Summary
本文介绍了一种易于遵循的体 外 培养原代猪视网膜色素上皮细胞的方法。
Abstract
视网膜色素上皮（RPE）是单层极化色素上皮细胞，位于视网膜的脉络膜和神经视网膜之间。多种功能，包括吞噬作用，营养/代谢物运输，维生素A代谢等，由RPE每天进行。RPE细胞是终末分化的上皮细胞，具有很少或没有再生能力。RPE细胞的缺失会导致多种眼部疾病，导致视力障碍，例如年龄相关性黄斑变性。因此，建立原代RPE细胞的 体外 培养模型，其与 体内 RPE比细胞系更相似，对于RPE细胞的特征和机理研究至关重要。考虑到人类眼球的来源有限，我们创建了一个培养原代猪RPE细胞的方案。通过使用该方案，RPE细胞可以很容易地从成年猪眼球中解离。随后，这些解离的细胞附着在培养皿/插入物上，增殖形成汇合的单层，并在2周内快速重建 体内 上皮组织的关键特征。通过qRT-PCR，证明原代猪RPE细胞表达的多个特征基因与天然RPE组织相当，而这些基因中的大多数在人RPE样细胞ARPE-19中丢失/高度降低。此外，免疫荧光染色显示紧密连接、组织极性和细胞骨架蛋白的分布，以及培养的原代细胞中存在对维生素 A 代谢至关重要的异构酶 RPE65。总之，我们开发了一种易于遵循的方法来培养具有高纯度和天然RPE特征的原代猪RPE细胞，这可以作为了解RPE生理学，研究细胞毒性和促进药物筛选的良好模型。
Introduction
视网膜色素上皮 （RPE） 位于视网膜1 外层的感光器和脉络膜毛细血管之间，具有多种功能，包括形成血液-视网膜屏障、运输和交换营养物质和视网膜代谢物、回收维生素 A 以维持正常的视觉周期，以及吞噬和清除脱落的感光器外段 （POS）2，3.由于POS需要不断的自我更新才能产生视力，因此RPE细胞需要不断吞噬分离的POS以维持视网膜稳态4。因此，RPE功能障碍导致许多致盲性眼病，如年龄相关性黄斑变性（AMD）4，视网膜色素变性（RP）5，Leber先天性黑朦6，糖尿病视网膜病变7等。到目前为止，大多数这些疾病的确切发病机制仍然难以捉摸。因此，建立了RPE细胞培养来研究RPE细胞生物学，病理变化和潜在机制。
作为研究细胞生物学的最简单模型，RPE细胞的培养早在1920年代就开始了8。尽管ARPE-19被广泛用作RPE细胞，但色素沉着的丧失，鹅卵石形态，特别是该细胞系中的屏障功能引起了很多关注9。相比之下，原代人RPE细胞的培养为生理和病理研究提供了更现实的场景9。然而，相对有限的可用性限制了它们的使用，道德问题始终存在。此外，几个小组使用小鼠模型培养RPE细胞。但小鼠眼睛尺寸小，单一培养通常需要多只小鼠，不方便9.最近，科学家们开发了利用人类胚胎干细胞或诱导多能干细胞来衍生RPE细胞的新方法。尽管该技术在治疗遗传性RPE疾病方面具有特殊潜力，但它非常耗时，通常需要几个月才能产生成熟的RPE细胞10。为了克服这些问题，我们在这里介绍了一种易于遵循的方案，用于在实验室中常规分离和培养高纯度RPE细胞。在合适的培养条件下，这些细胞可以显示出典型的RPE功能并表现出典型的RPE形态。因此，该培养方法可为了解RPE生理学、研究细胞毒性、研究相关眼病的病理机制、进行药物筛选提供良好的模型。
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Protocol
实验动物的使用符合视觉与眼科研究协会（ARVO）的规定，并得到厦门大学实验动物管理伦理委员会的批准。
1. 实验手术器械、组织消化酶、细胞培养缓冲液的制备
- 准备实验性手术装置，在眼球解剖前一天清洁并高压灭菌两对眼科手术剪刀和镊子，然后在65°C的通用方案烤箱中用手术器械干燥盒子过夜。
- 培养基制备。
- 制备补充有 10% （v/v） 胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺和 1% （v/v） 青霉素 （100 U/mL） 和链霉素 （100 U/mL） 的 DMEM/碱性培养基。
- 制备补充有 1% （v/v） FBS 和 1% （v/v） 青霉素 （100 U/mL） 和链霉素 （100 U/mL） 的 DMEM/F12 培养基。
- 制备 MEM-Nic 11，通过补充 MEM α 加入 2 mM L-谷氨酰胺、1% FBS、1% （v/v） 青霉素 （100 U/mL） 和链霉素 （100 U/mL）、0.1 mM NEAA、1% （v/v） N1 补充剂、牛磺酸 （0.25 mg/mL）、氢化可的松 （20 ng/mL）、三碘甲状腺素 （0.013 ng/mL） 和10 mM 烟酰胺。
注意：为了提高细胞活力和增殖，FBS的百分比可以增加到20%，以中和消化酶并接种解离的细胞。对于长期细胞培养，FBS的百分比可以降低到1%12。
- 在实验过程中解冻组织消化酶等分试样（补充有0.91mM EDTA的0.25%（w / v）胰蛋白酶/ EDTA溶液，以下简称胰蛋白酶/ EDTA溶液）。
注意：每次都应使用新鲜胰蛋白酶/ EDTA溶液以获得最佳结果。将10mL新鲜胰蛋白酶/ EDTA溶液等分到每个15mL无菌离心管中，并在-20°C冰箱中冷冻等分试样直至使用。 - 解剖溶液。
- 通过 0.22 μm 注射器过滤装置过滤溶液，对补充有 2% （v/v） 青霉素 （100 U/mL） 和链霉素 （100 U/mL） 的 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） （pH 7.2） 进行灭菌。
- 涂覆培养板和透孔插入物。
- 用 1x PBS 清洗孔和跨孔插入物。用移液管从孔和转孔中取出PBS，然后向下室中加入1 mL新鲜的1x PBS，向上室中加入600 μL 10 μg/ mL层粘连蛋白溶液。
- 将板/跨孔插入物在细胞培养箱中在37°C和5%CO2下孵育过夜。从上室取出层粘连蛋白溶液，并在接种细胞之前用 1 mL 冷的 1x PBS 洗涤两次。
2.解剖猪眼球RPE细胞
- 准备仪器。
- 用75%乙醇和紫外线清洁层流罩。准备三个含有~25 mL 75%乙醇的50 mL无菌离心管，三个含有~25 mL 1x PBS的50 mL无菌离心管和三个含有~15 mL 1x PBS的10 cm无菌细胞培养皿。
注意：这些设置通常用于解剖四个猪眼球。当使用更多眼球时，请放大。为了提高细胞活力，在冰上预冷1x PBS缓冲液至少30分钟。75%乙醇和紫外光都是确保实验仪器和细胞不受污染所必需的。提前打开紫外灯，对整个手术台进行消毒至少15分钟。
- 用75%乙醇和紫外线清洁层流罩。准备三个含有~25 mL 75%乙醇的50 mL无菌离心管，三个含有~25 mL 1x PBS的50 mL无菌离心管和三个含有~15 mL 1x PBS的10 cm无菌细胞培养皿。
- 清洁猪眼球。
- 从屠宰场获得新鲜的眼球，并将它们放在冰上直到解剖。将四个猪眼球浸泡在 10 cm 培养皿中的 ~15 mL 75% 乙醇中，并使用一把剪刀和镊子切断所有残留的结缔组织和肌肉。
注意：从巩膜外部尽可能多地去除组织以减少污染。此时不要切断视神经，以方便在去污和洗涤步骤中转移眼球。在此步骤之后，所有程序都应在层流罩中进行。
- 从屠宰场获得新鲜的眼球，并将它们放在冰上直到解剖。将四个猪眼球浸泡在 10 cm 培养皿中的 ~15 mL 75% 乙醇中，并使用一把剪刀和镊子切断所有残留的结缔组织和肌肉。
- 依次浸泡并清洗四个猪眼球，依次浸泡并清洗三个装有 75% 乙醇的 50 mL 无菌离心管，对猪眼球进行净化;每个眼球在每个管中浸泡至少5分钟。接下来，在三个装有 1x PBS 的 50 mL 无菌离心管中依次清洗猪眼球;在每个管中洗涤每个眼球至少5分钟（图1A）。每分钟倒置一次管子以彻底清洗眼球。
- 解剖猪眼球。
- 将四个猪眼球移动到含有1x PBS的10cm无菌细胞培养皿中。再次修剪每个眼球的外表面以去除视神经和小碎片（图1B）。用剪刀在角膜缘和巩膜的交叉处做一个小切口，然后去除角膜、虹膜、晶状体、玻璃体和神经视网膜（这些组织的详细结构请参考 图1）。
- 将RPE-脉络膜-巩膜复合物转移到新的10厘米细胞培养皿中，并进行四次切割以将眼罩平整成四叶草的形状（图1C）。
- 通过将四个RPE-脉络膜-巩膜复合物放入新的10厘米培养皿中进行胰蛋白酶/ EDTA溶液消化。倒入20mL新鲜胰蛋白酶/ EDTA溶液以合并RPE-脉络膜-巩膜复合物，并将培养皿放入37°C的细胞培养箱中~30分钟。
注意：使用新鲜的胰蛋白酶/ EDTA溶液解离RPE细胞。仔细控制胰蛋白酶/EDTA溶液消化的时间，因为较长的孵育时间（超过30分钟）可能会增加其他类型细胞的污染。
3. 猪眼球RPE细胞的分离培养
- RPE 解离。
- 用胰蛋白酶/EDTA 溶液孵育 30 分钟后，将培养皿从培养箱中取出，并向培养皿中加入 20 mL 预热培养基（含 10% FBS）以中和胰蛋白酶/EDTA 溶液。
注：在此步骤中，仅使用 DMEM/基本介质。当细胞达到汇合时，可以根据实验条件使用三种培养基：DMEM/碱性培养基、DMEM/F12培养基和MEM-Nic培养基。 - 使用 5 mL 移液器通过轻轻移液数次解离 RPE 细胞。将细胞悬液收集到 15 mL 离心管中。使用另外 10 mL 新鲜培养基 （10% FBS） 轻轻移液以洗涤培养皿上的 RPE-脉络膜-巩膜复合物以获得尽可能多的 RPE 细胞。
注意：不要用力研磨细胞。确保以约 3 mL/s 的速度填充和清空移液器。避免使细胞悬液冒泡。
- 用胰蛋白酶/EDTA 溶液孵育 30 分钟后，将培养皿从培养箱中取出，并向培养皿中加入 20 mL 预热培养基（含 10% FBS）以中和胰蛋白酶/EDTA 溶液。
- 通过在室温下以200× g 离心管5分钟来收集RPE细胞。使用移液管吸出上清液并加入另外 5 mL 培养基 （10% FBS） 以重悬细胞并以 200 x g 离心再 5 分钟。倒出上清液并用 12 mL 培养基重悬细胞。
注意：吸出上清液时，留下约1 mL培养基以避免细胞团块破裂。 - 接种 RPE 细胞。
- 将~1-2 x 105 个细胞/孔接种到12孔培养板或跨孔插入物中。通常，从四个猪眼球中获得约1.5 x 106 个RPE细胞。每2天更换一次培养基，当细胞完全覆盖孔/插入物的表面时，将血清浓度降低至1%。
注意：在细胞附着到培养皿/插入物之前，不要过于频繁地移动细胞培养皿。
- 将~1-2 x 105 个细胞/孔接种到12孔培养板或跨孔插入物中。通常，从四个猪眼球中获得约1.5 x 106 个RPE细胞。每2天更换一次培养基，当细胞完全覆盖孔/插入物的表面时，将血清浓度降低至1%。
- 每2天更换一次培养基，直到收获细胞。
注意：细胞达到汇合后，FBS的浓度可以降低，细胞可以培养长达几个月以允许完全分化和成熟。
4. 原代猪RPE细胞的表征
- 将细胞汇合培养1或2周，然后收获细胞进行进一步分析。
- 收获细胞进行实时定量 PCR （qRT-PCR） 分析。
- 取出培养基，用 1 mL 冷的 1x PBS 洗涤细胞，然后将 500 μL RNA 提取溶液加入每个孔中，以从约 1 x 106 个细胞中收集细胞裂解物。
- 提取mRNA13;从每个样品中提取约4μgRNA。使用 100 ng 的 mRNA 进行逆转录14;将cDNA稀释40倍以进行实时定量PCR分析。引物列于 表1中。
- 收获细胞进行免疫荧光染色。
- 取出培养基，用 1 mL 冷的 1x PBS 洗涤细胞，然后在 1x PBS 中加入 500 μL 4% （w/v） 多聚甲醛，以固定细胞（约 1 x 106 细胞/孔）在室温下 30 分钟。然后，用1x PBS洗涤细胞两次，并在4°C下用一抗（1x PBS中的1：100补充有1%（w / v）牛血清白蛋白）进行免疫荧光染色过夜，二抗（1x PBS中的1：200补充有1%（w / v）牛血清白蛋白）在室温下根据在线方案2小时。
- 免疫荧光图像按照在线手册16通过共聚焦显微镜获取。
- 收获细胞进行蛋白质印迹分析。
- 取出培养基，用冷的1x PBS洗涤细胞两次，然后将80μLRIPA缓冲液（含1x蛋白酶抑制剂）加入每个孔中，并使用细胞刮刀从培养皿/插入物上刮擦约1 x 106 个细胞。
- 从每个孔/插入 1.5 mL 微量离心管中收集细胞裂解物。将细胞裂解物煮沸10分钟，然后使用BCA试剂盒测量蛋白质浓度;每个样品的蛋白质浓度约为2 mg/mL。根据在线方案，使用每个样品的 25 μg 蛋白质进行蛋白质印迹分析17。
- 对于蛋白质印迹，将膜在 5 mL 一抗溶液中孵育（在 1x TBST 溶液中以 1：1，000 稀释的一抗，补充有 5% （w/v） 牛血清白蛋白）在 4 °C 下在旋转的多用途摇床上孵育过夜。
- 然后，根据所用一抗的来源，将膜与约15mL抗兔或抗小鼠二抗溶液（在补充有5%（w / v）脱脂牛奶的1x TBST溶液中1：5，000稀释的二抗）在室温下在轨道振荡器上孵育2小时。
- 跨上皮阻力 （TER） 测量。
- 用70%乙醇和无菌1x PBS顺序洗涤筷子电极。然后将电极的较短端放在顶腔室中，将较长的端放在Transwell插入物的底部腔室中，然后单击上皮电压表上的按钮进行测量。一式三份记录每个孔的TER测量值。
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Representative Results
将原代猪RPE（pRPE）细胞在含有10%FBS的DMEM/碱性培养基中培养，并在接种后2天（图2A）、6天（图2B）和10天（图2C）在光学显微镜下拍摄细胞形态。1周后，观察到具有鹅卵石形态的单层色素沉着pRPE细胞汇合。
为了更好地表征原代pRPE细胞，将传代3（P3）18和ARPE-19细胞的原代人RPE细胞（hRPE）在DMEM/碱性培养基中用1%FBS培养另一周，然后收获培养细胞的总mRNA和蛋白质，以及猪RPE/脉络膜组织。采用qRT-PCR和蛋白质印迹法评估成熟RPE关键特征基因19和蛋白质标记物的表达水平。与ARPE-19细胞相比，pRPE细胞保留了在天然RPE分泌（图3A（c）），吞噬作用（图3A（i）），运输（图3A（a），（d）），紧密连接（图3A（j）），屏障形成（图3A（b））以及视觉周期（图3A（e），B）中功能的基因的表达水平显着更高。然而，与原代hRPE和ARPE-19细胞相比，RPE的两个细胞骨架标记基因Krt8和Krt18在原代pRPE细胞中的表达水平显着降低（图3A（g），（h））。此外，参与吞噬作用的itgav在原代pRPE细胞中也较低（图3A（f））。由于这3个基因在pRPE细胞中的表达水平与猪RPE/脉络膜组织相似，这可能表明物种之间的基因表达差异。此外，负责黑色素产生的Tyr的表达水平在原代pRPE和hRPE细胞中都高度降低（图3A（k）），这可能解释了长期培养细胞中色素沉着的丧失。在人pRPE和猪pRPE细胞数据中观察到的qRT-PCR结果的差异可能是因为人类pRPE的储存时间更长，传代次数（P3）更高，因此表明亚培养时RPE特征的丧失。此外，蛋白质印迹显示，RPE65蛋白是具有RPE细胞的视觉周期中的关键酶，在pRPE细胞中表达，而其在原代hRPE细胞和ARPE-19细胞中的表达水平显着降低（图3B，C）。
为了进一步表征 RPE 细胞的极性和屏障功能，将 pRPE 和 ARPE-19 细胞的培养融合单层在带有 DMEM/Basic、DMEM/F12 和 MEM-Nic 培养基的跨孔插入物中培养 1 周（图 4）。在这些培养条件下，Na+-K+-ATP酶（图4A-F）和ZO-1（图4G-L）荧光染色结果显示，pRPE细胞的Na+-K+-ATP酶和ZO-1表达水平均高于ARPE-19细胞。Na+-K+-ATP酶在pRPE细胞顶端和基底表面的均匀分布表明，体外恢复细胞极性需要更长的培养时间。
RPE在其顶端表面附近形成紧密的连接，以严格调节视网膜内和脉络膜之间的代谢物交换20。ZO-1染色表明，紧密连接蛋白通常位于具有规则鹅卵石形态的原代pRPE细胞的质膜上，但ARPE-19细胞则不然。在3种培养基中，在DMEM/Basic培养的细胞中观察到最佳的ZO-1染色模式，而DMEM/F12未能维持pRPE细胞的鹅卵石形态。较高的TER值可作为RPE细胞紧密结形成和更好的屏障功能的指标21。为了确认紧密连接的功能，测量了跨上皮阻力（TER）。然而，与空的跨孔插入物相比，仅检测到略高的TER（图4M，N）。
在视网膜中，布鲁赫膜存在于RPE和脉络膜之间。Bruch膜的主要成分是IV型胶原蛋白，蛋白聚糖和层粘连蛋白22。为了模拟Bruch膜对RPE的支撑作用，将层粘连蛋白铺展在跨孔膜表面，以促进培养的RPE细胞的成熟。根据从图4获得的结果，将融合的pRPE细胞在DMEM /碱性培养基中的Transwell插入物上用1%FBS培养2周。免疫荧光染色结果显示，RPE特异性蛋白RPE65在所有pRPE细胞中均有表达（图5A，B）。Na+-K+-ATP酶分布在pRPE细胞的顶端表面，表明细胞极性重建（图5C，D）。ZO-1染色和TER结果表明，当它们在层粘连蛋白上培养时，原代pRPE细胞中紧密连接形成良好（图5E，F，H）。图5G描绘了用Hoechst染料染色的细胞。
此外，蛋白质印迹显示pRPE和ARPE-19细胞均产生生长因子，包括色素上皮衍生因子（PEDF）和血管内皮生长因子（VEGF）（图6A）。在含有DMEM/Basic、DMEM/F12和MEM-Nic培养基的跨孔插入物中融合单层pRPE培养1周后，从跨孔插入物的顶部和底部室收集培养基，并通过ELISA定量分泌的VEGF。当使用DMEM / Basic和MEM-Nic培养基进行细胞培养时，pPRE细胞比DMEM / F12培养基中的细胞分泌更多的VEGF（图6B）。然而，在所有测试条件下，Transwell插件的顶部和底部腔室之间的VEGF量没有差异（图6B）。此外，在涂有层粘连蛋白的插入物上和DMEM/碱性培养基中培养原代pRPE细胞2周后，收集来自顶部和底部室的培养基。蛋白质印迹分析显示，顶部腔室中的 PEDF 水平高于底部腔室，而两个腔室中分泌的 VEGF 蛋白水平相似（图 6C）。这些结果进一步支持了原代pRPE细胞在层粘连蛋白上汇合后再培养2周时细胞极性的重建。
图 1：pRPE 细胞分离的基本步骤 。 （A） 在 50 mL 无菌离心管中用 1x PBS 清洗猪眼球。（乙，丙）制备用于酶消化的RPE-脉络膜-巩膜复合物。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：细胞培养后的原代 pRPE 细胞形态。 （A）第2天，（B）第6天和（C）第10天原代pRPE细胞的代表性图像。比例尺 250 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：培养的 RPE 细胞中关键特征基因和蛋白质的表达水平。 （A） 原代 pRPE 细胞、原代 hRPE 细胞、ARPE-19 细胞和 pRPE/脉络膜组织中特征基因的 mRNA 水平的 qRT-PCR 分析。Gapdh被用作qRT-PCR的管家基因。原代pRPE细胞和ARPE-19细胞使用4个生物学重复，原代hRPE细胞和pRPE/脉络膜组织使用3个生物学重复。将ARPE-19细胞中的基因表达水平设置为对照。（B）ARPE-19和pRPE细胞中RPE65蛋白的蛋白质印迹分析。黏着菌素被用作负载对照。（C）原代hRPE细胞和pRPE /脉络膜组织中RPE65蛋白的蛋白质印迹分析。黏着菌素被用作负载对照。为了进行比较，使用学生t检验，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。请点击此处查看此图的大图。
图 4：使用 1% FBS 的 DMEM/Basic、DMEM/F12 和 MEM-Nic 培养基中原代 pRPE 和 ARPE-19 细胞的一周培养。 （A） DMEM/Basic 中原代 pRPE 细胞的 Na+-K+-ATP 酶荧光染色（红色），（B） DMEM/F12 和 （C） MEM-Nic 培养基。（D） DMEM/碱性培养基中 ARPE-19 细胞的 Na+-K+-ATP 酶荧光染色（红色），（E） DMEM/F12 培养基和 （F） MEM-Nic 培养基。（G） DMEM/碱性培养基中原代 pRPE 细胞的 ZO-1 荧光染色（绿色），（H） DMEM/F12 培养基和 （I） MEM-Nic 培养基。（J） DMEM/碱性培养基、（K） DMEM/F12 培养基和 （L） MEM-Nic 培养基中 ARPE-19 细胞中的 ZO-1 荧光染色（绿色）。原代pRPE （M）和ARPE-19（N）细胞在DMEM / Basic，DMEM / F12和MEM-Nic培养基中培养1周后的TER测量。对于每种类型的细胞，从至少三个不同的孔中获得数据。为了进行比较，使用学生t检验，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。比例尺 50 μm。请点击此处查看此图的大图。
图 5：在含有 1% FBS 的 DMEM/Basic 培养基中对 pRPE 细胞进行两周培养。 （A-F） 用 RPE65（A，B，红色）、Na+-K+-ATP 酶（C，D、红色）、ZO-1（E、F、绿色）和 （G） Hoechst（蓝色）染色。（H）在有或没有层粘连蛋白培养的细胞片中进行TER测量。对于不同的处理，从四个不同的孔中获得数据。为了进行比较，使用学生t检验，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。比例尺 = 50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图6：培养的原代pRPE和ARPE-19细胞的分泌功能。 （A）原代pRPE和ARPE-19细胞中VEGF和PEDF的蛋白质印迹分析。（B） 当融合细胞在 DMEM/Basic、DMEM/F12 和 MEM-Nic 培养基中培养 1 周时，在具有原代 pRPE 细胞的跨孔插入物的顶部和底部室分泌 VEGF。 （C） 在 DMEM/Basic 培养基中具有初级 pRPE 的跨孔插入物的顶部和底部室分泌 PEDF 和 VEGF，持续 2 周。对于不同的处理，从三个不同的孔获得数据。为了进行比较，使用学生t检验，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。请点击此处查看此图的大图。
| 智人 | 苏斯克罗法 | |
| 最佳1 | 女：GAAGGCAAGGACGAGCAAG | 女：GGACACCTGTATGCCTACGA |
| R： TCCAACTGCTTGTGTTCTGC | R： GGAACGTGAAGAGGGGTACA | |
| Cldn19 | 女：GGTGACCCAGGTTCTTCA | 女：TCGTGACCCAGGTTCTTC |
| R： CTGTTGGGTCTCTCTCTGGCTC | R： GCTGCTGTTGGATCGCTC | |
| 伊特加夫 | F： CGCAGTCCCATCTCAAATCC | 女：GCTTTCTTCAGGACGGAACA |
| R： GGCCCTGTATAAGATAGCTCGA | R： GAAATGAGCTGACCTTGCCA | |
| Krt8 | 女：嘎嘎嘎嘎嘎 | 女：CCCAGGAGAAGGAGCAGATC |
| R： GCCGCCTAAGGTTGTTGATG | R： ATGTTGTCGATGTTGCTCCG | |
| Krt18 | 女：CTTGGAGAAGGGACCCC | 女：GCTGATAATCGGAGGCTGGA |
| R： GGCCAGCTCTGTCTCATACT | R： GAAGTCATCAGCAGCGAC | |
| 默特克 | 女：GTGTGCAGCGTTCAGACAAT | 女：GCGGCTATTTCTTGGTGGAA |
| R： AAAATGTTGACGGGCTCAGG | R： ACGTAGATGGGGTCAGACAC | |
| 塞尔平夫1 | F： CAGATGAAAGGGAAGCTCGC | 女：AAGACGTCGCTGGAGGATTT |
| R： TTAGGGTCCGACATGGG | R： GGTCACTTTCAGAGGCAGGA | |
| Slc16a8 | F： GGGTCCTCCATCATGCTA | F： CAGTTCGAGGTGCTCATGG |
| R： GTCAGGTAGAGCTCCAGGAG | R： GACAGCCATGAAGACACCAG | |
| 斯特拉6 | 女：CTTTGCAGGAAGAAGCTGGG | 女：CTAGCCGTGTTGTCGATCCT |
| R： TAAATGGCCGTCCCTGTCAG | R： GACCATGAAGACAGCAGCAG | |
| Tjp1 | 女：ACAGGAAAATGACCGAGTTGC | 女：AAGACTTGTCAGCTCAGCCA |
| R： TGGTTCAGGATCAGGACGAC | R： CCAGCATCTCGAGGTTCACT | |
| 泰尔 | F： ACTCAGCCCAGCATTCT | F： ATCTACTCAGCCCAGCATCC |
| R： ACATCAGCTGAAGAGGGGAG | R： GAGCCTTGGAGTCCTGGATT | |
| 加普德 | F： CAGCCTCAAGATCATCAGCA | F： CATCCTGGGCTACACTGAGG |
| R： ATGATGTTCTGGAGAGCCCC | R： GGGGCTCTTACTCCTTGGAG |
表 1： 用于 qRT-PCR 的引物。
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Discussion
在这里，描述了用于从猪眼球中分离，培养和表征RPE细胞的详细和优化方案，该方案为RPE细胞的体外表征和RPE相关疾病研究提供了良好的模型。从人，小鼠和大鼠眼睛中分离RPE的方法已在前面描述过23，24，25。然而，在一些实验室中很难获得人类的眼球，并且通常会引发伦理问题。小鼠和大鼠的RPE组织相对较小，细胞在分离过程中容易受损，每只动物只能获得少量细胞。相比之下，猪眼球更容易获得和处理，它可以稳定地从单个眼球产生相对大量的原代细胞。在一些研究中，镊子用于机械分离RPE，这很容易导致细胞死亡。因此，透明质酸、分散酶和胰蛋白酶/EDTA 溶液以前已被用于解离 RPE 细胞。先前的研究表明，胰蛋白酶/EDTA溶液具有帮助RPE从脉络膜分离的能力21。因此，使用胰蛋白酶/EDTA溶液消化猪组织，以产生最佳结果。胰蛋白酶/EDTA神经化后，可以通过用移液器吸头轻轻移液将RPE组织解离成单细胞悬液。一个技巧是建议每个实验使用新鲜的胰蛋白酶/ EDTA溶液以完全解离RPE细胞。由于猪眼球的RPE组织面积较大，需要将半碗形的RPE-脉络膜-巩膜复合体切割成四叶草的形状，这有利于RPE组织与胰蛋白酶/EDTA溶液的充分接触，以利于它们与脉络膜分离。但是，消化时间不应超过半小时。在这段时间内，除RPE以外的其他组织不会被消化，这可以有效地减少来自其他类型细胞的污染。
将层粘连蛋白铺展在跨孔膜表面，模拟布鲁赫膜对RPE的支撑作用。结果表明，层粘连蛋白有利于pRPE细胞的生长，刺激转运蛋白和紧密连接蛋白的表达。然而，结果还表明，原代pRPE细胞需要更长的培养时间，约为2周，以恢复天然RPE组织的某些特征，包括细胞极性和紧密连接。
原发性RPE培养的一个缺点是难以在 体外维持视觉周期酶表达。因此，检查培养的RPE细胞是否可以表达RPE特异性蛋白RPE65至关重要。与ARPE-19细胞相比，pRPE细胞表达的RPE65蛋白明显更多。相比之下，在蛋白质印迹的ARPE-19细胞裂解物中仅观察到RPE65蛋白的弱条带。有趣的是，人与猪之间RPE65的分子量略有不同（图3B，C）。培养的RPE细胞中RPE65表达的丧失仍然是一个谜。即使在培养的原代细胞中，RPE65也随着传代而逐渐丢失（数据未显示）。到目前为止，考虑到视觉周期是天然RPE组织的关键功能，如何在 体外 维持RPE65的表达需要进一步研究。其次，该方案的一个主要限制是体 外 培养的RPE细胞不能传代。随着培养时间的延长，pRPE细胞往往会失去其六边形和TER以及色素沉着，因此只能使用传代0细胞。该培养方案的另一个局限性是导致遗传性视网膜疾病的基因突变难以在这些细胞中繁殖。因此，病毒介导的基因编辑将来可能被用于研究遗传性RPE疾病，例如Leger先天性黑朦。
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Disclosures
所有作者都透露不存在利益冲突。
所有作者都声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
作者希望对所有在这项研究中贡献细胞的动物表示感谢和尊重。这项研究部分得到了中国国家重点研发计划（2019YFA0111200，Yi Liao & Yuan Gao和Grant Nos. 2018YFA0107301，Wei Li）的资助。作者感谢厦门大学医学院中心实验室的黄静茹和尤翔在共聚焦成像方面的技术支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ARPE-19 cells | CCTCC | GDC0323 | |
| Bovine serum albumin | Yeasen | 36101ES60 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM 880 with Airyscan | |
| ChemiDoc Touch | Bio-Rad | 1708370 | |
| Cell scraper | Sangon | F619301 | |
| 10 cm culture dish | NEST | 121621EH01 | |
| 12-well culture plate | NEST | 29821075P | |
| DMEM F12 Medium | Gibco | C11330500BT | |
| DMEM basic Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EVOM2 | World Precision Instruments | EVOM2 | For TER measurement |
| Fetal bovine serum | ExCell Bio | FSP500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 0300-0108P | |
| Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 5196-2504 | |
| hydrocortisone | MCE | HY-N0583/CS-2226 | |
| Hoechst 33342 solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| LightCycler 96 Instrument | Roche | 5815916001 | |
| Liothyronine | MCE | HY-A0070A/CS-4141 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| MEM(1X)+GlutaMAX Medium | Gibco | 10566-016 | |
| MEM NEAA(100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Millex-GP syringe filter unit | Millipore | SLGPR33RB | |
| N1 | Sigma-Aldrich | SLCF4683 | |
| NcmECL Ultra | New Cell&Molecular Biotech | P10300 | |
| Non-fat Powdered Milk | Solarbio | D8340 | |
| Nicotinamide | SparkJade | SJ-MV0061 | |
| Na+-K+ ATPase antibody | Abcam | ab76020 | Recognize both human and porcine proteins |
| PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%) | Epizyme | PG112 | |
| primary Human RPE cells | - | - | Generous gift from Shoubi Wang lab |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Prism | GraphPad by Dotmatics | version 8.0 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | APExBIO | K1024 | |
| PRE65 antibody | Proteintech | 17939-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| PEDF antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-390172 | Recognize both human and porcine proteins |
| 100 x penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-031-1BCS | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | RARBIO | RA-9005 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | Toyobo | FSQ-201 | |
| RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 601052 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 602052 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Taurine | Damas-beta | 107-35-7 | |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | RNA extraction solution |
| TB Green Fast qPCR Mix | Takara | RR430A | |
| 12-well transwell inserts | Labselect | 14212 | |
| VEGF antibody | Proteintech | 19003-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| VEGF ELISA kit | Novusbio | VAL106 | |
| ZO-1 antibody | ABclonal | A0659 | Recognize both human and porcine proteins |
References
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