Summary
Ici, une méthode facile à suivre pour cultiver in vitro des cellules épithéliales pigmentaires primaires de la rétine porcine est présentée.
Abstract
L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est une monocouche de cellules épithéliales pigmentées polarisées, située entre la choroïde et la neurorétine dans la rétine. De multiples fonctions, y compris la phagocytose, le transport des nutriments / métabolites, le métabolisme de la vitamine A, etc., sont effectuées quotidiennement par l’EPR. Les cellules EPR sont des cellules épithéliales différenciées en phase terminale avec peu ou pas de capacité de régénération. La perte de cellules EPR entraîne de multiples maladies oculaires entraînant une déficience visuelle, telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Par conséquent, l’établissement d’un modèle de culture in vitro de cellules EPR primaires, qui ressemble plus à l’EPR in vivo qu’aux lignées cellulaires, est essentiel pour les études caractéristiques et mécanistes des cellules EPR. Compte tenu du fait que la source des globes oculaires humains est limitée, nous créons un protocole pour cultiver des cellules primaires d’EPR porcines. En utilisant ce protocole, les cellules EPR peuvent être facilement dissociées des globes oculaires porcins adultes. Par la suite, ces cellules dissociées se fixent aux boîtes de culture, prolifèrent pour former une monocouche confluente et rétablissent rapidement les principales caractéristiques du tissu épithélial in vivo en 2 semaines. Par qRT-PCR, il est démontré que les cellules RPE porcines primaires expriment plusieurs gènes de signature à des niveaux comparables avec le tissu RPE natif, tandis que les expressions de la plupart de ces gènes sont perdues / fortement réduites dans les cellules humaines de type EPR, ARPE-19. De plus, la coloration par immunofluorescence montre la distribution de la jonction serrée, de la polarité tissulaire et des protéines du cytosquelette, ainsi que la présence de RPE65, une isomérase essentielle au métabolisme de la vitamine A, dans les cellules primaires en culture. Dans l’ensemble, nous avons développé une approche facile à suivre pour la culture de cellules EPR porcines primaires avec des caractéristiques RPE de haute pureté et natives, qui pourrait servir de bon modèle pour comprendre la physiologie de l’EPR, étudier les toxicités cellulaires et faciliter les dépistages de médicaments.
Introduction
L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est situé entre les photorécepteurs et la choriocapillarise dans la couche externe de la rétine1 avec de multiples fonctions, y compris la formation de la barrière hémato-rétinienne, le transport et l’échange de nutriments et de métabolites rétiniens, le recyclage de la vitamine A pour maintenir un cycle visuel normal, et la phagocytose et la clairance des segments externes des photorécepteurs (POS)2,3 . Étant donné que les PDV nécessitent un auto-renouvellement constant pour générer la vision, les cellules EPR doivent continuellement engloutir les POS détachés pour maintenir l’homéostasie rétinienne4. Par conséquent, le dysfonctionnement de l’EPR entraîne de nombreuses maladies oculaires cécitantes, telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA)4, la rétinite pigmentaire (RP)5, l’amaurose congénitale de Leber6, la rétinopathie diabétique7, etc. Jusqu’à présent, la pathogenèse exacte de la plupart de ces maladies reste insaisissable. En conséquence, la culture cellulaire RPE est établie pour étudier la biologie cellulaire RPE, les changements pathologiques et les mécanismes sous-jacents.
En tant que modèle le plus simple pour étudier la biologie cellulaire, la culture de cellules EPR a commencé dès les années 19208. Bien que l’ARPE-19 soit largement utilisé comme cellules EPR, la perte de pigmentation, la morphologie des pavés et, surtout, les fonctions de barrière dans cette lignée cellulaire soulèvent beaucoup de préoccupations9. En comparaison, la culture de cellules EPR humaines primaires offre un scénario plus réaliste pour les études physiologiques et pathologiques9. Cependant, la disponibilité relativement limitée restreint leur utilisation et des problèmes éthiques existent toujours. En outre, plusieurs groupes ont utilisé des modèles murins pour cultiver des cellules EPR. Cependant, la taille de l’œil de souris est petite et une seule culture nécessite généralement de nombreuses souris, ce qui n’est pas pratique9. Récemment, les scientifiques ont mis au point de nouvelles méthodes pour utiliser des cellules souches embryonnaires humaines ou des cellules souches pluripotentes induites pour dériver des cellules EPR. Bien que cette technique ait un potentiel particulier pour le traitement des troubles héréditaires de l’EPR, elle prend beaucoup de temps et nécessite généralement plusieurs mois pour générer des cellules EPR matures10. Pour surmonter ces problèmes, nous introduisons ici un protocole facile à suivre pour isoler et cultiver régulièrement des cellules EPR de haute pureté en laboratoire. Dans des conditions de culture appropriées, ces cellules peuvent présenter des fonctions RPE typiques et présenter des morphologies RPE typiques. Par conséquent, cette méthode de culture peut fournir un bon modèle pour comprendre la physiologie de l’EPR, étudier la cytotoxicité, étudier les mécanismes pathologiques des maladies oculaires connexes et effectuer des dépistages de médicaments.
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Protocol
L’utilisation d’animaux de laboratoire était conforme aux règlements de l’Association pour la recherche en vision et ophtalmologie (ARVO) et a été approuvée par le Comité d’éthique de la gestion des animaux expérimentaux de l’Université de Xiamen.
1. Préparation de dispositifs chirurgicaux expérimentaux, d’enzymes de digestion tissulaire et de tampons de culture cellulaire
- Préparer les dispositifs chirurgicaux expérimentaux, en nettoyant et en autoclavant deux paires de ciseaux et de pinces chirurgicaux ophtalmiques la veille de la dissection du globe oculaire, puis en séchant la boîte avec des dispositifs chirurgicaux dans une étuve à protocole général à 65 °C pendant la nuit.
- Préparation des milieux de culture.
- Préparer le DMEM/milieu basique complété par 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin, 2 mM de L-glutamine et 1 % (v/v) de pénicilline (100 U/mL) et de streptomycine (100 U/mL).
- Préparer des milieux DMEM/F12 additionnés de FBS à 1 % (v/v) et de pénicilline à 1 % (v/v) (100 U/mL) et de streptomycine (100 U/mL).
- Préparer MEM-Nic 11, en complétant MEM alpha avec 2 mM de L-glutamine, 1% FBS, 1% (v/v) de pénicilline (100 U/mL) et de streptomycine (100 U/mL), 0,1 mM NEAA, 1% (v/v) supplément de N1, taurine (0,25 mg/mL), hydrocortisone (20 ng/mL), triiodo-thyronine (0,013 ng/mL) et10 mM de nicotinamide.
NOTE: Pour améliorer la viabilité et la prolifération cellulaires, le pourcentage de FBS peut être augmenté à 20% pour neutraliser les enzymes de digestion et ensemencer les cellules dissociées. Pour la culture cellulaire à long terme, le pourcentage de FBS peut être réduit à aussi bas que 1%12.
- Décongeler l’enzyme de digestion tissulaire aliquote (solution de trypsine/EDTA à 0,25 % (p/v) supplémentée en EDTA à 0,91 mM, ci-après appelée solution de trypsine/EDTA) au cours de l’expérience.
REMARQUE: Une solution fraîche de trypsine/EDTA doit être utilisée à chaque fois pour obtenir des résultats optimaux. Aliquote 10 mL de solution fraîche de trypsine/EDTA dans chaque tube centrifuge stérile de 15 mL et congeler les aliquotes au réfrigérateur à -20 °C jusqu’à utilisation. - Solution de dissection.
- Stériliser 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (pH 7,2) supplémentée en pénicilline à 2 % (v/v) (100 U/mL) et en streptomycine (100 U/mL) en filtrant la solution à l’aide d’une seringue filtrante de 0,22 μm.
- Enduire les plaques de culture et les inserts transwell.
- Lavez les puits et les inserts transwell avec 1x PBS. Retirer le PBS des puits et des puits à l’aide d’une pipette, puis ajouter 1 mL de 1x PBS frais dans la chambre inférieure et 600 μL de 10 μg/mL de solution de laminine dans la chambre supérieure.
- Incuber les plaques/inserts transwell dans l’incubateur de culture cellulaire pendant une nuit à 37 °C et 5% de CO2. Retirer la solution de laminine de la chambre supérieure et laver avec 1 mL de 1x PBS froid deux fois avant d’ensemencer les cellules.
2. Dissection des cellules EPR du globe oculaire porcin
- Préparation des instruments.
- Nettoyez la hotte à flux laminaire avec de l’éthanol à 75 % et de la lumière UV. Préparer trois tubes centrifugeux stériles de 50 mL contenant ~25 mL d’éthanol à 75 %, trois tubes centrifugeuses stériles de 50 mL contenant ~25 mL de 1x PBS et trois boîtes de culture cellulaire stérile de 10 cm contenant ~15 mL de 1x PBS.
REMARQUE: Ces paramètres sont généralement utilisés pour disséquer quatre globes oculaires porcins. Veuillez augmenter la taille lorsque d’autres globes oculaires sont utilisés. Pour améliorer la viabilité de la cellule, prérefroidir 1x tampon PBS sur de la glace pendant au moins 30 minutes. L’éthanol à 75 % et la lumière UV sont nécessaires pour s’assurer que les instruments expérimentaux et les cellules ne sont pas contaminés. Allumez la lampe UV à l’avance pour stériliser toute la table d’opération pendant au moins 15 min.
- Nettoyez la hotte à flux laminaire avec de l’éthanol à 75 % et de la lumière UV. Préparer trois tubes centrifugeux stériles de 50 mL contenant ~25 mL d’éthanol à 75 %, trois tubes centrifugeuses stériles de 50 mL contenant ~25 mL de 1x PBS et trois boîtes de culture cellulaire stérile de 10 cm contenant ~15 mL de 1x PBS.
- Nettoyez les globes oculaires du porc.
- Obtenir des globes oculaires frais d’un abattoir et les garder sur la glace jusqu’à la dissection. Trempez quatre globes oculaires porcins dans ~15 ml d’éthanol à 75% dans une boîte de Petri de 10 cm et utilisez une paire de ciseaux et de pinces pour couper tous les tissus conjonctifs et les muscles résiduels.
REMARQUE : Enlevez autant de tissu que possible à l’extérieur de la sclérotique pour réduire les contaminations. Ne coupez pas le nerf optique à ce moment pour faciliter le transfert des globes oculaires pendant l’étape de décontamination et de lavage. Après cette étape, toutes les procédures doivent être effectuées dans une hotte à flux laminaire.
- Obtenir des globes oculaires frais d’un abattoir et les garder sur la glace jusqu’à la dissection. Trempez quatre globes oculaires porcins dans ~15 ml d’éthanol à 75% dans une boîte de Petri de 10 cm et utilisez une paire de ciseaux et de pinces pour couper tous les tissus conjonctifs et les muscles résiduels.
- Décontaminer les globes oculaires porcins en trempant et en lavant quatre globes oculaires porcins dans trois tubes centrifugeux stériles de 50 ml remplis d’éthanol à 75 % de manière séquentielle; Chaque globe oculaire est plongé pendant au moins 5 minutes dans chaque tube. Ensuite, lavez les globes oculaires porcins dans trois tubes centrifugés stériles de 50 ml remplis de 1x PBS de manière séquentielle; laver chaque globe oculaire pendant au moins 5 minutes dans chaque tube (figure 1A). Inversez les tubes toutes les minutes pour bien laver les globes oculaires.
- Dissection des globes oculaires porcins.
- Déplacez les quatre globes oculaires porcins dans une boîte de culture cellulaire stérile de 10 cm contenant 1x PBS. Coupez à nouveau la surface externe de chaque globe oculaire pour enlever le nerf optique et les petits débris (Figure 1B). Utilisez des ciseaux pour faire une petite coupure à l’intersection du limbe et de la sclérotique, puis retirez la cornée, l’iris, le cristallin, le corps vitré et la rétine neurale (pour les structures détaillées de ces tissus, veuillez vous référer à la figure 1).
- Transférer le complexe EPR-choroïde-sclérotique dans une nouvelle boîte de culture cellulaire de 10 cm et faire quatre coupes pour aplatir l’œilleton en forme de trèfle à quatre feuilles (Figure 1C).
- Effectuer la digestion de la solution trypsine/EDTA en plaçant les quatre complexes EPR-choroïde-sclérotique dans une nouvelle boîte de 10 cm. Verser 20 ml de solution fraîche de trypsine/EDTA pour fusionner les complexes EPR-choroïde-sclérotique et mettre la capsule dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 °C pendant ~30 min.
REMARQUE: Utilisez une solution fraîche de trypsine/EDTA pour dissocier les cellules EPR. Contrôlez soigneusement le temps de digestion de la solution de trypsine / EDTA, car un temps d’incubation plus long (plus de 30 minutes) peut augmenter la contamination d’autres types de cellules.
3. Isolement et culture de cellules EPR du globe oculaire porcin
- Dissociation RPE.
- Sortir la capsule de l’incubateur après 30 minutes d’incubation avec une solution de trypsine/EDTA et ajouter 20 ml de milieux de culture préchauffés (avec 10 % de FBS) dans la capsule pour neutraliser la solution de trypsine/EDTA.
Remarque : À cette étape, seul le support DMEM/Basic est utilisé. Lorsque les cellules atteignent la confluence, trois milieux de culture peuvent être utilisés en fonction des conditions expérimentales : milieu DMEM/Basic, milieu DMEM/F12 et milieu MEM-Nic. - Utilisez une pipette de transfert de 5 mL pour dissocier les cellules EPR en les pipetant doucement plusieurs fois. Recueillir les suspensions cellulaires dans des tubes à centrifuger de 15 mL. Utiliser 10 mL supplémentaires de milieux de culture frais (10 % FBS) pour laver les complexes EPR-choroïde-sclérotique sur la capsule en pipetant doucement pour obtenir autant de cellules EPR que possible.
REMARQUE: Ne triturez pas les cellules trop vigoureusement. Assurez-vous de remplir et de vider la pipette à un débit d’environ 3 mL/s. Évitez de faire bouillonner la suspension cellulaire.
- Sortir la capsule de l’incubateur après 30 minutes d’incubation avec une solution de trypsine/EDTA et ajouter 20 ml de milieux de culture préchauffés (avec 10 % de FBS) dans la capsule pour neutraliser la solution de trypsine/EDTA.
- Recueillir les cellules EPR en centrifugeant les tubes à 200 x g pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette et ajouter 5 mL supplémentaires de milieu de culture (10% FBS) pour remettre les cellules en suspension et centrifuger à 200 x g pendant 5 minutes supplémentaires. Décanter le surnageant et remettre les cellules en suspension avec 12 mL de milieux de culture.
REMARQUE: Lors de l’aspiration du surnageant, laissez environ 1 mL de média pour éviter la rupture des amas cellulaires. - Ensemencement des cellules EPR.
- Semer ~1-2 x 105 cellules/puits dans des plaques de culture à 12 puits ou des inserts transwell. Habituellement, environ 1,5 x 106 cellules RPE sont obtenues à partir de quatre globes oculaires porcins. Changez les milieux de culture tous les 2 jours et réduisez la concentration sérique à 1% lorsque les cellules couvrent complètement la surface des puits/inserts.
REMARQUE: Ne déplacez pas la boîte de culture cellulaire trop fréquemment avant que les cellules ne se fixent à la boîte de culture/inserts.
- Semer ~1-2 x 105 cellules/puits dans des plaques de culture à 12 puits ou des inserts transwell. Habituellement, environ 1,5 x 106 cellules RPE sont obtenues à partir de quatre globes oculaires porcins. Changez les milieux de culture tous les 2 jours et réduisez la concentration sérique à 1% lorsque les cellules couvrent complètement la surface des puits/inserts.
- Changez les milieux de culture tous les 2 jours jusqu’à ce que les cellules soient récoltées.
REMARQUE: La concentration de FBS peut être réduite après que les cellules atteignent la confluence, et les cellules peuvent être cultivées jusqu’à plusieurs mois pour permettre une différenciation et une maturation complètes.
4. Caractérisation des cellules EPR porcines primaires
- Cultivez les cellules à confluence pendant 1 ou 2 semaines, puis récoltez les cellules pour une analyse plus approfondie.
- Récolter des cellules pour l’analyse quantitative par PCR en temps réel (qRT-PCR).
- Retirer le milieu de culture, laver les cellules avec 1 mL de 1x PBS froid, puis ajouter 500 μL de solution d’extraction d’ARN dans chaque puits pour recueillir le lysat cellulaire d’environ 1 x 106 cellules.
- Extraire l’ARNm13; environ 4 μg d’ARN sont extraits de chaque échantillon. Utiliser 100 ng d’ARNm pour effectuer la transcription inverse14; diluer l’ADNc 40 fois pour une analyse quantitative par PCR en temps réel. Les amorces sont énumérées dans le tableau 1.
- Récolter des cellules pour la coloration par immunofluorescence.
- Retirer le milieu de culture, laver les cellules avec 1 mL de 1x PBS froid, puis ajouter 500 μL de paraformaldéhyde à 4% (p/v) dans 1x PBS pour fixer les cellules (environ 1 x 106 cellules/puits) pendant 30 min à température ambiante. Ensuite, laver les cellules avec 1x PBS deux fois et effectuer une coloration par immunofluorescence avec des anticorps primaires (1:100 dans 1x PBS supplémenté avec 1% (p/v) d’albumine sérique bovine) à 4 °C pendant la nuit et des anticorps secondaires (1:200 dans 1x PBS supplémenté avec 1% (p/v) d’albumine sérique bovine) à température ambiante pendant 2 h selon les protocoles en ligne15.
- Les images d’immunofluorescence sont acquises par un microscope confocal suivant le manuel en ligne16.
- Récolter des cellules pour l’analyse par transfert Western.
- Retirez le milieu de culture, lavez les cellules avec 1x PBS froid deux fois, puis ajoutez 80 μL de tampon RIPA (avec 1x inhibiteur de protéase) dans chaque puits et utilisez des grattoirs cellulaires pour gratter environ 1 x 106 cellules de la vaisselle / inserts.
- Recueillir le lysat cellulaire de chaque puits/insert dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Faire bouillir les lysats cellulaires pendant 10 minutes, puis mesurer les concentrations de protéines à l’aide de kits BCA; la concentration en protéines de chaque échantillon est d’environ 2 mg/mL. Utiliser 25 μg de protéines de chaque échantillon pour l’analyse par transfert Western conformément aux protocoles en ligne17.
- Dans le cas du transfert Western, incuber les membranes dans 5 mL de solution d’anticorps primaires (dilution 1:1 000 des anticorps primaires dans 1x solution TBST supplémentée avec 5 % (p/v) d’albumine sérique bovine) à 4 °C pendant une nuit sur un agitateur polyvalent rotatif.
- Ensuite, incuber la membrane avec environ 15 mL de solution d’anticorps secondaires anti-lapin ou anti-souris (dilution 1:5 000 d’anticorps secondaires dans 1x solution TBST supplémentée avec 5% (p/v) de lait écrémé) à température ambiante pendant 2 h sur un agitateur orbitaire, selon la source d’anticorps primaire utilisé.
- Mesure de la résistance transépithéliale (TER).
- Lavez les électrodes de baguette avec de l’éthanol à 70% et stérile 1x PBS de manière séquentielle. Placez ensuite l’extrémité la plus courte de l’électrode dans la chambre supérieure et l’extrémité la plus longue dans la chambre inférieure des inserts transwell et cliquez sur le bouton du voltmètre épithélial pour les mesures. Enregistrer les mesures TER de chaque puits en trois exemplaires.
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Representative Results
Les cellules primaires de l’EPR porcine (EPRP) ont été cultivées dans un milieu DMEM/Basic avec 10 % de FBS, et la morphologie cellulaire au microscope optique a été photographiée 2 jours (figure 2A), 6 jours (figure 2B) et 10 jours (figure 2C) après l’ensemencement. Après 1 semaine, une monocouche confluente de cellules pRPE pigmentées avec des morphologies pavées a été observée.
Pour mieux caractériser les cellules primaires de l’EPRP, des cellules EPR humaines primaires (hRPE) au passage 3 (P3)18 et des cellules ARPE-19 ont été cultivées dans des milieux DMEM / Basic avec 1% FBS pour un autre wk, puis l’ARNm total et la protéine des cellules en culture, ainsi que les tissus porcins RPE / choroïdes, ont été récoltés. Les niveaux d’expression des gènes caractéristiques clés19 et des marqueurs protéiques de l’EPR mature ont été évalués par qRT-PCR et Western blot. Par rapport aux cellules ARPE-19, les cellules pRPE ont conservé des niveaux d’expression significativement plus élevés des gènes fonctionnant dans la sécrétion native d’EPR (Figure 3A(c)), la phagocytose (Figure 3A(i)), le transport (Figure 3A(a),(d)), les jonctions serrées (Figure 3A(j)), la formation de barrières (Figure 3A(b)), ainsi que le cycle visuel (Figure 3A(e),B). Cependant, les niveaux d’expression de Krt8 et Krt18, deux gènes marqueurs du cytosquelette de l’EPR, étaient significativement plus faibles dans les cellules pRPE primaires par rapport aux cellules primaires hRPE et ARPE-19 (Figure 3A(g),(h)). De plus, l’itgav, qui participe à la phagocytose, était également plus faible dans les cellules pRPE primaires (Figure 3A(f)). Étant donné que les niveaux d’expression de ces trois gènes dans les cellules pRPE étaient similaires avec le tissu porcin RPE/choroïde, cela peut indiquer les différences d’expression génique entre les espèces. De plus, le niveau d’expression de Tyr, qui est responsable de la production de mélanine, a été fortement réduit dans les cellules primaires pRPE et hRPE (Figure 3A (k)), ce qui peut expliquer la perte de pigmentation dans les cellules en culture à long terme. Les différences dans les résultats de la qRT-PCR observées dans les données des cellules pRPE humaines et porcines pourraient être dues au stockage plus long et au nombre de passage plus élevé (P3) de l’EPRP humaine, indiquant ainsi une perte de caractères EPR lors de la sous-culture. De plus, le transfert Western a montré que la protéine RPE65, qui est une enzyme clé dans le cycle visuel des cellules EPR, était exprimée dans les cellules pRPE, tandis que son niveau d’expression était significativement réduit dans les cellules hRPE primaires et les cellules ARPE-19 (Figure 3B,C).
Pour caractériser davantage les fonctions de polarité et de barrière des cellules EPR, les monocouches confluentes cultivées de cellules pRPE et ARPE-19 ont été cultivées dans des inserts transwell avec des milieux DMEM/Basic, DMEM/F12 et MEM-Nic pendant 1 semaine (Figure 4). Dans ces conditions de culture, les résultats de coloration fluorescente Na+-K+-ATPase (Figure 4A-F) et ZO-1 (Figure 4G-L) ont révélé que les cellules pRPE avaient des niveaux d’expression plus élevés de Na+-K+-ATPase et de ZO-1 que les cellules ARPE-19. La distribution égale de Na+-K+-ATPase à la surface apicale et basale des cellules pRPE indiquait qu’un temps de culture plus long était nécessaire pour restaurer les polarités cellulaires in vitro.
L’EPR forme des jonctions serrées près de sa surface apicale pour réguler étroitement l’échange de métabolites entre la rétine interne et les choroïdes20. La coloration ZO-1 suggère que les protéines de jonction serrée étaient normalement localisées au niveau de la membrane plasmique des cellules pRPE primaires avec des morphologies pavées régulières, mais pas des cellules ARPE-19. Parmi les trois milieux de culture, les meilleurs modèles de coloration ZO-1 ont été observés dans les cellules cultivées dans DMEM/Basic, tandis que DMEM/F12 n’a pas réussi à maintenir la morphologie pavée des cellules pRPE. Une valeur TER plus élevée sert d’indicateur de la formation de jonctions serrées et de meilleures fonctions de barrière des cellules RPE21. Pour confirmer la fonction des jonctions serrées, la résistance transépithéliale (TER) a été mesurée. Toutefois, seul un TER légèrement plus élevé a été détecté par rapport aux inserts de puits vides (figure 4M,N).
Dans la rétine, la membrane de Bruch existe entre l’EPR et la choroïde. Les principaux composants de la membrane de Bruch sont le collagène de type IV, les protéoglycanes et la laminine22. Afin de simuler l’effet de soutien de la membrane de Bruch sur l’EPR, la laminine a été répandue à la surface de la membrane transwell pour faciliter la maturation des cellules EPR en culture. D’après les résultats obtenus à partir de la figure 4, les cellules pRPE confluentes ont été cultivées sur des inserts transwell dans un milieu DMEM/Basic avec 1% FBS pour 2 semaines. Les résultats de la coloration par immunofluorescence ont montré que les protéines RPE65 spécifiques de l’EPR étaient exprimées dans toutes les cellules pRPE (Figure 5A,B). La Na+-K+-ATPase a été distribuée sur la surface apicale des cellules pRPE, suggérant le rétablissement des polarités cellulaires (Figure 5C,D). Les résultats de coloration ZO-1 et TER ont indiqué que les jonctions serrées étaient bien formées dans les cellules pRPE primaires lorsqu’elles étaient cultivées sur laminine (Figure 5E, F, H). La figure 5G représente des cellules colorées avec du colorant Hoechst.
De plus, le transfert Western a démontré que les cellules pRPE et ARPE-19 produisaient des facteurs de croissance, y compris le facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire (PEDF) et le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) (Figure 6A). Après que des monocouches confluentes de pRPE aient été cultivées dans des inserts transwell avec des milieux DMEM/Basic, DMEM/F12 et MEM-Nic pendant 1 semaine, les milieux de culture des chambres supérieure et inférieure des inserts transwell ont été collectés et le VEGF sécrété a été quantifié par ELISA. Lorsque les milieux DMEM/Basic et MEM-Nic ont été utilisés pour la culture cellulaire, les cellules pPRE sécrétaient plus de VEGF que les cellules des milieux DMEM/F12 (Figure 6B). Cependant, aucune différence n’a pu être détectée dans les quantités de VEGF entre les chambres supérieure et inférieure des inserts transpuits, dans toutes les conditions testées (figure 6B). De plus, après que les cellules primaires d’EPRP aient été cultivées sur les inserts recouverts de laminine et dans des milieux DMEM/Basic pendant 2 semaines, les milieux des chambres supérieure et inférieure ont été recueillis. L’analyse par transfert Western a montré des niveaux plus élevés de PEDF dans la chambre supérieure que dans la chambre inférieure, tandis que les niveaux de protéines du VEGF sécrété étaient similaires dans les deux chambres (figure 6C). Ces résultats ont également soutenu le rétablissement de la polarité cellulaire lorsque les cellules pRPE primaires ont été cultivées pendant 2 semaines supplémentaires après avoir atteint la confluence sur la laminine.
Figure 1 : Étapes de base de l’isolement des cellules pRPE. (A) Laver les globes oculaires porcins avec 1x PBS dans des tubes centrifugés stériles de 50 mL. (B,C) Préparer les complexes EPR-choroïde-sclérotique pour la digestion enzymatique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Morphologies des cellules pRPE primaires après culture cellulaire. Images représentatives des cellules pRPE primaires au jour (A) 2, (B) au jour 6 et (C) au jour 10. Barre d’échelle 250 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Niveaux d’expression des gènes et protéines clés de signature dans les cellules EPR en culture. (A) Analyse qRT-PCR des niveaux d’ARNm des gènes de signature dans les cellules pRPE primaires, les cellules hRPE primaires, les cellules ARPE-19 et le tissu pRPE/choroïde. Gapdh a été utilisé comme gène d’entretien pour la qRT-PCR. Quatre réplicats biologiques ont été utilisés pour les cellules pRPE primaires et les cellules ARPE-19, tandis que trois réplicas biologiques ont été utilisés pour les cellules hRPE primaires et le tissu pRPE/choroïde. Les niveaux d’expression génique dans les cellules ARPE-19 ont été définis comme témoins. (B) Analyse par transfert Western des protéines RPE65 dans les cellules ARPE-19 et pRPE. Vinculin a été utilisé comme contrôle de charge. (C) Analyse par transfert Western des protéines RPE65 dans les cellules hRPE primaires et le tissu pRPE/choroïde. Vinculin a été utilisé comme contrôle de charge. À titre de comparaison, le test t de Student a été utilisé, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Culture en un an de cellules primaires pRPE et ARPE-19 dans des milieux DMEM/Basic, DMEM/F12 et MEM-Nic avec 1 % FBS. (A) coloration fluorescente Na+-K+-ATPase (rouge) des cellules pRPE primaires dans les milieux DMEM/Basic, (B) DMEM/F12 et (C) MEM-Nic. (D) coloration fluorescente Na+-K+-ATPase (rouge) des cellules ARPE-19 dans les milieux DMEM/Basic, (E) milieux DMEM/F12 et (F) milieux MEM-Nic. (G) coloration fluorescente ZO-1 (vert) des cellules pRPE primaires dans les milieux DMEM/Basic, (H) milieux DMEM/F12 et (I) milieux MEM-Nic. (J) coloration fluorescente ZO-1 (vert) dans les cellules ARPE-19 dans les milieux DMEM/Basic, (K) milieux DMEM/F12 et (L) milieux MEM-Nic. Les mesures TER après les cellules primaires pRPE (M) et ARPE-19 (N) ont été cultivées dans des milieux DMEM/Basic, DMEM/F12 et MEM-Nic pendant 1 semaine. Pour chaque type de cellules, les données ont été obtenues à partir d’au moins trois puits différents. À titre de comparaison, le test t de Student a été utilisé, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Barre d’échelle 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Culture à deux semaines de cellules pRPE dans un milieu DMEM/Basic avec 1 % de FBS. (A-F) Les cellules cultivées avec ou sans laminine ont été colorées avec RPE65 (A, B, rouge), Na+-K+-ATPase (C, D, rouge), ZO-1 (E, F, vert) et (G) Hoechst (bleu). H) Mesures TER dans des feuilles cellulaires cultivées avec ou sans laminine. Pour différents traitements, les données ont été obtenues à partir de quatre puits différents. À titre de comparaison, le test t de Student a été utilisé, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Fonctions sécrétoires des cellules pRPE primaires et ARPE-19 en culture. (A) Analyse par transfert Western du VEGF et du PEDF dans les cellules primaires pRPE et ARPE-19. (B) VEGF sécrété dans la chambre supérieure et inférieure des inserts transwell avec des cellules pRPE primaires lorsque les cellules confluentes ont été cultivées dans des milieux DMEM/Basic, DMEM/F12 et MEM-Nic pendant 1 semaine. (C) PEDF et VEGF sécrétés dans la chambre supérieure et inférieure des inserts transwell avec pRPE primaire dans un milieu DMEM/Basic pendant 2 semaines. Pour différents traitements, les données ont été obtenues à partir de trois puits différents. À titre de comparaison, le test t de Student a été utilisé, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Homo sapiens | Sus scrofa | |
| Meilleur1 | F: GAAGGCAAGGACGAGCAAG | F : GGACACCTGTATGCCTACGA |
| R : TCCAACTGCTTGTGTTCTGC | R: GGAACGTGAAGAGGGGTACA | |
| Cldn19 | F : GGTGACCCAGGAGTTCTA | F : TCGTGACCCAGGAGTTCTTC |
| R: CTGTTGGGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT | R : GCTGCTGTTGGATCGCTC | |
| Itgav | F: CGCAGTCCCATCTCAAATCC | F : GCTTTCTTCAGGACGGAACA |
| R: GGCCCTGTATAAGATAGCTCGA | R: GAAATGAGCTGACCTTGCCA | |
| Krt8 | F: GGAGCAGATCAAGACCCTCA | F : CCCAGGAGAAGGAGCAGATC |
| R: GCCGCCTAAGGTTGTTGATG | R: ATGTTGTCGATGTTGCTCCG | |
| Krt18 | F: CTTGGAGAAGGGACCCC | F: GCTGATAATCGGAGGCTGGA |
| R : GGCCAGCTCTGTCTCATACT | R : GAAGTCATCAGCAGCGAGAC | |
| Mertk | F: GTGTGCAGCGTTCAGACAAT | F : GCGGCTATTTCTTGGTGGAA |
| R: AAAATGTTGACGGGCTCAGG | R: ACGTAGATGGGGTCAGACAC | |
| Serpinf1 | F: CAGATGAAAGGGAAGCTCGC | F : AAGACGTCGCTGGAGGATTT |
| R: TTAGGGTCCGACATCATGGG | R : GGTCACTTTCAGAGGCAGGA | |
| SLC16A8 | F: GGGTGTCCTCCATCATGCTA | F: CAGTTCGAGGTGCTCATGG |
| R: GTCAGGTAGAGCTCCAGGAG | R: GACAGCCATGAAGACACCAG | |
| Stra6 | F: CTTTGCAGGAAGAAGCTGGG | F: CTAGCCGTGTGTGTCGATCCT |
| R: TAAATGGCCGTCCCTGTCAG | R: GACCATGAAGACAGCAGCAG | |
| Tjp1 | F : ACAGGAAAATGACCGAGTTGC | F : AAGACTTGTCAGCTCAGCCA |
| R: TGGTTCAGGATCAGGACGAC | R: CCAGCATCTCGAGGTTCACT | |
| Sylvain | F: ACTCAGCCCAGCATCATTCT | F : ATCTACTCAGCCCAGCATCC |
| R: ACATCAGCTGAAGAGGAG | R: GAGCCTTGGAGTCCTGGATT | |
| Gapdh | F : CAGCCTCAAGATCATCAGCA | F : CATCCTGGGCTACACTGAGG |
| R: ATGATGTTCTGGAGAGCCCC | R: GGGGCTCTTACTCCTTGGAG |
Tableau 1 : Amorces pour qRT-PCR.
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Discussion
Ici, un protocole détaillé et optimisé pour l’isolement, la culture et la caractérisation des cellules EPR à partir de globes oculaires porcins, qui génère un bon modèle pour la caractérisation in vitro des cellules EPR et les études sur les troubles liés à l’EPR, a été décrit. Des méthodes d’isolement de l’EPR à partir d’yeux humains, de souris et de rats ont été décrites précédemment23,24,25. Cependant, il est difficile d’obtenir des globes oculaires humains dans certains laboratoires, et cela soulève généralement des questions éthiques. Les tissus RPE des souris et des rats sont relativement petits, les cellules sont facilement endommagées lors de la séparation et seules quelques cellules peuvent être obtenues de chaque animal. En revanche, les globes oculaires porcins sont beaucoup plus faciles à obtenir et à manipuler, ce qui pourrait générer de manière stable un nombre relativement important de cellules primaires à partir d’un seul globe oculaire. Dans certaines études, une pince à épiler est utilisée pour séparer mécaniquement l’EPR, ce qui peut facilement entraîner la mort cellulaire. Par conséquent, l’acide hyaluronique, la dispase et la solution de trypsine/EDTA ont été utilisés précédemment pour dissocier les cellules EPR. Des études antérieures ont montré que la solution trypsine/EDTA a la capacité d’aider l’EPR à se détacher de la choroïde21. Par conséquent, une solution de trypsine / EDTA a été utilisée pour digérer les tissus porcins, ce qui génère des résultats optimaux. Après la neuralisation de la trypsine/EDTA, les tissus EPR pouvaient être dissociés en suspension unicellulaire en pipetant doucement avec une pointe de pipette. Une astuce est que la solution fraîche de trypsine / EDTA est recommandée pour chaque expérience afin de dissocier complètement les cellules EPR. En raison de la grande surface des tissus RPE des globes oculaires porcins, le complexe RPE-choroïde-scléroïde en forme de demi-bol doit être coupé en forme de trèfle à quatre feuilles, ce qui favorise le contact complet entre les tissus RPE et la solution trypsine/EDTA afin de faciliter leur séparation de la choroïde. Cependant, le temps de digestion ne doit pas dépasser une demi-heure. Pendant ce temps, les autres tissus, à l’exception de l’EPR, ne seront pas digérés, ce qui pourrait réduire efficacement les contaminations provenant d’autres types de cellules.
La laminine a été étalée à la surface de la membrane transwell pour simuler l’effet de soutien de la membrane de Bruch sur l’EPR. Les résultats ont montré que la laminine était bénéfique pour la croissance des cellules pRPE, ce qui stimulait l’expression des protéines de transport et de jonction serrée. Cependant, les résultats ont également indiqué qu’un temps de culture plus long, d’environ 2 semaines, était nécessaire pour que les cellules pRPE primaires restaurent certaines caractéristiques des tissus RPE natifs, y compris la polarité cellulaire et les jonctions serrées.
L’une des lacunes de la culture primaire d’EPR est qu’il est difficile de maintenir les expressions enzymatiques du cycle visuel in vitro. Par conséquent, il est essentiel d’examiner si les cellules RPE en culture pourraient exprimer des protéines spécifiques de l’EPR RPE65. Par rapport aux cellules ARPE-19, les cellules pRPE ont exprimé significativement plus de protéine RPE65. En revanche, seule une faible bande de protéine RPE65 a été observée dans les lysats cellulaires ARPE-19 dans le transfert Western. Il est intéressant d’observer que le poids moléculaire du RPE65 était légèrement différent entre l’homme et le porc (Figure 3B,C). La perte de l’expression de RPE65 dans les cellules RPE en culture reste un mystère. Même dans les cellules primaires en culture, RPE65 a été progressivement perdu avec les passages (données non présentées). Jusqu’à présent, comment maintenir l’expression de RPE65 in vitro nécessite une enquête plus approfondie, compte tenu du fait que le cycle visuel est une fonction critique pour les tissus RPE natifs. Deuxièmement, une limitation majeure de ce protocole est que les cellules EPR en culture in vitro ne peuvent pas être transmises. Avec une culture prolongée, les cellules pRPE ont tendance à perdre leur forme hexagonale et leur TER ainsi que leur pigmentation, de sorte que seules les cellules de passage 0 peuvent être utilisées. Une autre limite de ce protocole de culture est que les mutations génétiques, qui conduisent à des maladies rétiniennes héréditaires, sont difficiles à reproduire dans ces cellules. Par conséquent, l’édition de gènes médiée par le virus peut être utilisée pour étudier les troubles héréditaires de l’EPR tels que l’amaurose congénitale de Léger à l’avenir.
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Disclosures
Tous les auteurs ont révélé qu’il n’y avait pas de conflits d’intérêts.
Tous les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Acknowledgments
Les auteurs aimeraient montrer leur gratitude et leur respect à tous les animaux qui apportent leurs cellules dans cette étude. Cette étude a été financée en partie par des subventions du National Key R&D Program of China (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao et Grant nos. 2018YFA0107301, Wei Li). Les auteurs remercient Jingru Huang et Xiang You du laboratoire central de la faculté de médecine de l’Université de Xiamen pour leur soutien technique en imagerie confocale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ARPE-19 cells | CCTCC | GDC0323 | |
| Bovine serum albumin | Yeasen | 36101ES60 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM 880 with Airyscan | |
| ChemiDoc Touch | Bio-Rad | 1708370 | |
| Cell scraper | Sangon | F619301 | |
| 10 cm culture dish | NEST | 121621EH01 | |
| 12-well culture plate | NEST | 29821075P | |
| DMEM F12 Medium | Gibco | C11330500BT | |
| DMEM basic Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EVOM2 | World Precision Instruments | EVOM2 | For TER measurement |
| Fetal bovine serum | ExCell Bio | FSP500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 0300-0108P | |
| Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 5196-2504 | |
| hydrocortisone | MCE | HY-N0583/CS-2226 | |
| Hoechst 33342 solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| LightCycler 96 Instrument | Roche | 5815916001 | |
| Liothyronine | MCE | HY-A0070A/CS-4141 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| MEM(1X)+GlutaMAX Medium | Gibco | 10566-016 | |
| MEM NEAA(100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Millex-GP syringe filter unit | Millipore | SLGPR33RB | |
| N1 | Sigma-Aldrich | SLCF4683 | |
| NcmECL Ultra | New Cell&Molecular Biotech | P10300 | |
| Non-fat Powdered Milk | Solarbio | D8340 | |
| Nicotinamide | SparkJade | SJ-MV0061 | |
| Na+-K+ ATPase antibody | Abcam | ab76020 | Recognize both human and porcine proteins |
| PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%) | Epizyme | PG112 | |
| primary Human RPE cells | - | - | Generous gift from Shoubi Wang lab |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Prism | GraphPad by Dotmatics | version 8.0 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | APExBIO | K1024 | |
| PRE65 antibody | Proteintech | 17939-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| PEDF antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-390172 | Recognize both human and porcine proteins |
| 100 x penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-031-1BCS | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | RARBIO | RA-9005 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | Toyobo | FSQ-201 | |
| RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 601052 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 602052 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Taurine | Damas-beta | 107-35-7 | |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | RNA extraction solution |
| TB Green Fast qPCR Mix | Takara | RR430A | |
| 12-well transwell inserts | Labselect | 14212 | |
| VEGF antibody | Proteintech | 19003-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| VEGF ELISA kit | Novusbio | VAL106 | |
| ZO-1 antibody | ABclonal | A0659 | Recognize both human and porcine proteins |
References
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