Summary
هنا ، يتم تقديم طريقة سهلة المتابعة لزراعة الخلايا الظهارية الصبغية الصبغية الأولية في المختبر في المختبر .
Abstract
ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) هي طبقة أحادية من الخلايا الظهارية المصطبغة المستقطبة ، وتقع بين المشيمية والشبكية العصبية في شبكية العين. يتم إجراء وظائف متعددة ، بما في ذلك البلعمة ، ونقل المغذيات / الأيض ، واستقلاب فيتامين أ ، وما إلى ذلك ، بواسطة RPE على أساس يومي. خلايا RPE هي خلايا ظهارية متمايزة نهائيا ذات قدرة تجدد قليلة أو معدومة. يؤدي فقدان خلايا RPE إلى أمراض عيون متعددة تؤدي إلى ضعف البصر ، مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر. لذلك ، فإن إنشاء نموذج زراعة في المختبر لخلايا RPE الأولية ، والتي تشبه إلى حد كبير RPE في الجسم الحي أكثر من خطوط الخلايا ، أمر بالغ الأهمية للدراسات المميزة والميكانيكية لخلايا RPE. بالنظر إلى حقيقة أن مصدر مقل العيون البشرية محدود ، فإننا ننشئ بروتوكولا لزراعة خلايا RPE الخنازير الأولية. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن فصل خلايا RPE بسهولة عن مقل عيون الخنازير البالغة. بعد ذلك ، تلتصق هذه الخلايا المنفصلة بأطباق / إدخالات الثقافة ، وتتكاثر لتشكل طبقة أحادية متقاربة ، وتعيد بسرعة إنشاء السمات الرئيسية للأنسجة الظهارية في الجسم الحي في غضون 2 أسبوع. بواسطة qRT-PCR ، ثبت أن خلايا RPE الخنازير الأولية تعبر عن جينات توقيع متعددة بمستويات مماثلة مع أنسجة RPE الأصلية ، في حين أن تعبيرات معظم هذه الجينات تضيع / تنخفض بشكل كبير في الخلايا البشرية الشبيهة ب RPE ، ARPE-19. علاوة على ذلك ، يظهر تلطيخ التألق المناعي توزيع الوصلة الضيقة ، وقطبية الأنسجة ، وبروتينات الهيكل الخلوي ، بالإضافة إلى وجود RPE65 ، وهو إيزوميراز مهم لعملية التمثيل الغذائي لفيتامين أ ، في الخلايا الأولية المستزرعة. إجمالا ، قمنا بتطوير نهج سهل المتابعة لزراعة خلايا RPE الخنازير الأولية ذات النقاء العالي وميزات RPE الأصلية ، والتي يمكن أن تكون بمثابة نموذج جيد لفهم فسيولوجيا RPE ، ودراسة سمية الخلايا ، وتسهيل فحوصات الأدوية.
Introduction
تقع ظهارة صبغة الشبكية (RPE) بين المستقبلات الضوئية والمشيمية الشعرية في الطبقة الخارجية من الشبكية1 مع وظائف متعددة ، بما في ذلك تشكيل حاجز الدم والشبكية ، ونقل وتبادل العناصر الغذائية ومستقلبات الشبكية ، وإعادة تدوير فيتامين أ للحفاظ على دورة بصرية طبيعية ، والبلعمة وإزالة الأجزاء الخارجية للمستقبلات الضوئية (POSs)2,3 . نظرا لأن نقاط البيع تتطلب تجديدا ذاتيا مستمرا لتوليد الرؤية ، فإن خلايا RPE تحتاج إلى ابتلاع نقاط البيع المنفصلة باستمرار للحفاظ على توازن الشبكية4. لذلك ، يؤدي الخلل الوظيفي في RPE إلى العديد من أمراض العيون المسببة للعمى ، مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD)4 ، التهاب الشبكية الصباغي (RP)5 ، داء ليبر الخلقي6 ، اعتلال الشبكية السكري7 ، إلخ. حتى الآن ، لا يزال التسبب الدقيق لمعظم هذه الأمراض بعيد المنال. نتيجة لذلك ، تم إنشاء ثقافة خلايا RPE لدراسة بيولوجيا خلية RPE ، والتغيرات المرضية ، والآليات الأساسية.
كأبسط نموذج لدراسة بيولوجيا الخلية ، بدأت ثقافة خلايا RPE في وقت مبكر من 1920s8. على الرغم من أن ARPE-19 يستخدم على نطاق واسع كخلايا RPE ، إلا أن فقدان التصبغ ، ومورفولوجيا الحصى ، وخاصة وظائف الحاجز في خط الخلية هذا تثير الكثير من المخاوف9. وبالمقارنة ، فإن ثقافة خلايا RPE البشرية الأولية تقدم سيناريو أكثر واقعية للدراسات الفسيولوجية والمرضية9. ومع ذلك ، فإن التوافر المحدود نسبيا يقيد استخدامها والقضايا الأخلاقية موجودة دائما. بالإضافة إلى ذلك ، استخدمت عدة مجموعات نماذج الماوس لزراعة خلايا RPE. ومع ذلك ، فإن حجم عين الفأر صغير ، وعادة ما تتطلب ثقافة واحدة العديد من الفئران ، وهو أمر غير مناسب9. في الآونة الأخيرة ، طور العلماء طرقا جديدة لاستخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية أو الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات لاشتقاق خلايا RPE. على الرغم من أن هذه التقنية لها إمكانات خاصة لعلاج اضطرابات RPE الموروثة ، إلا أنها تستغرق وقتا طويلا وعادة ما تتطلب عدة أشهر لتوليد خلايا RPE الناضجة10. للتغلب على هذه المشاكل ، نقدم هنا بروتوكولا سهل المتابعة لعزل وزراعة خلايا RPE عالية النقاء في المختبر بشكل روتيني. في ظل ظروف الثقافة المناسبة ، يمكن لهذه الخلايا عرض وظائف RPE النموذجية وإظهار أشكال RPE النموذجية. لذلك ، يمكن أن توفر طريقة الاستزراع هذه نموذجا جيدا لفهم فسيولوجيا RPE ، ودراسة السمية الخلوية ، والتحقيق في الآليات المرضية لأمراض العين ذات الصلة ، وإجراء فحوصات الأدوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
امتثل استخدام التجارب للوائح جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون (ARVO) وتمت الموافقة عليه من قبل لجنة أخلاقيات إدارة التجارب بجامعة شيامن.
1. تحضير الأجهزة الجراحية التجريبية ، وإنزيم هضم الأنسجة ، ومخزن زراعة الخلايا
- قم بإعداد الأجهزة الجراحية التجريبية ، عن طريق تنظيف وتعقيم زوجين من المقصات والملقط الجراحي للعيون في اليوم السابق لتشريح مقلة العين ، وبعد ذلك تجفيف الصندوق بالأجهزة الجراحية في فرن بروتوكول عام عند 65 درجة مئوية طوال الليل.
- الإعداد الإعلامي الثقافي.
- تحضير DMEM / الوسائط الأساسية المكملة ب 10٪ (v / v) مصل بقري جنيني ، 2 مليمتر L-جلوتامين ، و 1٪ (v / v) بنسلين (100 وحدة / مل) وستربتومايسين (100 وحدة / مل).
- تحضير وسائط DMEM / F12 المكملة ب 1٪ (v / v) FBS ، و 1٪ (v / v) البنسلين (100 وحدة / مل) والستربتومايسين (100 وحدة / مل).
- تحضير MEM-Nic 11 ، عن طريق تكملة MEM alpha ب 2 mM L-glutamine ، 1٪ FBS ، 1٪ (v / v) البنسلين (100 وحدة / مل) والستربتومايسين (100 وحدة / مل) ، 0.1 mM NEAA ، 1٪ (v / v) N1 الملحق ، توراين (0.25 ملغ / مل) ، هيدروكورتيزون (20 نانوغرام / مل) ، ثلاثي يودو ثيرونين (0.013 نانوغرام / مل) ، و10 مللي متر نيكوتيناميد.
ملاحظة: لتحسين صلاحية الخلية وتكاثرها ، يمكن زيادة النسبة المئوية ل FBS إلى 20٪ لتحييد إنزيمات الهضم وزرع الخلايا المنفصلة. بالنسبة لزراعة الخلايا على المدى الطويل ، يمكن تقليل النسبة المئوية ل FBS إلى 1٪ 12.
- قم بإذابة حصة إنزيم هضم الأنسجة (0.25٪ (وزن / حجم) محلول تربسين / EDTA مكمل ب 0.91 mM EDTA ، يشار إليه فيما يلي باسم محلول Trypsin / EDTA) أثناء التجربة.
ملاحظة: يجب استخدام محلول Fresh Trypsin / EDTA في كل مرة للحصول على أفضل النتائج. احصل على 10 مل من محلول Trypsin / EDTA الطازج في كل أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل وقم بتجميد القسمة في ثلاجة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. - حل التشريح.
- تعقيم 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (درجة الحموضة 7.2) مكمل ب 2٪ (v / v) البنسلين (100 وحدة / مل) والستربتومايسين (100 وحدة / مل) عن طريق تصفية المحلول من خلال وحدة تصفية حقنة 0.22 ميكرومتر.
- معطف لوحات الثقافة وإدراج transwell.
- اغسل الآبار وإدراج transwell مع 1x PBS. قم بإزالة PBS من الآبار و transwells باستخدام ماصة ، ثم أضف 1 مل من 1x PBS الطازج إلى الغرفة السفلية و 600 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل من محلول الصفيحة إلى الغرفة العلوية.
- احتضان الألواح / إدخالات transwell في حاضنة زراعة الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. قم بإزالة محلول اللامينين من الغرفة العلوية واغسله ب 1 مل من 1x PBS البارد مرتين قبل بذر الخلايا.
2. تشريح خلايا RPE مقلة العين الخنازير
- إعداد الصكوك.
- نظف غطاء التدفق الصفحي بنسبة 75٪ من الإيثانول وضوء الأشعة فوق البنفسجية. قم بإعداد ثلاثة أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 50 مل تحتوي على ~ 25 مل من الإيثانول بنسبة 75٪ ، وثلاثة أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 50 مل تحتوي على ~ 25 مل من 1x PBS ، وثلاثة أطباق زراعة خلايا معقمة مقاس 10 سم تحتوي على ~ 15 مل من 1x PBS.
ملاحظة: عادة ما تستخدم هذه الإعدادات لتشريح أربعة مقل عيون خنازير. يرجى توسيع نطاقها عند استخدام المزيد من مقل العيون. لتحسين صلاحية الخلية ، قم بتبريد 1x PBS على الجليد لمدة 30 دقيقة على الأقل. كل من 75٪ من الإيثانول والأشعة فوق البنفسجية ضروريان لضمان عدم تلوث الأدوات والخلايا التجريبية. قم بتشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية مسبقا لتعقيم طاولة التشغيل بالكامل لمدة 15 دقيقة على الأقل.
- نظف غطاء التدفق الصفحي بنسبة 75٪ من الإيثانول وضوء الأشعة فوق البنفسجية. قم بإعداد ثلاثة أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 50 مل تحتوي على ~ 25 مل من الإيثانول بنسبة 75٪ ، وثلاثة أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 50 مل تحتوي على ~ 25 مل من 1x PBS ، وثلاثة أطباق زراعة خلايا معقمة مقاس 10 سم تحتوي على ~ 15 مل من 1x PBS.
- تنظيف مقل العيون الخنازير.
- الحصول على مقل العيون الطازجة من المسلخ والاحتفاظ بها على الجليد حتى تشريح. انقع أربعة مقل عيون خنزير في ~ 15 مل من الإيثانول بنسبة 75٪ في طبق بتري 10 سم واستخدم مقصا وملقطا لقطع جميع الأنسجة الضامة والعضلات المتبقية.
ملاحظة: قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة من خارج الصلبة لتقليل التلوث. لا تقطع العصب البصري في هذا الوقت لتسهيل نقل مقل العيون أثناء خطوة إزالة التلوث والغسيل. بعد هذه الخطوة ، يجب تنفيذ جميع الإجراءات في غطاء تدفق رقائقي.
- الحصول على مقل العيون الطازجة من المسلخ والاحتفاظ بها على الجليد حتى تشريح. انقع أربعة مقل عيون خنزير في ~ 15 مل من الإيثانول بنسبة 75٪ في طبق بتري 10 سم واستخدم مقصا وملقطا لقطع جميع الأنسجة الضامة والعضلات المتبقية.
- تطهير مقل عيون الخنازير عن طريق نقع وغسل أربعة مقل عيون خنزير في ثلاثة أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 50 مل مملوءة بنسبة 75٪ من الإيثانول بطريقة متسلسلة ؛ يتم غمس كل مقلة عين لمدة 5 دقائق على الأقل في كل أنبوب. بعد ذلك ، اغسل مقل عيون الخنازير في ثلاثة أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 50 مل مملوءة ب 1x PBS بطريقة متسلسلة ؛ اغسل كل مقلة عين لمدة 5 دقائق على الأقل في كل أنبوب (الشكل 1 أ). اقلب الأنابيب كل دقيقة لغسل مقل العيون جيدا.
- تشريح مقل العيون الخنازير.
- انقل مقل العيون الخنازير الأربعة إلى طبق زراعة خلايا معقمة مقاس 10 سم يحتوي على 1x PBS. قم بقص السطح الخارجي لكل مقلة عين مرة أخرى لإزالة العصب البصري والحطام الصغير (الشكل 1 ب). استخدم المقص لعمل قطع صغير عند تقاطع الحافة والصلبة ، ثم قم بإزالة القرنية والقزحية والعدسة والجسم الزجاجي والشبكية العصبية (للحصول على الهياكل التفصيلية لهذه الأنسجة ، يرجى الرجوع إلى الشكل 1).
- انقل مركب RPE-choroid-sclera إلى طبق زراعة خلايا جديد بطول 10 سم وقم بعمل أربع قطع لتسطيح فنجان العين على شكل برسيم من أربع أوراق (الشكل 1C).
- قم بإجراء عملية هضم محلول التربسين / EDTA عن طريق وضع مجمعات RPE-choroid-sclera الأربعة في طبق جديد بحجم 10 سم. صب 20 مل من محلول Trypsin / EDTA الطازج لدمج مجمعات RPE-choroid-sclera ووضع الطبق في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ~ 30 دقيقة.
ملاحظة: استخدم محلول Trypsin/EDTA الجديد لفصل خلايا RPE. تحكم بعناية في وقت هضم محلول التربسين / EDTA ، حيث أن وقت الحضانة الأطول (أكثر من 30 دقيقة) قد يزيد من تلوث أنواع أخرى من الخلايا.
3. عزل وثقافة خلايا RPE مقلة العين الخنازير
- تفكك RPE.
- أخرج الطبق من الحاضنة بعد 30 دقيقة من الحضانة بمحلول Trypsin / EDTA وأضف 20 مل من وسائط الاستزراع الدافئة مسبقا (مع 10٪ FBS) إلى الطبق لتحييد محلول Trypsin / EDTA.
ملاحظة: في هذه الخطوة، يتم استخدام وسائط DMEM/Basic فقط. عندما تصل الخلايا إلى نقطة التقاء ، يمكن استخدام ثلاثة وسائط استزراع اعتمادا على الظروف التجريبية: DMEM / الوسائط الأساسية ، وسائط DMEM / F12 ، ووسائط MEM-Nic. - استخدم ماصة نقل سعة 5 مل لفصل خلايا RPE عن طريق السحب برفق عدة مرات. اجمع معلقات الخلايا في أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل. استخدم 10 مل أخرى من وسائط الاستزراع الطازجة (10٪ FBS) لغسل مجمعات RPE-choroid-sclera على الطبق عن طريق السحب برفق للحصول على أكبر عدد ممكن من خلايا RPE.
ملاحظة: لا تسحن الخلايا بقوة كبيرة. تأكد من ملء وتفريغ الماصة بمعدل حوالي 3 مل / ثانية. تجنب فقاعات تعليق الخلية.
- أخرج الطبق من الحاضنة بعد 30 دقيقة من الحضانة بمحلول Trypsin / EDTA وأضف 20 مل من وسائط الاستزراع الدافئة مسبقا (مع 10٪ FBS) إلى الطبق لتحييد محلول Trypsin / EDTA.
- اجمع خلايا RPE عن طريق طرد الأنابيب بالطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بشفط المادة الطافية باستخدام ماصة وأضف 5 مل أخرى من وسائط الاستزراع (10٪ FBS) لإعادة تعليق الخلايا وأجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق أخرى. صب المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا ب 12 مل من وسائط الثقافة.
ملاحظة: عند استنشاق المادة الطافية، اترك حوالي 1 مل من الوسائط لتجنب كسر كتل الخلايا. - بذر خلايا RPE.
- البذور ~ 1-2 × 105 خلايا / بئر في 12 لوحة ثقافة بئر أو إدراج transwell. عادة ، يتم الحصول على حوالي 1.5 × 106 خلايا RPE من أربعة مقل عيون خنازير. قم بتغيير وسائط الاستزراع كل يومين وتقليل تركيز المصل إلى 1٪ عندما تغطي الخلايا سطح الآبار / الإدخالات بالكامل.
ملاحظة: لا تحرك طبق زراعة الخلايا بشكل متكرر قبل أن تلتصق الخلايا بصحن / إدخالات الثقافة.
- البذور ~ 1-2 × 105 خلايا / بئر في 12 لوحة ثقافة بئر أو إدراج transwell. عادة ، يتم الحصول على حوالي 1.5 × 106 خلايا RPE من أربعة مقل عيون خنازير. قم بتغيير وسائط الاستزراع كل يومين وتقليل تركيز المصل إلى 1٪ عندما تغطي الخلايا سطح الآبار / الإدخالات بالكامل.
- تغيير وسائط الثقافة كل 2 أيام حتى يتم حصاد الخلايا.
ملاحظة: يمكن تقليل تركيز FBS بعد وصول الخلايا إلى نقطة التقاء، ويمكن استزراع الخلايا لمدة تصل إلى عدة أشهر للسماح بالتمايز والنضج الكاملين.
4. توصيف خلايا RPE الخنازير الأولية
- استزرع الخلايا عند التقاء لمدة 1 أو 2 أسبوع ، ثم احصد الخلايا لمزيد من التحليل.
- خلايا الحصاد لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR).
- قم بإزالة وسائط الاستزراع ، واغسل الخلايا ب 1 مل من 1x PBS البارد ، ثم أضف 500 ميكرولتر من محلول استخراج الحمض النووي الريبي في كل بئر لجمع محللة الخلية من حوالي 1 × 106 خلايا.
- استخراج mRNA13 ؛ يتم استخراج ما يقرب من 4 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي من كل عينة. استخدم 100 نانوغرام من mRNA لإجراء النسخ العكسي14 ؛ قم بتخفيف cDNA 40 ضعفا لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي. يتم سرد الاشعال في الجدول 1.
- خلايا الحصاد لتلطيخ المناعي.
- قم بإزالة وسائط المزرعة ، واغسل الخلايا ب 1 مل من 1x PBS البارد ، ثم أضف 500 ميكرولتر من 4٪ (وزن / حجم) بارافورمالدهيد في 1x PBS لإصلاح الخلايا (حوالي 1 × 106 خلايا / بئر) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، اغسل الخلايا باستخدام 1x PBS مرتين وقم بإجراء تلطيخ المناعي بالأجسام المضادة الأولية (1: 100 في 1x PBS مكملة ب 1٪ (وزن / صوت) ألبومين مصل البقري) عند 4 درجات مئوية طوال الليل والأجسام المضادة الثانوية (1: 200 في 1x PBS تستكمل ب 1٪ (وزن / حجم) ألبومين مصل البقري) في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة وفقا للبروتوكولات عبر الإنترنت15.
- يتم الحصول على صور التألق المناعي بواسطة مجهر متحد البؤر يتبع الدليل عبر الإنترنت16.
- خلايا الحصاد لتحليل اللطخة الغربية.
- قم بإزالة وسائط الاستزراع ، واغسل الخلايا ببارد 1x PBS مرتين ، ثم أضف 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت RIPA (مع 1x مثبط الأنزيم البروتيني) في كل بئر واستخدم كاشطات الخلايا لخدش حوالي 1 × 106 خلايا من الأطباق / الإدراجات.
- اجمع محللة الخلية من كل بئر / أدخلها في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. غلي تحلل الخلية لمدة 10 دقائق ثم قم بقياس تركيزات البروتين باستخدام مجموعات BCA ؛ تركيز البروتين لكل عينة حوالي 2 ملغ / مل. استخدم 25 ميكروغرام من البروتينات لكل عينة لتحليل اللطخة الغربية وفقا للبروتوكولات عبر الإنترنت17.
- بالنسبة للبقع الغربية ، قم باحتضان الأغشية في 5 مل من محلول الأجسام المضادة الأولية (1: 1000 تخفيف من الأجسام المضادة الأولية في محلول 1x TBST مكمل ب 5٪ (وزن / حجم) ألبومين مصل بقري) عند 4 درجات مئوية طوال الليل على شاكر دوار متعدد الأغراض.
- بعد ذلك ، احتضن الغشاء بحوالي 15 مل من محلول الأجسام المضادة الثانوي المضاد للأرانب أو الفئران (1: 5000 تخفيف للأجسام المضادة الثانوية في محلول 1x TBST المكمل ب 5٪ (وزن / حجم) حليب خالي الدسم) في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة على شاكر مداري ، وفقا لمصدر الجسم المضاد الأولي المستخدم.
- قياس المقاومة عبر الظهارة (TER).
- اغسل أقطاب عود تناول الطعام بنسبة 70٪ من الإيثانول و 1x PBS المعقمة بطريقة متسلسلة. ثم ضع الطرف الأقصر للقطب في الغرفة العلوية والطرف الأطول في الغرفة السفلية لإدخالات transwell وانقر فوق الزر الموجود على مقياس الفولتميتر الظهاري للقياسات. سجل قياسات TER لكل بئر في ثلاث نسخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم استزراع خلايا RPE الخنازير الأولية (pRPE) في وسائط DMEM / Basic بنسبة 10٪ FBS ، وتم تصوير مورفولوجيا الخلية تحت المجهر الضوئي في يومين (الشكل 2A) و 6 أيام (الشكل 2B) و 10 أيام (الشكل 2C) بعد البذر. بعد 1 أسبوع ، لوحظت طبقة أحادية متقاربة من خلايا pRPE المصطبغة مع مورفولوجيا مرصوفة بالحصى.
لتوصيف خلايا pRPE الأولية بشكل أفضل ، تم زراعة خلايا RPE البشرية الأولية (hRPE) في الممر 3 (P3) 18 وخلايا ARPE-19 في وسائط DMEM / Basic مع 1٪ FBS لأسبوع آخر ، ثم تم حصاد إجمالي mRNA وبروتين الخلايا المستزرعة ، وكذلك أنسجة RPE / المشيمية الخنازير. تم تقييم مستويات التعبير عن الجينات المميزة الرئيسية19 وعلامات البروتين ل RPE الناضجة بواسطة qRT-PCR واللطخة الغربية. بالمقارنة مع خلايا ARPE-19 ، احتفظت خلايا pRPE بمستويات تعبير أعلى بكثير من الجينات التي تعمل في إفراز RPE الأصلي (الشكل 3A (c)) ، البلعمة (الشكل 3A (i)) ، النقل (الشكل 3A (a) ، (d)) ، الوصلات الضيقة (الشكل 3A (j)) ، تشكيل الحاجز (الشكل 3A (b)) ، وكذلك الدورة البصرية (الشكل 3A (e) ، B). ومع ذلك ، كانت مستويات التعبير عن Krt8 و Krt18 ، وهما جينان من علامات الهيكل الخلوي ل RPE ، أقل بكثير في خلايا pRPE الأولية مقارنة بخلايا hRPE و ARPE-19 الأولية (الشكل 3A (g) ، (h)). علاوة على ذلك ، كان itgav ، الذي يشارك في البلعمة ، أقل في خلايا pRPE الأولية أيضا (الشكل 3A (f)). نظرا لأن مستويات التعبير عن هذه الجينات الثلاثة في خلايا pRPE كانت متشابهة مع أنسجة RPE / المشيمية الخنازير ، فقد يشير ذلك إلى اختلافات التعبير الجيني بين الأنواع. علاوة على ذلك ، انخفض مستوى تعبير صور ، المسؤول عن إنتاج الميلانين ، بشكل كبير في كل من خلايا pRPE الأولية و hRPE (الشكل 3A (k)) ، مما قد يفسر فقدان التصبغ في الخلايا المستزرعة على المدى الطويل. قد تكون الاختلافات في نتائج qRT-PCR التي لوحظت في بيانات خلايا pRPE البشرية وخلايا pRPE الخنازير بسبب التخزين الأطول ورقم المرور الأعلى (P3) ل pRPE البشري ، مما يشير إلى فقدان أحرف RPE في الزراعة الفرعية. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت اللطخة الغربية أن بروتين RPE65 ، وهو إنزيم رئيسي في الدورة البصرية التي تتميز بخلايا RPE ، تم التعبير عنه في خلايا pRPE ، بينما انخفض مستوى تعبيره بشكل كبير في خلايا hRPE الأولية وخلايا ARPE-19 (الشكل 3B ، C).
لمزيد من توصيف وظائف القطبية والحاجز لخلايا RPE ، تم استزراع الطبقات الأحادية المتقاربة المستزرعة لخلايا pRPE و ARPE-19 في إدخالات transwell مع وسائط DMEM / Basic و DMEM / F12 و MEM-Nic لمدة أسبوع واحد (الشكل 4). في ظل ظروف المزرعة هذه ، كشفت نتائج تلطيخ Na + -K + -ATPase (الشكل 4A-F) و ZO-1 (الشكل 4G-L) أن خلايا pRPE لديها مستويات تعبير أعلى لكل من Na + -K + -ATPase و ZO-1 من خلايا ARPE-19. يشير التوزيع المتساوي ل Na + -K + -ATPase على السطح القمي والقاعدي لخلايا pRPE إلى أن هناك حاجة إلى وقت زراعة أطول لاستعادة أقطاب الخلايا في المختبر.
تشكل RPE تقاطعات ضيقة بالقرب من سطحها القمي لتنظيم تبادل المستقلبات بإحكام بين شبكية العين الداخلية والمشيمية20. اقترح تلطيخ ZO-1 أن بروتينات الوصلات الضيقة كانت موضعية عادة في غشاء البلازما لخلايا pRPE الأولية مع مورفولوجيا مرصوفة بالحصى منتظمة ، ولكن ليس لخلايا ARPE-19. من بين وسائط الاستزراع الثلاثة ، لوحظت أفضل أنماط تلطيخ ZO-1 في الخلايا المستزرعة في DMEM / Basic ، بينما فشل DMEM / F12 في الحفاظ على مورفولوجيا الحصى لخلايا pRPE. تعمل قيمة TER الأعلى كمؤشر على تكوين الوصلة الضيقة ووظائف حاجز أفضل لخلايا RPE21. لتأكيد وظيفة التقاطعات الضيقة ، تم قياس المقاومة الظهارية (TER). ومع ذلك ، تم اكتشاف TER أعلى قليلا فقط مقارنة بإدخالات transwell الفارغة (الشكل 4M ، N).
في شبكية العين ، يوجد غشاء Bruch بين RPE والمشيمية. المكونات الرئيسية لغشاء Bruch هي الكولاجين من النوع الرابع ، البروتيوغليكان ، و laminin22. من أجل محاكاة التأثير الداعم لغشاء Bruch على RPE ، تم نشر laminin على سطح غشاء transwell لتسهيل نضوج خلايا RPE المستزرعة. بناء على النتائج التي تم الحصول عليها من الشكل 4 ، تم استزراع خلايا pRPE المتقاربة على إدخالات transwell في وسائط DMEM / Basic مع 1٪ FBS لمدة 2 أسبوع. أظهرت نتائج تلطيخ الفلورسنت المناعي أن البروتينات الخاصة ب RPE RPE65 تم التعبير عنها في جميع خلايا pRPE (الشكل 5 أ ، ب). تم توزيع Na + -K + -ATPase على السطح القمي لخلايا pRPE ، مما يشير إلى إعادة إنشاء أقطاب الخلايا (الشكل 5C ، D). أشارت نتائج كل من تلطيخ ZO-1 و TER إلى أن الوصلات الضيقة تشكلت بشكل جيد في خلايا pRPE الأولية عندما تم زراعتها على laminin (الشكل 5E ، F ، H). يصور الشكل 5G الخلايا الملطخة بصبغة Hoechst.
علاوة على ذلك ، أظهرت اللطخة الغربية أن كلا من خلايا pRPE و ARPE-19 أنتجت عوامل نمو ، بما في ذلك العامل المشتق من ظهارة الصباغ (PEDF) وعامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) (الشكل 6 أ). بعد استزراع الطبقات الأحادية المتقاربة من pRPE في إدخالات transwell مع وسائط DMEM / Basic و DMEM / F12 و MEM-Nic لمدة أسبوع واحد ، تم جمع وسائط الاستزراع من الغرف العلوية والسفلية لإدخالات transwell ، وتم تحديد كمية VEGF المفرز بواسطة ELISA. عندما تم استخدام وسائط DMEM / Basic و MEM-Nic لزراعة الخلايا ، أفرزت خلايا pPRE VEGF أكثر من الخلايا الموجودة في وسائط DMEM / F12 (الشكل 6B). ومع ذلك ، لا يمكن اكتشاف أي اختلافات في كميات VEGF بين الغرف العلوية والسفلية لإدخالات transwell في جميع الظروف المختبرة (الشكل 6B). بالإضافة إلى ذلك ، بعد زراعة خلايا pRPE الأولية على الإدخالات المطلية باللامينين وفي وسائط DMEM / Basic لمدة 2 أسبوع ، تم جمع الوسائط من الغرف العلوية والسفلية. أظهر تحليل اللطخة الغربية مستويات أعلى من PEDF في الغرفة العلوية مقارنة بالغرفة السفلية ، بينما كانت مستويات البروتين في VEGF المفرز متشابهة في كلتا الغرفتين (الشكل 6C). دعمت هذه النتائج أيضا إعادة إنشاء قطبية الخلية عندما تم استزراع خلايا pRPE الأولية لمدة 2 أسبوع أخرى بعد وصولها إلى التقاء على laminin.
الشكل 1: الخطوات الأساسية لعزل خلايا pRPE . (أ) اغسل مقل عيون الخنازير باستخدام 1x PBS في أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 50 مل. (ب، ج) إعداد مجمعات RPE-المشيمية-الصلبة للهضم الأنزيمي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: مورفولوجيا خلايا pRPE الأولية بعد زراعة الخلية. صور تمثيلية لخلايا pRPE الأولية في (أ) اليوم 2 و(ب) اليوم 6 و(ج) اليوم 10. شريط مقياس 250 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: مستويات التعبير عن الجينات والبروتينات المميزة الرئيسية في خلايا RPE المستزرعة. (أ) تحليل qRT-PCR لمستويات mRNA للجينات المميزة في خلايا pRPE الأولية ، وخلايا hRPE الأولية ، وخلايا ARPE-19 ، وأنسجة pRPE / المشيمية. تم استخدام Gapdh كجين حفظ المنزل ل qRT-PCR. تم استخدام أربعة مكررات بيولوجية لخلايا pRPE الأولية وخلايا ARPE-19 ، بينما تم استخدام ثلاث نسخ بيولوجية لخلايا hRPE الأولية والأنسجة المشيمية. تم تعيين مستويات التعبير الجيني في خلايا ARPE-19 كعناصر تحكم. (ب) تحليل اللطخة الغربية لبروتينات RPE65 في خلايا ARPE-19 و pRPE. تم استخدام Vinculin كعنصر تحكم في التحميل. (ج) تحليل اللطخة الغربية لبروتينات RPE65 في خلايا hRPE الأولية والأنسجة المشيمية. تم استخدام Vinculin كعنصر تحكم في التحميل. للمقارنة ، تم استخدام اختبار t للطالب ، * p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، ***p < 0.001. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: ثقافة أسبوع واحد لخلايا pRPE و ARPE-19 الأولية في وسائط DMEM / Basic و DMEM / F12 و MEM-Nic مع 1٪ FBS. (A) Na + -K + -ATPase تلطيخ الفلورسنت (أحمر) لخلايا pRPE الأولية في DMEM / Basic ، (B) DMEM / F12 ، و (C) وسائط MEM-Nic. (د) Na + -K + -ATPase تلطيخ الفلورسنت (أحمر) لخلايا ARPE-19 في DMEM / الوسائط الأساسية ، (E) وسائط DMEM / F12 ، و (F) وسائط MEM-Nic. (ز) تلطيخ الفلورسنت ZO-1 (أخضر) لخلايا pRPE الأولية في DMEM / الوسائط الأساسية ، (H) وسائط DMEM / F12 ، و (I) وسائط MEM-Nic. (J) تلطيخ الفلورسنت ZO-1 (أخضر) في خلايا ARPE-19 في وسائط DMEM / الأساسية ، (K) وسائط DMEM / F12 ، و (L) وسائط MEM-Nic. تم استزراع قياسات TER بعد خلايا pRPE (M) و ARPE-19 (N) الأولية في وسائط DMEM / Basic و DMEM / F12 و MEM-Nic لمدة أسبوع واحد. لكل نوع من الخلايا ، تم الحصول على البيانات من ثلاثة آبار مختلفة على الأقل. للمقارنة ، تم استخدام اختبار t للطالب ، * p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، ***p < 0.001. شريط المقياس 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: ثقافة ثنائية الأسبوع لخلايا pRPE في وسائط DMEM / Basic مع 1٪ FBS. (A-F) تم تلوين الخلايا المزروعة مع أو بدون laminin ب RPE65 (A ، B ، أحمر) ، Na + -K + -ATPase (C ، D ، أحمر) ، ZO-1 (E ، F ، أخضر) ، و (G) Hoechst (أزرق). (ح) قياسات TER في صفائح الخلايا المزروعة مع أو بدون laminin. بالنسبة للمعالجات المختلفة ، تم الحصول على البيانات من أربعة آبار مختلفة. للمقارنة ، تم استخدام اختبار t للطالب ، * p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، ***p < 0.001. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: الوظائف الإفرازية لخلايا pRPE الأولية المستزرعة وARPE-19. (أ) تحليل اللطخة الغربية ل VEGF و PEDF في خلايا pRPE و ARPE-19 الأولية. (ب) إفراز VEGF في الغرفة العلوية والسفلية لإدخالات transwell مع خلايا pRPE الأولية عندما تم استزراع الخلايا المتقاربة في وسائط DMEM / Basic و DMEM / F12 و MEM-Nic لمدة أسبوع واحد. (ج) PEDF و VEGF المفرزين في الغرفة العلوية والسفلية لإدخالات transwell مع pRPE الأولي في وسائط DMEM / Basic لمدة 2 أسبوع. بالنسبة للمعالجات المختلفة ، تم الحصول على البيانات من ثلاثة آبار مختلفة. للمقارنة ، تم استخدام اختبار t للطالب ، * p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، ***p < 0.001. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| الإنسان العاقل | سوس سكروفا | |
| أفضل1 | F: GAAGGCAAGGACGAGCAAG | F: GGACACCTGTATGCCTACGA |
| R: TCCAACTGCTTGTGTTCTGC | R: GGAACGTGAAGAGGTACA | |
| كلدن 19 | F: GGTGACCCAGGAGTTCTTCA | F: TCGTGACCCAGGAGTTCTTC |
| R: CTGTTGGGTCTCTCTGGCTC | R: GCTGCTGTTGGATCGCTC | |
| إيتغاف | F: CGCAGTCCCATCTCAAATCC | F: GCTTTCTTCAGGACGGAACA |
| R: GGCCCTGTATAAGATAGCTCGA | R: GAAATGAGCTGACCTTGCCA | |
| كرت8 | F: GGAGCAGATCAAGACCCTCA | F: CCCAGGAGAAGGAGCAGATC |
| R: GCCGCCTAAGGTTGTTGATG | R: ATGTTGTCGATGTTGCTCCG | |
| كرت 18 | F: CTTGGAGAAGAAGGGACCCC | F: GCTGATAATCGGAGGCTGGA |
| R: GGCCAGCTCTGTCTCATACT | R: GAAGTCATCAGCAGCGAGAC | |
| ميرتك | F: GTGTGCAGCGTTCAGACAAT | F: GCGGCTATTTCTTGGTGGAA |
| R: AAAATGTTGACGGGCTCAGG | R: ACGTAGATGGGGTCAGACAC | |
| سيربينف1 | F: CAGATGAAAGGGAAGCTCGC | F: AAGACGTCGCTGGAGGATTT |
| R: TTAGGGTCCGACATGGG | R: GGTCACTTTCAGAGGCAGGA | |
| SLC16a8 | F: GGGTGTCCTCCATGCTA | F: CAGTTCGAGGTGCTCATGG |
| R: GTCAGGTAGAGCTCCAGGAG | R: جاكاجاكاتغاكاكاج | |
| سترا 6 | F: CTTTGCAGGAAGAAGCTGGG | F: CTAGCCGTTGTCGATCCT |
| R: TAAATGGCCGTCCCTGTCAG | R: جاكاتجاجاجاكاجكاج | |
| Tjp1 | F: ACAGGAAAATGACCGAGTTGC | F: AAGACTTGTCAGCTCAGCCCA |
| R: TGGTTCAGGATCAGGACGAC | R: CCAGCATCTCGAGGTTCACT | |
| صور | F: ACTCAGCCCAGCATCATTCT | F: ATCTACTCAGCCCAGCATCC |
| R: ACATCAGCTGAAGAGGGGAG | R: GAGCCTTGGAGTCCTGGATT | |
| غابده | F: CAGCCTCAAGATCATCAGCA | F: CATCCTGGGCTACACTGAGG |
| R: ATGATGTTCTGGAGAGCCCC | R: GGGGCTCTTACTCCTTGGAG |
الجدول 1: الاشعال ل qRT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا ، تم وصف بروتوكول مفصل ومحسن لعزل وثقافة وتوصيف خلايا RPE من مقل عيون الخنازير ، والذي يولد نموذجا جيدا للتوصيف المختبري لخلايا RPE ودراسات الاضطرابات المتعلقة ب RPE. تم وصف طرق عزل RPE عن عيون الإنسان والفأر والفئران سابقا23،24،25. ومع ذلك ، من الصعب الحصول على مقل العيون البشرية في بعض المختبرات ، وعادة ما يثير قضايا أخلاقية. أنسجة RPE للفئران والجرذان صغيرة نسبيا ، وتتلف الخلايا بسهولة أثناء الانفصال ، ولا يمكن الحصول إلا على عدد قليل من الخلايا من كل. في المقابل ، من الأسهل بكثير الحصول على مقل العيون الخنازير والتعامل معها ، مما قد يولد بثبات عددا كبيرا نسبيا من الخلايا الأولية من مقلة عين واحدة. في بعض الدراسات ، يتم استخدام الملقط لفصل RPE ميكانيكيا ، مما قد يؤدي بسهولة إلى موت الخلايا. لذلك ، تم استخدام حمض الهيالورونيك ، وديسباز ، ومحلول التربسين / EDTA لفصل خلايا RPE سابقا. أظهرت الدراسات السابقة أن محلول Trypsin / EDTA لديه القدرة على مساعدة RPE على الانفصال عن المشيمية21. لذلك ، تم استخدام محلول Trypsin / EDTA لهضم أنسجة الخنازير ، والتي تولد أفضل النتائج. بعد التربسين / EDTA العصبي ، يمكن فصل أنسجة RPE إلى تعليق خلية واحدة عن طريق السحب بلطف بطرف ماصة. إحدى الخدع هي أن محلول Trypsin / EDTA الجديد موصى به لكل تجربة لفصل خلايا RPE بالكامل. نظرا للمساحة الكبيرة لأنسجة RPE في مقل عيون الخنازير ، يجب قطع مجمع RPE-choroid-sclera على شكل نصف وعاء إلى شكل برسيم من أربع أوراق ، مما يؤدي إلى الاتصال الكامل بين أنسجة RPE ومحلول Trypsin / EDTA لتسهيل فصلها عن المشيمية. ومع ذلك ، يجب ألا يتجاوز وقت الهضم نصف ساعة. خلال هذا الوقت ، لن يتم هضم الأنسجة الأخرى باستثناء RPE ، مما قد يقلل بشكل فعال من التلوث من أنواع أخرى من الخلايا.
تم نشر Laminin على سطح غشاء transwell لمحاكاة التأثير الداعم لغشاء Bruch على RPE. أظهرت النتائج أن اللامينين كان مفيدا لنمو خلايا pRPE ، مما حفز التعبير عن بروتينات الناقل والوصلات الضيقة. ومع ذلك ، أشارت النتائج أيضا إلى أن وقت زراعة أطول ، يبلغ حوالي 2 أسبوع ، كان مطلوبا لخلايا pRPE الأولية لاستعادة ميزات معينة لأنسجة RPE الأصلية ، بما في ذلك قطبية الخلية والوصلات الضيقة.
أحد أوجه القصور في ثقافة RPE الأولية هو أنه من الصعب الحفاظ على تعبيرات إنزيم الدورة البصرية في المختبر. لذلك ، من الأهمية بمكان فحص ما إذا كانت خلايا RPE المستزرعة يمكنها التعبير عن بروتينات RPE الخاصة RPE65. بالمقارنة مع خلايا ARPE-19 ، عبرت خلايا pRPE عن بروتين RPE65 بشكل ملحوظ. في المقابل ، لوحظ فقط شريط ضعيف من بروتين RPE65 في محللات خلايا ARPE-19 في اللطخة الغربية. من المثير للاهتمام ملاحظة أن الوزن الجزيئي ل RPE65 كان مختلفا قليلا بين الإنسان والخنازير (الشكل 3B ، C). لا يزال فقدان تعبير RPE65 في خلايا RPE المستزرعة لغزا. حتى في الخلايا الأولية المستزرعة ، فقد RPE65 تدريجيا مع الممرات (البيانات غير معروضة). حتى الآن ، تتطلب كيفية الحفاظ على تعبير RPE65 في المختبر مزيدا من التحقيق ، مع الأخذ في الاعتبار حقيقة أن الدورة البصرية هي وظيفة حاسمة لأنسجة RPE الأصلية. ثانيا ، يتمثل أحد القيود الرئيسية لهذا البروتوكول في أنه لا يمكن تمرير خلايا RPE المستزرعة في المختبر. مع الثقافة المطولة ، تميل خلايا pRPE إلى فقدان شكلها السداسي و TER بالإضافة إلى التصبغ ، بحيث يمكن استخدام خلايا المرور 0 فقط. هناك قيد آخر على بروتوكول الاستزراع هذا وهو أن الطفرات الجينية ، التي تؤدي إلى أمراض الشبكية الوراثية ، يصعب تكاثرها في هذه الخلايا. لذلك ، يمكن استخدام تحرير الجينات بوساطة الفيروس لدراسة اضطرابات RPE الوراثية مثل داء Leger الخلقي في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
كشف جميع المؤلفين أنه لا يوجد تضارب في المصالح.
يعلن جميع المؤلفين عدم وجود مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
يود المؤلفون إظهار امتنانهم واحترامهم لجميع الحيوانات التي تساهم بخلاياها في هذه الدراسة. تم دعم هذه الدراسة جزئيا من خلال منح من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2019YFA0111200 ، Yi Liao و Yuan Gao و Grant nos. 2018YFA0107301 ، Wei Li). يشكر المؤلفون Jingru Huang و Xiang You من المختبر المركزي ، كلية الطب ، جامعة شيامن على الدعم الفني في التصوير البؤري.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ARPE-19 cells | CCTCC | GDC0323 | |
| Bovine serum albumin | Yeasen | 36101ES60 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM 880 with Airyscan | |
| ChemiDoc Touch | Bio-Rad | 1708370 | |
| Cell scraper | Sangon | F619301 | |
| 10 cm culture dish | NEST | 121621EH01 | |
| 12-well culture plate | NEST | 29821075P | |
| DMEM F12 Medium | Gibco | C11330500BT | |
| DMEM basic Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EVOM2 | World Precision Instruments | EVOM2 | For TER measurement |
| Fetal bovine serum | ExCell Bio | FSP500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 0300-0108P | |
| Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 5196-2504 | |
| hydrocortisone | MCE | HY-N0583/CS-2226 | |
| Hoechst 33342 solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| LightCycler 96 Instrument | Roche | 5815916001 | |
| Liothyronine | MCE | HY-A0070A/CS-4141 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| MEM(1X)+GlutaMAX Medium | Gibco | 10566-016 | |
| MEM NEAA(100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Millex-GP syringe filter unit | Millipore | SLGPR33RB | |
| N1 | Sigma-Aldrich | SLCF4683 | |
| NcmECL Ultra | New Cell&Molecular Biotech | P10300 | |
| Non-fat Powdered Milk | Solarbio | D8340 | |
| Nicotinamide | SparkJade | SJ-MV0061 | |
| Na+-K+ ATPase antibody | Abcam | ab76020 | Recognize both human and porcine proteins |
| PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%) | Epizyme | PG112 | |
| primary Human RPE cells | - | - | Generous gift from Shoubi Wang lab |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Prism | GraphPad by Dotmatics | version 8.0 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | APExBIO | K1024 | |
| PRE65 antibody | Proteintech | 17939-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| PEDF antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-390172 | Recognize both human and porcine proteins |
| 100 x penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-031-1BCS | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | RARBIO | RA-9005 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | Toyobo | FSQ-201 | |
| RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 601052 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 602052 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Taurine | Damas-beta | 107-35-7 | |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | RNA extraction solution |
| TB Green Fast qPCR Mix | Takara | RR430A | |
| 12-well transwell inserts | Labselect | 14212 | |
| VEGF antibody | Proteintech | 19003-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| VEGF ELISA kit | Novusbio | VAL106 | |
| ZO-1 antibody | ABclonal | A0659 | Recognize both human and porcine proteins |
References
- Tan, L. X., Germer, C. J., La Cunza, N., Lakkaraju, A. Complement activation, lipid metabolism, and mitochondrial injury: Converging pathways in age-related macular degeneration. Redox Biology. 37, 101781 (2020).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Ducloyer, J. B., Le Meur, G., Cronin, T., Adjali, O., Weber, M. Gene therapy for retinitis pigmentosa. Medecine Sciences. 36 (6-7), 607-615 (2020).
- den Hollander, A. I., Roepman, R., Koenekoop, R. K., Cremers, F. P. Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 391-419 (2008).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Smith, D. T. Melanin pigment in the pigmented epithelium of the retina of the embryo chick eye studied in vivo and in vino. The Anatomical Record. 18, 260-261 (1920).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- D'Antonio-Chronowska, A., D'Antonio, M., Frazer, K. A. In vitro differentiation of human iPSC-derived retinal pigment epithelium cells (iPSC-RPE). Bio-Protocol. 9 (24), 3469 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- Scientific, T. , Available from: https://www.thermofisher.cn/document-connect/document connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2Ftrizol_reagent.pdf (2022).
- Toyota. , Available from: https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf (2022).
- Abcam. , Available from: https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol (2022).
- Zeiss. , Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals (2022).
- Cell Signal Technology. , Available from: https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western (2022).
- Wang, S., et al. Reversed senescence of retinal pigment epithelial cell by coculture with embryonic stem cell via the TGFbeta and PI3K pathways. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 588050 (2020).
- Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Experimental Eye Research. 126, 1-4 (2014).
- Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Experimental Eye Research. 126, 5-15 (2014).
- Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. Physiology and function of the tight junction. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002584 (2009).
- Nita, M., Strzalka-Mrozik, B., Grzybowski, A., Mazurek, U., Romaniuk, W. Age-related macular degeneration and changes in the extracellular matrix. Medical Science Monitor. 20, 1003-1016 (2014).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Langenfeld, A., Julien, S., Schraermeyer, U. An improved method for the isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult rats. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1493-1502 (2015).
- Sonoda, S. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
