleri açık kromatinde hem nükleozomsuz hem de nükleozomal bölgeler içerir. BioRender.com ile oluşturuldu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Tripan mavisi kullanılarak hücre lizis etkinliğinin karşılaştırılması . (A) NMuMG hücreleri hipotonik tampon8 ile tedavi edildi ve tripan mavisi ile boyandı. (B) NMuMG hücreleri CSK tamponu ile tedavi edildi ve tripan mavisi ile boyandı. Ölçek çubukları 50 μm'yi gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: ATAC-seq kütüphanelerinin güçlendirilmiş DNA fragman analizi. ATAC-seq kütüphaneleri MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinden hazırlandı. (A) PCR amplifikasyonundan sonra, PCR ürünleri boncuk saflaştırmadan önce ve sonra 0.5x TBE,% 1.5 agaroz jeli üzerinde analiz edildi. Astarlar çoğunlukla ilk boncuk saflaştırma ile uzaklaştırılır. (B) 1x TAE,% 1 agaroz jel elektroforezi ve (C) otomatik bir elektroforezden DNA bant paternleri de endikedir. SYBR Gold, A ve B'de gösterilen DNA fragmanlarını görselleştirmek için kullanıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: ATAC-seq kütüphanelerinin zenginleştirme analizi . (A) ESR1 lokusunu gösteren genom tarayıcı izi. T47D hücreleri20'deki ATAC-seq verilerinin genom kapsamı gösterilmiştir. Önceki bir yayından astarlar26 kullanıldı ve hedef bölgeleri sarı renkle vurgulandı. (B) ATAC-seq kütüphanelerinde primer amplikon zenginleştirmesini gösteren çubuk grafik. ATAC-seq kütüphaneleri hipotonik tampon veya CSK tamponu ile hazırlandı. ATAC-seq kütüphaneleri oluşturmak için farklı Tn5 konsantrasyonları da kullanılmıştır. qPCR gerçekleştirmek için her kütüphanenin 1 ng'si kullanıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: ATAC-seq optimizasyonu için genom tarayıcı görselleştirmesi. Kütüphane hazırlığı sırasında farklı miktarlarda Tn5 transpozaz eklenmiştir. 1,25 μL Tn5 koşulu daha yüksek arka plan sinyalleri gösterir (sarı renkle vurgulanır), diğer iki koşul ise benzer görünür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: ATAC-seq kütüphanelerinin DNA fragman boyutu dağılımı. (A) ATAC-seq kütüphaneleri belirtilen hücre sayıları kullanılarak hazırlanmıştır. 25.000 hücre giriş koşulundan elde edilen ATAC-seq verileri, nükleozomsuz fragmanların en yüksek zenginleşmesini gösterirken, 100.000 hücre giriş koşulu en yüksek mono-nükleozomal DNA'ları sundu. (B) Farklı hücre numaralarından ATAC-seq verilerini gösteren genom tarayıcı izleri. (C) Homer tepe ek açıklama analizi. Her pik Homer29 tarafından promotör-proksimal veya distal tepe olarak sınıflandırıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Ad | Sıra |
| ESR1 C İleri | TGGTGACTCATATTTGAACAAGCC |
| ESR1 C Ters | CTCCTCCGTTGAATGTGTCTCC |
| ESR1 K İleri | TGTGGCTGGCTGCGTATG |
| ESR1 K Ters | TGTCTCTCTCTCTGTTTGATTCCC |
| ESR1 L İleri | TGTGCCTGGAGTGATGTTTAAG |
| ESR1 L Ters | CATTACAAAGGTGCTGGAGGAC |
Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan primerlerin listesi.
| Adım -ları | Sıcaklık | Saat | Devir |
| Boşluk doldurma | 72 °C | 5 dk | 1 |
| İlk Denatürasyon | 98 °C | 30 Saniye | 1 |
| Denatürasyon | 98 °C | 10 Saniye | 5 |
| Tavlama | 63 °C | 30 Saniye | |
| Uzantı | 72 °C | 1 dk | |
| Tutmak | 4 °C | ebediyen |
Tablo 2: PCR amplifikasyon programı bölüm 1.
| Adım -ları | Sıcaklık | Devir |
| İlk Denatürasyon | 98 °C 30 sn. | 1 |
| Denatürasyon | 98 °C 10 sn. | 20 |
| Tavlama | 63 °C 30 sn. | |
| Uzantı | 72 °C 1 dk | |
| Plaka okuma |
Tablo 3: qPCR ayarları.
| Adım -ları | Sıcaklık | Saat | Devir |
| İlk Denatürasyon | 98 °C | 30 Saniye | 1 |
| Denatürasyon | 98 °C | 10 Saniye | Adım 6.4'te hesaplanan toplam döngüler |
| Tavlama | 63 °C | 30 Saniye | |
| Uzantı | 72 °C | 1 dk | |
| Tutmak | 4 °C | ebediyen |
Tablo 4: PCR amplifikasyon programı bölüm 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ATAC-seq, açık ve aktif kromatin bölgelerini haritalamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Kanser hücresi ilerlemesi sıklıkla genetik değişiklikler ve epigenetik yeniden programlama tarafından yönlendirilir, bu da kromatin erişilebilirliğinin ve gen ekspresyonunun değişmesine neden olur. Bu yeniden programlamanın bir örneği, tümör metastazı30 sırasında anahtar hücresel yeniden programlama süreçleri olduğu bilinen epitel-mezenkimal geçiş (EMT) ve ters süreci olan mezenkimal - epitel geçişi (MET) sırasında görülür. Bir başka örnek ise luminal meme tümörlerinde sıklıkla gözlenen hormon tedavilerine karşı ilaç direncinin kazanılmasıdır31. ATAC-seq, kromatin seviyesinde bu tür hücre fenotipik değişikliklerini izlemek için yararlıdır ve bir menşe hücreyi ve kanser alt tiplerini tahmin etmek için kullanılabilir4.
ATAC-seq ile kromatin yeniden şekillenmesini hassas bir şekilde ölçmek için, tekrarlanabilir ve tutarlı bir protokolün oluşturulması gereklidir. Bu yazıda, ATAC-seq kütüphane optimizasyonu için standart bir strateji açıklanmaktadır. MDA-MB-231 ve NMuMG hücre hatlarından gelen ATAC-seq verileri, optimizasyon işlemlerine örnek olarak kullanılır. EMT'yi incelemek için NMuMG hücreleri kullanılmıştır ve MDA-MB-231 hücreleri ters süreci olan MET'i incelemek için kullanılmıştır. Bu hücresel modeller daha önce EMT ve MET13,32 sırasında epigenetik değişiklikleri incelemek için kullanılmıştır. Hücre lizisi ve Tn5 konsantrasyonu için uygun bir tamponun kullanılması, başarılı ATAC-seq kütüphanesi hazırlığının temel bileşenidir. Bu bileşenlere ek olarak, hücre canlılığının yüksek bir yüzdesi (>% 90), lizis tamponunda uygun deterjan konsantrasyonları ve tek hücreli süspansiyonun hazırlanması da çok önemlidir. Tn5 çürütme verimliliği numuneler arasında önemli ölçüde farklı olduğunda, veri varyasyonlarını düzeltmek zordur. Bunun nedeni, sindirim verimliliğini nicel olarak değerlendirmek için iç ve dış kontrollerin eksikliğidir. Hücresel özellikler veya özellikler, kontrol grubundaki hücreler ile test grubundaki hücreler arasında da farklı olabilir. Bu nedenle, lizis tamponu seçimi de dahil olmak üzere deneysel koşulların dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi, her iki deney grubundan da yüksek kaliteli ATAC-seq verileri elde etmek için gereklidir (Şekil 5 ve Şekil 6).
Açık kromatin profillemesinin yanı sıra, ATAC-seq, transkripsiyon faktörü ayak izlerini ve nükleozom konumlandırmasını tanımlamak için kullanılmıştır 8,33. Bu tür bilgilerin çoğunlukla açık kromatin bölgelerinden türetildiğine dikkat etmek önemlidir (Şekil 1F). Bu nedenle, sonuçlar açık kromatin bölgelerine doğru önyargılı olacaktır. Bununla birlikte, ATAC-seq, kromatin mimarisini incelemek için güçlü bir araçtır. Bu devrim niteliğindeki araç, yakın zamanda tek hücreli genomik için benimsenmiştir ve gen düzenlemesi ve kromatin biyolojisi hakkındaki anlayışımızı geliştirmeye katkıda bulunmaya devam etmektedir.
VERİ KULLANILABİLİRLİĞİ:
Bu protokolde sunulan veriler, GSE202791 Katılım Numarası altında Gen İfade Omnibus'ta mevcuttur. Analizde GSE72141 ve GSE99479'dan elde edilen ATAC-seq verileri de kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, bu makalede açıklanan araştırmalarla ilgili ilgili veya maddi finansal çıkarların olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
UND Genomics Core tesisine olağanüstü teknik yardım için minnettarız.
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri [P20GM104360 - M.T., P20 GM104360 - AD] ve Kuzey Dakota Üniversitesi Tıp ve Sağlık Bilimleri Fakültesi, Biyomedikal Bilimler Bölümü [MT'ye] tarafından sağlanan başlangıç fonları tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-3810 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1182-1830 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-1840 | Filtered and low-retention. Beveled Grade |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | |
| 20 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1183-1810 | Filtered and low-retention |
| 200 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1180-8810 | Filtered and low-retention |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Fisherbrand | 06-443-19 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Genetic Analysis Grade |
| All the cell lines used in this study are obtained from ATCC | ATCC | ||
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Bead purification kit |
| CellDrop Cell Counter | DeNovix | CellDrop FL | Cell counter |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| Ethanol 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Anhydrous; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products |
| Fetal Bovine Serum - TET Tested | R&D Systems | S10350 | Triple 0.1 µm filtered |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Gibco Trypsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0.25%), phenol red |
| Glycerol | IBI Scientific | 56-81-5 | |
| Glycine | MilliporeSigma | G8898 | |
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous) |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD and Tn5 Transposase |
| NP - 40 (IGEPAL CA-630) | MilliporeSigma | I8896 | for molecular biology |
| PCR Detection System | BioRad | 1855484 | CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler |
| PIPES | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance Certified, suitable for cell culture |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit |
| Quibit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| Sodium Acetate | Homemade | - | pH 5.2 |
| Sucrose | IBI Scientific | 57-50-1 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Green Supermix, 1.25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips | USA Scientific | 1402-4700 | Flex-free, natural, polypropylene |
| TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | Single notch. Natural polypropylene |
| Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Grade |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit | Illumina | PE-121-1003 | paired-end |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, viscous liquid |
| Water | MilliporeSigma | W3500 | sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
References
- Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
- Liu, Y. Clinical implications of chromatin accessibility in human cancers. Oncotarget. 11 (18), 1666-1678 (2020).
- Sanghi, A., et al. Chromatin accessibility associates with protein-RNA correlation in human cancer. Nature Communications. 12 (1), 5732 (2021).
- Corces, M. R., et al. The chromatin accessibility landscape of primary human cancers. Science. 362 (6413), (2018).
- Boyle, A. P., et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome. Cell. 132 (2), 311-322 (2008).
- Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
- Pardo, C. E., Nabilsi, N. H., Darst, R. P., Kladde, M. P. Integrated DNA methylation and chromatin structural analysis at single-molecule resolution. Methods in Molecular Biology. 1288, 123-141 (2015).
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. , 1 (2015).
- Mehrmohamadi, M., Sepehri, M. H., Nazer, N., Norouzi, M. R. A comparative overview of epigenomic profiling methods. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 714687 (2021).
- Fujiwara, S., Baek, S., Varticovski, L., Kim, S., Hager, G. L. High quality ATAC-Seq data recovered from cryopreserved breast cell lines and tissue. Scientific Reports. 9 (1), 516 (2019).
- Takaku, M., et al. GATA3-dependent cellular reprogramming requires activation-domain dependent recruitment of a chromatin remodeler. Genome Biology. 17, 36 (2016).
- Rohland, N., Reich, D. C. ost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), 25 (2009).
- Picard Toolkit Broad Institute, GitHub Repository. , Available from: https://broadinstitute.github.io/picard/ (2022).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
- Zhou, B., et al. INO80 governs superenhancer-mediated oncogenic transcription and tumor growth in melanoma. Genes & Development. 30 (12), 1440-1453 (2016).
- Takaku, M., et al. GATA3 zinc finger 2 mutations reprogram the breast cancer transcriptional network. Nature Communications. 9 (1), 1059 (2018).
- Oldfield, A. J., et al. NF-Y controls fidelity of transcription initiation at gene promoters through maintenance of the nucleosome-depleted region. Nature Communications. 10 (1), 3072 (2019).
- Langer, L. F., Ward, J. M., Archer, T. K. Tumor suppressor SMARCB1 suppresses super-enhancers to govern hESC lineage determination. Elife. 8, 45672 (2019).
- Elrod, N. D., et al. The integrator complex attenuates promoter-proximal transcription at protein-coding genes. Molecular Cell. 76 (5), 738-752 (2019).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Porter, J. R., et al. Global inhibition with specific activation: How p53 and MYC redistribute the transcriptome in the DNA double-strand break response. Molecular Cell. 67 (6), 1013-1025 (2017).
- Dhasarathy, A., Kajita, M., Wade, P. A. The transcription factor snail mediates epithelial to mesenchymal transitions by repression of estrogen receptor-alpha. Molecular Endocrinology. 21 (12), 2907-2918 (2007).
- McCarthy, M. T., O'Callaghan, C. A. PeaKDEck: A kernel density estimator-based peak calling program for DNaseI-seq data. Bioinformatics. 30 (9), 1302-1304 (2014).
- Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nature Protocols. 7 (6), 1518-1552 (2022).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Garcia-Martinez, L., Zhang, Y., Nakata, Y., Chan, H. L., Morey, L. Epigenetic mechanisms in breast cancer therapy and resistance. Nature Communications. 12 (1), 1786 (2021).
- Bhattacharya, A., et al. The calcium channel proteins ORAI3 and STIM1 mediate TGF-β induced Snai1 expression. Oncotarget. 9 (50), 29468-29483 (2018).
- Schep, A. N., et al. Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions. Genome Research. 25 (11), 1757-1770 (2015).
