Summary
Hier wordt een eenvoudig te volgen methode gepresenteerd om primaire retinale pigmentepitheelcellen van varkens in vitro te kweken.
Abstract
Het retinale pigmentepitheel (RPE) is een monolaag van gepolariseerde gepigmenteerde epitheelcellen, gelegen tussen het vaatvlies en neuroretina in het netvlies. Meerdere functies, waaronder fagocytose, transport van voedingsstoffen / metabolieten, vitamine A-metabolisme, enz., Worden dagelijks door de RPE uitgevoerd. RPE-cellen zijn terminaal gedifferentieerde epitheelcellen met weinig of geen regeneratief vermogen. Verlies van RPE-cellen resulteert in meerdere oogziekten die leiden tot visuele beperkingen, zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie. Daarom is de vaststelling van een in vitro kweekmodel van primaire RPE-cellen, dat meer lijkt op de RPE in vivo dan cellijnen, van cruciaal belang voor de karakteristieke en mechanistische studies van RPE-cellen. Gezien het feit dat de bron van menselijke oogbollen beperkt is, maken we een protocol om primaire varkens RPE-cellen te kweken. Door dit protocol te gebruiken, kunnen RPE-cellen gemakkelijk worden gedissocieerd van volwassen varkensoogbollen. Vervolgens hechten deze gedissocieerde cellen zich aan kweekschalen / inserts, prolifereren zich om een confluente monolaag te vormen en herstellen snel de belangrijkste kenmerken van epitheelweefsel in vivo binnen 2 weken. Door qRT-PCR wordt aangetoond dat RPE-cellen van primaire varkens meerdere signatuurgenen tot expressie brengen op vergelijkbare niveaus met inheems RPE-weefsel, terwijl de expressies van de meeste van deze genen verloren gaan / sterk verminderd zijn in menselijke RPE-achtige cellen, ARPE-19. Bovendien toont de immunofluorescentiekleuring de verdeling van tight junction, weefselpolariteit en cytoskeleteiwitten, evenals de aanwezigheid van RPE65, een isomerase dat cruciaal is voor het vitamine A-metabolisme, in gekweekte primaire cellen. Al met al hebben we een eenvoudig te volgen benadering ontwikkeld om primaire varkens RPE-cellen te kweken met een hoge zuiverheid en native RPE-kenmerken, die zou kunnen dienen als een goed model om RPE-fysiologie te begrijpen, celtoxiciteiten te bestuderen en medicijnscreenings te vergemakkelijken.
Introduction
Het retinale pigmentepitheel (RPE) bevindt zich tussen fotoreceptoren en choriocapillaris in de buitenste laag van het netvlies1 met meerdere functies, waaronder het vormen van de bloed-retinale barrière, het transporteren en uitwisselen van voedingsstoffen en retinale metabolieten, het recyclen van vitamine A om een normale visuele cyclus te behouden, en fagocytose en klaring van afgeworpen fotoreceptor buitenste segmenten (POSs)2,3 . Omdat POS'en constante zelfvernieuwing vereisen om visie te genereren, moeten de RPE-cellen continu losgemaakte POS'en overspoelen om retinale homeostase te behouden4. Daarom resulteert RPE-disfunctie in veel verblindende oogziekten, zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD)4, retinitis pigmentosa (RP)5, Leber congenitale amaurosis6, diabetische retinopathie7, enz. Tot nu toe blijft de exacte pathogenese van de meeste van deze ziekten ongrijpbaar. Als gevolg hiervan wordt RPE-celcultuur opgericht om RPE-celbiologie, pathologische veranderingen en onderliggende mechanismen te bestuderen.
Als het eenvoudigste model om celbiologie te bestuderen, werd de kweek van RPE-cellen al in de jaren 1920 gestart8. Hoewel ARPE-19 veel wordt gebruikt als RPE-cellen, roepen verlies van pigmentatie, kasseimorfologie en vooral de barrièrefuncties in deze cellijn veel zorgen op9. Ter vergelijking: de kweek van primaire menselijke RPE-cellen biedt een realistischer scenario voor fysiologische en pathologische studies9. De relatief beperkte beschikbaarheid beperkt echter het gebruik ervan en ethische kwesties bestaan altijd. Daarnaast gebruikten verschillende groepen muismodellen om RPE-cellen te kweken. De grootte van het muizenoog is echter klein en een enkele cultuur vereist meestal veel muizen, wat niet handig is9. Onlangs hebben wetenschappers nieuwe methoden ontwikkeld om menselijke embryonale stamcellen of geïnduceerde pluripotente stamcellen te gebruiken om RPE-cellen af te leiden. Hoewel deze techniek een bijzonder potentieel heeft voor de behandeling van erfelijke RPE-aandoeningen, is het tijdrovend en duurt het meestal enkele maanden om volwassen RPE-cellen te genereren10. Om deze problemen te overwinnen, introduceren we hier een eenvoudig te volgen protocol om RPE-cellen met een hoge zuiverheidsgraad routinematig in het laboratorium te isoleren en te kweken. Onder geschikte kweekomstandigheden kunnen deze cellen typische RPE-functies weergeven en typische RPE-morfologieën vertonen. Daarom kan deze kweekmethode een goed model bieden om de RPE-fysiologie te begrijpen, cytotoxiciteit te bestuderen, pathologische mechanismen van gerelateerde oogziekten te onderzoeken en medicijnscreenings uit te voeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het gebruik van proefdieren voldeed aan de voorschriften van de Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) en werd goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Experimenteel Dierbeheer van xiamen University.
1. Voorbereiding van experimentele chirurgische apparaten, weefselverteringsenzym en celkweekbuffer
- Bereid de experimentele chirurgische apparaten voor door twee paar oogheelkundige chirurgische scharen en tangen de dag voor de oogboldissectie te reinigen en te autoclaveren en vervolgens de doos te drogen met chirurgische apparaten in een algemene protocoloven bij 65 ° C 's nachts.
- Voorbereiding van cultuurmedia.
- Bereid DMEM/Basic media aangevuld met 10% (v/v) foetaal runderserum, 2 mM L-glutamine en 1% (v/v) penicilline (100 E/ml) en streptomycine (100 E/ml).
- Bereid DMEM/F12 media aangevuld met 1% (v/v) FBS en 1% (v/v) penicilline (100 U/ml) en streptomycine (100 E/ml).
- Bereid MEM-Nic11, door MEM alfa aan te vullen met 2 mM L-glutamine, 1% FBS, 1% (v/v) penicilline (100 U/ml) en streptomycine (100 U/ml), 0,1 mM NEAA, 1% (v/v) N1-supplement, taurine (0,25 mg/ml), hydrocortison (20 ng/ml), triiodo-thyronine (0,013 ng/ml) en 10 mM nicotinamide.
OPMERKING: Om de levensvatbaarheid en proliferatie van cellen te verbeteren, kan het percentage FBS worden verhoogd tot 20% om de spijsvertering enzymen te neutraliseren en de gedissocieerde cellen te zaaien. Voor langdurige celkweek kan het percentage FBS worden verlaagd tot slechts 1%12.
- Ontdooi het weefselverteringsenzym aliquot (0,25% (w/v) Trypsine/EDTA-oplossing aangevuld met 0,91 mM EDTA, hierna Trypsine/EDTA-oplossing genoemd) tijdens het experiment.
OPMERKING: Verse Trypsin/EDTA-oplossing moet elke keer worden gebruikt om optimale resultaten te verkrijgen. Aliquot 10 ml verse Trypsin/EDTA-oplossing in elke steriele centrifugebuis van 15 ml en vries de aliquots in op een koelkast van -20 °C tot gebruik. - Dissectie oplossing.
- Steriliseer 1x Fosfaat Gebufferde Zoutoplossing (PBS) (pH 7,2) aangevuld met 2% (v/v) penicilline (100 U/ml) en streptomycine (100 E/ml) door de oplossing door een spuitfilterunit van 0,22 μm te filteren.
- Bedek de kweekplaten en transwell inzetstukken.
- Was de putjes en transwell inzetstukken met 1x PBS. Verwijder de PBS uit putten en transwells met een pipet en voeg vervolgens 1 ml verse 1x PBS toe aan de onderste kamer en 600 μL 10 μg / ml laminineoplossing aan de bovenste kamer.
- Incubeer de platen/transwell inserts in de celkweekincubator 's nachts bij 37 °C en 5% CO2. Verwijder de laminine-oplossing uit de bovenste kamer en was tweemaal met 1 ml koud 1x PBS voordat u de cellen zaait.
2. Dissectie van varkensoogbal RPE-cellen
- Voorbereiding van de instrumenten.
- Reinig de laminaire stromingskap met 75% ethanol en UV-licht. Bereid drie steriele centrifugebuizen van 50 ml met ~ 25 ml 75% ethanol, drie steriele centrifugebuizen van 50 ml met ~ 25 ml 1x PBS en drie steriele celkweekschalen van 10 cm met ~ 15 ml 1x PBS.
OPMERKING: Deze instellingen worden meestal gebruikt voor het ontleden van vier varkensoogbollen. Schaal op wanneer er meer oogbollen worden gebruikt. Om de levensvatbaarheid van de cel te verbeteren, precool 1x PBS buffer op ijs gedurende ten minste 30 minuten. Zowel 75% ethanol als UV-licht zijn nodig om ervoor te zorgen dat experimentele instrumenten en cellen niet besmet zijn. Zet de UV-lamp van tevoren aan om de hele operatietafel minstens 15 minuten te steriliseren.
- Reinig de laminaire stromingskap met 75% ethanol en UV-licht. Bereid drie steriele centrifugebuizen van 50 ml met ~ 25 ml 75% ethanol, drie steriele centrifugebuizen van 50 ml met ~ 25 ml 1x PBS en drie steriele celkweekschalen van 10 cm met ~ 15 ml 1x PBS.
- Maak de oogbollen van het varken schoon.
- Haal verse oogbollen uit een slachthuis en bewaar ze op ijs totdat ze worden gedissectied. Week vier varkensoogbollen in ~ 15 ml 75% ethanol in een petrischaaltje van 10 cm en gebruik een schaar en tang om alle resterende bindweefsels en spieren af te snijden.
OPMERKING: Verwijder zoveel mogelijk weefsel van buiten de sclera om besmettingen te verminderen. Snijd de oogzenuw op dit moment niet door om de overdracht van oogbollen tijdens de decontaminatie- en wasstap te vergemakkelijken. Na deze stap moeten alle procedures worden uitgevoerd in een laminaire stromingskap.
- Haal verse oogbollen uit een slachthuis en bewaar ze op ijs totdat ze worden gedissectied. Week vier varkensoogbollen in ~ 15 ml 75% ethanol in een petrischaaltje van 10 cm en gebruik een schaar en tang om alle resterende bindweefsels en spieren af te snijden.
- Ontsmet de oogbollen van het varkenstaarten door vier varkensoogbollen in drie steriele centrifugebuizen van 50 ml gevuld met 75% ethanol op een sequentiële manier te weken en te wassen; elke oogbol wordt gedurende ten minste 5 minuten in elke buis gedompeld. Was vervolgens de oogbollen van het varkens in drie steriele centrifugebuizen van 50 ml gevuld met 1x PBS op een sequentiële manier; was elke oogbol gedurende ten minste 5 minuten in elke buis (figuur 1A). Keer de buisjes elke minuut om om de oogbollen grondig te wassen.
- Dissectie van varkensoogbollen.
- Verplaats de vier varkensoogbollen in een steriele celkweekschaal van 10 cm met 1x PBS. Snijd het buitenoppervlak van elke oogbol opnieuw bij om de oogzenuw en kleine brokstukken te verwijderen (figuur 1B). Gebruik een schaar om een kleine snede te maken op het snijpunt van de limbus en sclera en verwijder vervolgens het hoornvlies, de iris, de lens, het glasachtig lichaam en het neurale netvlies (voor gedetailleerde structuren van deze weefsels raadpleegt u figuur 1).
- Breng het RPE-choroïde-sclera-complex over in een nieuwe celkweekschaal van 10 cm en maak vier sneden om de oogschelp plat te maken in de vorm van een klavertje vier (figuur 1C).
- Voer trypsine / EDTA-oplossingsvertering uit door de vier RPE-choroïde-sclera-complexen in een nieuwe schaal van 10 cm te plaatsen. Giet 20 ml verse Trypsin/EDTA-oplossing om de RPE-choroïde-sclera-complexen samen te voegen en plaats de schaal in de celkweekincubator bij 37 °C gedurende ~30 min.
OPMERKING: Gebruik verse Trypsine/EDTA-oplossing om de RPE-cellen te dissociëren. Controleer zorgvuldig de tijd van trypsine / EDTA-oplossingsvertering, omdat een langere incubatietijd (meer dan 30 minuten) de besmetting van andere soorten cellen kan verhogen.
3. Isolatie en kweek van varkensoogbal RPE-cellen
- RPE-dissociatie.
- Haal het gerecht uit de incubator na 30 minuten incubatie met Trypsin/EDTA-oplossing en voeg 20 ml voorgewarmde kweekmedia (met 10% FBS) toe aan het gerecht om de Trypsine/EDTA-oplossing te neutraliseren.
OPMERKING: Bij deze stap worden alleen DMEM/Basic-media gebruikt. Wanneer cellen confluency bereiken, kunnen drie kweekmedia worden gebruikt, afhankelijk van de experimentele omstandigheden: DMEM / Basic-media, DMEM / F12-media en MEM-Nic-media. - Gebruik een transferpipet van 5 ml om de RPE-cellen te dissociëren door meerdere keren voorzichtig te pipetteren. Verzamel celsuspensies in centrifugebuizen van 15 ml. Gebruik nog eens 10 ml verse kweekmedia (10% FBS) om de RPE-choroïde-sclera-complexen op de schaal te wassen door voorzichtig te pipetteren om zoveel mogelijk RPE-cellen te verkrijgen.
OPMERKING: Trakteer de cellen niet te krachtig. Zorg ervoor dat u de pipet vult en leegt met een snelheid van ongeveer 3 ml / s. Vermijd borrelen van de celsuspensie.
- Haal het gerecht uit de incubator na 30 minuten incubatie met Trypsin/EDTA-oplossing en voeg 20 ml voorgewarmde kweekmedia (met 10% FBS) toe aan het gerecht om de Trypsine/EDTA-oplossing te neutraliseren.
- Verzamel RPE-cellen door de buizen te centrifugeren bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Aspirateer het supernatant met behulp van een pipet en voeg nog eens 5 ml kweekmedia (10% FBS) toe om de cellen te resuspenderen en centrifugeer bij 200 x g gedurende nog eens 5 minuten. Decanteer het supernatant en resuspendeer de cellen met 12 ml kweekmedia.
OPMERKING: Laat bij het aspirateren van het supernatant ongeveer 1 ml media achter om het breken van celklonters te voorkomen. - Zaaien van RPE-cellen.
- Zaad ~ 1-2 x 105 cellen / goed in 12-well kweekplaten of transwell inserts. Meestal worden ongeveer 1,5 x 106 RPE-cellen verkregen uit vier varkensoogbollen. Verander de kweekmedia om de 2 dagen en verlaag de serumconcentratie tot 1% wanneer de cellen het oppervlak van de putten/inserts volledig bedekken.
OPMERKING: Verplaats de celkweekschaal niet te vaak voordat cellen zich aan de kweekschaal /inzetstukken hechten.
- Zaad ~ 1-2 x 105 cellen / goed in 12-well kweekplaten of transwell inserts. Meestal worden ongeveer 1,5 x 106 RPE-cellen verkregen uit vier varkensoogbollen. Verander de kweekmedia om de 2 dagen en verlaag de serumconcentratie tot 1% wanneer de cellen het oppervlak van de putten/inserts volledig bedekken.
- Verander de kweekmedia om de 2 dagen totdat de cellen zijn geoogst.
OPMERKING: De concentratie van FBS kan worden verlaagd nadat cellen confluency hebben bereikt en cellen kunnen tot enkele maanden worden gekweekt om volledige differentiatie en rijping mogelijk te maken.
4. Karakterisering van RPE-cellen van primaire varkens
- Kweek de cellen op confluency gedurende 1 of 2 weken en oogst vervolgens de cellen voor verdere analyse.
- Oogst cellen voor kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) analyse.
- Verwijder de kweekmedia, was de cellen met 1 ml koude 1x PBS en voeg vervolgens 500 μL RNA-extractieoplossing toe aan elke put om cellysaat te verzamelen uit ongeveer 1 x 106 cellen.
- Extract mRNA13; uit elk monster wordt ongeveer 4 μg RNA geëxtraheerd. Gebruik 100 ng mRNA om reverse transcriptie uit te voeren14; verdun de cDNA 40-voudig voor kwantitatieve real-time PCR-analyse. Primers zijn opgenomen in tabel 1.
- Oogst cellen voor immunofluorescentiekleuring.
- Verwijder de kweekmedia, was de cellen met 1 ml koude 1x PBS en voeg vervolgens 500 μL van 4% (w / v) paraformaldehyde toe in 1x PBS om de cellen (ongeveer 1 x 106 cellen / put) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur te fixeren. Was vervolgens de cellen tweemaal met 1x PBS en voer immunofluorescentiekleuring uit met primaire antilichamen (1:100 in 1x PBS aangevuld met 1% (w / v) runderserumalbumine) bij 4 ° C 's nachts en secundaire antilichamen (1:200 in 1x PBS aangevuld met 1% (w / v) runderserumalbumine) bij kamertemperatuur gedurende 2 uur volgens online protocollen15.
- De immunofluorescentiebeelden worden verkregen door een confocale microscoop volgens de online handleiding16.
- Oogst cellen voor Western blot analyse.
- Verwijder de kweekmedia, was de cellen twee keer met koude 1x PBS en voeg vervolgens 80 μL RIPA-buffer (met 1x proteaseremmer) toe aan elke put en gebruik celschrapers om ongeveer 1 x 106 cellen van de schotels / inserts te krassen.
- Verzamel het cellysaat uit elke put/insert in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Kook de cellysaten gedurende 10 minuten en meet vervolgens de eiwitconcentraties met behulp van BCA-kits; de eiwitconcentratie van elk monster is ongeveer 2 mg / ml. Gebruik 25 μg eiwitten van elk monster voor Western blot-analyse volgens online protocollen17.
- Voor Western blot, incubeer de membranen in 5 ml primaire antilichaamoplossing (1:1.000 verdunning van primaire antilichamen in 1x TBST-oplossing aangevuld met 5% (w / v) runderserumalbumine) bij 4 ° C 's nachts op een roterende multifunctionele shaker.
- Incubeer vervolgens het membraan met ongeveer 15 ml anti-konijn of anti-muis secundaire antilichaamoplossing (1:5.000 verdunning van secundaire antilichamen in 1x TBST-oplossing aangevuld met 5% (w / v) niet-vette melk) bij kamertemperatuur gedurende 2 uur op een orbitale shaker, volgens de bron van het gebruikte primaire antilichaam.
- Transepitheliale weerstand (TER) meting.
- Was de eetstokelektroden met 70% ethanol en steriele 1x PBS op een sequentiële manier. Plaats vervolgens het kortere uiteinde van de elektrode in de bovenste kamer en het langere uiteinde in de onderste kamer van de transwell-inzetstukken en klik op de knop op de epitheliale voltmeter voor de metingen. Noteer de TER-metingen van elke put in drievoud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De primaire varkens RPE (pRPE) cellen werden gekweekt in DMEM/Basic media met 10% FBS, en celmorfologie onder lichtmicroscoop werd gefotografeerd op 2 dagen (figuur 2A), 6 dagen (figuur 2B) en 10 dagen (figuur 2C) na het zaaien. Na 1 week werd een confluente monolaag van gepigmenteerde pRPE-cellen met kasseimorfologieën waargenomen.
Om de primaire pRPE-cellen beter te karakteriseren, werden primaire menselijke RPE-cellen (hRPE) bij Passage 3 (P3) 18 en ARPE-19-cellen gekweekt in DMEM / Basic-media met 1% FBS voor nog een week, en vervolgens werden het totale mRNA en eiwit van de gekweekte cellen, evenals varkens RPE / choroïde weefsels, geoogst. De expressieniveaus van de belangrijkste karakteristieke genen19 en eiwitmarkers van volwassen RPE werden geëvalueerd door qRT-PCR en Western blot. In vergelijking met ARPE-19-cellen behielden pRPE-cellen significant hogere expressieniveaus van genen die functioneren in inheemse RPE-secretie (figuur 3A(c)), fagocytose (figuur 3A(i)), transport (figuur 3A(a),(d)), tight junctions (figuur 3A(j)), barrièrevorming (figuur 3A(b)) en visuele cyclus (figuur 3A(e),B). De expressieniveaus van Krt8 en Krt18, twee cytoskeletmarkergenen van de RPE, waren echter significant lager in primaire pRPE-cellen in vergelijking met primaire hRPE- en ARPE-19-cellen (figuur 3A(g),(h)). Bovendien was itgav, dat deelneemt aan fagocytose, ook lager in primaire pRPE-cellen (figuur 3A(f)). Aangezien de expressieniveaus van deze drie genen in pRPE-cellen vergelijkbaar waren met het varkens-RPE/vaatweefsel, kan dit wijzen op de genexpressieverschillen tussen de soorten. Bovendien was het expressieniveau van Tyr, dat verantwoordelijk is voor de melanineproductie, sterk verminderd in zowel primaire pRPE- als hRPE-cellen (figuur 3A (k)), wat het verlies van pigmentatie in langdurig gekweekte cellen kan verklaren. De verschillen in de qRT-PCR-resultaten die worden waargenomen in de gegevens van menselijke pRPE- en porcine pRPE-cellen kunnen te wijten zijn aan de langere opslag en het hogere passagenummer (P3) van menselijke pRPE, wat wijst op een verlies van RPE-karakters bij subkweek. Bovendien toonde Western blot aan dat RPE65-eiwit, een belangrijk enzym in de visuele cyclus met RPE-cellen, tot expressie kwam in pRPE-cellen, terwijl het expressieniveau significant was verlaagd in primaire hRPE-cellen en ARPE-19-cellen (figuur 3B, C).
Om de polariteit en barrièrefuncties van RPE-cellen verder te karakteriseren, werden de gekweekte confluente monolagen van pRPE- en ARPE-19-cellen gekweekt in transwell-inserts met DMEM / Basic, DMEM / F12 en MEM-Nic-media gedurende 1 week (figuur 4). Onder deze kweekomstandigheden toonden de fluorescerende kleuringsresultaten van Na+-K+-ATPase (Figuur 4A-F) en ZO-1 (Figuur 4G-L) aan dat pRPE-cellen hogere expressieniveaus hadden van zowel Na+-K+-ATPase als ZO-1 dan ARPE-19-cellen. De gelijke verdeling van Na+-K+-ATPase aan het apicale en basale oppervlak van pRPE-cellen gaf aan dat een langere kweektijd nodig was om de celpolariteiten in vitro te herstellen.
De RPE vormt tight junctions in de buurt van het apicale oppervlak om de uitwisseling van metabolieten tussen het binnenste netvlies en vaatvlies strak te reguleren20. ZO-1-kleuring suggereerde dat tight junction-eiwitten normaal gesproken gelokaliseerd waren op het plasmamembraan van primaire pRPE-cellen met regelmatige kasseimorfologieën, maar niet van ARPE-19-cellen. Van de drie kweekmedia werden de beste ZO-1-kleuringspatronen waargenomen in cellen gekweekt in DMEM / Basic, terwijl DMEM / F12 er niet in slaagde de kasseimorfologie van pRPE-cellen te behouden. Een hogere TER-waarde dient als indicator voor tight junction-vorming en betere barrièrefuncties van RPE-cellen21. Om de functie van tight junctions te bevestigen, werd transepitheliale weerstand (TER) gemeten. Er werd echter slechts een iets hogere TER gedetecteerd in vergelijking met lege transwell-inserts (figuur 4M,N).
In het netvlies bevindt zich het membraan van Bruch tussen de RPE en het vaatvlies. De belangrijkste componenten van het membraan van Bruch zijn collageen type IV, proteoglycanen en laminine22. Om het ondersteunende effect van bruch's membraan op RPE te simuleren, werd laminine verspreid over het oppervlak van het transwellmembraan om de rijping van gekweekte RPE-cellen te vergemakkelijken. Op basis van de resultaten van figuur 4 werden de confluente pRPE-cellen gekweekt op transwell-inserts in DMEM/Basic-media met 1% FBS gedurende 2 weken. Immunofluorescente kleuringsresultaten toonden aan dat RPE-specifieke eiwitten RPE65 tot expressie kwamen in alle pRPE-cellen (figuur 5A,B). Na+-K+-ATPase werd verdeeld over het apicale oppervlak van pRPE-cellen, wat wijst op het herstel van celpolariteiten (figuur 5C,D). Zowel ZO-1-kleuring als TER-resultaten gaven aan dat tight junctions goed gevormd waren in primaire pRPE-cellen wanneer ze werden gekweekt op laminine (figuur 5E, F, H). Figuur 5G toont cellen gekleurd met Hoechst-kleurstof.
Bovendien toonde Western blot aan dat zowel pRPE- als ARPE-19-cellen groeifactoren produceerden, waaronder pigmentepitheel-afgeleide factor (PEDF) en vasculaire endotheelgroeifactor (VEGF) (figuur 6A). Nadat confluente monolagen van pRPE gedurende 1 week werden gekweekt in transwell-inserts met DMEM/Basic-, DMEM/F12- en MEM-Nic-media, werden cultuurmedia uit de bovenste en onderste kamers van de transwell-inserts verzameld en werd de uitgescheiden VEGF gekwantificeerd door ELISA. Wanneer DMEM/Basic en MEM-Nic media werden gebruikt voor celkweek, scheidden pPRE-cellen meer VEGF uit dan cellen in DMEM/F12-media (figuur 6B). Er konden echter geen verschillen worden gedetecteerd in VEGF-hoeveelheden tussen de bovenste en onderste kamers van de transwell-inzetstukken in alle geteste omstandigheden (figuur 6B). Bovendien, nadat primaire pRPE-cellen waren gekweekt op de inserts bedekt met laminine en in DMEM / Basic-media gedurende 2 weken, werden de media uit de bovenste en onderste kamers verzameld. Western blot-analyse toonde hogere niveaus van PEDF in de bovenste kamer dan de onderste kamer, terwijl de eiwitniveaus van uitgescheiden VEGF in beide kamers vergelijkbaar waren (figuur 6C). Deze resultaten ondersteunden verder het herstel van de celpolariteit wanneer primaire pRPE-cellen nog eens 2 weken werden gekweekt nadat ze samenvloeiing op laminine hadden bereikt.
Figuur 1: Basisstappen van pRPE-celisolatie. (A) Was varkensoogbollen met 1x PBS in steriele centrifugebuizen van 50 ml. (B,C) Bereid RPE-choroïde-scleracomplexen voor op enzymatische spijsvertering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Primaire pRPE-celmorfologieën na celkweek. Representatieve beelden van primaire pRPE-cellen op (A) dag 2, (B) dag 6 en (C) dag 10. Schaalbalk 250 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Expressieniveaus van belangrijke handtekeninggenen en eiwitten in gekweekte RPE-cellen. (A) qRT-PCR-analyse van mRNA-niveaus van signatuurgenen in primaire pRPE-cellen, primaire hRPE-cellen, ARPE-19-cellen en pRPE / vaatweefsel. Gapdh werd gebruikt als het huishoudgen voor qRT-PCR. Vier biologische replicaties werden gebruikt voor primaire pRPE-cellen en ARPE-19-cellen, terwijl drie biologische replicaties werden gebruikt voor primaire hRPE-cellen en pRPE / choroïde weefsel. De genexpressieniveaus in ARPE-19-cellen werden ingesteld als controles. (B) Western blot analyse van RPE65 eiwitten in ARPE-19 en pRPE cellen. Vinculin werd gebruikt als laadcontrole. (C) Western blot analyse van RPE65 eiwitten in primaire hRPE cellen en pRPE/vaatweefsel. Vinculin werd gebruikt als laadcontrole. Ter vergelijking werd de student t-test gebruikt, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Eén-wk cultuur van primaire pRPE- en ARPE-19-cellen in DMEM/Basic-, DMEM/F12- en MEM-Nic-media met 1% FBS. (A) Na+-K+-ATPase fluorescerende kleuring (rood) van primaire pRPE-cellen in DMEM/Basic, (B) DMEM/F12 en (C) MEM-Nic-media. (D) Na+-K+-ATPase fluorescerende kleuring (rood) van ARPE-19-cellen in DMEM/Basic-media, (E) DMEM/F12-media en (F) MEM-Nic-media. (G) ZO-1 fluorescerende kleuring (groen) van primaire pRPE-cellen in DMEM/Basic-media, (H) DMEM/F12-media en (I) MEM-Nic-media. (J) ZO-1 fluorescerende kleuring (groen) in ARPE-19-cellen in DMEM/Basic-media, (K) DMEM/F12-media en (L) MEM-Nic-media. TER-metingen na primaire pRPE (M) en ARPE-19 (N) cellen werden gekweekt in DMEM/Basic, DMEM/F12 en MEM-Nic media gedurende 1 week. Voor elk type cellen werden gegevens verkregen uit ten minste drie verschillende putten. Ter vergelijking: student t-test werd gebruikt, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Schaalbalk 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Twee weken kweek van pRPE-cellen in DMEM/Basic media met 1% FBS. (A-F) Cellen gekweekt met of zonder laminine werden gekleurd met RPE65 (A,B, Rood), Na+-K+-ATPase (C,D, Rood), ZO-1 (E,F, Groen) en (G) Hoechst (Blauw) . H) TER-metingen in celplaten gekweekt met of zonder laminine. Voor verschillende behandelingen werden gegevens verkregen uit vier verschillende putten. Ter vergelijking: student t-test werd gebruikt, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Secretoire functies van gekweekte primaire pRPE- en ARPE-19-cellen. (A) Western blot-analyse van VEGF en PEDF in primaire pRPE- en ARPE-19-cellen. (B) Uitgescheiden VEGF in de bovenste en onderste kamer van transwell inserts met primaire pRPE-cellen wanneer confluente cellen werden gekweekt in DMEM/Basic, DMEM/F12 en MEM-Nic media gedurende 1 week. (C) Uitgescheiden PEDF en VEGF in de boven- en onderkamer van transwell inserts met primaire pRPE in DMEM/Basic media gedurende 2 weken. Voor verschillende behandelingen werden gegevens verkregen uit drie verschillende putten. Ter vergelijking: student t-test werd gebruikt, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Mensdom | Sus scrofa | | |
| Beste1 | F: GAAGGCAAGGACGAGCAAG | F: GGACACCTGTATGCCTACGA |
| R: TCCAACTGCTTGTGTTCTGC | R: GGAACGTGAAGAGGGGTACA | |
| Cldn19 | F: GGTGACCCAGGAGTTCTTCA | F: TCGTGACCCAGGAGTTCTTC |
| R: CTGTTGGGTCTCTCTGGCTC | R: GCTGCTGTTGGATCGCTC | |
| Itgav | F: CGCAGTCCCATCTCAAATCC | F: GCTTTCTTCAGGACGGAACA |
| R: GGCCCTGTATAAGATAGCTCGA | R: GAAATGAGCTGACCTTGCCA | |
| Krt8 | F: GGAGCAGATCAAGACCCTCA | F: CCCAGGAGAAGGAGCAGATC |
| R: GCCGCCTAAGGTTGTTGATG | R: ATGTTGTCGATGTTGCTCCG | |
| Krt18 | F: CTTGGAGAAGAAGGGACCCC | F: GCTGATAATCGGAGGCTGGA |
| R: GGCCAGCTCTGTCTCATACT | R: GAAGTCATCAGCAGCGAGAC | |
| Mertk | F: GTGTGCAGCGTTCAGACAAT | F: GCGGCTATTTCTTGGTGGAA |
| R: AAAATGTTGACGGGCTCAGG | R: ACGTAGATGGGGTCAGACAC | |
| Serpinf1 | F: CAGATGAAAGGGAAGCTCGC | F: AAGACGTCGCTGGAGGATTT |
| R: TTAGGGTCCGACATCATGGG | R: GGTCACTTTCAGAGGCAGGA | |
| SLC16a8 | F: GGGTGTCCTCCATCATGCTA | F: CAGTTCGAGGTGCTCATGG |
| R: GTCAGGTAGAGCTCCAGGAG | R: GACAGCCATGAAGACACCAG | |
| Stra6 | F: CTTTGCAGGAAGAAGCTGGG | F: CTAGCCGTGTTGTCGATCCT |
| R: TAAATGGCCGTCCCTGTCAG | R: GACCATGAAGACAGCAGCAG | |
| TJP1 | F: ACAGGAAAATGACCGAGTTGC | F: AAGACTTGTCAGCTCAGCCA |
| R: TGGTTCAGGATCAGGACGAC | R: CCAGCATCTCGAGGTTCACT | |
| Tyr | F: ACTCAGCCCAGCATCATTCT | F: ATCTACTCAGCCCAGCATCC |
| R: ACATCAGCTGAAGAGGGGAG | R: GAGCCTTGGAGTCCTGGATT | |
| Gapdh | F: CAGCCTCAAGATCATCAGCA | F: CATCCTGGGCTACACTGAGG |
| R: ATGATGTTCTGGAGAGCCCC | R: GGGGCTCTTACTCCTTGGAG |
Tabel 1: Primers voor qRT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier is een gedetailleerd en geoptimaliseerd protocol beschreven voor de isolatie, kweek en karakterisering van RPE-cellen uit varkensoogbollen, dat een goed model genereert voor in vitro karakterisering van RPE-cellen en RPE-gerelateerde stoornisstudies. Methoden voor de isolatie van de RPE van menselijke, muis- en rattenogen zijn eerder beschreven 23,24,25. Het is echter moeilijk om menselijke oogbollen te verkrijgen in sommige laboratoria, en het roept meestal ethische kwesties op. De RPE-weefsels van muizen en ratten zijn relatief klein, de cellen worden gemakkelijk beschadigd tijdens de scheiding en slechts een paar cellen kunnen van elk dier worden verkregen. Daarentegen zijn varkensoogbollen veel gemakkelijker te verkrijgen en te hanteren, wat stabiel een relatief groot aantal primaire cellen uit een enkele oogbol zou kunnen genereren. In sommige studies wordt een pincet gebruikt om RPE mechanisch te scheiden, wat gemakkelijk kan leiden tot celdood. Daarom zijn hyaluronzuur, dispase en Trypsine /EDTA-oplossing eerder gebruikt om RPE-cellen te dissociëren. Eerdere studies hebben aangetoond dat trypsine/EDTA-oplossing het vermogen heeft om RPE te helpen loskomen van het vaatvlies21. Daarom werd Trypsin/EDTA-oplossing gebruikt om de varkensweefsels te verteren, wat optimale resultaten oplevert. Na trypsine/EDTA-neuralisatie konden RPE-weefsels worden gedissocieerd in eencellige suspensie door voorzichtig te pipetteren met een pipetpunt. Een truc is dat verse Trypsin / EDTA-oplossing wordt aanbevolen voor elk experiment om RPE-cellen volledig te dissociëren. Vanwege het grote oppervlak van de RPE-weefsels van varkensoogbollen, moet het halve komvormige RPE-choroïde-sclera-complex in de vorm van een klavertje vier worden gesneden, wat bevorderlijk is voor het volledige contact tussen de RPE-weefsels en de Trypsin / EDTA-oplossing om hun scheiding van het vaatvlies te vergemakkelijken. De verteringstijd mag echter niet langer zijn dan een half uur. Binnen deze tijd zullen andere weefsels behalve RPE niet worden verteerd, wat de besmettingen van andere soorten cellen effectief zou kunnen verminderen.
Laminine werd verspreid op het oppervlak van het transwellmembraan om het ondersteunende effect van bruch's membraan op RPE te simuleren. De resultaten toonden aan dat laminine gunstig was voor de groei van pRPE-cellen, wat de expressie van transporter- en tight junction-eiwitten stimuleerde. De resultaten gaven echter ook aan dat een langere kweektijd, van ongeveer 2 weken, nodig was voor primaire pRPE-cellen om bepaalde kenmerken van inheemse RPE-weefsels te herstellen, waaronder celpolariteit en tight junctions.
Een tekortkoming voor primaire RPE-cultuur is dat het moeilijk is om visuele cyclus-enzymexpressies in vitro te behouden. Daarom is het van cruciaal belang om te onderzoeken of gekweekte RPE-cellen RPE-specifieke eiwitten RPE65 kunnen tot expressie kunnen brengen. In vergelijking met ARPE-19-cellen brachten pRPE-cellen significant meer RPE65-eiwit tot expressie. Daarentegen werd slechts een zwakke band van RPE65-eiwit waargenomen in ARPE-19-cellysaten in Western blot. Het is interessant om op te merken dat het molecuulgewicht van RPE65 enigszins verschilde tussen mens en varken (figuur 3B,C). Het verlies van RPE65-expressie in gekweekte RPE-cellen blijft een mysterie. Zelfs in gekweekte primaire cellen ging RPE65 geleidelijk verloren met passages (gegevens niet getoond). Tot nu toe vereist het behoud van de expressie van RPE65 in vitro verder onderzoek, gezien het feit dat de visuele cyclus een kritieke functie is voor inheemse RPE-weefsels. Ten tweede is een belangrijke beperking van dit protocol dat in vitro gekweekte RPE-cellen niet kunnen worden doorgegeven. Bij langdurige kweek hebben pRPE-cellen de neiging om hun zeshoekige vorm en TER en pigmentatie te verliezen, zodat alleen passage 0-cellen kunnen worden gebruikt. Een andere beperking van dit kweekprotocol is dat genetische mutaties, die leiden tot erfelijke netvliesaandoeningen, moeilijk te reproduceren zijn in deze cellen. Daarom kan virusgemedieerde genbewerking worden gebruikt om erfelijke RPE-aandoeningen zoals Leger congenitale amaurosis in de toekomst te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs onthulden dat er geen belangenconflicten zijn.
Alle auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.
Acknowledgments
De auteurs willen graag hun dankbaarheid en respect tonen voor alle dieren die hun cellen bijdragen aan deze studie. Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van het National Key R &D-programma van China (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao en Grant nos. 2018YFA0107301, Wei Li). De auteurs bedanken Jingru Huang en Xiang You van Central Lab, School of Medicine, Xiamen University voor technische ondersteuning bij confocale beeldvorming.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ARPE-19 cells | CCTCC | GDC0323 | |
| Bovine serum albumin | Yeasen | 36101ES60 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM 880 with Airyscan | |
| ChemiDoc Touch | Bio-Rad | 1708370 | |
| Cell scraper | Sangon | F619301 | |
| 10 cm culture dish | NEST | 121621EH01 | |
| 12-well culture plate | NEST | 29821075P | |
| DMEM F12 Medium | Gibco | C11330500BT | |
| DMEM basic Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EVOM2 | World Precision Instruments | EVOM2 | For TER measurement |
| Fetal bovine serum | ExCell Bio | FSP500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 0300-0108P | |
| Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 5196-2504 | |
| hydrocortisone | MCE | HY-N0583/CS-2226 | |
| Hoechst 33342 solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| LightCycler 96 Instrument | Roche | 5815916001 | |
| Liothyronine | MCE | HY-A0070A/CS-4141 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| MEM(1X)+GlutaMAX Medium | Gibco | 10566-016 | |
| MEM NEAA(100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Millex-GP syringe filter unit | Millipore | SLGPR33RB | |
| N1 | Sigma-Aldrich | SLCF4683 | |
| NcmECL Ultra | New Cell&Molecular Biotech | P10300 | |
| Non-fat Powdered Milk | Solarbio | D8340 | |
| Nicotinamide | SparkJade | SJ-MV0061 | |
| Na+-K+ ATPase antibody | Abcam | ab76020 | Recognize both human and porcine proteins |
| PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%) | Epizyme | PG112 | |
| primary Human RPE cells | - | - | Generous gift from Shoubi Wang lab |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Prism | GraphPad by Dotmatics | version 8.0 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | APExBIO | K1024 | |
| PRE65 antibody | Proteintech | 17939-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| PEDF antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-390172 | Recognize both human and porcine proteins |
| 100 x penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-031-1BCS | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | RARBIO | RA-9005 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | Toyobo | FSQ-201 | |
| RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 601052 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 602052 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Taurine | Damas-beta | 107-35-7 | |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | RNA extraction solution |
| TB Green Fast qPCR Mix | Takara | RR430A | |
| 12-well transwell inserts | Labselect | 14212 | |
| VEGF antibody | Proteintech | 19003-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| VEGF ELISA kit | Novusbio | VAL106 | |
| ZO-1 antibody | ABclonal | A0659 | Recognize both human and porcine proteins |
References
- Tan, L. X., Germer, C. J., La Cunza, N., Lakkaraju, A. Complement activation, lipid metabolism, and mitochondrial injury: Converging pathways in age-related macular degeneration. Redox Biology. 37, 101781 (2020).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Ducloyer, J. B., Le Meur, G., Cronin, T., Adjali, O., Weber, M. Gene therapy for retinitis pigmentosa. Medecine Sciences. 36 (6-7), 607-615 (2020).
- den Hollander, A. I., Roepman, R., Koenekoop, R. K., Cremers, F. P. Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 391-419 (2008).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Smith, D. T. Melanin pigment in the pigmented epithelium of the retina of the embryo chick eye studied in vivo and in vino. The Anatomical Record. 18, 260-261 (1920).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- D'Antonio-Chronowska, A., D'Antonio, M., Frazer, K. A. In vitro differentiation of human iPSC-derived retinal pigment epithelium cells (iPSC-RPE). Bio-Protocol. 9 (24), 3469 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- Scientific, T. , Available from: https://www.thermofisher.cn/document-connect/document connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2Ftrizol_reagent.pdf (2022).
- Toyota. , Available from: https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf (2022).
- Abcam. , Available from: https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol (2022).
- Zeiss. , Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals (2022).
- Cell Signal Technology. , Available from: https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western (2022).
- Wang, S., et al. Reversed senescence of retinal pigment epithelial cell by coculture with embryonic stem cell via the TGFbeta and PI3K pathways. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 588050 (2020).
- Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Experimental Eye Research. 126, 1-4 (2014).
- Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Experimental Eye Research. 126, 5-15 (2014).
- Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. Physiology and function of the tight junction. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002584 (2009).
- Nita, M., Strzalka-Mrozik, B., Grzybowski, A., Mazurek, U., Romaniuk, W. Age-related macular degeneration and changes in the extracellular matrix. Medical Science Monitor. 20, 1003-1016 (2014).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Langenfeld, A., Julien, S., Schraermeyer, U. An improved method for the isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult rats. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1493-1502 (2015).
- Sonoda, S. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
