Summary
Her præsenteres en let at følge metode til dyrkning af primære porcine retinale pigmentepitelceller in vitro .
Abstract
Det retinale pigmentepitel (RPE) er et monolag af polariserede pigmenterede epitelceller, der ligger mellem choroid og neuroretina i nethinden. Flere funktioner, herunder fagocytose, næringsstof/metabolittransport, vitamin A-metabolisme osv., udføres dagligt af RPE. RPE-celler er terminalt differentierede epitelceller med ringe eller ingen regenerativ kapacitet. Tab af RPE-celler resulterer i flere øjensygdomme, der fører til synshandicap, såsom aldersrelateret makuladegeneration. Derfor er etableringen af en in vitro-kulturmodel af primære RPE-celler, som ligner RPE in vivo mere end cellelinjer, afgørende for de karakteristiske og mekanistiske undersøgelser af RPE-celler. I betragtning af at kilden til menneskelige øjenkugler er begrænset, opretter vi en protokol til dyrkning af primære RPE-celler hos svin. Ved at bruge denne protokol kan RPE-celler let adskilles fra voksne svineøjne. Derefter binder disse dissocierede celler sig til dyrkningsskåle / indsatser, spredes for at danne et sammenflydende monolag og genopretter hurtigt nøglefunktioner i epitelvæv in vivo inden for 2 uger. Ved qRT-PCR er det påvist, at primære RPE-celler hos svin udtrykker flere signaturgener på sammenlignelige niveauer med naturligt RPE-væv, mens ekspressionerne af de fleste af disse gener går tabt/stærkt reduceres i humane RPE-lignende celler, ARPE-19. Desuden viser immunofluorescensfarvningen fordelingen af tæt kryds, vævspolaritet og cytoskeletproteiner samt tilstedeværelsen af RPE65, en isomerase, der er kritisk for vitamin A-metabolisme, i dyrkede primære celler. Alt i alt har vi udviklet en let at følge tilgang til dyrkning af primære svine-RPE-celler med høj renhed og native RPE-funktioner, som kan tjene som en god model til at forstå RPE-fysiologi, studere celletoksiciteter og lette lægemiddelscreeninger.
Introduction
Retinale pigmentepitel (RPE) er placeret mellem fotoreceptorer og choriocapillaris i det ydre lag af nethinden1 med flere funktioner, herunder dannelse af blod-retinal barriere, transport og udveksling af næringsstoffer og retinale metabolitter, genbrug af vitamin A for at opretholde en normal visuel cyklus og fagocytose og clearance af skurfotoreceptor ydre segmenter (POS'er)2,3 . Da POS'er kræver konstant selvfornyelse for at generere vision, skal RPE-cellerne kontinuerligt opsluge løsrevne POS'er for at opretholde retinal homeostase4. Derfor resulterer RPE-dysfunktion i mange blændende øjensygdomme, såsom aldersrelateret makuladegeneration (AMD)4, retinitis pigmentosa (RP)5, Leber medfødt amaurose6, diabetisk retinopati7 osv. Indtil nu forbliver den nøjagtige patogenese af de fleste af disse sygdomme undvigende. Som et resultat etableres RPE-cellekultur for at studere RPE-cellebiologi, patologiske ændringer og underliggende mekanismer.
Som den enkleste model til at studere cellebiologi blev kulturen af RPE-celler startet allerede i 1920'erne8. Selvom ARPE-19 i vid udstrækning anvendes som RPE-celler, giver tab af pigmentering, brostensmorfologi og især barrierefunktionerne i denne cellelinje anledning til mange bekymringer9. Til sammenligning tilbyder kulturen af primære humane RPE-celler et mere realistisk scenario for fysiologiske og patologiske undersøgelser9. Den relativt begrænsede tilgængelighed begrænser imidlertid deres brug, og etiske problemer eksisterer altid. Derudover brugte flere grupper musemodeller til at dyrke RPE-celler. Imidlertid er museøjets størrelse lille, og en enkelt kultur kræver normalt mange mus, hvilket ikke er praktisk9. For nylig har forskere udviklet nye metoder til at bruge menneskelige embryonale stamceller eller inducerede pluripotente stamceller til at udlede RPE-celler. Selvom denne teknik har særligt potentiale til behandling af arvelige RPE-lidelser, er det tidskrævende og kræver normalt flere måneder at generere modne RPE-celler10. For at overvinde disse problemer introducerer vi her en let at følge protokol til rutinemæssigt at isolere og dyrke RPE-celler med høj renhed i laboratoriet. Under passende dyrkningsforhold kan disse celler vise typiske RPE-funktioner og udvise typiske RPE-morfologier. Derfor kan denne kulturmetode give en god model til at forstå RPE-fysiologi, studere cytotoksicitet, undersøge patologiske mekanismer for relaterede okulære sygdomme og udføre lægemiddelscreeninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anvendelsen af forsøgsdyr overholdt reglerne fra Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) og blev godkendt af den etiske komité for eksperimentel dyreforvaltning ved Xiamen University.
1. Forberedelse af eksperimentelle kirurgiske anordninger, vævsfordøjelsesenzym og cellekulturbuffer
- Forbered det eksperimentelle kirurgiske udstyr ved at rengøre og autoklavere to par oftalmologiske kirurgiske sakse og tang dagen før øjenæbledissektionen og derefter tørre kassen med kirurgisk udstyr i en generel protokolovn ved 65 ° C natten over.
- Forberedelse af kulturmedier.
- Forbered DMEM / Basic medier suppleret med 10% (v / v) føtalt bovin serum, 2 mM L-glutamin og 1% (v / v) penicillin (100 E / ml) og streptomycin (100 E / ml).
- Forbered DMEM / F12 medier suppleret med 1% (v / v) FBS og 1% (v / v) penicillin (100 E / ml) og streptomycin (100 E / ml).
- Forbered MEM-Nic 11 ved at supplere MEM alpha med 2 mM L-glutamin, 1% FBS, 1% (v / v) penicillin (100 E / ml) og streptomycin (100 E / ml), 0,1 mM NEAA, 1% (v / v) N1 supplement, taurin (0,25 mg / ml), hydrocortison (20 ng / ml), triiodo-thyronin (0,013 ng / ml) og10 mM nikotinamid.
BEMÆRK: For at forbedre cellelevedygtighed og proliferation kan procentdelen af FBS øges til 20% for at neutralisere fordøjelsesenzymer og frø de dissocierede celler. For langvarig cellekultur kan procentdelen af FBS reduceres til så lavt som 1%12.
- Optø vævsfordøjelsesenzymet alikvote (0,25% (w/v) trypsin/EDTA-opløsning suppleret med 0,91 mM EDTA, i det følgende benævnt trypsin/EDTA-opløsning) under forsøget.
BEMÆRK: Frisk Trypsin / EDTA opløsning bør anvendes hver gang for at opnå optimale resultater. Der anvendes en prøve på 10 ml frisk trypsin/EDTA-opløsning i hvert 15 ml sterilt centrifugeglas, og delprøverne fryses ved -20 °C i køleskab indtil brug. - Dissektion løsning.
- Steriliser 1x fosfatbufret saltvand (PBS) (pH 7,2) suppleret med 2% (v/v) penicillin (100 E/ml) og streptomycin (100 E/ml) ved at filtrere opløsningen gennem en 0,22 μm sprøjtefilterenhed.
- Overtræk kulturpladerne og transwellindsatserne.
- Vask brøndene og transwellindsatserne med 1x PBS. PBS fjernes fra brønde og transwells med en pipette, og derefter tilsættes 1 ml frisk 1x PBS til det nedre kammer og 600 μL 10 μg/ml lamininopløsning til det øverste kammer.
- Pladerne/transwellindsatserne inkuberes i cellekulturkuvøsen natten over ved 37 °C og 5 % CO2. Fjern lamininopløsningen fra det øverste kammer og vask med 1 ml kold 1x PBS to gange, før cellerne podes.
2. Dissektion af RPE-celler fra svin øjeæble
- Forberedelse af instrumenterne.
- Rengør laminar flowhætten med 75% ethanol og UV-lys. Forbered tre 50 ml sterile centrifugeglas indeholdende ~ 25 ml 75% ethanol, tre 50 ml sterile centrifugerør indeholdende ~ 25 ml 1x PBS og tre 10 cm sterile cellekulturskåle indeholdende ~ 15 ml 1x PBS.
BEMÆRK: Disse indstillinger bruges normalt til at dissekere fire svineøjer. Skaler op, når der bruges flere øjenkugler. For at forbedre cellelevedygtigheden forkøles 1x PBS-buffer på is i mindst 30 minutter. Både 75% ethanol og UV-lys er nødvendige for at sikre, at eksperimentelle instrumenter og celler ikke forurenes. Tænd UV-lampen på forhånd for at sterilisere hele operationsbordet i mindst 15 min.
- Rengør laminar flowhætten med 75% ethanol og UV-lys. Forbered tre 50 ml sterile centrifugeglas indeholdende ~ 25 ml 75% ethanol, tre 50 ml sterile centrifugerør indeholdende ~ 25 ml 1x PBS og tre 10 cm sterile cellekulturskåle indeholdende ~ 15 ml 1x PBS.
- Rengør svinens øjenkugler.
- Få friske øjne fra et slagteri og hold dem på is indtil dissektion. Sug fire svineøjer i blød i ~ 15 ml 75% ethanol i en 10 cm petriskål og brug en saks og tang til at afskære alt det resterende bindevæv og muskler.
BEMÆRK: Fjern så meget væv som muligt uden for sclera for at reducere forureninger. Skær ikke synsnerven på dette tidspunkt for at lette overførslen af øjenkugler under dekontaminerings- og vasketrinnet. Efter dette trin skal alle procedurer udføres i en laminær strømningshætte.
- Få friske øjne fra et slagteri og hold dem på is indtil dissektion. Sug fire svineøjer i blød i ~ 15 ml 75% ethanol i en 10 cm petriskål og brug en saks og tang til at afskære alt det resterende bindevæv og muskler.
- Dekontaminere svineøjeæblerne ved at blødgøre og vaske fire svineøjeæbler i tre 50 ml sterile centrifugerør fyldt med 75% ethanol på en sekventiel måde; Hvert øjeæble dyppes i mindst 5 minutter i hvert rør. Derefter vaskes svineøjeæblerne i tre 50 ml sterile centrifugerør fyldt med 1x PBS på en sekventiel måde; vask hvert øjeæble i mindst 5 minutter i hvert rør (figur 1A). Vend rørene hvert minut for at vaske øjenkuglerne grundigt.
- Dissektion af svin øjenkugler.
- Flyt de fire svineøjeæbler til en 10 cm steril cellekulturskål indeholdende 1x PBS. Trim den ydre overflade af hvert øjeæble igen for at fjerne synsnerven og små snavs (figur 1B). Brug en saks til at lave et lille snit i skæringspunktet mellem limbus og sclera, og fjern derefter hornhinden, iris, linse, glaslegeme og neurale nethinden (for detaljerede strukturer af disse væv, se figur 1).
- Overfør RPE-choroid-sclera-komplekset til en ny 10 cm cellekulturskål og lav fire snit for at flade øjenkoppen i form af et firkløver (figur 1C).
- Udfør fordøjelsen af Trypsin/EDTA-opløsningen ved at placere de fire RPE-choroid-sclera-komplekser i en ny 10 cm skål. Hæld 20 ml frisk Trypsin / EDTA-opløsning for at fusionere RPE-choroid-sclera-komplekserne og sæt skålen i cellekulturinkubatoren ved 37 ° C i ~ 30 minutter.
BEMÆRK: Brug frisk Trypsin / EDTA-opløsning til at adskille RPE-cellerne. Kontroller omhyggeligt tidspunktet for fordøjelsen af Trypsin / EDTA-opløsning, da en længere inkubationstid (mere end 30 min) kan øge forureningen af andre typer celler.
3. Isolering og kultur af RPE-celler fra svin øjeæble
- RPE-dissociation.
- Tag skålen ud af inkubatoren efter 30 minutters inkubation med Trypsin / EDTA-opløsning og tilsæt 20 ml forvarmet kulturmedie (med 10% FBS) til skålen for at neutralisere Trypsin / EDTA-opløsningen.
BEMÆRK: På dette trin bruges kun DMEM/Basic-medier. Når celler når sammenløb, kan tre kulturmedier anvendes afhængigt af de eksperimentelle betingelser: DMEM / Basic media, DMEM / F12 media og MEM-Nic media. - Brug en 5 ml overførselspipette til at adskille RPE-cellerne ved forsigtigt pipettering flere gange. Opsaml cellesuspensioner i 15 ml centrifugeglas. Brug yderligere 10 ml friske kulturmedier (10% FBS) til at vaske RPE-choroid-sclera-komplekserne på fadet ved forsigtigt pipettering for at opnå så mange RPE-celler som muligt.
BEMÆRK: Triturer ikke cellerne for kraftigt. Sørg for at fylde og tømme pipetten med en hastighed på ca. 3 ml/s. Undgå at boble cellesuspensionen.
- Tag skålen ud af inkubatoren efter 30 minutters inkubation med Trypsin / EDTA-opløsning og tilsæt 20 ml forvarmet kulturmedie (med 10% FBS) til skålen for at neutralisere Trypsin / EDTA-opløsningen.
- Opsaml RPE-celler ved at centrifugere glassene ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten suges til ved hjælp af en pipette og tilsættes yderligere 5 ml dyrkningsmedier (10 % FBS) for at resuspendere cellerne og centrifugeres ved 200 x g i yderligere 5 minutter. Supernatanten dekanteres, og cellerne resuspenderes med 12 ml dyrkningsmedier.
BEMÆRK: Når supernatanten suges op, efterlades ca. 1 ml medie for at undgå, at celleklumperne går i stykker. - Såning RPE-celler.
- Frø ~ 1-2 x 105 celler / brønd i 12-brønds kulturplader eller transwellindsatser. Normalt opnås ca. 1,5 x 106 RPE-celler fra fire svineøjer. Skift kulturmediet hver 2. dag og reducer serumkoncentrationen til 1%, når cellerne dækker overfladen af hullerne/indsatserne helt.
BEMÆRK: Flyt ikke cellekulturskålen for ofte, før cellerne fastgøres til dyrkningsskålen/indsatserne.
- Frø ~ 1-2 x 105 celler / brønd i 12-brønds kulturplader eller transwellindsatser. Normalt opnås ca. 1,5 x 106 RPE-celler fra fire svineøjer. Skift kulturmediet hver 2. dag og reducer serumkoncentrationen til 1%, når cellerne dækker overfladen af hullerne/indsatserne helt.
- Skift kulturmediet hver 2. dag, indtil cellerne høstes.
BEMÆRK: Koncentrationen af FBS kan reduceres, når cellerne når sammenløb, og celler kan dyrkes i op til flere måneder for at muliggøre fuld differentiering og modning.
4. Karakterisering af primære RPE-celler fra svin
- Dyrk cellerne ved sammenløb i 1 eller 2 uger, og høst derefter cellerne til yderligere analyse.
- Høst celler til kvantitativ realtids PCR-analyse (qRT-PCR).
- Fjern kulturmediet, vask cellerne med 1 ml kold 1x PBS, og tilsæt derefter 500 μL RNA-ekstraktionsopløsning i hver brønd for at opsamle cellelysat fra ca. 1 x 106 celler.
- Uddrag mRNA13; ca. 4 μg RNA ekstraheres fra hver prøve. Brug 100 ng mRNA til at udføre revers transkription14; fortynd cDNA'et 40 gange til kvantitativ PCR-analyse i realtid. Primere er angivet i tabel 1.
- Høstceller til immunofluorescensfarvning.
- Fjern dyrkningsmediet, vask cellerne med 1 ml kold 1x PBS, og tilsæt derefter 500 μL 4% (w/v) paraformaldehyd i 1x PBS for at fiksere cellerne (ca. 1 x 106 celler/hul) i 30 minutter ved stuetemperatur. Derefter vaskes cellerne med 1x PBS to gange og udføres immunofluorescensfarvning med primære antistoffer (1:100 i 1x PBS suppleret med 1% (w/v) bovint serumalbumin) ved 4 °C natten over og sekundære antistoffer (1:200 i 1x PBS suppleret med 1% (w/v) bovint serumalbumin) ved stuetemperatur i 2 timer i henhold til onlineprotokoller15.
- Immunofluorescensbillederne erhverves af et konfokalmikroskop efter onlinemanualen16.
- Høstceller til Western blot-analyse.
- Fjern dyrkningsmediet, vask cellerne med kold 1x PBS to gange, og tilsæt derefter 80 μL RIPA-buffer (med 1x proteasehæmmer) i hver brønd, og brug celleskrabere til at ridse ca. 1 x 106 celler af opvasken/indsatserne.
- Opsaml cellelysatet fra hvert hul/indsæt i et 1,5 ml mikrocentrifugeglas. Kog cellelysaterne i 10 minutter, og mål derefter proteinkoncentrationer ved hjælp af BCA-sæt; proteinkoncentrationen i hver prøve er ca. 2 mg/ml. Brug 25 μg proteiner fra hver prøve til Western blot-analyse i henhold til onlineprotokoller17.
- For Western blot, inkuberes membranerne i 5 ml primær antistofopløsning (1:1.000 fortynding af primære antistoffer i 1x TBST-opløsning suppleret med 5 % (w/v) bovint serumalbumin) ved 4 °C natten over på en roterende multifunktionsryster.
- Derefter inkuberes membranen med ca. 15 ml sekundær antistofopløsning mod kanin eller mus (1:5.000 fortynding af sekundære antistoffer i 1x TBST-opløsning suppleret med 5% (w/v) fedtfri mælk) ved stuetemperatur i 2 timer på en orbitalryster, afhængigt af kilden til det anvendte primære antistof.
- Måling af transepitelmodstand (TER).
- Vask spisepindeelektroderne med 70% ethanol og steril 1x PBS sekventielt. Placer derefter den kortere ende af elektroden i det øverste kammer og den længere ende i det nederste kammer på transwellindsatserne, og klik på knappen på epitelvoltmeteret for målingerne. TER-målingerne af hver brønd registreres i tre eksemplarer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De primære porcine RPE (pRPE) celler blev dyrket i DMEM / Basic medier med 10% FBS, og cellemorfologi under lysmikroskop blev fotograferet 2 dage (figur 2A), 6 dage (figur 2B) og 10 dage (figur 2C) efter såning. Efter 1 uge blev der observeret et sammenflydende monolag af pigmenterede pRPE-celler med brostensmorfologier.
For bedre at karakterisere de primære pRPE-celler blev primære humane RPE-celler (hRPE) ved passage 3 (P3) 18 og ARPE-19-celler dyrket i DMEM / Basic-medier med 1% FBS for en anden wk, og derefter blev det samlede mRNA og protein i de dyrkede celler samt svin RPE / choroidvæv høstet. Ekspressionsniveauerne af nøglekarakteristiske gener19 og proteinmarkører for moden RPE blev evalueret af qRT-PCR og Western blot. Sammenlignet med ARPE-19-celler bevarede pRPE-celler signifikant højere ekspressionsniveauer af gener, der fungerer i native RPE-sekretion (figur 3A (c)), fagocytose (figur 3A (i)), transport (figur 3A (a), (d)), tætte kryds (figur 3A (j)), barrieredannelse (figur 3A (b)) samt visuel cyklus (figur 3A (e), B). Imidlertid var ekspressionsniveauerne for Krt8 og Krt18, to cytoskeletmarkørgener i RPE, signifikant lavere i primære pRPE-celler sammenlignet med primære hRPE- og ARPE-19-celler (figur 3A (g), (h)). Desuden var itgav, som deltager i fagocytose, også lavere i primære pRPE-celler (figur 3A (f)). Da ekspressionsniveauerne af disse tre gener i pRPE-celler var ens med svin RPE / choroidvæv, kan dette indikere genekspressionsforskellene mellem arterne. Desuden blev ekspressionsniveauet for Tyr, som er ansvarlig for melaninproduktion, stærkt reduceret i både primære pRPE- og hRPE-celler (figur 3A (k)), hvilket kan forklare tabet af pigmentering i langsigtede dyrkede celler. Forskellene i qRT-PCR-resultaterne observeret i dataene fra humane pRPE- og svinepRPE-celler kan skyldes den længere opbevaring og det højere passageantal (P3) af human pRPE, hvilket indikerer et tab af RPE-tegn ved subkultur. Derudover viste Western blot, at RPE65-proteinet, som er et nøgleenzym i den visuelle cyklus med RPE-celler, blev udtrykt i pRPE-celler, mens dets ekspressionsniveau blev signifikant reduceret i primære hRPE-celler og ARPE-19-celler (figur 3B, C).
For yderligere at karakterisere RPE-cellernes polaritets- og barrierefunktioner blev de dyrkede sammenflydende monolag af pRPE- og ARPE-19-celler dyrket i transwellindsatser med DMEM / Basic, DMEM / F12 og MEM-Nic-medier til 1 wk (figur 4). Under disse dyrkningsbetingelser afslørede Na+-K+-ATPase (figur 4A-F) og ZO-1 (figur 4G-L) fluorescerende farvningsresultater, at pRPE-celler havde højere ekspressionsniveauer af både Na+-K+-ATPase og ZO-1 end ARPE-19-celler. Den lige fordeling af Na+-K+-ATPase på pRPE-cellernes apikale og basale overflade indikerede, at der var behov for længere dyrkningstid for at genoprette cellepolariteter in vitro.
RPE danner tætte kryds nær sin apikale overflade for tæt at regulere udvekslingen af metabolitter mellem den indre nethinden og choroider20. ZO-1-farvning antydede, at tætte forbindelsesproteiner normalt var lokaliseret ved plasmamembranen i primære pRPE-celler med regelmæssige brostenmorfologier, men ikke af ARPE-19-celler. Blandt de tre kulturmedier blev de bedste ZO-1-farvningsmønstre observeret i celler dyrket i DMEM / Basic, mens DMEM / F12 ikke kunne opretholde brostenmorfologien af pRPE-celler. En højere TER-værdi tjener som indikator for tæt forbindelsesdannelse og bedre barrierefunktioner af RPE-celler21. For at bekræfte funktionen af stramme kryds blev transepitelmodstand (TER) målt. Der blev imidlertid kun påvist lidt højere TER sammenlignet med tomme transwell-skær (figur 4M,N).
I nethinden eksisterer Bruchs membran mellem RPE og choroid. Hovedkomponenterne i Bruchs membran er kollagen type IV, proteoglycaner og laminin22. For at simulere den understøttende virkning af Bruchs membran på RPE blev laminin spredt på overfladen af transwellmembranen for at lette modningen af dyrkede RPE-celler. Baseret på resultaterne opnået fra figur 4 blev de sammenflydende pRPE-celler dyrket på transwell-indsatser i DMEM / Basic-medier med 1% FBS i 2 uger. Immunofluorescerende farvningsresultater viste, at RPE-specifikke proteiner RPE65 blev udtrykt i alle pRPE-celler (figur 5A,B). Na+-K+-ATPase blev fordelt på den apikale overflade af pRPE-celler, hvilket tyder på genetablering af cellepolariteter (figur 5C,D). Både ZO-1-farvning og TER-resultater indikerede, at tætte kryds var veldannede i primære pRPE-celler, når de blev dyrket på laminin (figur 5E, F, H). Figur 5G viser celler, der er farvet med Hoechst-farvestof.
Desuden viste Western blot, at både pRPE- og ARPE-19-celler producerede vækstfaktorer, herunder pigmentepitelafledt faktor (PEDF) og vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) (figur 6A). Efter at sammenflydende monolag af pRPE var blevet dyrket i transwellskær med DMEM/Basic, DMEM/F12 og MEM-Nic-medier i 1 uge, blev kulturmedier fra transwellindsatsernes øverste og nederste kammer opsamlet, og den udskillede VEGF blev kvantificeret af ELISA. Når DMEM/Basic- og MEM-Nic-medier blev brugt til cellekultur, udskilte pPRE-celler mere VEGF end celler i DMEM/F12-medier (figur 6B). Der kunne imidlertid ikke påvises forskelle i VEGF-mængderne mellem transwellindsatsernes øverste og nederste kammer under alle testede forhold (figur 6B). Efter at primære pRPE-celler var blevet dyrket på indsatserne belagt med laminin og i DMEM/Basic-medier i 2 uger, blev medierne fra det øverste og nederste kammer desuden opsamlet. Western blot-analyse viste højere niveauer af PEDF i det øverste kammer end det nederste kammer, mens proteinniveauerne i udskilt VEGF var ens i begge kamre (figur 6C). Disse resultater understøttede yderligere genoprettelsen af cellepolaritet, når primære pRPE-celler blev dyrket i yderligere 2 uger, efter at de nåede sammenløb på laminin.
Figur 1: Grundlæggende trin i pRPE-celleisolering . (A) Vask svineøjeæbler med 1x PBS i 50 ml sterile centrifugeglas. (B,C) Forbered RPE-choroid-sclera-komplekser til enzymatisk fordøjelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Primære pRPE-cellemorfologier efter cellekultur. Repræsentative billeder af primære pRPE-celler på (A) dag 2, (B) dag 6 og (C) dag 10. Skalabjælke 250 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Ekspressionsniveauer af nøglesignaturgener og proteiner i dyrkede RPE-celler. (A) qRT-PCR-analyse af mRNA-niveauer af signaturgener i primære pRPE-celler, primære hRPE-celler, ARPE-19-celler og pRPE/choroidvæv. Gapdh blev brugt som husholdningsgen for qRT-PCR. Fire biologiske replikater blev anvendt til primære pRPE-celler og ARPE-19-celler, mens tre biologiske replikater blev brugt til primære hRPE-celler og pRPE / choroidvæv. Genekspressionsniveauerne i ARPE-19-celler blev indstillet som kontroller. (B) Western blot-analyse af RPE65-proteiner i ARPE-19- og pRPE-celler. Vinculin blev brugt som lastkontrol. C) Western blot-analyse af RPE65-proteiner i primære hRPE-celler og pRPE/choroidvæv. Vinculin blev brugt som lastkontrol. Til sammenligning blev elevernes t-test brugt, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: One-wk-kultur af primære pRPE- og ARPE-19-celler i DMEM/Basic-, DMEM/F12- og MEM-Nic-medier med 1 % FBS. (A) Na+-K+-ATPase-fluorescerende farvning (rød) af primære pRPE-celler i DMEM/Basic, (B) DMEM/F12 og (C) MEM-Nic-medier. (D) Na+-K+-ATPase fluorescerende farvning (rød) af ARPE-19-celler i DMEM/Basic-medier, (E) DMEM/F12-medier og (F) MEM-Nic-medier. (G) ZO-1 fluorescerende farvning (grøn) af primære pRPE-celler i DMEM / Basic media, (H) DMEM / F12 media og (I) MEM-Nic media. (J) ZO-1 fluorescerende farvning (grøn) i ARPE-19-celler i DMEM / Basic-medier, (K) DMEM / F12-medier og (L) MEM-Nic-medier. TER-målinger efter primære pRPE (M) og ARPE-19 (N) celler blev dyrket i DMEM / Basic, DMEM / F12 og MEM-Nic medier i 1 uge. For hver type celler blev der opnået data fra mindst tre forskellige brønde. Til sammenligning blev elevernes t-test brugt, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Skalabjælke 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: To-wk kultur af pRPE celler i DMEM / Basic medier med 1% FBS. (A-F) Celler dyrket med eller uden laminin blev farvet med RPE65 (A, B, Red), Na+-K +-ATPase (C, D, Red), ZO-1 (E, F, Green) og (G) Hoechst (Blue). H) TER-målinger i celleark dyrket med eller uden laminin. For forskellige behandlinger blev der indhentet data fra fire forskellige brønde. Til sammenligning blev elevernes t-test brugt, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Sekretoriske funktioner af dyrkede primære pRPE- og ARPE-19-celler. (A) Western blot-analyse af VEGF og PEDF i primære pRPE- og ARPE-19-celler. (B) Udskilt VEGF i det øverste og nederste kammer af transwell-indsatser med primære pRPE-celler, når sammenflydende celler blev dyrket i DMEM/Basic-, DMEM/F12- og MEM-Nic-medier i 1 uger. (C) Udskilt PEDF og VEGF i øverste og nederste kammer af transwell-indsatser med primær pRPE i DMEM/Basic-medier til 2 uger. For forskellige behandlinger blev der indhentet data fra tre forskellige brønde. Til sammenligning blev elevernes t-test brugt, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Homo sapiens | Sus scrofa | |
| Bedste1 | F: GAAGGCAAGGACGAGCAAG | F: GGACACCTGTATGCCTACGA |
| R: TCCAACTGCTTGTGTTCTGC | R: GGAACGTGAAGAGGGGTACA | |
| Cldn19 | F: GGTGACCCAGGAGTTCTTCA | F: TCGTGACCCAGGAGTTCTTC |
| R: CTGTTGGGTCTCTCTGGCTC | R: GCTGCTGTTGGATCGCTC | |
| Itgav | F: CGCAGTCCCATCTCAAATCC | F: GCTTTCTTCAGGACGGAACA |
| R: GGCCCTGTATAAGATAGCTCGA | R: GAAATGAGCTGACCTTGCCA | |
| Krt8 | F: GGAGCAGATCAAGACCCTCA | F: CCCAGGAGAAGGAGCAGATC |
| R: GCCGCCTAAGGTTGTTGATG | R: ATGTTGTCGATGTTGCTCCG | |
| Krt18 | F: CTTGGAGAAGAAGGGACCCC | F: GCTGATAATCGGAGGCTGGA |
| R: GGCCAGCTCTGTCTCATACT | R: GAAGTCATCAGCAGCGAGAC | |
| Mertk | F: GTGTGCAGCGTTCAGACAAT | F: GCGGCTATTTCTTGGTGGAA |
| R: AAAATGTTGACGGGCTCAGG | R: ACGTAGATGGGGTCAGACAC | |
| Serpinf1 | F: CAGATGAAAGGGAAGCTCGC | F: AAGACGTCGCTGGAGGATTT |
| R: TTAGGGTCCGACATGGG | R: GGTCACTTTCAGAGGCAGGA | |
| SLC16A8 | F: GGGTGTCCTCCATGCTA | F: CAGTTCGAGGTGCTCATGG |
| R: GTCAGGTAGAGCTCCAGGAG | R: GACAGCCATGAAGACACCAG | |
| Stra6 | F: CTTTGCAGGAAGAAGCTGGG | F: CTAGCCGTGTTGTCGATCCT |
| R: TAAATGGCCGTCCCTGTCAG | R: GACCATGAAGACACAGCAGCAG | |
| TJP1 | F: ACAGGAAAATGACCGAGTTGC | F: AAGACTTGTCAGCTCAGCCA |
| R: TGGTTCAGGATCAGGACGAC | R: CCAGCATCTCGAGGTTCACT | |
| Tyr | F: ACTCAGCCCAGCATCATTCT | F: ATCTACTCAGCCCAGCATCC |
| R: ACATCAGCTGAAGAGGGGAG | R: GAGCCTTGGAGTCCTGGATT | |
| Gapdh | F: CAGCCTCAAGATCATCAGCA | F: CATCCTGGGCTACACTGAGG |
| R: ATGATGTTCTGGAGAGCCCC | R: GGGGCTTACTCCTTGGAG |
Tabel 1: Primere til qRT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her er beskrevet en detaljeret og optimeret protokol til isolering, dyrkning og karakterisering af RPE-celler fra svineøjeæbler, som genererer en god model til in vitro-karakterisering af RPE-celler og RPE-relaterede lidelsesstudier. Metoder til isolering af RPE fra menneske-, muse- og rotteøjne er tidligere beskrevet23,24,25. Det er dog vanskeligt at få menneskelige øjne i nogle laboratorier, og det rejser normalt etiske spørgsmål. RPE-vævene hos mus og rotter er relativt små, cellerne beskadiges let under adskillelse, og kun få celler kan opnås fra hvert dyr. I modsætning hertil er svineøjne meget lettere at opnå og håndtere, hvilket stabilt kunne generere et relativt stort antal primære celler fra et enkelt øjeæble. I nogle undersøgelser bruges pincet til mekanisk adskillelse af RPE, hvilket let kan føre til celledød. Derfor er hyaluronsyre, dispase og Trypsin / EDTA-opløsning tidligere blevet anvendt til at dissociere RPE-celler. Tidligere undersøgelser har vist, at Trypsin / EDTA løsning har evnen til at hjælpe RPE løsne fra choroid21. Derfor blev Trypsin / EDTA-opløsning brugt til at fordøje svinevævene, som genererer optimale resultater. Efter trypsin/EDTA-neuralisering kunne RPE-væv dissocieres til enkeltcellesuspension ved forsigtigt pipettering med en pipettespids. Et trick er, at frisk Trypsin / EDTA-opløsning anbefales til hvert eksperiment for fuldt ud at dissociere RPE-celler. På grund af det store område af RPE-vævene i svineøjekugler skal det halvskålformede RPE-choroid-sclera-kompleks skæres i form af et firkløver, hvilket bidrager til fuld kontakt mellem RPE-vævene og Trypsin / EDTA-opløsningen for at lette deres adskillelse fra choroid. Fordøjelsestiden bør dog ikke overstige en halv time. Inden for denne tid vil andre væv undtagen RPE ikke blive fordøjet, hvilket effektivt kan reducere forureningerne fra andre typer celler.
Laminin blev spredt på overfladen af transwellmembranen for at simulere den understøttende virkning af Bruchs membran på RPE. Resultaterne viste, at laminin var gavnligt for væksten af pRPE-celler, hvilket stimulerede ekspressionen af transportør- og tight junction-proteiner. Resultaterne viste imidlertid også, at en længere dyrkningstid på ca. 2 uger var nødvendig for primære pRPE-celler for at genoprette visse træk ved native RPE-væv, herunder cellepolaritet og tætte kryds.
En mangel ved primær RPE-kultur er, at det er vanskeligt at opretholde visuelle cyklusenzymekspressioner in vitro. Derfor er det afgørende at undersøge, om dyrkede RPE-celler kan udtrykke RPE-specifikke proteiner RPE65. Sammenlignet med ARPE-19-celler udtrykte pRPE-celler signifikant mere RPE65-protein. I modsætning hertil blev der kun observeret et svagt bånd af RPE65-protein i ARPE-19-cellelysater i Western blot. Det er interessant at observere, at molekylvægten af RPE65 var lidt forskellig mellem mennesker og svin (figur 3B,C). Tabet af RPE65-ekspression i dyrkede RPE-celler forbliver som et mysterium. Selv i dyrkede primære celler gik RPE65 gradvist tabt med passager (data ikke vist). Indtil nu kræver det yderligere undersøgelse, hvordan man opretholder ekspressionen af RPE65 in vitro, i betragtning af at visuel cyklus er en kritisk funktion for indfødte RPE-væv. For det andet er en væsentlig begrænsning ved denne protokol, at in vitro-dyrkede RPE-celler ikke kan passeres. Ved langvarig dyrkning har pRPE-celler tendens til at miste deres sekskantede form og TER samt pigmentering, så kun passage 0-celler kan bruges. En anden begrænsning af denne kulturprotokol er, at genetiske mutationer, der fører til arvelige nethindesygdomme, er vanskelige at reproducere i disse celler. Derfor kan virusmedieret genredigering anvendes til at studere arvelige RPE-lidelser som Leger medfødt amaurose i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfatterne oplyste, at der ikke er nogen interessekonflikter.
Alle forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne vise deres taknemmelighed og respekt for alle dyr, der bidrager med deres celler i denne undersøgelse. Denne undersøgelse blev delvist støttet af tilskud fra National Key R&D Program of China (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao og Grant nr. 2018YFA0107301, Wei Li). Forfatterne takker Jingru Huang og Xiang You fra Central Lab, School of Medicine, Xiamen University for teknisk support i konfokal billeddannelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ARPE-19 cells | CCTCC | GDC0323 | |
| Bovine serum albumin | Yeasen | 36101ES60 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM 880 with Airyscan | |
| ChemiDoc Touch | Bio-Rad | 1708370 | |
| Cell scraper | Sangon | F619301 | |
| 10 cm culture dish | NEST | 121621EH01 | |
| 12-well culture plate | NEST | 29821075P | |
| DMEM F12 Medium | Gibco | C11330500BT | |
| DMEM basic Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EVOM2 | World Precision Instruments | EVOM2 | For TER measurement |
| Fetal bovine serum | ExCell Bio | FSP500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 0300-0108P | |
| Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 5196-2504 | |
| hydrocortisone | MCE | HY-N0583/CS-2226 | |
| Hoechst 33342 solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| LightCycler 96 Instrument | Roche | 5815916001 | |
| Liothyronine | MCE | HY-A0070A/CS-4141 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| MEM(1X)+GlutaMAX Medium | Gibco | 10566-016 | |
| MEM NEAA(100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Millex-GP syringe filter unit | Millipore | SLGPR33RB | |
| N1 | Sigma-Aldrich | SLCF4683 | |
| NcmECL Ultra | New Cell&Molecular Biotech | P10300 | |
| Non-fat Powdered Milk | Solarbio | D8340 | |
| Nicotinamide | SparkJade | SJ-MV0061 | |
| Na+-K+ ATPase antibody | Abcam | ab76020 | Recognize both human and porcine proteins |
| PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%) | Epizyme | PG112 | |
| primary Human RPE cells | - | - | Generous gift from Shoubi Wang lab |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Prism | GraphPad by Dotmatics | version 8.0 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | APExBIO | K1024 | |
| PRE65 antibody | Proteintech | 17939-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| PEDF antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-390172 | Recognize both human and porcine proteins |
| 100 x penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-031-1BCS | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | RARBIO | RA-9005 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | Toyobo | FSQ-201 | |
| RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 601052 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 602052 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Taurine | Damas-beta | 107-35-7 | |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | RNA extraction solution |
| TB Green Fast qPCR Mix | Takara | RR430A | |
| 12-well transwell inserts | Labselect | 14212 | |
| VEGF antibody | Proteintech | 19003-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| VEGF ELISA kit | Novusbio | VAL106 | |
| ZO-1 antibody | ABclonal | A0659 | Recognize both human and porcine proteins |
References
- Tan, L. X., Germer, C. J., La Cunza, N., Lakkaraju, A. Complement activation, lipid metabolism, and mitochondrial injury: Converging pathways in age-related macular degeneration. Redox Biology. 37, 101781 (2020).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Ducloyer, J. B., Le Meur, G., Cronin, T., Adjali, O., Weber, M. Gene therapy for retinitis pigmentosa. Medecine Sciences. 36 (6-7), 607-615 (2020).
- den Hollander, A. I., Roepman, R., Koenekoop, R. K., Cremers, F. P. Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 391-419 (2008).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Smith, D. T. Melanin pigment in the pigmented epithelium of the retina of the embryo chick eye studied in vivo and in vino. The Anatomical Record. 18, 260-261 (1920).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- D'Antonio-Chronowska, A., D'Antonio, M., Frazer, K. A. In vitro differentiation of human iPSC-derived retinal pigment epithelium cells (iPSC-RPE). Bio-Protocol. 9 (24), 3469 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- Scientific, T. , Available from: https://www.thermofisher.cn/document-connect/document connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2Ftrizol_reagent.pdf (2022).
- Toyota. , Available from: https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf (2022).
- Abcam. , Available from: https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol (2022).
- Zeiss. , Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals (2022).
- Cell Signal Technology. , Available from: https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western (2022).
- Wang, S., et al. Reversed senescence of retinal pigment epithelial cell by coculture with embryonic stem cell via the TGFbeta and PI3K pathways. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 588050 (2020).
- Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Experimental Eye Research. 126, 1-4 (2014).
- Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Experimental Eye Research. 126, 5-15 (2014).
- Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. Physiology and function of the tight junction. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002584 (2009).
- Nita, M., Strzalka-Mrozik, B., Grzybowski, A., Mazurek, U., Romaniuk, W. Age-related macular degeneration and changes in the extracellular matrix. Medical Science Monitor. 20, 1003-1016 (2014).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Langenfeld, A., Julien, S., Schraermeyer, U. An improved method for the isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult rats. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1493-1502 (2015).
- Sonoda, S. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
