Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

תרבית ראשונית של תאי אפיתל פיגמנט רשתית חזירית

Published: September 23, 2022 doi: 10.3791/64244
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Eye Institute of Xiamen University, Fujian Provincial Key Laboratory of Ophthalmology and Visual Science, School of Medicine, Xiamen University, 2Department of Ophthalmology, Xiang'an Hospital of Xiamen University, School of Medicine, Xiamen University, 3Xiamen University Affiliated Xiamen Eye Center, School of Medicine, Xiamen University
* These authors contributed equally

Summary

כאן מוצגת שיטה קלה למעקב לתרבית תאי אפיתל פיגמנט רשתית חזיריים ראשוניים במבחנה .

Abstract

אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) הוא חד-שכבתי של תאי אפיתל פיגמנטיים מקוטבים, הממוקמים בין הכורואיד לנוירוארטינה ברשתית. פונקציות מרובות, כולל פאגוציטוזיס, הובלת חומרים מזינים / מטבוליטים, מטבוליזם של ויטמין A וכו ', מבוצעות על ידי RPE על בסיס יומי. תאי RPE הם תאי אפיתל ממוינים עם יכולת התחדשות מועטה או ללא יכולת התחדשות. אובדן תאי RPE גורם למחלות עיניים מרובות המובילות לליקוי ראייה, כגון ניוון מקולרי הקשור לגיל. לכן, הקמת מודל תרבית במבחנה של תאי RPE ראשוניים, הדומה יותר ל-RPE in vivo מאשר לקווי תאים, היא קריטית למחקרים האופייניים והמכניסטיים של תאי RPE. בהתחשב בעובדה שמקור גלגלי העיניים האנושיים מוגבל, אנו יוצרים פרוטוקול לתרבית תאי RPE חזיריים ראשוניים. על ידי שימוש בפרוטוקול זה, ניתן לנתק בקלות תאי RPE מגלגלי עיניים חזיריים בוגרים. לאחר מכן, תאים מנותקים אלה מתחברים לתרביות/תוספות, מתרבים ליצירת מונו-שכבה מתמזגת, ומבססים מחדש במהירות תכונות מרכזיות של רקמת אפיתל in vivo תוך 2 שבועות. על ידי qRT-PCR, הוכח כי תאי RPE חזיריים ראשוניים מבטאים גנים חתימה מרובים ברמות דומות לרקמת RPE מקורית, בעוד שהביטויים של רוב הגנים הללו הולכים לאיבוד/מופחתים מאוד בתאים דמויי RPE אנושיים, ARPE-19. יתר על כן, צביעת האימונופלואורסצנציה מראה את התפלגות הצומת ההדוק, קוטביות הרקמה וחלבוני השלד, כמו גם את נוכחותו של RPE65, איזומראז חיוני לחילוף החומרים של ויטמין A, בתאים ראשוניים בתרבית. בסך הכל, פיתחנו גישה קלה למעקב לתרבית תאי RPE חזיריים ראשוניים עם טוהר גבוה ותכונות RPE מקוריות, שיכולה לשמש מודל טוב להבנת הפיזיולוגיה של RPE, לחקר רעילות תאים ולהקלה על בדיקות סמים.

Introduction

אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) ממוקם בין פוטורצפטורים וכוריוקפילריס בשכבה החיצונית של הרשתית1 עם פונקציות מרובות, כולל יצירת מחסום הדם-רשתית, הובלה והחלפה של חומרים מזינים ומטבוליטים ברשתית, מיחזור ויטמין A כדי לשמור על מחזור ראייה תקין, ופאגוציטוזה ופינוי של מקטעים חיצוניים של פוטורצפטור (POSs)2,3 . מכיוון שנקודות תורפה דורשות התחדשות עצמית מתמדת כדי ליצור ראייה, תאי ה-RPE צריכים לבלוע ברציפות נקודות מכירה מנותקות כדי לשמור על הומאוסטזיס רשתית4. לכן, תפקוד לקוי של RPE גורם למחלות עיניים מסנוורות רבות, כגון ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD)4, רטיניטיס פיגמנטוזה (RP)5, אמורוזיס מולד לבר6, רטינופתיה סוכרתית7 וכו '. עד כה, הפתוגנזה המדויקת של רוב המחלות הללו נותרה חמקמקה. כתוצאה מכך, תרבית תאי RPE הוקמה כדי לחקור ביולוגיה של תאי RPE, שינויים פתולוגיים ומנגנונים בסיסיים.

כמודל הפשוט ביותר לחקר הביולוגיה של התא, התרבית של תאי RPE החלה כבר בשנותה-20 של המאה ה-20. למרות ש-ARPE-19 נמצא בשימוש נרחב כתאי RPE, אובדן פיגמנטציה, מורפולוגיה מרוצפת, ובמיוחד תפקודי המחסום בקו תאים זה מעלים חששות רבים9. לשם השוואה, התרבית של תאי RPE אנושיים ראשוניים מציעה תרחיש מציאותי יותר למחקרים פיזיולוגיים ופתולוגיים9. עם זאת, הזמינות המוגבלת יחסית מגבילה את השימוש בהם וסוגיות אתיות קיימות תמיד. בנוסף, מספר קבוצות השתמשו במודלים של עכברים כדי לתרבת תאי RPE. עם זאת, גודל עין העכבר הוא קטן, ותרבות אחת בדרך כלל דורש עכברים רבים, וזה לא נוח9. לאחרונה, מדענים פיתחו שיטות חדשות לשימוש בתאי גזע עובריים אנושיים או בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים כדי להפיק תאי RPE. למרות שלטכניקה זו יש פוטנציאל מיוחד לטיפול בהפרעות RPE תורשתיות, היא גוזלת זמן ובדרך כלל דורשת מספר חודשים כדי ליצור תאי RPE בוגרים10. כדי להתגבר על בעיות אלה, כאן אנו מציגים פרוטוקול קל למעקב כדי לבודד ולתרבת תאי RPE בטוהר גבוה במעבדה באופן שגרתי. בתנאי תרבית מתאימים, תאים אלה יכולים להציג פונקציות RPE אופייניות ולהציג מורפולוגיות RPE טיפוסיות. לכן, שיטת תרבות זו יכולה לספק מודל טוב להבנת הפיזיולוגיה של RPE, לחקור ציטוטוקסיות, לחקור מנגנונים פתולוגיים של מחלות עיניים קשורות ולבצע בדיקות סמים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

השימוש בחיות ניסוי עמד בתקנות האגודה למחקר בראייה וברפואת עיניים (ARVO) ואושר על ידי ועדת האתיקה לניהול ניסויים בבעלי חיים באוניברסיטת שיאמן.

1. הכנת מכשירים כירורגיים ניסיוניים, אנזים לעיכול רקמות וחיץ תרביות תאים

  1. הכינו את המכשירים הכירורגיים הניסיוניים, על ידי ניקוי ואוטוקלאבינג של שני זוגות מספריים ומלקחיים כירורגיים עיניים יום לפני נתיחת גלגל העין, ולאחר מכן ייבוש הקופסה עם מכשירי ניתוח בתנור פרוטוקול כללי בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  2. הכנת מדיה תרבותית.
    1. יש להכין תוסף DMEM/Basic עם סרום בקר עוברי של 10% (v/v), 2 מ"מ L-גלוטמין ו-1% (v/v) פניצילין (100 U/mL) וסטרפטומיצין (100 U/mL).
    2. יש להכין מדיית DMEM/F12 בתוספת FBS של 1% (v/v) ופניצילין 1% (v/v) (100 U/mL) וסטרפטומיצין (100 U/mL).
    3. יש להכין את MEM-Nic 11, על ידי תוספת MEM אלפא עם 2 mM L-גלוטמין, 1% FBS, 1% (v/v) פניצילין (100 U/mL) וסטרפטומיצין (100 U/mL), 0.1 mM NEAA, 1% (v/v) תוסףN1, טאורין (0.25 מ"ג/מ"ל), הידרוקורטיזון (20 ננוגרם/מ"ל), טריאודו-תירונין (0.013 ננוגרם/מ"ל) ו-10 mM ניקוטין-אמיד.
      הערה: כדי לשפר את הכדאיות וההתרבות של התאים, ניתן להגדיל את אחוז ה-FBS ל-20% כדי לנטרל אנזימי עיכול ולזרוע את התאים המנותקים. עבור תרבית תאים ארוכת טווח, ניתן להוריד את אחוז ה-FBS ל-1%12.
  3. במהלך הניסוי הפשרה של אנזים עיכול הרקמות אליקוט (0.25% (w/v) תמיסת טריפסין/EDTA בתוספת 0.91 mM EDTA, להלן תמיסת טריפסין/EDTA) במהלך הניסוי.
    הערה: יש להשתמש בתמיסת טריפסין/EDTA טרייה בכל פעם כדי להשיג תוצאות מיטביות. Aliquot 10 מ"ל של תמיסת טריפסין/EDTA טרייה לכל צינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מ"ל והקפאת האליקוטים במקרר בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
  4. פתרון דיסקציה.
    1. יש לעקר 1x פוספט מלח מופרך (PBS) (pH 7.2) בתוספת 2% (v/v) פניצילין (100 U/mL) וסטרפטומיצין (100 U/mL) על ידי סינון התמיסה דרך יחידת מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.
  5. מצפים את צלחות התרבית ותוספות טרנסוול.
    1. לשטוף את הבארות ואת תוספות transwell עם 1x PBS. הסר את PBS מבארות ו transwells עם פיפטה, ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של 1x PBS טרי לתא התחתון ו 600 μL של 10 מיקרוגרם / מ"ל של תמיסת laminin לתא העליון.
    2. לדגום את הצלחות/טרנסוול באינקובטור תרבית התאים למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. הסר את תמיסת הלמינין מהתא העליון ושטוף עם 1 מ"ל של PBS קר 1x פעמיים לפני זריעת התאים.

2. דיסקציה של תאי RPE של גלגל העין חזירי

  1. הכנת הכלים.
    1. נקו את מכסה המנוע עם 75% אתנול ואור UV. הכן שלושה צינורות צנטריפוגה סטריליים של 50 מ"ל המכילים ~ 25 מ"ל של 75% אתנול, שלושה צינורות צנטריפוגה סטריליים של 50 מ"ל המכילים ~ 25 מ"ל של PBS 1x, ושלושה כלי תרבית תאים סטריליים בגודל 10 ס"מ המכילים ~ 15 מ"ל של PBS אחד.
      הערה: הגדרות אלה משמשות בדרך כלל לניתוח ארבעה גלגלי עיניים חזיריים. אנא הרחב כאשר נעשה שימוש בגלגלי עיניים נוספים. כדי לשפר את כדאיות התא, יש ליצור מראש מאגר PBS 1x על הקרח למשך 30 דקות לפחות. גם 75% אתנול וגם אור UV נחוצים כדי להבטיח שמכשירים ותאים ניסיוניים אינם מזוהמים. הדליקו את מנורת ה-UV מראש כדי לעקר את כל שולחן הניתוחים למשך 15 דקות לפחות.
  2. נקו את גלגלי העיניים החזיריים.
    1. השיגו גלגלי עיניים טריים מבית מטבחיים והשאירו אותם על הקרח עד לנתיחה. השרו ארבעה גלגלי עיניים חזיריים לתוך ~ 15 מ"ל של 75% אתנול בצלחת פטרי בגודל 10 ס"מ והשתמשו בזוג מספריים ומלקחיים כדי לנתק את כל שאריות רקמות החיבור והשרירים.
      הערה: יש להסיר כמה שיותר רקמות מחוץ לסקלרה כדי להפחית את הזיהום. אין לחתוך את עצב הראייה בשלב זה כדי להקל על העברת גלגלי עיניים במהלך deontamination ו לשטוף שלב. לאחר שלב זה, כל ההליכים צריכים להתבצע במכסה מנוע זרימה למינרית.
  3. לנטרל את גלגלי העיניים החזיריים על ידי השריה ושטיפה של ארבעה גלגלי עיניים חזיריים בשלושה צינורות צנטריפוגה סטריליים של 50 מ"ל מלאים ב-75% אתנול באופן רציף; כל גלגל עיניים טבול לפחות 5 דקות בכל צינור. לאחר מכן, לשטוף את גלגלי העיניים חזיר בשלושה צינורות צנטריפוגה סטרילית 50 מ"ל מלא 1x PBS באופן רציף; שטפו כל גלגל עיניים במשך 5 דקות לפחות בכל צינור (איור 1A). הפוך את הצינורות כל דקה כדי לשטוף את גלגלי העיניים ביסודיות.
  4. דיסקציה של גלגלי עיניים חזיריים.
    1. העבירו את ארבעת גלגלי העיניים החזיריים לתוך צלחת תרבית תאים סטרילית באורך 10 ס"מ המכילה PBS אחד. חתוך שוב את המשטח החיצוני של כל גלגל עיניים כדי להסיר את עצב הראייה ואת הפסולת הקטנה (איור 1B). השתמשו במספריים כדי לבצע חתך קטן בצומת של הלימבוס והסקלרה, ולאחר מכן הסירו את הקרנית, הקשתית, העדשה, הגוף הזגוגי והרשתית העצבית (למבנים מפורטים של הרקמות האלה, ראו איור 1).
    2. העבירו את קומפלקס RPE-כורואיד-סקלרה לתוך צלחת תרבית תאים חדשה בקוטר 10 ס"מ ובצעו ארבעה חיתוכים כדי לנפח את העין בצורת תלתן בעל ארבעה עלים (איור 1C).
  5. בצעו עיכול תמיסת טריפסין/EDTA על ידי הכנסת ארבעת קומפלקסי RPE-כורואיד-סקלרה לצלחת חדשה באורך 10 ס"מ. יוצקים 20 מ"ל של תמיסת טריפסין/EDTA טרייה כדי למזג את קומפלקסי RPE-כורואיד-סקלרה ומכניסים את המנה לחממה של תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ~30 דקות.
    הערה: השתמש בתמיסת טריפסין/EDTA טרייה כדי לנתק את תאי ה-RPE. שלוט בזהירות בזמן העיכול של תמיסת טריפסין/EDTA, שכן זמן דגירה ארוך יותר (יותר מ-30 דקות) עלול להגביר את הזיהום של סוגים אחרים של תאים.

3. בידוד ותרבית של תאי RPE חזיריים של גלגל העין

  1. דיסוציאציה של RPE.
    1. הוציאו את המנה מהאינקובטור לאחר 30 דקות של דגירה עם תמיסת טריפסין/EDTA והוסיפו 20 מ"ל של מדיית תרבית שחוממה מראש (עם 10% FBS) למנה כדי לנטרל את תמיסת טריפסין/EDTA.
      הערה: בשלב זה, נעשה שימוש במדיה DMEM/Basic בלבד. כאשר תאים מגיעים למפגש, ניתן להשתמש בשלוש מדיות תרבית בהתאם לתנאי הניסוי: DMEM/מדיה בסיסית, מדיה DMEM/F12 ומדיה MEM-Nic.
    2. השתמש פיפטה העברה של 5 מ"ל כדי לנתק את תאי ה- RPE על ידי פיפטינג עדין מספר פעמים. לאסוף מתלי תאים לתוך צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל. השתמש בעוד 10 מ"ל של מדיית תרבית טרייה (10% FBS) כדי לשטוף את קומפלקסי RPE-choroid-sclera על המנה על ידי פיפטינג עדין כדי להשיג כמה שיותר תאי RPE.
      הערה: אין לבצע טריטורציה נמרצת מדי של התאים. הקפידו למלא ולרוקן את הפיפטה בקצב של כ-3 מ"ל/שנייה. הימנע מבעבע את השעיית התא.
  2. אסוף תאי RPE על ידי צנטריפוגה של הצינורות ב 200 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את הסופר-נאטנט באמצעות פיפטה והוסיפו עוד 5 מ"ל של מדיית תרבית (10% FBS) כדי להשעות את התאים והצנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 5 דקות נוספות. לנטרל את הסופר-נאטנט ולהחיות את התאים עם 12 מ"ל של מדיה תרבית.
    הערה: בעת שאיפת הסופר-נטנט, יש להשאיר כ-1 מ"ל של מדיה כדי למנוע שבירה של גושי תאים.
  3. זריעת תאי RPE.
    1. זרעים ~ 1-2 x 105 תאים / באר לתוך 12-באר צלחות תרבית או תוספות transwell. בדרך כלל, כ 1.5 x 10 6תאים RPE מתקבלים ארבעה גלגלי עיניים חזיר. יש לשנות את מדיית התרבית כל יומיים ולהפחית את ריכוז הסרום ל-1% כאשר התאים מכסים באופן מלא את פני הבארות/התוספות.
      הערה: אין להזיז את צלחת תרבית התאים לעתים קרובות מדי לפני שהתאים מתחברים לצלחת התרבית/התוספות.
  4. שנה את מדיית התרבית כל יומיים עד שהתאים נקטפים.
    הערה: ניתן להפחית את ריכוז ה-FBS לאחר שהתאים מגיעים למפגש, וניתן לתרבת תאים למשך עד מספר חודשים כדי לאפשר התמיינות והבשלה מלאות.

4. אפיון תאי RPE חזיריים ראשוניים

  1. תרבית את התאים במפגש במשך 1 או 2 שבועות, ולאחר מכן לקצור את התאים לניתוח נוסף.
  2. קציר תאים לניתוח PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR).
    1. הסר את מדיה תרבית, לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS קר 1x, ולאחר מכן להוסיף 500 μL של מיצוי RNA פתרון לתוך כל באר כדי לאסוף ליזאט התא מ 1 x 106 תאים .
    2. חלץ mRNA13; כ-4 מיקרוגרם של RNA מופקים מכל דגימה. השתמש 100 ng של mRNA כדי לבצע שעתוק הפוך14; לדלל את ה-cDNA פי 40 לצורך ניתוח PCR כמותי בזמן אמת. פריימרים מפורטים בטבלה 1.
  3. קצירת תאים לצביעת אימונופלואורסצנציה.
    1. הסר את מדיית התרבית, שטף את התאים עם 1 מ"ל של PBS 1x קר, ולאחר מכן הוסף 500 μL של 4% (w / v) paraformaldehyde ב 1x PBS כדי לתקן את התאים (כ 1 x 106 תאים / טוב) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את התאים עם 1x PBS פעמיים ובצעו צביעה אימונופלואורסצנטית עם נוגדנים ראשוניים (1:100 ב-PBS 1x בתוספת 1% (w/v) אלבומין בסרום בקר) ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה ונוגדנים משניים (1:200 ב-1x PBS בתוספת 1% (w/v) אלבומין בסרום בקר) בטמפרטורת החדר למשך שעתיים על פי פרוטוקולים מקוונים15.
    2. תמונות האימונופלואורסצנציה נרכשות על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי בעקבות המדריך המקוון16.
  4. קציר תאים לניתוח כתם מערבי.
    1. הסר את מדיית התרבית, שטף את התאים עם PBS 1x קר פעמיים, ולאחר מכן הוסף 80 μL של חיץ RIPA (עם מעכב פרוטאז 1x) לתוך כל באר והשתמש מגרדי תאים כדי לגרד כ 1 x 106 תאים מן הכלים / תוספות.
    2. לאסוף את התא lysate מכל באר / להכניס לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. מרתיחים את התא ליזטים במשך 10 דקות ולאחר מכן למדוד את ריכוזי החלבון באמצעות ערכות BCA; ריכוז החלבון בכל דגימה הוא כ-2 מ"ג/מ"ל. השתמש ב-25 מיקרוגרם חלבונים מכל דגימה לניתוח כתמים מערביים על פי פרוטוקולים מקוונים17.
    3. עבור כתם מערבי, דגירה של הממברנות ב-5 מ"ל של תמיסת נוגדנים ראשונית (דילול של 1:1,000 נוגדנים ראשוניים בתמיסת TBST אחת בתוספת 5% (w/v) אלבומין בסרום בקר) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה על שייקר רב-תכליתי מסתובב.
    4. לאחר מכן, דגירה על הממברנה עם כ-15 מ"ל של תמיסת נוגדנים משנית נגד ארנב או נגד עכבר (דילול של 1:5,000 נוגדנים משניים בתמיסת TBST אחת בתוספת חלב 5% (w/v) ללא שומן) בטמפרטורת החדר למשך שעתיים על שייקר מסלולי, על פי מקור הנוגדן העיקרי המשמש.
  5. מדידת התנגדות טרנס-אפיתליאלית (TER).
    1. לשטוף את האלקטרודות chopstick עם 70% אתנול סטרילי 1x PBS באופן רציף. לאחר מכן הנח את הקצה הקצר יותר של האלקטרודה בתא העליון ואת הקצה הארוך יותר בתא התחתון של תוספות הטרנסוול ולחץ על הכפתור במד המתח האפיתל עבור המדידות. רשום את מדידות ה- TER של כל באר במשולשים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תאי ה-RPE החזיריים העיקריים (pRPE) גודלו בתרבית במדיה DMEM/Basic עם 10% FBS, והמורפולוגיה של התאים תחת מיקרוסקופ אור צולמה ביומיים (איור 2A), 6 ימים (איור 2B) ו-10 ימים (איור 2C) לאחר הזריעה. לאחר 1 שבועות, נצפתה שכבה חד-שכבתית משולבת של תאי pRPE פיגמנטיים עם מורפולוגיות מרוצפות.

כדי לאפיין טוב יותר את תאי ה-pRPE הראשוניים, תאי RPE אנושיים ראשוניים (hRPE) במעבר 3 (P3)18 ותאי ARPE-19 גודלו בתרבית במדיה DMEM/Basic עם 1% FBS עבור wk נוסף, ולאחר מכן נקטפו סך ה-mRNA והחלבון של התאים בתרבית, כמו גם רקמות RPE/כורואיד חזיריות. רמות הביטוי של גנים אופייניים מרכזיים19 וסמני חלבון של RPE בוגר הוערכו על ידי qRT-PCR וכתם מערבי. בהשוואה לתאי ARPE-19, תאי pRPE שמרו על רמות ביטוי גבוהות יותר באופן משמעותי של גנים המתפקדים בהפרשת RPE מקומית (איור 3A(c)), פאגוציטוזה (איור 3A(i)), תחבורה (איור 3A(a),(d)), צמתים הדוקים (איור 3A(j)), היווצרות מחסום (איור 3A(b)), כמו גם מחזור ראייה (איור 3A(e),B). עם זאת, רמות הביטוי של Krt8 ו-Krt18, שני גנים של סמני שלד ציטוסקלטון של ה-RPE, היו נמוכות משמעותית בתאי pRPE ראשוניים בהשוואה לתאי hRPE ראשוניים ו-ARPE-19 (איור 3A(g),(h)). יתר על כן, itgav, שמשתתף בפאגוציטוזה, היה נמוך יותר גם בתאי pRPE ראשוניים (איור 3A(f)). מאחר שרמות הביטוי של שלושת הגנים האלה בתאי pRPE היו דומות לרקמת ה-RPE/כורואיד החזירית, הדבר עשוי להצביע על ההבדלים בביטוי הגנים בין המינים. יתר על כן, רמת הביטוי של Tyr, שאחראי על ייצור המלנין, הייתה נמוכה מאוד הן בתאי pRPE ראשוניים והן בתאי hRPE (איור 3A(k)), מה שעשוי להסביר את אובדן הפיגמנטציה בתאים בתרבית ארוכת טווח. ההבדלים בתוצאות qRT-PCR שנצפו בנתונים של תאי pRPE אנושיים ותאי pRPE חזיריים עשויים לנבוע מהאחסון הארוך יותר וממספר המעבר הגבוה יותר (P3) של pRPE אנושי, ובכך מצביעים על אובדן תווי RPE בתת-תרבות. בנוסף, כתם מערבי הראה כי חלבון RPE65, שהוא אנזים מפתח במחזור הראייה הכולל תאי RPE, התבטא בתאי pRPE, בעוד שרמת הביטוי שלו פחתה באופן משמעותי בתאי hRPE ראשוניים ובתאי ARPE-19 (איור 3B,C).

כדי לאפיין עוד יותר את הקוטביות ואת תפקודי המחסום של תאי RPE, המונו-שכבות המתמזגות בתרבית של תאי pRPE ו-ARPE-19 גודלו בתרבית בתוספות טרנסוול עם DMEM/Basic, DMEM/F12 ומדיה MEM-Nic במשך 1 שבועות (איור 4). בתנאי התרבית האלה, תוצאות צביעה פלואורסצנטית של Na+-K+-ATPase (איור 4A-F) ו-ZO-1 (איור 4G-L) גילו שלתאי pRPE היו רמות ביטוי גבוהות יותר הן של Na+-K+-ATPase והן של ZO-1 מאשר של תאי ARPE-19. ההתפלגות השווה של Na+-K+-ATPase על פני השטח האפיקליים והבסיסיים של תאי pRPE הצביעה על כך שנדרש זמן תרבית ארוך יותר כדי לשחזר את הקטבים של התאים במבחנה.

ה-RPE יוצר צמתים הדוקים ליד פני השטח האפיקליים שלו כדי לווסת באופן הדוק את חילופי המטבוליטים בין הרשתית הפנימית לבין הכורואידים20. צביעת ZO-1 העלתה כי חלבוני צומת הדוקים היו ממוקמים בדרך כלל בקרום הפלזמה של תאי pRPE ראשוניים עם מורפולוגיות מרוצפות אבן רגילות, אך לא של תאי ARPE-19. מבין שלושת מדיות התרבית, דפוסי הצביעה הטובים ביותר של ZO-1 נצפו בתאים שגודלו בתרבית ב-DMEM/Basic, בעוד ש-DMEM/F12 לא הצליח לשמור על המורפולוגיה המרוצפת של תאי pRPE. ערך TER גבוה יותר משמש כאינדיקטור להיווצרות צומת הדוקה ותפקודי מחסום טובים יותר של תאי RPE21. כדי לאשר את הפונקציה של צמתים הדוקים, נמדדה התנגדות טרנס-אפיתליאלית (TER). עם זאת, זוהה רק TER מעט גבוה יותר בהשוואה לתוספות טרנסוול ריקות (איור 4M,N).

ברשתית, הממברנה של ברוך קיימת בין ה-RPE לכורואיד. המרכיבים העיקריים של הממברנה של ברוך הם קולגן מסוג IV, פרוטאוגליקנים ולמינין22. על מנת לדמות את ההשפעה התומכת של הממברנה של ברוך על RPE, למינין התפשט על פני השטח של קרום טרנסוול כדי להקל על ההבשלה של תאי RPE בתרבית. בהתבסס על התוצאות שהתקבלו מאיור 4, תאי ה-pRPE המתמזגים גודלו בתרבית על תוספות טרנסוול במדיה DMEM/Basic עם 1% FBS עבור 2 שבועות. תוצאות צביעה אימונופלואורסצנטית הראו כי חלבונים ספציפיים ל-RPE RPE65 התבטאו בכל תאי ה-pRPE (איור 5A,B). Na+-K+-ATPase הופץ על פני השטח האפיקליים של תאי pRPE, מה שמרמז על התבססות מחדש של קוטבי התאים (איור 5C,D). גם הכתמת ZO-1 וגם תוצאות ה-TER הצביעו על כך שצמתים הדוקים נוצרו היטב בתאי pRPE ראשוניים כאשר הם גודלו בתרבית על למינין (איור 5E,F,H). איור 5G מתאר תאים מוכתמים בצבע Hoechst.

יתר על כן, כתם מערבי הראה שגם תאי pRPE וגם תאי ARPE-19 מייצרים גורמי גדילה, כולל גורם שמקורו באפיתל פיגמנטי (PEDF) וגורם גדילה אנדותל וסקולרי (VEGF) (איור 6A). לאחר שמונו-שכבות מקבילות של pRPE תורבתו בתוספות טרנסוול עם DMEM/Basic, DMEM/F12 ומדיה MEM-Nic עבור wk אחד, מדיה תרבותית מהתאים העליונים והתחתונים של תוספות הטרנסוול נאספה, וה-VEGF המופרש כומת על ידי ELISA. כאשר נעשה שימוש במדיה DMEM/Basic ו-MEM-Nic עבור תרבית תאים, תאי pPRE הפרישו יותר VEGF מאשר תאים במדיית DMEM/F12 (איור 6B). עם זאת, לא ניתן היה לזהות הבדלים בכמויות VEGF בין התאים העליונים והתחתונים של תוספות הטרנסוול בכל התנאים שנבדקו (איור 6B). בנוסף, לאחר שתאי pRPE ראשוניים עברו תרבית על התוספות המצופות בלמינין ובמדיה DMEM/Basic במשך 2 שבועות, נאספה המדיה מהתאים העליונים והתחתונים. ניתוח כתמים מערביים הראה רמות גבוהות יותר של PEDF בתא העליון מאשר בתא התחתון, בעוד שרמות החלבון של VEGF מופרש היו דומות בשני התאים (איור 6C). תוצאות אלה תמכו עוד יותר בהתבססות מחדש של קוטביות התא כאשר תאי pRPE ראשוניים גודלו בתרבית במשך 2 שבועות נוספים לאחר שהגיעו למפגש על למינין.

Figure 1
איור 1: שלבים בסיסיים של בידוד תאי pRPE . (A) לשטוף גלגלי עיניים חזיריים עם 1x PBS בצינורות צנטריפוגה סטריליים של 50 מ"ל. (ב,ג) הכן קומפלקסים RPE-choroid-sclera לעיכול אנזימטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: מורפולוגיות ראשוניות של תאי pRPE לאחר תרבית תאים. תמונות מייצגות של תאי pRPE ראשוניים ב-(A) יום 2, (B) יום 6 ו-(C) יום 10. סרגל קנה מידה 250 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: רמות ביטוי של גנים וחלבונים מרכזיים בתאי RPE בתרבית. (A) ניתוח qRT-PCR של רמות mRNA של גני חתימה בתאי pRPE ראשוניים, תאי hRPE ראשוניים, תאי ARPE-19 ורקמת pRPE/כורואיד. Gapdh שימש כגן שמירת הבית עבור qRT-PCR. ארבעה שכפולים ביולוגיים שימשו לתאי pRPE ראשוניים ולתאי ARPE-19, בעוד ששלושה שכפולים ביולוגיים שימשו לתאי hRPE ראשוניים ולרקמת pRPE/כורואיד. רמות ביטוי הגנים בתאי ARPE-19 נקבעו כבקרות. (B) ניתוח כתמים מערביים של חלבוני RPE65 בתאי ARPE-19 ו-pRPE. וינקולין שימש כבקרת טעינה. (C) ניתוח כתמים מערביים של חלבוני RPE65 בתאי hRPE ראשוניים וברקמת pRPE/כורואידית. וינקולין שימש כבקרת טעינה. לשם השוואה, נעשה שימוש במבחן t-סטודנט *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: תרבית של שבוע אחד של תאי pRPE ו-ARPE-19 ראשוניים במדיה DMEM/Basic, DMEM/F12 ו-MEM-Nic עם 1% FBS. (A) צביעה פלואורסצנטית Na+-K+-ATPase (אדום) של תאי pRPE ראשוניים ב-DMEM/Basic, (B) DMEM/F12 ו-(C) במדיה MEM-Nic. (D) צביעה פלואורסצנטית של Na+-K+-ATPase (אדום) של תאי ARPE-19 במדיה DMEM/בסיסית, (E) מדיית DMEM/F12, ו-(F) מדיית MEM-Nic. (G) צביעה פלואורסצנטית של ZO-1 (ירוק) של תאי pRPE ראשוניים במדיה DMEM/בסיסית, (H) מדיית DMEM/F12, ו-(I) מדיית MEM-Nic. (J) צביעה פלואורסצנטית של ZO-1 (ירוק) בתאי ARPE-19 במדיה DMEM/בסיסית, (K) מדיית DMEM/F12, ו-(L) מדיית MEM-Nic. מדידות TER לאחר תאי pRPE ראשוניים (M) ו-ARPE-19 (N) גודלו בתרבית במדיה DMEM/Basic, DMEM/F12 ו-MEM-Nic במשך 1 שבועות. עבור כל סוג של תאים, הנתונים התקבלו מלפחות שלוש בארות שונות. לשם השוואה, נעשה שימוש במבחן t-סטודנט *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. סרגל קנה מידה 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: תרבית של שני שבועות של תאי pRPE במדיה DMEM/Basic עם 1% FBS. (A-F) תאים בתרבית עם או בלי למינין היו מוכתמים ב-RPE65 (A,B, אדום), Na+-K+-ATPase (C,D, אדום), ZO-1 (E,F, ירוק) ו-(G) Hoechst (כחול). (H) מדידות TER ביריעות תאים בתרבית עם או בלי למינין. עבור טיפולים שונים התקבלו נתונים מארבע בארות שונות. לשם השוואה, נעשה שימוש במבחן t-סטודנט *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: תפקודי הפרשה של תאי pRPE ו-ARPE-19 ראשוניים בתרבית. (A) ניתוח כתמים מערביים של VEGF ו-PEDF בתאי pRPE ו-ARPE-19 ראשוניים. (B) VEGF מופרש בתא העליון והתחתון של תוספות טרנסוול עם תאי pRPE ראשוניים כאשר תאים מתמזגים התרבו בתרבית ב-DMEM/Basic, DMEM/F12 ומדיה MEM-Nic עבור 1 wk. (C) PEDF ו-VEGF מופרשים בתא העליון והתחתון של תוספות טרנסוול עם pRPE ראשוני במדיה DMEM/Basic למשך 2 שבועות. עבור טיפולים שונים התקבלו נתונים משלוש בארות שונות. לשם השוואה, נעשה שימוש במבחן t-סטודנט *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

הומו ספיינס Sus scrofa
הטוב ביותר1 F: GAAGGCAAGGACGAGCAAG F: GGACACCTGTATGCCTACGA
R: TCCAACTGCTTGTTCTGC R: GGAACGTGAAGAGGGGTACA
Cldn19 F: GGTGACCCAGGAGTTCTTCA F: TCGTGACCCAGGAGTTCTTC
R: CTGTTGGGTCTCTCTCTCTCTC R: GCTGCTGTTGGATCGCTC
איטגב F: CGCAGTCCCATCTCAAATCC F: GCTTTTCTCAGGACGGAACA
R: GGCCCTGTATAAGATAGCTCGA R: GAAATGAGCTGACCTTGCCA
Krt8 F: GGAGCAGATCAAGACCCTCA F: CCCAGGAGAAGGAGCAGATC
R: GCCGCCTAAGGTTGTTGATG R: ATGTTGTCGATGTTGCTCCG
Krt18 F: CTTGGAGAAGAAGGGACCCC F: GCTGATAATCGGGGGCTGGA
R: GGCCAGCTCTCTCATACT R: GAAGTCATCAGCAGCGAGAC
מרטק F: GTGTGCAGCGTTCAGACAAT F: GCGGCTATTTTGGTGGAA
R: AAAATGTTGACGGGCTCAGG R: ACGTAGATGGGGTCAGACAC
סרפין1 F: CAGATGAAAGGGAAGCTCGC F: AAGACGTCGCTGGAGGATTT
R: TTAGGGTCCGACATCATGGG R: GGTCACTTTCAGAGGCAGGA
Slc16a8 F: GGGTCCTCCATCATGCTA F: CAGTTCGAGGTGCTCATGG
R: GTCAGGTAGAGCTCCAGGAG R: GACAGCCATGAAGACACCAG
סטרה6 F: CTTTGCAGGAAGAAGGGGGG F: CTAGCCGTTGTCGATCCT
R: TAAATGGCCGTCCCTGTCAG R: GACCATGAAGACAGCAGCAGCAG
Tjp1 F: ACAGGAAAATGACCGAGTTGC F: AAGACTTGTCAGCTCAGCCA
R: TGGTTCAGGATCAGGACGAC R: CCAGCATCTCGAGGTTCACT
צור F: ACTCAGCCCAGCATCATTCT F: ATCTACTCAGCCCAGCATCC
R: ACATCAGCTGAAGAGGGGAG R: GAGCCTTGGAGTCCTGGATT
גאפדה F: CAGCCTCAAGATCATCAGCA F: CATCCTGGGCTACACTGAGG
R: ATGATGTTGGAGAGCCCC R: GGGGCTCTTACTCCTTGGAG

טבלה 1: פריימרים עבור qRT-PCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן תואר פרוטוקול מפורט וממוטב לבידוד, תרבית ואפיון של תאי RPE מגלגלי עיניים חזיריים, המייצר מודל טוב לאפיון חוץ גופי של תאי RPE ומחקרי הפרעות הקשורות ל-RPE. שיטות לבידוד ה-RPE מעיני אדם, עכבר וחולדה תוארו בעבר23,24,25. עם זאת, קשה להשיג גלגלי עיניים אנושיים במעבדות מסוימות, וזה בדרך כלל מעלה סוגיות אתיות. רקמות ה-RPE של עכברים וחולדות קטנות יחסית, התאים ניזוקים בקלות במהלך ההפרדה, וניתן לקבל רק תאים בודדים מכל חיה. לעומת זאת, גלגלי עיניים חזיריים הרבה יותר קלים להשגה ולטיפול, מה שיכול ביציבות לייצר מספר גדול יחסית של תאים ראשוניים מגלגל עין יחיד. במחקרים מסוימים, פינצטה משמשים להפרדה מכנית של RPE, מה שיכול בקלות להוביל למוות של תאים. לכן, חומצה היאלורונית, דיספאז ותמיסת טריפסין/EDTA שימשו בעבר לניתוק תאי RPE. מחקרים קודמים הראו כי לתמיסת טריפסין/EDTA יש את היכולת לעזור ל-RPE להתנתק מהכורואיד21. לכן, תמיסת טריפסין/EDTA שימשה לעיכול רקמות החזיר, אשר מניבות תוצאות מיטביות. לאחר נוירוליזציה של טריפסין/EDTA, ניתן לנתק רקמות RPE לתרחיף של תא בודד על ידי צנרת עדינה עם קצה פיפטה. טריק אחד הוא שתמיסת טריפסין/EDTA טרייה מומלצת לכל ניסוי כדי לנתק לחלוטין תאי RPE. בשל השטח הגדול של רקמות ה-RPE של גלגלי עיניים חזיריים, יש לחתוך את קומפלקס ה-RPE-choroid-sclera בצורת חצי קערה לצורת תלתן בעל ארבעה עלים, אשר תורם למגע המלא בין רקמות ה-RPE לתמיסת טריפסין/EDTA כדי להקל על הפרדתם מהכורואיד. עם זאת, זמן העיכול לא יעלה על חצי שעה. בתוך פרק זמן זה, רקמות אחרות מלבד RPE לא יתעכלו, מה שיכול להפחית ביעילות את הזיהומים מסוגים אחרים של תאים.

למינין התפשט על פני השטח של קרום הטרנסוול כדי לדמות את ההשפעה התומכת של הממברנה של ברוך על RPE. התוצאות הראו כי למינין היה מועיל לצמיחה של תאי pRPE, אשר עורר את הביטוי של טרנספורטר וחלבוני צומת הדוק. עם זאת, התוצאות גם הצביעו על כך שנדרש זמן תרבית ארוך יותר, של כ-2 שבועות, עבור תאי pRPE ראשוניים כדי לשחזר תכונות מסוימות של רקמות RPE מקומיות, כולל קוטביות התאים וצמתים הדוקים.

אחד החסרונות של תרבית RPE ראשונית הוא שקשה לשמור על ביטויי אנזימי מחזור חזותי במבחנה. לכן, חיוני לבחון אם תאי RPE בתרבית יכולים לבטא חלבונים ספציפיים ל-RPE RPE65. בהשוואה לתאי ARPE-19, תאי pRPE ביטאו באופן משמעותי יותר חלבון RPE65. לעומת זאת, רק פס חלש של חלבון RPE65 נצפה בליזאטים של תאי ARPE-19 בכתם המערבי. מעניין לראות שהמשקל המולקולרי של RPE65 היה מעט שונה בין בני אדם לחזירים (איור 3B,C). אובדן הביטוי של RPE65 בתאי RPE בתרבית נותר בגדר תעלומה. אפילו בתאים ראשוניים בתרבית, RPE65 אבד בהדרגה עם מעברים (נתונים לא מוצגים). עד כה, כיצד לשמור על הביטוי של RPE65 במבחנה דורש חקירה נוספת, בהתחשב בעובדה כי מחזור הראייה הוא פונקציה קריטית עבור רקמות RPE המקומי. שנית, מגבלה מרכזית של פרוטוקול זה היא שלא ניתן להעביר תאי RPE בתרבית במבחנה. בתרבית ממושכת, תאי pRPE נוטים לאבד את צורתם המשושה ואת ה-TER שלהם, כמו גם פיגמנטציה, כך שניתן להשתמש רק בתאי מעבר 0. מגבלה נוספת של פרוטוקול תרבית זה היא שמוטציות גנטיות, המובילות למחלות רשתית תורשתיות, קשות להתרבות בתאים אלה. לכן, עריכת גנים בתיווך וירוסים עשויה לשמש כדי לחקור הפרעות RPE תורשתיות כגון amaurosis מולדת Leger בעתיד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

כל המחברים חשפו כי אין ניגודי עניינים.

כל המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים רוצים להראות את הכרת התודה והכבוד שלהם לכל בעלי החיים שתורמים את התאים שלהם במחקר זה. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענקים מתוכנית המו"פ הלאומית של סין (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao ומענק מס' 2018YFA0107301, Wei Li). המחברים מודים לג'ינגרו הואנג ושיאנג יו מהמעבדה המרכזית, בית הספר לרפואה, אוניברסיטת שיאמן על התמיכה הטכנית בהדמיה קונפוקלית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ARPE-19 cells CCTCC GDC0323
Bovine serum albumin Yeasen 36101ES60
Confocal microscopy Zeiss LSM 880 with Airyscan
ChemiDoc Touch Bio-Rad 1708370
Cell scraper Sangon F619301
10 cm culture dish NEST 121621EH01
12-well culture plate NEST 29821075P
DMEM F12 Medium Gibco C11330500BT
DMEM basic Medium Gibco C11995500BT
EVOM2 World Precision Instruments EVOM2 For TER measurement
Fetal bovine serum ExCell Bio FSP500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific  A-11034
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A-11012
Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP Bio-Rad 0300-0108P
Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP Bio-Rad 5196-2504
hydrocortisone MCE HY-N0583/CS-2226
Hoechst 33342 solution (20 mM) ThermoFisher Scientific 62249
LightCycler 96 Instrument Roche 5815916001
Liothyronine MCE HY-A0070A/CS-4141
laminin Sigma-Aldrich L2020-1MG
MEM(1X)+GlutaMAX Medium Gibco 10566-016
MEM NEAA(100X) Gibco 11140-050
Millex-GP syringe filter unit Millipore SLGPR33RB
N1 Sigma-Aldrich SLCF4683
NcmECL Ultra New Cell&Molecular Biotech P10300
Non-fat Powdered Milk Solarbio D8340
Nicotinamide SparkJade SJ-MV0061
Na+-K+ ATPase antibody Abcam ab76020 Recognize both human and porcine proteins
PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%) Epizyme PG112
primary Human RPE cells  - - Generous gift from Shoubi Wang lab 
Pierce BCA Protein Assay Kit  ThermoFisher Scientific 23225
Prism GraphPad by Dotmatics version 8.0
Protease Inhibitor Cocktails APExBIO K1024
PRE65 antibody Proteintech 17939-1-AP Recognize both human and porcine proteins
PEDF antibody Santa Cruz Biotechnology sc-390172 Recognize both human and porcine proteins
100 x penicillin/streptomycin  Biological Industries 03-031-1BCS
Phosphate buffered saline (PBS) RARBIO RA-9005
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix Toyobo FSQ-201
RIPA buffer ThermoFisher Scientific  89900
15 mL sterile centrifuge tubes NEST 601052
50 mL sterile centrifuge tubes NEST 602052
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-056
Taurine Damas-beta 107-35-7
Trizol Thermo-Fisher  15596026 RNA extraction solution
TB Green Fast qPCR Mix Takara RR430A
12-well transwell inserts Labselect 14212
VEGF antibody Proteintech 19003-1-AP Recognize both human and porcine proteins
VEGF ELISA kit Novusbio VAL106
ZO-1 antibody ABclonal A0659 Recognize both human and porcine proteins

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tan, L. X., Germer, C. J., La Cunza, N., Lakkaraju, A. Complement activation, lipid metabolism, and mitochondrial injury: Converging pathways in age-related macular degeneration. Redox Biology. 37, 101781 (2020).
  2. Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
  3. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
  4. Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
  5. Ducloyer, J. B., Le Meur, G., Cronin, T., Adjali, O., Weber, M. Gene therapy for retinitis pigmentosa. Medecine Sciences. 36 (6-7), 607-615 (2020).
  6. den Hollander, A. I., Roepman, R., Koenekoop, R. K., Cremers, F. P. Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 391-419 (2008).
  7. Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
  8. Smith, D. T. Melanin pigment in the pigmented epithelium of the retina of the embryo chick eye studied in vivo and in vino. The Anatomical Record. 18, 260-261 (1920).
  9. Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
  10. D'Antonio-Chronowska, A., D'Antonio, M., Frazer, K. A. In vitro differentiation of human iPSC-derived retinal pigment epithelium cells (iPSC-RPE). Bio-Protocol. 9 (24), 3469 (2019).
  11. Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
  12. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
  13. Scientific, T. , Available from: https://www.thermofisher.cn/document-connect/document connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2Ftrizol_reagent.pdf (2022).
  14. Toyota. , Available from: https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf (2022).
  15. Abcam. , Available from: https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol (2022).
  16. Zeiss. , Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals (2022).
  17. Cell Signal Technology. , Available from: https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western (2022).
  18. Wang, S., et al. Reversed senescence of retinal pigment epithelial cell by coculture with embryonic stem cell via the TGFbeta and PI3K pathways. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 588050 (2020).
  19. Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Experimental Eye Research. 126, 1-4 (2014).
  20. Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Experimental Eye Research. 126, 5-15 (2014).
  21. Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. Physiology and function of the tight junction. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002584 (2009).
  22. Nita, M., Strzalka-Mrozik, B., Grzybowski, A., Mazurek, U., Romaniuk, W. Age-related macular degeneration and changes in the extracellular matrix. Medical Science Monitor. 20, 1003-1016 (2014).
  23. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  24. Langenfeld, A., Julien, S., Schraermeyer, U. An improved method for the isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult rats. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1493-1502 (2015).
  25. Sonoda, S. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).

Tags

ביולוגיה גיליון 187
תרבית ראשונית של תאי אפיתל פיגמנט רשתית חזירית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wen, F., Wang, Y., He, D., Liao, C., … More

Wen, F., Wang, Y., He, D., Liao, C., Ouyang, W., Liu, Z., Li, W., Liao, Y. Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (187), e64244, doi:10.3791/64244 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter