Summary
Hier wird eine einfach zu befolgende Methode zur Kultivierung primärer retinaler Netzhaut-Pigmentepithelzellen in vitro vorgestellt.
Abstract
Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine Monoschicht aus polarisierten pigmentierten Epithelzellen, die sich zwischen Aderhaut und Neuroretina in der Netzhaut befindet. Mehrere Funktionen, einschließlich Phagozytose, Nährstoff- / Metabolitentransport, Vitamin-A-Stoffwechsel usw., werden vom RPE täglich durchgeführt. RPE-Zellen sind terminale differenzierte Epithelzellen mit geringer oder keiner Regenerationsfähigkeit. Der Verlust von RPE-Zellen führt zu mehreren Augenerkrankungen, die zu Sehstörungen führen, wie z. B. altersbedingte Makuladegeneration. Daher ist die Etablierung eines In-vitro-Kulturmodells von primären RPE-Zellen, das dem RPE in vivo ähnlicher ist als Zelllinien, entscheidend für die charakteristischen und mechanistischen Untersuchungen von RPE-Zellen. In Anbetracht der Tatsache, dass die Quelle menschlicher Augäpfel begrenzt ist, erstellen wir ein Protokoll zur Kultivierung primärer porciner RPE-Zellen. Durch die Verwendung dieses Protokolls können RPE-Zellen leicht von erwachsenen Augäpfeln von Schweinen getrennt werden. Anschließend heften sich diese dissoziierten Zellen an Kulturschalen / -inserts, vermehren sich zu einer konfluenten Monoschicht und stellen die Schlüsselmerkmale des Epithelgewebes in vivo innerhalb von 2 Wochen schnell wieder her. Mittels qRT-PCR wird gezeigt, dass primäre porcine RPE-Zellen mehrere Signaturgene in vergleichbaren Konzentrationen mit nativem RPE-Gewebe exprimieren, während die Expression der meisten dieser Gene in menschlichen RPE-ähnlichen Zellen, ARPE-19, verloren geht bzw. stark reduziert ist. Darüber hinaus zeigt die Immunfluoreszenzfärbung die Verteilung von Tight Junction-, Gewebepolaritäts- und Zytoskelettproteinen sowie das Vorhandensein von RPE65, einer Isomerase, die für den Vitamin-A-Stoffwechsel entscheidend ist, in kultivierten Primärzellen. Insgesamt haben wir einen einfach zu befolgenden Ansatz entwickelt, um primäre porcine RPE-Zellen mit hoher Reinheit und nativen RPE-Eigenschaften zu kultivieren, der als gutes Modell dienen könnte, um die RPE-Physiologie zu verstehen, Zelltoxizitäten zu untersuchen und Medikamentenscreenings zu erleichtern.
Introduction
Das retinale Pigmentepithel (RPE) befindet sich zwischen Photorezeptoren und Choriokapillaris in der äußeren Schicht der Netzhaut1 und hat mehrere Funktionen, einschließlich der Bildung der Blut-Retina-Schranke, des Transports und Austauschs von Nährstoffen und retinalen Metaboliten, des Recyclings von Vitamin A zur Aufrechterhaltung eines normalen Sehzyklus sowie der Phagozytose und Beseitigung der abgestoßenen äußeren Photorezeptorsegmente (POSs)2,3 . Da POSs eine ständige Selbsterneuerung erfordern, um das Sehen zu erzeugen, müssen die RPE-Zellen kontinuierlich abgelöste POSs verschlingen, um die retinale Homöostaseaufrechtzuerhalten 4. Daher führt eine RPE-Dysfunktion zu vielen erblindenden Augenerkrankungen, wie z.B. altersbedingte Makuladegeneration (AMD)4, Retinitis pigmentosa (RP)5, Lebersche kongenitale Amaurose6, diabetische Retinopathie7 usw. Bis heute ist die genaue Pathogenese der meisten dieser Krankheiten schwer fassbar. Infolgedessen wird die RPE-Zellkultur etabliert, um die RPE-Zellbiologie, pathologische Veränderungen und zugrunde liegende Mechanismen zu untersuchen.
Als einfachstes Modell zur Untersuchung der Zellbiologie wurde bereits in den 1920er Jahren mit der Kultivierung von RPE-Zellen begonnen8. Obwohl ARPE-19 als RPE-Zellen weit verbreitet ist, geben der Verlust der Pigmentierung, die Morphologie des Kopfsteinpflasters und insbesondere die Barrierefunktionen in dieser Zelllinie Anlass zur Sorge9. Im Vergleich dazu bietet die Kultur primärer humaner RPE-Zellen ein realistischeres Szenario für physiologische und pathologische Studien9. Die relativ begrenzte Verfügbarkeit schränkt jedoch ihre Nutzung ein und es gibt immer ethische Fragen. Darüber hinaus verwendeten mehrere Gruppen Mausmodelle, um RPE-Zellen zu kultivieren. Die Größe des Mausauges ist jedoch klein, und eine einzelne Kultur erfordert normalerweise viele Mäuse, was nicht praktisch ist9. In jüngster Zeit haben Wissenschaftler neue Methoden entwickelt, um menschliche embryonale Stammzellen oder induzierte pluripotente Stammzellen zur Gewinnung von RPE-Zellen zu verwenden. Obwohl diese Technik ein besonderes Potenzial für die Behandlung von erblichen RPE-Störungen hat, ist sie zeitaufwendig und benötigt in der Regel mehrere Monate, um reife RPE-Zellen zu erzeugen10. Um diese Probleme zu überwinden, stellen wir hier ein einfach zu befolgendes Protokoll vor, um hochreine RPE-Zellen routinemäßig im Labor zu isolieren und zu kultivieren. Unter geeigneten Kulturbedingungen können diese Zellen typische RPE-Funktionen aufweisen und typische RPE-Morphologien aufweisen. Daher kann diese Kulturmethode ein gutes Modell liefern, um die RPE-Physiologie zu verstehen, die Zytotoxizität zu untersuchen, pathologische Mechanismen verwandter Augenerkrankungen zu untersuchen und Medikamentenscreenings durchzuführen.
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Protocol
Die Verwendung von Versuchstieren entsprach den Vorschriften der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) und wurde von der Ethikkommission für experimentelles Tiermanagement der Universität Xiamen genehmigt.
1. Herstellung von experimentellen chirurgischen Geräten, Gewebeverdauungsenzym und Zellkulturpuffer
- Bereiten Sie die experimentellen chirurgischen Geräte vor, indem Sie am Tag vor der Augapfeldissektion zwei Paar ophthalmochirurgische Scheren und Pinzetten reinigen und autoklavieren und anschließend die Box mit chirurgischen Geräten in einem allgemeinen Protokollofen bei 65 °C über Nacht trocknen.
- Aufbereitung von Nährmedien.
- Bereiten Sie DMEM/Basismedien vor, ergänzt mit 10 % (v/v) fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin und 1 % (v/v) Penicillin (100 E/ml) und Streptomycin (100 E/ml).
- Bereiten Sie DMEM/F12-Medien vor, die mit 1% (v/v) FBS und 1% (v/v) Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 U/ml) ergänzt sind.
- Bereiten Sie MEM-Nic 11 vor, indem Sie MEM alpha mit 2 mM L-Glutamin, 1% FBS, 1% (v/v) Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 U/ml), 0,1 mM NEAA, 1% (v/v)N1-Ergänzung, Taurin (0,25 mg/ml), Hydrocortison (20 ng/ml), Trijod-Thyronin (0,013 ng/ml) und 10 mM Nicotinamid ergänzen.
HINWEIS: Um die Lebensfähigkeit und Proliferation der Zellen zu verbessern, kann der Prozentsatz von FBS auf 20% erhöht werden, um Verdauungsenzyme zu neutralisieren und die dissoziierten Zellen zu säen. Für die langfristige Zellkultur kann der Prozentsatz von FBS auf bis zu 1% gesenkt werden12.
- Das Gewebeverdauungsenzym aliquot (0,25 % (w/v) Trypsin/EDTA-Lösung, ergänzt mit 0,91 mM EDTA, im Folgenden als Trypsin/EDTA-Lösung bezeichnet) während des Experiments auftauen.
HINWEIS: Frische Trypsin/EDTA-Lösung sollte jedes Mal verwendet werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Aliquot 10 ml frische Trypsin/EDTA-Lösung in jedes 15 ml sterile Zentrifugenröhrchen geben und die Aliquots bis zur Verwendung bei -20 °C im Kühlschrank einfrieren. - Sezierlösung.
- Sterilisieren Sie 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (pH 7,2), ergänzt mit 2% (v/v) Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 U/ml), indem Sie die Lösung durch eine 0,22 μm Spritzenvorsatzfiltereinheit filtrieren.
- Beschichten Sie die Kulturplatten und Transwell-Einsätze.
- Waschen Sie die Vertiefungen und Transwell-Einsätze mit 1x PBS. Entfernen Sie das PBS mit einer Pipette aus Vertiefungen und Transwells und geben Sie dann 1 ml frisches 1x PBS in die untere Kammer und 600 μl 10 μg/ml Lamininlösung in die obere Kammer.
- Die Platten/Transwell-Einsätze werden über Nacht bei 37 °C und 5 %CO2 im Zellkulturbrutschrank inkubiert. Entfernen Sie die Lamininlösung aus der oberen Kammer und waschen Sie zweimal mit 1 ml kaltem 1x PBS, bevor Sie die Zellen aussäen.
2. Dissektion von RPE-Zellen des Augapfels von Schweinen
- Vorbereitung der Instrumente.
- Reinigen Sie die Laminar-Flow-Haube mit 75% Ethanol und UV-Licht. Bereiten Sie drei sterile 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit ~25 mL 75%igem Ethanol, drei sterile 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit ~25 mL 1x PBS und drei sterile 10-cm-Zellkulturschalen mit ~15 mL 1x PBS vor.
HINWEIS: Diese Einstellungen werden normalerweise für das Sezieren von vier Schweineaugäpfeln verwendet. Bitte vergrößern Sie, wenn mehr Augäpfel verwendet werden. Um die Lebensfähigkeit der Zelle zu verbessern, 1x PBS-Puffer auf Eis für mindestens 30 min vorkühlen. Sowohl 75% Ethanol als auch UV-Licht sind notwendig, um sicherzustellen, dass experimentelle Instrumente und Zellen nicht kontaminiert werden. Schalten Sie die UV-Lampe im Voraus ein, um den gesamten Operationstisch für mindestens 15 Minuten zu sterilisieren.
- Reinigen Sie die Laminar-Flow-Haube mit 75% Ethanol und UV-Licht. Bereiten Sie drei sterile 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit ~25 mL 75%igem Ethanol, drei sterile 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit ~25 mL 1x PBS und drei sterile 10-cm-Zellkulturschalen mit ~15 mL 1x PBS vor.
- Reinigen Sie die Augäpfel des Schweins.
- Holen Sie sich frische Augäpfel aus einem Schlachthof und halten Sie sie bis zur Sezierung auf Eis. Tränken Sie vier Schweineaugäpfel in ~ 15 ml 75% Ethanol in einer 10 cm großen Petrischale und schneiden Sie mit einer Schere und einer Pinzette das restliche Bindegewebe und die Muskeln ab.
HINWEIS: Entfernen Sie so viel Gewebe wie möglich von außerhalb der Sklera, um Kontaminationen zu reduzieren. Schneiden Sie den Sehnerv zu diesem Zeitpunkt nicht durch, um den Transfer der Augäpfel während der Dekontamination und des Waschvorgangs zu erleichtern. Nach diesem Schritt sollten alle Verfahren in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden.
- Holen Sie sich frische Augäpfel aus einem Schlachthof und halten Sie sie bis zur Sezierung auf Eis. Tränken Sie vier Schweineaugäpfel in ~ 15 ml 75% Ethanol in einer 10 cm großen Petrischale und schneiden Sie mit einer Schere und einer Pinzette das restliche Bindegewebe und die Muskeln ab.
- Die Augäpfel des Schweins werden dekontaminiert, indem vier Augäpfel des Schweins nacheinander in drei sterilen 50-ml-Zentrifugenröhrchen, die mit 75% Ethanol gefüllt sind, eingeweicht und gewaschen werden. Jeder Augapfel wird für mindestens 5 min in jedes Röhrchen getaucht. Als nächstes waschen Sie die Augäpfel des Schweins nacheinander in drei sterilen 50-ml-Zentrifugenröhrchen, die mit 1x PBS gefüllt sind. Waschen Sie jeden Augapfel mindestens 5 Minuten lang in jeder Tube (Abbildung 1A). Drehen Sie die Schläuche jede Minute um, um die Augäpfel gründlich zu waschen.
- Dissektion von Augäpfeln bei Schweinen.
- Bewegen Sie die vier Augäpfel des Schweins in eine 10 cm große sterile Zellkulturschale mit 1x PBS. Schneiden Sie die äußere Oberfläche jedes Augapfels erneut ab, um den Sehnerv und kleine Trümmer zu entfernen (Abbildung 1B). Verwenden Sie eine Schere, um einen kleinen Schnitt am Schnittpunkt von Limbus und Sklera zu machen, und entfernen Sie dann die Hornhaut, die Iris, die Linse, den Glaskörper und die neurale Netzhaut (für detaillierte Strukturen dieser Gewebe siehe Abbildung 1).
- Übertragen Sie den RPE-Aderhaut-Sklera-Komplex in eine neue 10 cm große Zellkulturschale und machen Sie vier Schnitte, um die Augenmuschel in Form eines vierblättrigen Kleeblatts zu glätten (Abbildung 1C).
- Führen Sie den Aufschluss der Trypsin/EDTA-Lösung durch, indem Sie die vier RPE-Aderhaut-Sklera-Komplexe in eine neue 10-cm-Schale geben. Gießen Sie 20 ml frische Trypsin/EDTA-Lösung, um die RPE-Aderhaut-Sklera-Komplexe zu verschmelzen, und geben Sie die Schale für ~30 min in den Zellkultur-Inkubator bei 37 °C.
HINWEIS: Verwenden Sie frische Trypsin/EDTA-Lösung, um die RPE-Zellen zu dissoziieren. Der Zeitpunkt der Verdauung von Trypsin/EDTA-Lösung ist sorgfältig zu kontrollieren, da eine längere Inkubationszeit (mehr als 30 Minuten) die Kontamination anderer Zelltypen erhöhen kann.
3. Isolierung und Kultur von RPE-Zellen des Augapfels bei Schweinen
- RPE-Dissoziation.
- Nehmen Sie die Schale nach 30 Minuten Inkubation mit Trypsin/EDTA-Lösung aus dem Inkubator und geben Sie 20 ml vorgewärmte Nährmedien (mit 10% FBS) in die Schale, um die Trypsin/EDTA-Lösung zu neutralisieren.
HINWEIS: In diesem Schritt werden nur DMEM/Basic-Medien verwendet. Wenn Zellen Konfluenz erreichen, können je nach Versuchsbedingungen drei Kulturmedien verwendet werden: DMEM/Basismedien, DMEM/F12-Medien und MEM-Nic-Medien. - Verwenden Sie eine 5-ml-Transferpipette, um die RPE-Zellen durch vorsichtiges Pipettieren mehrmals zu dissoziieren. Die Zellsuspensionen werden in 15-ml-Zentrifugenröhrchen gesammelt. Verwenden Sie weitere 10 ml frisches Nährmedium (10% FBS), um die RPE-Aderhaut-Sklera-Komplexe auf der Schale zu waschen, indem Sie vorsichtig pipettieren, um so viele RPE-Zellen wie möglich zu erhalten.
HINWEIS: Trituieren Sie die Zellen nicht zu stark. Stellen Sie sicher, dass die Pipette mit einer Geschwindigkeit von ca. 3 ml/s gefüllt und entleert wird. Vermeiden Sie ein Aufblasen der Zellsuspension.
- Nehmen Sie die Schale nach 30 Minuten Inkubation mit Trypsin/EDTA-Lösung aus dem Inkubator und geben Sie 20 ml vorgewärmte Nährmedien (mit 10% FBS) in die Schale, um die Trypsin/EDTA-Lösung zu neutralisieren.
- Sammeln Sie RPE-Zellen, indem Sie die Röhrchen bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand mit einer Pipette ab und fügen Sie weitere 5 ml Nährmedium (10% FBS) hinzu, um die Zellen zu resuspendieren, und zentrifugieren Sie weitere 5 Minuten lang bei 200 x g . Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit 12 ml Nährmedien.
HINWEIS: Lassen Sie beim Absaugen des Überstands etwa 1 ml Medium stehen, um das Aufbrechen von Zellklumpen zu vermeiden. - Aussaat von RPE-Zellen.
- Säen Sie ~ 1-2 x 105 Zellen / Vertiefung in 12-Well-Kulturplatten oder Transwell-Einsätze. Üblicherweise werden etwa 1,5 x 106 RPE-Zellen aus vier Schweineaugäpfeln gewonnen. Wechseln Sie die Nährmedien alle 2 Tage und reduzieren Sie die Serumkonzentration auf 1%, wenn die Zellen die Oberfläche der Vertiefungen/Inserts vollständig bedecken.
HINWEIS: Bewegen Sie die Zellkulturschale nicht zu häufig, bevor sich die Zellen an der Kulturschale / den Einsätzen anheften.
- Säen Sie ~ 1-2 x 105 Zellen / Vertiefung in 12-Well-Kulturplatten oder Transwell-Einsätze. Üblicherweise werden etwa 1,5 x 106 RPE-Zellen aus vier Schweineaugäpfeln gewonnen. Wechseln Sie die Nährmedien alle 2 Tage und reduzieren Sie die Serumkonzentration auf 1%, wenn die Zellen die Oberfläche der Vertiefungen/Inserts vollständig bedecken.
- Wechseln Sie die Nährmedien alle 2 Tage, bis die Zellen geerntet sind.
HINWEIS: Die Konzentration von FBS kann reduziert werden, nachdem die Zellen die Konfluenz erreicht haben, und die Zellen können bis zu mehreren Monaten kultiviert werden, um eine vollständige Differenzierung und Reifung zu ermöglichen.
4. Charakterisierung primärer porciner RPE-Zellen
- Kulturieren Sie die Zellen am Zusammenfluss für 1 oder 2 Wochen und ernten Sie dann die Zellen für die weitere Analyse.
- Erntezellen für die quantitative real-time PCR (qRT-PCR) Analyse.
- Entfernen Sie die Nährmedien, waschen Sie die Zellen mit 1 ml kaltem 1x PBS und geben Sie dann 500 μL RNA-Extraktionslösung in jede Vertiefung, um Zelllysat aus etwa 1 x 106 Zellen zu sammeln.
- Extrakt mRNA13; Aus jeder Probe werden ca. 4 μg RNA extrahiert. Verwenden Sie 100 ng mRNA, um eine reverse Transkriptiondurchzuführen 14; Verdünnen Sie die cDNA um das 40-fache für die quantitative Echtzeit-PCR-Analyse. Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt.
- Ernten Sie Zellen für die Immunfluoreszenzfärbung.
- Entfernen Sie das Nährmedium, waschen Sie die Zellen mit 1 ml kaltem 1x PBS und fügen Sie dann 500 μL 4% (w/v) Paraformaldehyd in 1x PBS hinzu, um die Zellen (ca. 1 x 106 Zellen / Well) für 30 min bei Raumtemperatur zu fixieren. Anschließend werden die Zellen zweimal mit 1x PBS gewaschen und eine Immunfluoreszenzfärbung mit primären Antikörpern (1:100 in 1x PBS ergänzt mit 1% (w/v) Rinderserumalbumin) bei 4 °C über Nacht und sekundären Antikörpern (1:200 in 1x PBS ergänzt mit 1% (w/v) Rinderserumalbumin) bei Raumtemperatur für 2 h gemäß Online-Protokollen15 durchgeführt.
- Die Immunfluoreszenzbilder werden mit einem konfokalen Mikroskop nach dem Online-Handbuch16 aufgenommen.
- Ernten Sie Zellen für die Western-Blot-Analyse.
- Entfernen Sie die Nährmedien, waschen Sie die Zellen zweimal mit kaltem 1x PBS und geben Sie dann 80 μL RIPA-Puffer (mit 1x Protease-Inhibitor) in jede Vertiefung und kratzen Sie mit Zellabstreifern etwa 1 x 106 Zellen von den Schalen/Einsätzen.
- Sammeln Sie das Zelllysat aus jeder Vertiefung / jedem Einsatz in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Kochen Sie die Zelllysate für 10 Minuten und messen Sie dann die Proteinkonzentrationen mit BCA-Kits. Die Proteinkonzentration jeder Probe beträgt etwa 2 mg/ml. Verwenden Sie 25 μg Proteine jeder Probe für die Western-Blot-Analyse gemäß den Online-Protokollen17.
- Bei Western Blot werden die Membranen in 5 ml primärer Antikörperlösung (1:1.000 Verdünnung der primären Antikörper in 1x TBST-Lösung, ergänzt mit 5% (w/v) Rinderserumalbumin) bei 4 °C über Nacht auf einem rotierenden Mehrzweckschüttler inkubiert.
- Anschließend wird die Membran mit etwa 15 ml sekundärer Anti-Kaninchen- oder Anti-Maus-Sekundärantikörperlösung (1:5.000 Verdünnung von Sekundärantikörpern in 1x TBST-Lösung, ergänzt mit 5% (w/v) fettfreier Milch) bei Raumtemperatur für 2 h auf einem Orbitalschüttler entsprechend der Quelle des verwendeten primären Antikörpers inkubiert.
- Messung des transepithelialen Widerstandes (TER).
- Waschen Sie die Essstäbchenelektroden nacheinander mit 70% Ethanol und sterilem 1x PBS. Legen Sie dann das kürzere Ende der Elektrode in die obere Kammer und das längere Ende in die untere Kammer der Transwell-Einsätze und klicken Sie auf den Knopf am Epithelvoltmeter für die Messungen. Notieren Sie die TER-Messungen jedes Bohrlochs in dreifacher Ausfertigung.
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Representative Results
Die primären porcinen RPE-Zellen (pRPE) wurden in DMEM/Basismedien mit 10% FBS kultiviert, und die Zellmorphologie unter dem Lichtmikroskop wurde 2 Tage (Abbildung 2A), 6 Tage (Abbildung 2B) und 10 Tage (Abbildung 2C) nach der Aussaat fotografiert. Nach 1 Woche wurde eine konfluente Monoschicht von pigmentierten pRPE-Zellen mit Kopfsteinpflaster-Morphologien beobachtet.
Um die primären pRPE-Zellen besser zu charakterisieren, wurden primäre humane RPE-Zellen (hRPE) in Passage 3 (P3)18 und ARPE-19-Zellen in DMEM/Basic-Medien mit 1% FBS für eine weitere Woche kultiviert, und dann wurden die gesamte mRNA und das Protein der kultivierten Zellen sowie porcines RPE/Aderhautgewebe geerntet. Die Expressionsniveaus der charakteristischen Schlüsselgene19 und Proteinmarker des reifen RPE wurden mittels qRT-PCR und Western Blot untersucht. Im Vergleich zu ARPE-19-Zellen behielten pRPE-Zellen signifikant höhere Expressionsniveaus von Genen bei, die in der nativen RPE-Sekretion (Abbildung 3A(c)), Phagozytose (Abbildung 3A(i)), Transport (Abbildung 3A(a),(d)), Tight Junctions (Abbildung 3A(j)), Barrierebildung (Abbildung 3A(b)) sowie im Sehzyklus (Abbildung 3A(e),B) funktionieren. Die Expressionsniveaus von Krt8 und Krt18, zwei Zytoskelett-Markergenen des RPE, waren jedoch in primären pRPE-Zellen im Vergleich zu primären hRPE- und ARPE-19-Zellen signifikant niedriger (Abbildung 3A(g),(h)). Darüber hinaus war Itgav, das an der Phagozytose beteiligt ist, auch in primären pRPE-Zellen niedriger (Abbildung 3A(f)). Da die Expressionsniveaus dieser drei Gene in pRPE-Zellen mit denen des porcinen RPE/Aderoidgewebes vergleichbar waren, könnte dies auf die Genexpressionsunterschiede zwischen den Spezies hindeuten. Darüber hinaus war das Expressionsniveau von Tyr, das für die Melaninproduktion verantwortlich ist, sowohl in primären pRPE- als auch in hRPE-Zellen stark reduziert (Abbildung 3A(k)), was den Verlust der Pigmentierung in langfristig kultivierten Zellen erklären könnte. Die Unterschiede in den qRT-PCR-Ergebnissen, die in den Daten von humanen pRPE- und porcinen pRPE-Zellen beobachtet wurden, könnten auf die längere Lagerung und die höhere Passagenzahl (P3) von humanem pRPE zurückzuführen sein, was auf einen Verlust von RPE-Zeichen bei der Subkultivierung hindeutet. Darüber hinaus zeigte der Western Blot, dass das RPE65-Protein, das ein Schlüsselenzym im Sehzyklus mit RPE-Zellen ist, in pRPE-Zellen exprimiert wurde, während sein Expressionsniveau in primären hRPE-Zellen und ARPE-19-Zellen signifikant reduziert war (Abbildung 3B, C).
Um die Polaritäts- und Barrierefunktionen von RPE-Zellen weiter zu charakterisieren, wurden die kultivierten konfluenten Monoschichten von pRPE- und ARPE-19-Zellen in Transwell-Inserts mit DMEM/Basic-, DMEM/F12- und MEM-Nic-Medien für 1 Woche kultiviert (Abbildung 4). Unter diesen Kulturbedingungen zeigten die Fluoreszenz-Färbungsergebnisse von Na+-K+-ATPase (Abbildung 4A-F) und ZO-1 (Abbildung 4G-L), dass pRPE-Zellen höhere Expressionsniveaus sowohl von Na+-K+-ATPase als auch von ZO-1 aufwiesen als ARPE-19-Zellen. Die gleichmäßige Verteilung der Na+-K+-ATPase an der apikalen und basalen Oberfläche von pRPE-Zellen deutete darauf hin, dass eine längere Kulturzeit erforderlich war, um die Zellpolaritäten in vitro wiederherzustellen.
Das RPE bildet enge Verbindungen in der Nähe seiner apikalen Oberfläche, um den Austausch von Metaboliten zwischen der inneren Netzhaut und den Aderhaut20 eng zu regulieren. Die ZO-1-Färbung deutete darauf hin, dass Tight-Junction-Proteine normalerweise an der Plasmamembran von primären pRPE-Zellen mit regulären Kopfsteinpflaster-Morphologien lokalisiert waren, nicht jedoch von ARPE-19-Zellen. Unter den drei Kulturmedien wurden die besten ZO-1-Färbungsmuster in Zellen beobachtet, die in DMEM/Basic kultiviert wurden, während DMEM/F12 die Kopfsteinpflaster-Morphologie von pRPE-Zellen nicht aufrechterhalten konnte. Ein höherer TER-Wert dient als Indikator für die Bildung von Tight Junction und bessere Barrierefunktionen von RPE-Zellen21. Um die Funktion von Tight Junctions zu bestätigen, wurde der transepitheliale Widerstand (TER) gemessen. Im Vergleich zu leeren Transwell-Einsätzen wurde jedoch nur eine geringfügig höhere TER festgestellt (Abbildung 4M,N).
In der Netzhaut befindet sich die Bruch-Membran zwischen dem RPE und der Aderhaut. Die Hauptbestandteile der Bruch-Membran sind Kollagen Typ IV, Proteoglykane und Laminin22. Um die unterstützende Wirkung der Bruch-Membran auf RPE zu simulieren, wurde Laminin auf der Oberfläche der Transwell-Membran verteilt, um die Reifung kultivierter RPE-Zellen zu erleichtern. Basierend auf den Ergebnissen aus Abbildung 4 wurden die konfluenten pRPE-Zellen auf Transwell-Inserts in DMEM/Basic-Medien mit 1% FBS für 2 Wochen kultiviert. Die Ergebnisse der Immunfluoreszenzfärbung zeigten, dass RPE-spezifische Proteine RPE65 in allen pRPE-Zellen exprimiert wurden (Abbildung 5A, B). Die Na+-K+-ATPase war auf der apikalen Oberfläche von pRPE-Zellen verteilt, was auf die Wiederherstellung der Zellpolaritäten hindeutet (Abbildung 5C, D). Sowohl die ZO-1-Färbung als auch die TER-Ergebnisse deuteten darauf hin, dass Tight Junctions in primären pRPE-Zellen gut gebildet wurden, wenn sie auf Laminin kultiviert wurden (Abbildung 5E, F, H). Abbildung 5G zeigt Zellen, die mit Hoechst-Farbstoff gefärbt wurden.
Darüber hinaus zeigte der Western-Blot, dass sowohl pRPE- als auch ARPE-19-Zellen Wachstumsfaktoren produzierten, darunter den Pigmentepithel-abgeleiteten Faktor (PEDF) und den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) (Abbildung 6A). Nachdem konfluente Monoschichten von pRPE in Transwell-Inserts mit DMEM/Basic-, DMEM/F12- und MEM-Nic-Medien für 1 Woche kultiviert worden waren, wurden Nährmedien aus den oberen und unteren Kammern der Transwell-Inserts gesammelt, und das sezernierte VEGF wurde mittels ELISA quantifiziert. Wenn DMEM/Basic- und MEM-Nic-Medien für die Zellkultur verwendet wurden, sezernierten pPRE-Zellen mehr VEGF als Zellen in DMEM/F12-Medien (Abbildung 6B). Es konnten jedoch unter allen getesteten Bedingungen keine Unterschiede in den VEGF-Mengen zwischen der oberen und unteren Kammer der Transwell-Einsätze festgestellt werden (Abbildung 6B). Darüber hinaus wurden nach der Kultivierung der primären pRPE-Zellen auf den mit Laminin beschichteten Einsätzen und in DMEM/Basismedien für 2 Wochen die Medien aus den oberen und unteren Kammern gesammelt. Die Western-Blot-Analyse zeigte höhere PEDF-Konzentrationen in der oberen Kammer als in der unteren Kammer, während die Proteingehalte von sezerniertem VEGF in beiden Kammern ähnlich waren (Abbildung 6C). Diese Ergebnisse unterstützten die Wiederherstellung der Zellpolarität, wenn primäre pRPE-Zellen für weitere 2 Wochen kultiviert wurden, nachdem sie die Konfluenz auf Laminin erreicht hatten.
Abbildung 1: Grundlegende Schritte der pRPE-Zellisolierung . (A) Schweineaugäpfel mit 1x PBS in sterilen 50-ml-Zentrifugenröhrchen waschen. (B,C) Bereiten Sie RPE-Aderhaut-Sklera-Komplexe für die enzymatische Verdauung vor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Primäre pRPE-Zellmorphologien nach Zellkultur. Repräsentative Bilder von primären pRPE-Zellen an (A) Tag 2, (B) Tag 6 und (C) Tag 10. Maßstabsbalken 250 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Expressionsniveaus von wichtigen Signaturgenen und Proteinen in kultivierten RPE-Zellen. (A) qRT-PCR-Analyse der mRNA-Spiegel von Signaturgenen in primären pRPE-Zellen, primären hRPE-Zellen, ARPE-19-Zellen und pRPE/Aderhautgewebe. Gapdh wurde als Haushalts-Gen für die qRT-PCR verwendet. Vier biologische Replikate wurden für primäre pRPE-Zellen und ARPE-19-Zellen verwendet, während drei biologische Replikate für primäre hRPE-Zellen und pRPE/Aderhautgewebe verwendet wurden. Die Genexpressionsniveaus in ARPE-19-Zellen wurden als Kontrollen festgelegt. (B) Western-Blot-Analyse von RPE65-Proteinen in ARPE-19- und pRPE-Zellen. Vinculin wurde als Belastungskontrolle verwendet. (C) Western-Blot-Analyse von RPE65-Proteinen in primären hRPE-Zellen und pRPE/Aderhautgewebe. Vinculin wurde als Belastungskontrolle verwendet. Zum Vergleich wurde der Schüler-t-Test verwendet, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Ein-Wochen-Kultur von primären pRPE- und ARPE-19-Zellen in DMEM/Basic-, DMEM/F12- und MEM-Nic-Medien mit 1% FBS. (A) Na+-K+-ATPase-Fluoreszenzfärbung (Rot) von primären pRPE-Zellen in DMEM/Basic-, (B) DMEM/F12- und (C) MEM-Nic-Medien. (D) Na+-K+-ATPase-Fluoreszenzfärbung (rot) von ARPE-19-Zellen in DMEM/Basis-Medien, (E) DMEM/F12-Medien und (F) MEM-Nic-Medien. (G) ZO-1-Fluoreszenzfärbung (Grün) von primären pRPE-Zellen in DMEM/Basismedien, (H) DMEM/F12-Medien und (I) MEM-Nic-Medien. (J) ZO-1-Fluoreszenzfärbung (grün) in ARPE-19-Zellen in DMEM/Basismedien, (K) DMEM/F12-Medien und (L) MEM-Nic-Medien. TER-Messungen nach primären pRPE (M) und ARPE-19 (N) Zellen wurden in DMEM/Basic-, DMEM/F12- und MEM-Nic-Medien für 1 Woche kultiviert. Für jeden Zelltyp wurden Daten aus mindestens drei verschiedenen Bohrungen gewonnen. Zum Vergleich wurde der Schüler-t-Test verwendet, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Maßstabsbalken 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Zwei-Wochen-Kultur von pRPE-Zellen in DMEM/Basic-Medien mit 1% FBS. (A-F) Zellen, die mit oder ohne Laminin kultiviert wurden, wurden mit RPE65 (A,B, Rot), Na+-K+-ATPase (C,D, Rot), ZO-1 (E,F, Grün) und (G) Hoechst (Blau) gefärbt. (H) TER-Messungen in Zellblättern, die mit oder ohne Laminin kultiviert wurden. Für verschiedene Behandlungen wurden Daten aus vier verschiedenen Bohrungen gewonnen. Zum Vergleich wurde der Schüler-t-Test verwendet, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Sekretorische Funktionen von kultivierten primären pRPE- und ARPE-19-Zellen. (A) Western-Blot-Analyse von VEGF und PEDF in primären pRPE- und ARPE-19-Zellen. (B) Sezernierte VEGF in der oberen und unteren Kammer von Transwell-Inserts mit primären pRPE-Zellen, wenn konfluente Zellen in DMEM/Basic-, DMEM/F12- und MEM-Nic-Medien für 1 Woche kultiviert wurden. (C) Sekretierte PEDF und VEGF in der oberen und unteren Kammer von Transwell-Inserts mit primärem pRPE in DMEM/Basic-Medien für 2 Wochen. Für verschiedene Behandlungen wurden Daten aus drei verschiedenen Bohrungen gewonnen. Zum Vergleich wurde der Schüler-t-Test verwendet, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Menschheit | Sus scrofa | |
| Beste1 | V: GAAGGCAAGGACGAGCAAG | V: GGACACCTGTATGCCTACGA |
| R: TCCAACTGCTTGTGTTCTGC | R: GGAACGTGAAGAGGGGTACA | |
| CLDN19 | F: GGTGACCCAGGAGTTCTTCA | F: TCGTGACCCAGGAGTTCTTC |
| R: CTGTTGGGTCTCTCTCTGGCTC | R: GCTGCTGTTGGATCGCTC | |
| Itgav | F: CGCAGTCCCATCTCAAATCC | F: GCTTTCTTCAGGACGGAACA |
| R: GGCCCTGTATAAGATAGCTCGA | R: GAAATGAGCTGACCTTGCCA | |
| Krt8 | V: GGAGCAGATCAAGACCCTCA | F: CCCAGGAGAAGGAGCAGATC |
| R: GCCGCCTAAGGTTGTTGATG | R: ATGTTGTCGATGTTGCTCCG | |
| Krt18 | F: CTTGGAGAAGAAGGGACCCC | F: GCTGATAATCGGAGGCTGGA |
| R: GGCCAGCTCTGTCTCATACT | R: GAAGTCATCAGCAGCGAGAC | |
| Mertk | | F: GTGTGCAGCGTTCAGACAAT | F: GCGGCTATTTCTTGGTGGAA |
| R: AAAATGTTGACGGGCTCAGG | R: ACGTAGATGGGGTCAGACAC | |
| Serpinf1 | F: CAGATGAAAGGGAAGCTCGC | F: AAGACGTCGCTGGAGGATTT |
| R: TTAGGGTCCGACATCATGGG | R: GGTCACTTTCAGAGGCAGGA | |
| SLC16a8 | F: GGGTGTCCTCCATCATGCTA | F: CAGTTCGAGGTGCTCATGG |
| R: GTCAGGTAGAGCTCCAGGAG | R: GACAGCCATGAAGACACCAG | |
| Stra6 | F: CTTTGCAGGAAGAAGCTGGG | F: CTAGCCGTGTTGTCGATCCT |
| R: TAAATGGCCGTCCCTGTCAG | R: GACCATGAAGACAGCAGCAG | |
| TJP1 | F: ACAGGAAAATGACCGAGTTGC | F: AAGACTTGTCAGCTCAGCCA |
| R: TGGTTCAGGATCAGGACGAC | R: CCAGCATCTCGAGGTTCACT | |
| Tyr | F: ACTCAGCCCAGCATCATTCT | F: ATCTACTCAGCCCAGCATCC |
| R: ACATCAGCTGAAGAGGGGAG | R: GAGCCTTGGAGTCCTGGATT | |
| Gapdh | F: CAGCCTCAAGATCATCAGCA | F: CATCCTGGGCTACACTGAGG |
| R: ATGATGTTCTGGAGAGCCCC | R: GGGGCTCTTACTCCTTGGAG |
Tabelle 1: Primer für die qRT-PCR.
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Discussion
Hier wurde ein detailliertes und optimiertes Protokoll für die Isolierung, Kultur und Charakterisierung von RPE-Zellen aus Augäpfeln von Schweinen beschrieben, das ein gutes Modell für die In-vitro-Charakterisierung von RPE-Zellen und RPE-bezogene Störungsstudien erzeugt. Methoden zur Isolierung des RPE aus den Augen von Menschen, Mäusen und Ratten wurden bereitsbeschrieben 23,24,25. In einigen Laboratorien ist es jedoch schwierig, menschliche Augäpfel zu erhalten, und es wirft in der Regel ethische Fragen auf. Das RPE-Gewebe von Mäusen und Ratten ist relativ klein, die Zellen werden während der Trennung leicht beschädigt, und von jedem Tier können nur wenige Zellen gewonnen werden. Im Gegensatz dazu sind Schweineaugäpfel viel einfacher zu erhalten und zu handhaben, was eine relativ große Anzahl von Primärzellen aus einem einzigen Augapfel stabil erzeugen könnte. In einigen Studien wird eine Pinzette verwendet, um RPE mechanisch zu trennen, was leicht zum Zelltod führen kann. Daher wurden Hyaluronsäure, Dispase und Trypsin / EDTA-Lösung früher verwendet, um RPE-Zellen zu dissoziieren. Frühere Studien haben gezeigt, dass Trypsin / EDTA-Lösung die Fähigkeit hat, RPE zu helfen, sich von der Aderhaut21 zu lösen. Daher wurde Trypsin / EDTA-Lösung verwendet, um das Schweinegewebe zu verdauen, das optimale Ergebnisse erzielt. Nach der Trypsin/EDTA-Neuralisation konnten RPE-Gewebe durch vorsichtiges Pipettieren mit einer Pipettenspitze in Einzelzellsuspension dissoziiert werden. Ein Trick besteht darin, dass für jedes Experiment eine frische Trypsin/EDTA-Lösung empfohlen wird, um RPE-Zellen vollständig zu dissoziieren. Aufgrund der großen Fläche des RPE-Gewebes von Augäpfeln von Schweinen muss der halbschalenförmige RPE-Aderhaut-Sklera-Komplex in die Form eines vierblättrigen Kleeblattes geschnitten werden, das den vollständigen Kontakt zwischen dem RPE-Gewebe und der Trypsin/EDTA-Lösung begünstigt, um deren Trennung von der Aderhaut zu erleichtern. Die Verdauungszeit sollte jedoch eine halbe Stunde nicht überschreiten. Innerhalb dieser Zeit werden andere Gewebe außer RPE nicht verdaut, was die Kontamination durch andere Zelltypen effektiv reduzieren könnte.
Laminin wurde auf der Oberfläche der Transwell-Membran verteilt, um die unterstützende Wirkung der Bruch-Membran auf RPE zu simulieren. Die Ergebnisse zeigten, dass Laminin vorteilhaft für das Wachstum von pRPE-Zellen war, die die Expression von Transporter- und Tight-Junction-Proteinen stimulierten. Die Ergebnisse zeigten jedoch auch, dass eine längere Kulturzeit von etwa 2 Wochen für primäre pRPE-Zellen erforderlich war, um bestimmte Merkmale von nativen RPE-Geweben, einschließlich Zellpolarität und Tight Junctions, wiederherzustellen.
Ein Nachteil der primären RPE-Kultur besteht darin, dass es schwierig ist, die Enzymexpression des visuellen Zyklus in vitro aufrechtzuerhalten. Daher ist es wichtig zu untersuchen, ob kultivierte RPE-Zellen RPE-spezifische Proteine RPE65 exprimieren können. Im Vergleich zu ARPE-19-Zellen exprimierten pRPE-Zellen signifikant mehr RPE65-Protein. Im Gegensatz dazu wurde in ARPE-19-Zelllysaten im Western Blot nur eine schwache Bande des RPE65-Proteins beobachtet. Es ist interessant zu beobachten, dass sich das Molekulargewicht von RPE65 zwischen Mensch und Schwein leicht unterschied (Abbildung 3B,C). Der Verlust der RPE65-Expression in kultivierten RPE-Zellen bleibt ein Rätsel. Selbst in kultivierten Primärzellen ging RPE65 mit Passagen allmählich verloren (Daten nicht gezeigt). Wie die Expression von RPE65 in vitro aufrechterhalten werden kann, bedarf es weiterer Untersuchungen, wenn man bedenkt, dass der visuelle Zyklus eine kritische Funktion für natives RPE-Gewebe ist. Zweitens besteht eine wesentliche Einschränkung dieses Protokolls darin, dass in vitro kultivierte RPE-Zellen nicht passieren können. Bei längerer Kultur neigen pRPE-Zellen dazu, ihre hexagonale Form und TER sowie Pigmentierung zu verlieren, so dass nur Passage-0-Zellen verwendet werden können. Eine weitere Einschränkung dieses Kulturprotokolls besteht darin, dass genetische Mutationen, die zu erblichen Netzhauterkrankungen führen, in diesen Zellen schwer zu reproduzieren sind. Daher könnte die Virus-vermittelte Gen-Editierung in Zukunft eingesetzt werden, um erbliche RPE-Erkrankungen wie die kongenitale Amaurose von Leger zu untersuchen.
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Disclosures
Alle Autoren gaben an, dass es keine Interessenkonflikte gibt.
Alle Autoren erklären, dass keine finanziellen Interessenkonflikte im Zusammenhang stehen.
Acknowledgments
Die Autoren möchten allen Tieren, die ihre Zellen in diese Studie einbringen, ihre Dankbarkeit und ihren Respekt entgegenbringen. Diese Studie wurde zum Teil durch Zuschüsse des National Key R&D Program of China (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao und Grant No. 2018YFA0107301, Wei Li) unterstützt. Die Autoren danken Jingru Huang und Xiang You vom Central Lab, School of Medicine, Xiamen University für die technische Unterstützung bei der konfokalen Bildgebung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ARPE-19 cells | CCTCC | GDC0323 | |
| Bovine serum albumin | Yeasen | 36101ES60 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM 880 with Airyscan | |
| ChemiDoc Touch | Bio-Rad | 1708370 | |
| Cell scraper | Sangon | F619301 | |
| 10 cm culture dish | NEST | 121621EH01 | |
| 12-well culture plate | NEST | 29821075P | |
| DMEM F12 Medium | Gibco | C11330500BT | |
| DMEM basic Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EVOM2 | World Precision Instruments | EVOM2 | For TER measurement |
| Fetal bovine serum | ExCell Bio | FSP500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 0300-0108P | |
| Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 5196-2504 | |
| hydrocortisone | MCE | HY-N0583/CS-2226 | |
| Hoechst 33342 solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| LightCycler 96 Instrument | Roche | 5815916001 | |
| Liothyronine | MCE | HY-A0070A/CS-4141 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| MEM(1X)+GlutaMAX Medium | Gibco | 10566-016 | |
| MEM NEAA(100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Millex-GP syringe filter unit | Millipore | SLGPR33RB | |
| N1 | Sigma-Aldrich | SLCF4683 | |
| NcmECL Ultra | New Cell&Molecular Biotech | P10300 | |
| Non-fat Powdered Milk | Solarbio | D8340 | |
| Nicotinamide | SparkJade | SJ-MV0061 | |
| Na+-K+ ATPase antibody | Abcam | ab76020 | Recognize both human and porcine proteins |
| PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%) | Epizyme | PG112 | |
| primary Human RPE cells | - | - | Generous gift from Shoubi Wang lab |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Prism | GraphPad by Dotmatics | version 8.0 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | APExBIO | K1024 | |
| PRE65 antibody | Proteintech | 17939-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| PEDF antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-390172 | Recognize both human and porcine proteins |
| 100 x penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-031-1BCS | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | RARBIO | RA-9005 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | Toyobo | FSQ-201 | |
| RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 601052 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 602052 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Taurine | Damas-beta | 107-35-7 | |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | RNA extraction solution |
| TB Green Fast qPCR Mix | Takara | RR430A | |
| 12-well transwell inserts | Labselect | 14212 | |
| VEGF antibody | Proteintech | 19003-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| VEGF ELISA kit | Novusbio | VAL106 | |
| ZO-1 antibody | ABclonal | A0659 | Recognize both human and porcine proteins |
References
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