Summary
यहां, विट्रो में प्राथमिक पोर्सिन रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं को कल्चर करने के लिए एक आसान-से-पालन विधि प्रस्तुत की गई है।
Abstract
रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) ध्रुवीकृत रंजित उपकला कोशिकाओं का एक मोनोलेयर है, जो रेटिना में कोरॉयड और न्यूरोरेटिना के बीच स्थित है। मेटाबोलाइट परिवहन, विटामिन ए चयापचय, आदि सहित कई कार्य, आरपीई द्वारा दैनिक आधार पर आयोजित किए जाते हैं। आरपीई कोशिकाएं बहुत कम या कोई पुनर्योजी क्षमता के साथ टर्मिनल रूप से विभेदित उपकला कोशिकाएं हैं। आरपीई कोशिकाओं के नुकसान के परिणामस्वरूप कई आंखों की बीमारियां होती हैं, जिससे दृष्टि हानि होती है, जैसे कि उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन। इसलिए, प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं के एक इन विट्रो कल्चर मॉडल की स्थापना, जो सेल लाइनों की तुलना में विवो में आरपीई से अधिक निकटता से मिलती-जुलती है, आरपीई कोशिकाओं की विशेषता और यांत्रिक अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है। इस तथ्य को ध्यान में रखते हुए कि मानव नेत्रगोलक का स्रोत सीमित है, हम प्राथमिक पोर्सिन आरपीई कोशिकाओं को कल्चर करने के लिए एक प्रोटोकॉल बनाते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, आरपीई कोशिकाओं को आसानी से वयस्क पोर्सिन नेत्रगोलक से अलग किया जा सकता है। इसके बाद, ये अलग-अलग कोशिकाएं कल्चर व्यंजनों / इंसर्ट से जुड़ जाती हैं, एक कॉन्फ्लुएंट मोनोलेयर बनाने के लिए प्रसार करती हैं, और जल्दी से 2 डब्ल्यूके के भीतर विवो में उपकला ऊतक की प्रमुख विशेषताओं को फिर से स्थापित करती हैं। क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा, यह प्रदर्शित किया गया है कि प्राथमिक पोर्सिन आरपीई कोशिकाएं देशी आरपीई ऊतक के साथ तुलनीय स्तरों पर कई हस्ताक्षर जीन व्यक्त करती हैं, जबकि इनमें से अधिकांश जीनों की अभिव्यक्ति मानव आरपीई जैसी कोशिकाओं, एआरपीई -19 में खो जाती है / अत्यधिक कम हो जाती है। इसके अलावा, इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधलापन तंग जंक्शन, ऊतक ध्रुवीयता और साइटोस्केलेटन प्रोटीन के वितरण को दर्शाता है, साथ ही सुसंस्कृत प्राथमिक कोशिकाओं में विटामिन ए चयापचय के लिए महत्वपूर्ण आइसोमेरेज़ आरपीई 65 की उपस्थिति को दर्शाता है। कुल मिलाकर, हमने उच्च शुद्धता और देशी आरपीई विशेषताओं के साथ प्राथमिक पोर्सिन आरपीई कोशिकाओं को कल्चर करने के लिए एक आसान-से-पालन दृष्टिकोण विकसित किया है, जो आरपीई फिजियोलॉजी को समझने, सेल विषाक्तता का अध्ययन करने और दवा स्क्रीनिंग की सुविधा के लिए एक अच्छे मॉडल के रूप में काम कर सकता है।
Introduction
रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) रेटिना1 की बाहरी परत में फोटोरिसेप्टर और कोरियोकेशिकाओं के बीच कई कार्यों के साथ स्थित है, जिसमें रक्त-रेटिना बाधा बनाना, पोषक तत्वों और रेटिना मेटाबोलाइट्स का परिवहन और आदान-प्रदान करना, सामान्य दृश्य चक्र बनाए रखने के लिए विटामिन ए का पुनर्चक्रण, और फागोसाइटोसिस और शेड फोटोरिसेप्टर बाहरी खंडों (पीओएस) की निकासी शामिल है। . चूंकि पीओएस को दृष्टि उत्पन्न करने के लिए निरंतर आत्म-नवीकरण की आवश्यकता होती है, इसलिए आरपीई कोशिकाओं को रेटिना होमियोस्टेसिस4 को बनाए रखने के लिए अलग-अलग पीओएस को लगातार घेरने की आवश्यकता होती है। इसलिए, आरपीई डिसफंक्शन के परिणामस्वरूप कई अंधा आंखों के रोग होते हैं, जैसे कि उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन (एएमडी)4, रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा (आरपी)5, लेबर जन्मजात एमौरोसिस6, मधुमेह रेटिनोपैथी7, आदि। अब तक, इनमें से अधिकांश बीमारियों का सटीक रोगजनन अभी भी अज्ञात है। नतीजतन, आरपीई सेल कल्चर आरपीई सेल जीव विज्ञान, पैथोलॉजिकल परिवर्तन और अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए स्थापित किया गया है।
सेल जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए सबसे सरल मॉडल के रूप में, आरपीई कोशिकाओं की संस्कृति 1920 के दशक की शुरुआत में शुरूहुई थी। यद्यपि एआरपीई -19 का व्यापक रूप से आरपीई कोशिकाओं के रूप में उपयोग किया जाता है, पिग्मेंटेशन का नुकसान, कोबलस्टोन आकृति विज्ञान, और, विशेष रूप से, इस सेल लाइन में बाधा कार्य बहुत सारी चिंताएं उठातेहैं। इसकी तुलना में, प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं की संस्कृति शारीरिक और पैथोलॉजिकल अध्ययनों के लिए अधिक यथार्थवादी परिदृश्य प्रदान करतीहै। हालांकि, अपेक्षाकृत सीमित उपलब्धता उनके उपयोग को प्रतिबंधित करती है और नैतिक मुद्दे हमेशा मौजूद होते हैं। इसके अलावा, कई समूहों ने आरपीई कोशिकाओं को कल्चर करने के लिए माउस मॉडल का उपयोग किया। हालांकि, माउस आंख का आकार छोटा है, और एक एकल संस्कृति को आमतौर पर कई चूहों की आवश्यकता होती है, जो सुविधाजनक नहीं है। हाल ही में, वैज्ञानिकों ने आरपीई कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं या प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए नए तरीके विकसित किए हैं। यद्यपि इस तकनीक में विरासत में मिले आरपीई विकारों के उपचार के लिए विशेष क्षमता है, यह समय लेने वाली है और आमतौर पर परिपक्व आरपीईकोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए कई महीनों की आवश्यकता होती है। इन समस्याओं को दूर करने के लिए, यहां हम प्रयोगशाला में नियमित रूप से उच्च शुद्धता वाले आरपीई कोशिकाओं को अलग करने और संस्कृति करने के लिए एक आसान-से-पालन प्रोटोकॉल पेश करते हैं। उपयुक्त संस्कृति स्थितियों के तहत, ये कोशिकाएं विशिष्ट आरपीई कार्यों को प्रदर्शित कर सकती हैं और विशिष्ट आरपीई आकृति विज्ञान प्रदर्शित कर सकती हैं। इसलिए, यह संस्कृति विधि आरपीई फिजियोलॉजी को समझने, साइटोटॉक्सिसिटी का अध्ययन करने, संबंधित ओकुलर रोगों के पैथोलॉजिकल तंत्र की जांच करने और दवा स्क्रीनिंग का संचालन करने के लिए एक अच्छा मॉडल प्रदान कर सकती है।
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Protocol
प्रयोगात्मक जानवरों के उपयोग ने एसोसिएशन फॉर रिसर्च इन विजन एंड ओप्थाल्मोलॉजी (एआरवीओ) के नियमों का अनुपालन किया और ज़ियामेन विश्वविद्यालय के प्रायोगिक पशु प्रबंधन की नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।
1. प्रयोगात्मक सर्जिकल उपकरणों, ऊतक पाचन एंजाइम और सेल कल्चर बफर की तैयारी
- प्रायोगिक सर्जिकल उपकरणों को तैयार करें, नेत्रगोलक विच्छेदन से एक दिन पहले नेत्र शल्य चिकित्सा कैंची और बल के दो जोड़े को साफ और ऑटोक्लेव करके, और बाद में रात भर 65 डिग्री सेल्सियस पर एक सामान्य प्रोटोकॉल ओवन में सर्जिकल उपकरणों के साथ बॉक्स को सुखाएं।
- संस्कृति मीडिया की तैयारी।
- 10% (वी / वी) भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, और 1% (वी / वी) पेनिसिलिन (100 यू / एमएल) और स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 यू / एमएल) के साथ पूरक डीएमईएम / बेसिक मीडिया तैयार करें।
- डीएमईएम /एफ 12 मीडिया तैयार करें जो 1% (वी / वी) एफबीएस, और 1% (वी / वी) पेनिसिलिन (100 यू / एमएल) और स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 यू / एमएल) के साथ पूरक है।
- एमईएम अल्फा को 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन,1% एफबीएस, 1% (वी / वी) पेनिसिलिन (100 यू / एमएल) और स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 यू / एमएल), 0.1 एमएम एनईएए, 1% (वी / वी) एन 1 पूरक, टॉरिन (0.25 मिलीग्राम / एमएल), हाइड्रोकार्टिसोन (20 एनजी / एमएल), ट्राइओडो-थायरोनिन (0.013 एनजी / एमएल) के साथ पूरक करके एमईएम-एनआईसी 11 तैयार करें।
नोट: सेल व्यवहार्यता और प्रसार में सुधार करने के लिए, पाचन एंजाइमों को बेअसर करने और अलग कोशिकाओं को बीज देने के लिए एफबीएस का प्रतिशत 20% तक बढ़ाया जा सकता है। दीर्घकालिक सेल संस्कृति के लिए, एफबीएस का प्रतिशत 1% 12 तक कम हो सकता है।
- प्रयोग के दौरान ऊतक पाचन एंजाइम एलिकोट (0.25% (डब्ल्यू / वी) ट्रिप्सिन / ईडीटीए समाधान को 0.91 एमएम ईडीटीए के साथ पूरक किया गया, जिसे बाद में ट्रिप्सिन / ईडीटीए समाधान के रूप में जाना जाता है) को पिघलाएं।
नोट: इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए हर बार ताजा ट्रिप्सिन / ईडीटीए समाधान का उपयोग किया जाना चाहिए। ईडीटीए समाधान के 10 एमएल को प्रत्येक 15 एमएल बाँझ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें और उपयोग होने तक -20 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर पर एलिकोट को फ्रीज करें। - विच्छेदन समाधान।
- 0.22 μm सिरिंज फ़िल्टर यूनिट के माध्यम से घोल को फ़िल्टर करके 2% (v/v) पेनिसिलिन (100 U/mL) और स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 U/mL) के साथ पूरक 1x फॉस्फेट बफ़र्ड सलाइन (PBS) (pH 7.2) को निष्फल करें।
- कल्चर प्लेटों और ट्रांसवेल इंसर्ट को कोट करें।
- कुओं और ट्रांसवेल को 1x PBS के साथ धोएं। पीबीएस को कुओं और ट्रांसवेल से एक पिपेट के साथ निकालें, और फिर निचले कक्ष में 1 एमएल ताजा 1x पीबीएस और ऊपरी कक्ष में 10 μg / mL लैमिनिन घोल के 600 μL जोड़ें।
- सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रात भर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर प्लेटों / ट्रांसवेल इंसर्ट को इनक्यूबेट करें। ऊपरी कक्ष से लैमिनिन घोल निकालें और कोशिकाओं को बीज देने से पहले 1 एमएल ठंडे 1x पीबीएस से दो बार धो लें।
2. पोर्सिन नेत्रगोलक आरपीई कोशिकाओं का विच्छेदन
- उपकरणों की तैयारी।
- 75% इथेनॉल और यूवी प्रकाश के साथ लैमिनार प्रवाह हुड को साफ करें। तीन 50 एमएल बाँझ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब तैयार करें जिसमें ~ 25 एमएल 75% इथेनॉल, तीन 50 एमएल बाँझ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब होते हैं जिनमें ~ 25 एमएल 1x पीबीएस होता है, और तीन 10 सेमी बाँझ सेल कल्चर व्यंजन होते हैं जिनमें ~ 15 एमएल 1x PBS होता है।
नोट: इन सेटिंग्स का उपयोग आमतौर पर चार पोर्सिन नेत्रगोलकों को विच्छेदित करने के लिए किया जाता है। अधिक नेत्रगोलक का उपयोग करते समय कृपया स्केल करें। सेल व्यवहार्यता में सुधार करने के लिए, कम से कम 30 मिनट के लिए बर्फ पर प्रीकूल 1x पीबीएस बफर। 75% इथेनॉल और यूवी प्रकाश दोनों यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं कि प्रयोगात्मक उपकरण और कोशिकाएं दूषित नहीं हैं। कम से कम 15 मिनट के लिए पूरे ऑपरेशन टेबल को निष्फल करने के लिए यूवी लैंप को पहले से चालू करें।
- 75% इथेनॉल और यूवी प्रकाश के साथ लैमिनार प्रवाह हुड को साफ करें। तीन 50 एमएल बाँझ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब तैयार करें जिसमें ~ 25 एमएल 75% इथेनॉल, तीन 50 एमएल बाँझ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब होते हैं जिनमें ~ 25 एमएल 1x पीबीएस होता है, और तीन 10 सेमी बाँझ सेल कल्चर व्यंजन होते हैं जिनमें ~ 15 एमएल 1x PBS होता है।
- पोर्सिन आंखों की पुतलियों को साफ करें।
- बूचड़खाने से ताजा आंखों की पुतलियां प्राप्त करें और उन्हें विच्छेदन तक बर्फ पर रखें। 10 सेमी पेट्री डिश में 75% इथेनॉल के ~ 15 एमएल में चार पोर्सिन नेत्रगोलियों को भिगोएं और सभी अवशिष्ट संयोजी ऊतकों और मांसपेशियों को काटने के लिए कैंची और बल की एक जोड़ी का उपयोग करें।
नोट: संदूषण को कम करने के लिए श्वेतपटल के बाहर से जितना संभव हो उतना ऊतक हटा दें। परिशोधन और धोने के चरण के दौरान आंखों की पुतलियों के हस्तांतरण की सुविधा के लिए इस समय ऑप्टिक तंत्रिका को न काटें। इस चरण के बाद, सभी प्रक्रियाओं को एक लामिनार प्रवाह हुड में किया जाना चाहिए।
- बूचड़खाने से ताजा आंखों की पुतलियां प्राप्त करें और उन्हें विच्छेदन तक बर्फ पर रखें। 10 सेमी पेट्री डिश में 75% इथेनॉल के ~ 15 एमएल में चार पोर्सिन नेत्रगोलियों को भिगोएं और सभी अवशिष्ट संयोजी ऊतकों और मांसपेशियों को काटने के लिए कैंची और बल की एक जोड़ी का उपयोग करें।
- अनुक्रमिक तरीके से 75% इथेनॉल से भरे तीन 50 एमएल बाँझ सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में चार पोर्सिन नेत्रगोलकों को भिगोकर और धोकर पोर्सिन आंखों की पुतलियों को नष्ट करें; प्रत्येक नेत्रगोलक को प्रत्येक ट्यूब में कम से कम 5 मिनट के लिए डुबोया जाता है। इसके बाद, पोर्सिन नेत्रगोलक को अनुक्रमिक तरीके से 1x PBS से भरे तीन 50 एमएल बाँझ सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में धोएं; प्रत्येक ट्यूब में कम से कम 5 मिनट के लिए प्रत्येक नेत्रगोलक को धोएं (चित्रा 1 ए)। आंखों की पुतलियों को अच्छी तरह से धोने के लिए हर मिनट ट्यूबों को उलट दें।
- पोर्सिन नेत्रगोलकियों का विच्छेदन।
- चार पोर्सिन नेत्रगोलकों को 10 सेमी बाँझ सेल कल्चर डिश में ले जाएं जिसमें 1x PBS होता है। ऑप्टिक तंत्रिका और छोटे मलबे को हटाने के लिए प्रत्येक नेत्रगोलक की बाहरी सतह को फिर से ट्रिम करें (चित्रा 1 बी)। लिम्बस और स्क्लेरा के चौराहे पर एक छोटा सा कट बनाने के लिए कैंची का उपयोग करें, और फिर कॉर्निया, आईरिस, लेंस, विट्रियस बॉडी और तंत्रिका रेटिना को हटा दें (इन ऊतकों की विस्तृत संरचनाओं के लिए, कृपया चित्रा 1 देखें)।
- आरपीई-कोरॉयड-स्क्लेरा कॉम्प्लेक्स को एक नए 10 सेमी सेल कल्चर डिश में स्थानांतरित करें और चार-पत्ती वाले क्लोवर (चित्रा 1 सी) के आकार में आईकप को फ्लैट करने के लिए चार कट बनाएं।
- चार आरपीई-कोरॉयड-स्क्लेरा कॉम्प्लेक्स को एक नए 10 सेमी डिश में रखकर ट्रिप्सिन / ईडीटीए समाधान पाचन करें। आरपीई-कोरॉयड-स्क्लेरा कॉम्प्लेक्स को विलय करने के लिए ताजा ट्रिप्सिन / ईडीटीए समाधान के 20 एमएल डालें और डिश को ~ 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में डालें।
नोट: आरपीई कोशिकाओं को अलग करने के लिए ताजा ट्रिप्सिन / ईडीटीए समाधान का उपयोग करें। ईडीटीए समाधान पाचन के समय को सावधानीपूर्वक नियंत्रित करें, क्योंकि लंबे समय तक इनक्यूबेशन समय (30 मिनट से अधिक) अन्य प्रकार की कोशिकाओं के संदूषण को बढ़ा सकता है।
3. पोर्सिन नेत्रगोलक आरपीई कोशिकाओं का अलगाव और संस्कृति
- आरपीई पृथक्करण।
- ईडीटीए समाधान के साथ 30 मिनट की इनक्यूबेशन के बाद डिश को इनक्यूबेटर से बाहर निकालें और ट्रिप्सिन / ईडीटीए समाधान को बेअसर करने के लिए डिश में 20 एमएल प्रीवार्ड कल्चर मीडिया (10% एफबीएस के साथ) जोड़ें।
नोट: इस चरण में, केवल DMEM / बेसिक मीडिया का उपयोग किया जाता है। जब कोशिकाएं सामंजस्य तक पहुंचती हैं, तो प्रयोगात्मक स्थितियों के आधार पर तीन संस्कृति मीडिया का उपयोग किया जा सकता है: डीएमईएम / बेसिक मीडिया, डीएमईएम / एफ 12 मीडिया, और एमईएम-एनआईसी मीडिया। - आरपीई कोशिकाओं को धीरे-धीरे कई बार पाइप करके अलग करने के लिए 5 एमएल ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करें। सेल निलंबन को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में एकत्र करें। डिश पर आरपीई-कोरॉयड-स्क्लेरा कॉम्प्लेक्स को धोने के लिए एक और 10 एमएल फ्रेश कल्चर मीडिया (10% एफबीएस) का उपयोग करें ताकि जितना संभव हो उतने आरपीई कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए धीरे-धीरे पाइपिंग की जा सके।
नोट: कोशिकाओं को बहुत सख्ती से ट्राइट्यूरेट न करें। पिपेट को लगभग 3 एमएल /सेकंड की दर से भरना और खाली करना सुनिश्चित करें। सेल निलंबन को बुदबुदाने से बचें।
- ईडीटीए समाधान के साथ 30 मिनट की इनक्यूबेशन के बाद डिश को इनक्यूबेटर से बाहर निकालें और ट्रिप्सिन / ईडीटीए समाधान को बेअसर करने के लिए डिश में 20 एमएल प्रीवार्ड कल्चर मीडिया (10% एफबीएस के साथ) जोड़ें।
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करके आरपीई कोशिकाओं को इकट्ठा करें। एक पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए एक और 5 एमएल कल्चर मीडिया (10% एफबीएस) जोड़ें और अगले 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को डिसेंट करें और 12 एमएल कल्चर मीडिया के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
नोट: सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेटेड करते समय, सेल क्लंप के टूटने से बचने के लिए लगभग 1 एमएल मीडिया छोड़ दें। - आरपीई कोशिकाओं को सीडिंग।
- बीज ~ 1-2 x 10 5 कोशिकाएं /अच्छी तरह से 12-वेल कल्चर प्लेटों या ट्रांसवेल इंसर्ट में। आमतौर पर, लगभग 1.5 x 106 आरपीई कोशिकाएं चार पोर्सिन नेत्रगोलक से प्राप्त की जाती हैं। हर 2 दिनों में कल्चर मीडिया को बदलें और सीरम एकाग्रता को 1% तक कम करें जब कोशिकाएं कुओं / इंसर्ट की सतह को पूरी तरह से कवर करती हैं।
नोट: सेल कल्चर डिश को बहुत बार स्थानांतरित न करें इससे पहले कि कोशिकाएं कल्चर डिश / इंसर्ट से जुड़ी हों।
- बीज ~ 1-2 x 10 5 कोशिकाएं /अच्छी तरह से 12-वेल कल्चर प्लेटों या ट्रांसवेल इंसर्ट में। आमतौर पर, लगभग 1.5 x 106 आरपीई कोशिकाएं चार पोर्सिन नेत्रगोलक से प्राप्त की जाती हैं। हर 2 दिनों में कल्चर मीडिया को बदलें और सीरम एकाग्रता को 1% तक कम करें जब कोशिकाएं कुओं / इंसर्ट की सतह को पूरी तरह से कवर करती हैं।
- कोशिकाओं की कटाई होने तक हर 2 दिनों में संस्कृति मीडिया को बदलें।
नोट: कोशिकाओं के संयोजन तक पहुंचने के बाद एफबीएस की एकाग्रता को कम किया जा सकता है, और कोशिकाओं को पूर्ण भेदभाव और परिपक्वता की अनुमति देने के लिए कई महीनों तक सुसंस्कृत किया जा सकता है।
4. प्राथमिक पोर्सिन आरपीई कोशिकाओं का लक्षण वर्णन
- कोशिकाओं को 1 या 2 डब्ल्यूके के लिए संयोजन पर कल्चर करें, और फिर आगे के विश्लेषण के लिए कोशिकाओं की कटाई करें।
- मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) विश्लेषण के लिए हार्वेस्ट सेल।
- कल्चर मीडिया को हटा दें, कोशिकाओं को 1 एमएल ठंडे 1x PBS के साथ धोएं, और फिर लगभग 1 x 106 कोशिकाओं से सेल लाइसेट एकत्र करने के लिए प्रत्येक कुएं में 500 μL आरएनए निष्कर्षण समाधान जोड़ें।
- एमआरएनए13 निकालें; प्रत्येक नमूने से लगभग 4 μg RNA निकाला जाता है। रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन14 करने के लिए एमआरएनए के 100 एनजी का उपयोग करें; मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण के लिए सीडीएनए को 40 गुना पतला करें। प्राइमर तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं।
- इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने के लिए हार्वेस्ट कोशिकाएं।
- कल्चर मीडिया को हटा दें, कोशिकाओं को 1 एमएल ठंडे 1x PBS के साथ धोएं, और फिर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं (लगभग 1 x 106 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) को ठीक करने के लिए 1x PBS में 4% (w / v) पैराफॉर्मलडिहाइड का 500 μL जोड़ें। फिर, कोशिकाओं को 1x PBS के साथ दो बार धोएं और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी (1x PBS में 1:100 में 1%(w/v) गोजातीय सीरम एल्बुमिन के साथ पूरक) और ऑनलाइन प्रोटोकॉल15 के अनुसार 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर द्वितीयक एंटीबॉडी (1x PBS में 1:200) के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला करें।
- इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों को ऑनलाइन मैनुअल16 के बाद एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा प्राप्त किया जाता है।
- पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए फसल कोशिकाएं।
- कल्चर मीडिया को हटा दें, कोशिकाओं को ठंडे 1x PBS के साथ दो बार धोएं, और फिर प्रत्येक कुएं में 80 μL RIPA बफर (1x प्रोटीज अवरोधक के साथ) जोड़ें और डिश / इंसर्ट से लगभग 1 x 106 कोशिकाओं को खरोंचने के लिए सेल स्क्रैपर का उपयोग करें।
- प्रत्येक कुएं से सेल लाइसेट एकत्र करें / 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें। सेल लाइसेट को 10 मिनट के लिए उबालें और फिर बीसीए किट का उपयोग करके प्रोटीन सांद्रता को मापें; प्रत्येक नमूने की प्रोटीन सांद्रता लगभग 2 मिलीग्राम / एमएल है। ऑनलाइन प्रोटोकॉल17 के अनुसार पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए प्रत्येक नमूने के 25 μg प्रोटीन का उपयोग करें।
- वेस्टर्न ब्लॉट के लिए, 5 एमएल प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान (1: 1,000 प्राथमिक एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने) में झिल्ली को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- फिर, उपयोग किए गए प्राथमिक एंटीबॉडी के स्रोत के अनुसार, कक्षीय शेकर पर 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 5% (डब्ल्यू / वी) गैर-वसा वाले दूध के साथ पूरक 1 एक्स टीबीएसटी समाधान में द्वितीयक एंटीबॉडी के लगभग 15 एमएल एंटी-खरगोश या एंटी-माउस सेकेंडरी एंटीबॉडी समाधान (1: 5,000 कमजोर पड़ने) के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
- ट्रांसएपिथेलियल प्रतिरोध (टीईआर) माप।
- चॉपस्टिक इलेक्ट्रोड को 70% इथेनॉल और बाँझ 1x पीबीएस के साथ अनुक्रमिक तरीके से धोएं। फिर इलेक्ट्रोड के छोटे सिरे को शीर्ष कक्ष में रखें और लंबे सिरे को ट्रांसवेल इंसर्ट के निचले कक्ष में रखें और माप के लिए उपकला वोल्टमीटर पर बटन पर क्लिक करें। प्रत्येक कुएं के टीईआर माप को तीन प्रतियों में रिकॉर्ड करें।
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Representative Results
प्राथमिक पोर्सिन आरपीई (पीआरपीई) कोशिकाओं को डीएमईएम / बेसिक मीडिया में 10% एफबीएस के साथ संवर्धित किया गया था, और प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत सेल आकृति विज्ञान को बीज बोने के बाद 2 दिनों (चित्रा 2 ए), 6 दिनों (चित्रा 2 बी) और 10 दिनों (चित्रा 2 सी) में चित्रित किया गया था। 1 डब्ल्यूके के बाद, कोबलस्टोन आकृति विज्ञान के साथ पिगमेंटेड पीआरपीई कोशिकाओं का एक कंफ्लुएंट मोनोलेयर देखा गया था।
प्राथमिक पीआरपे कोशिकाओं को बेहतर ढंग से चिह्नित करने के लिए, पैसेज 3 (पी 3)18 और एआरपीई -19 कोशिकाओं में प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं (एचआरपीई) को डीएमईएम / बेसिक मीडिया में एक और डब्ल्यूके के लिए 1% एफबीएस के साथ संवर्धित किया गया था, और फिर सुसंस्कृत कोशिकाओं के कुल एमआरएनए और प्रोटीन, साथ ही पोर्सिन आरपीई / कोरॉयड ऊतकों को काटा गया था। प्रमुख विशिष्ट जीन19 और परिपक्व आरपीई के प्रोटीन मार्करों के अभिव्यक्ति स्तर का मूल्यांकन क्यूआरटी-पीसीआर और वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा किया गया था। एआरपीई -19 कोशिकाओं की तुलना में, पीआरपीई कोशिकाओं ने देशी आरपीई स्राव (चित्रा 3 ए (सी)), फागोसाइटोसिस (चित्रा 3 ए (आई)), परिवहन (चित्रा 3 ए (ए), (डी)), तंग जंक्शन (चित्रा 3 ए (जे)), बाधा गठन (चित्रा 3 ए (बी)), साथ ही दृश्य चक्र (चित्रा 3 ए (ई), बी) में काम करने वाले जीन के उच्च अभिव्यक्ति स्तर को बनाए रखा। हालांकि, आरपीई के दो साइटोस्केलेटन मार्कर जीन केआरटी 8 और केआरटी 18 के अभिव्यक्ति स्तर, प्राथमिक एचआरपीई और एआरपीई -19 कोशिकाओं (चित्रा 3 ए (जी), (एच)) की तुलना में प्राथमिक पीआरपीई कोशिकाओं में काफी कम थे। इसके अलावा, इटगाव, जो फागोसाइटोसिस में भाग लेता है, प्राथमिक पीआरपीई कोशिकाओं में भी कम था (चित्रा 3 ए (एफ))। चूंकि पीआरपीई कोशिकाओं में इन तीन जीनों के अभिव्यक्ति स्तर पोर्सिन आरपीई / कोरॉयड ऊतक के समान थे, इसलिए यह प्रजातियों के बीच जीन अभिव्यक्ति अंतर का संकेत दे सकता है। इसके अलावा, टायर का अभिव्यक्ति स्तर, जो मेलेनिन उत्पादन के लिए जिम्मेदार है, प्राथमिक पीआरपीई और एचआरपीई कोशिकाओं (चित्रा 3 ए (के)) दोनों में अत्यधिक कम हो गया था, जो दीर्घकालिक सुसंस्कृत कोशिकाओं में रंजकता के नुकसान की व्याख्या कर सकता है। मानव पीआरई और पोर्सिन पीआरपीई कोशिकाओं के डेटा में देखे गए क्यूआरटी-पीसीआर परिणामों में असमानताएं मानव पीआरई के लंबे भंडारण और उच्च मार्ग संख्या (पी 3) के कारण हो सकती हैं, इस प्रकार उप-संवर्धन पर आरपीई वर्णों के नुकसान का संकेत मिलता है। इसके अलावा, वेस्टर्न ब्लॉट से पता चला है कि आरपीई 65 प्रोटीन, जो आरपीई कोशिकाओं की विशेषता वाले दृश्य चक्र में एक प्रमुख एंजाइम है, को पीआरपीई कोशिकाओं में व्यक्त किया गया था, जबकि प्राथमिक एचआरपीई कोशिकाओं और एआरपीई -19 कोशिकाओं (चित्रा 3 बी, सी) में इसकी अभिव्यक्ति का स्तर काफी कम हो गया था।
आरपीई कोशिकाओं की ध्रुवीयता और बाधा कार्यों को और अधिक चिह्नित करने के लिए, पीआरपीई और एआरपीई -19 कोशिकाओं के सुसंस्कृत कंफ्लुएंट मोनोलेयर को डीएमईएम / बेसिक, डीएमईएम / एफ 12, और एमईएम-निक मीडिया के साथ ट्रांसवेल इंसर्ट में 1 डब्ल्यूके के लिए संवर्धित किया गया था (चित्रा 4)। इन संस्कृति स्थितियों के तहत, Na+-K+-ATPase (चित्रा 4A-F) और ZO-1 (चित्रा 4G-L) फ्लोरोसेंट स्टेनिंग परिणामों से पता चला कि PRPE कोशिकाओं में ARPE-19 कोशिकाओं की तुलना में Na+-K+-ATPase और ZO-1 दोनों के उच्च अभिव्यक्ति स्तर थे। पीआरपीई कोशिकाओं की एपिकल और बेसल सतह पर एनए + -के + -एटीपीस के समान वितरण ने संकेत दिया कि विट्रो में सेल ध्रुवीयता को बहाल करने के लिए एक लंबे समय तक संस्कृति समय की आवश्यकता थी।
आरपीई आंतरिक रेटिना और कोरॉइड 20 के बीच मेटाबोलाइट्स के आदान-प्रदान को कसकर विनियमित करने के लिए अपनी एपिकल सतह के पास तंग जंक्शनबनाता है। जेडओ -1 धुंधला होने से पता चला कि तंग जंक्शन प्रोटीन सामान्य रूप से नियमित कोबलस्टोन आकृति विज्ञान के साथ प्राथमिक पीआरपीई कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली पर स्थानीयकृत थे, लेकिन एआरपीई -19 कोशिकाओं के नहीं। तीन संस्कृति मीडियाओं में से, डीएमईएम / बेसिक में संवर्धित कोशिकाओं में सबसे अच्छा जेडओ -1 धुंधला पैटर्न देखा गया था, जबकि डीएमईएम / एफ 12 पीआरपीई कोशिकाओं के कोबलस्टोन आकृति विज्ञान को बनाए रखने में विफल रहा। एक उच्च टीईआर मान तंग जंक्शन गठन और आरपीई कोशिकाओं के बेहतर बाधा कार्यों के संकेतक के रूप में कार्य करताहै। तंग जंक्शनों के कार्य की पुष्टि करने के लिए, ट्रांसएपिथेलियल प्रतिरोध (टीईआर) मापा गया था। हालांकि, खाली ट्रांसवेल इंसर्ट (चित्रा 4 एम, एन) की तुलना में केवल थोड़ा अधिक टीईआर पाया गया था।
रेटिना में, ब्रुच की झिल्ली आरपीई और कोरॉयड के बीच मौजूद है। ब्रुच की झिल्ली के मुख्य घटक कोलेजन टाइप IV, प्रोटीओग्लाइकेन्स और लेमिनिन22 हैं। आरपीई पर ब्रुच की झिल्ली के सहायक प्रभाव का अनुकरण करने के लिए, सुसंस्कृत आरपीई कोशिकाओं की परिपक्वता की सुविधा के लिए ट्रांसवेल झिल्ली की सतह पर लैमिनिन फैलाया गया था। चित्रा 4 से प्राप्त परिणामों के आधार पर, कॉन्फ्लुएंट पीआरपीई कोशिकाओं को डीएमईएम / बेसिक मीडिया में ट्रांसवेल इंसर्ट पर 2 डब्ल्यूके के लिए 1% एफबीएस के साथ सुसंस्कृत किया गया था। इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला परिणामों से पता चला है कि आरपीई-विशिष्ट प्रोटीन आरपीई 65 सभी पीआरपीई कोशिकाओं (चित्रा 5 ए, बी) में व्यक्त किए गए थे। Na+-K+-ATPase को PRPE कोशिकाओं की एपिकल सतह पर वितरित किया गया था, जो सेल ध्रुवीयता (चित्रा 5C, D) की पुन: स्थापना का सुझाव देता है। जेडओ -1 धुंधला और टीईआर परिणामों दोनों ने संकेत दिया कि प्राथमिक पीआरपीई कोशिकाओं में तंग जंक्शन अच्छी तरह से बने थे जब उन्हें लैमिनिन (चित्रा 5 ई, एफ, एच) पर सुसंस्कृत किया गया था। चित्रा 5 जी होचस्ट डाई से सना कोशिकाओं को दर्शाता है।
इसके अलावा, वेस्टर्न ब्लॉट ने प्रदर्शित किया कि पीआरपीई और एआरपीई -19 कोशिकाओं दोनों ने वृद्धि कारकों का उत्पादन किया, जिसमें वर्णक उपकला-व्युत्पन्न कारक (पीईडीएफ) और संवहनी एंडोथेलियल विकास कारक (वीईजीएफ) (चित्रा 6 ए) शामिल हैं। 1 डब्ल्यूके के लिए डीएमईएम/बेसिक, डीएमईएम/एफ12 और एमईएम-निक मीडिया के साथ ट्रांसवेल इंसर्ट में पीआरपीई के कंफ्लुएंट मोनोलेयर को संवर्धित करने के बाद, ट्रांसवेल इंसर्ट के ऊपर और नीचे के कक्षों से कल्चर मीडिया एकत्र किया गया था, और स्रावित वीईजीएफ को एलिसा द्वारा परिमाणित किया गया था। जब सेल कल्चर के लिए डीएमईएम / बेसिक और एमईएम-एनआईसी मीडिया का उपयोग किया गया था, तो पीपीआरई कोशिकाओं ने डीएमईएम / एफ 12 मीडिया (चित्रा 6 बी) में कोशिकाओं की तुलना में अधिक वीईजीएफ स्रावित किया था। हालांकि, सभी परीक्षण की गई स्थितियों में ट्रांसवेल इंसर्ट के शीर्ष और निचले कक्षों के बीच वीईजीएफ मात्रा में कोई अंतर नहीं पाया जा सका (चित्रा 6 बी)। इसके अलावा, प्राथमिक पीआरपीई कोशिकाओं को लैमिनिन के साथ लेपित इंसर्ट पर और डीएमईएम / बेसिक मीडिया में 2 डब्ल्यूके के लिए सुसंस्कृत करने के बाद, ऊपर और नीचे के कक्षों से मीडिया एकत्र किया गया था। वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण ने नीचे के कक्ष की तुलना में शीर्ष कक्ष में पीईडीएफ के उच्च स्तर दिखाए, जबकि स्रावित वीईजीएफ के प्रोटीन स्तर दोनों कक्षों में समान थे (चित्रा 6 सी)। इन परिणामों ने सेल पोलैरिटी की पुन: स्थापना का समर्थन किया जब प्राथमिक पीआरपीई कोशिकाओं को लैमिनिन पर कॉन्फ्लुएंसी तक पहुंचने के बाद अन्य 2 डब्ल्यूके के लिए संवर्धित किया गया था।
चित्र 1: पीआरपीई सेल अलगाव के बुनियादी चरण। (ए) 50 एमएल बाँझ सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 1x PBS के साथ पोर्सिन नेत्रगोलक धोएं। (बी, सी) एंजाइमैटिक पाचन के लिए आरपीई-कोरॉयड-स्क्लेरा कॉम्प्लेक्स तैयार करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: सेल संस्कृति के बाद प्राथमिक पीआरपीई सेल आकृति विज्ञान। (ए) दिन 2, (बी) दिन 6, और (सी) दिन 10 पर प्राथमिक पीआरपीई कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियां। स्केल बार 250 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्र 3: सुसंस्कृत आरपीई कोशिकाओं में प्रमुख हस्ताक्षर जीन और प्रोटीन के अभिव्यक्ति स्तर। (ए) प्राथमिक पीआरईपीई कोशिकाओं, प्राथमिक एचआरपीई कोशिकाओं, एआरपीई -19 कोशिकाओं और पीआरपीई / कोरॉयड ऊतक में हस्ताक्षर जीन के एमआरएनए स्तरों का क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण। गपध को क्यूआरटी-पीसीआर के लिए हाउसकीपिंग जीन के रूप में इस्तेमाल किया गया था। प्राथमिक पीआरपीई कोशिकाओं और एआरपीई -19 कोशिकाओं के लिए चार जैविक प्रतिकृतियों का उपयोग किया गया था, जबकि प्राथमिक एचआरपीई कोशिकाओं और पीआरपीई / कोरॉयड ऊतक के लिए तीन जैविक प्रतिकृति का उपयोग किया गया था। एआरपीई -19 कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति स्तर को नियंत्रण के रूप में सेट किया गया था। (बी) एआरपीई -19 और पीआरपीई कोशिकाओं में आरपीई 65 प्रोटीन का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। विनकुलिन का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था। (ग) प्राथमिक एचआरपीई कोशिकाओं और पीआरपे/कोरॉयड ऊतक में आरपीई65 प्रोटीन का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। विनकुलिन का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था। तुलना के लिए, छात्र टी-टेस्ट का उपयोग किया गया था, *पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4: डीएमईएम/बेसिक, डीएमईएम/एफ12 और एमईएम-निक मीडिया में प्राथमिक पीआरपीई और एआरपीई-19 कोशिकाओं की एक-डब्ल्यूके संस्कृति 1% एफबीएस के साथ। (डी) डीएमईएम/बेसिक मीडिया में एआरपीई-19 कोशिकाओं का एनए+-के+-एटीपीस फ्लोरोसेंट स्टेनिंग (लाल), (ई) डीएमईएम/एफ12 मीडिया और (एफ) एमईएम-एनआईसी मीडिया। (छ) डीएमईएम/बेसिक मीडिया में प्राथमिक पीआरपीई कोशिकाओं का जेडओ-1 फ्लोरोसेंट स्टेनिंग (ग्रीन), (एच) डीएमईएम/एफ12 मीडिया और (आई) एमईएम-एनआईसी मीडिया। (जे) डीएमईएम /बेसिक मीडिया, (के) डीएमईएम / एफ 12 मीडिया, और (एल) एमईएम-एनआईसी मीडिया में एआरपीई -19 कोशिकाओं में जेडओ -1 फ्लोरोसेंट स्टेनिंग (ग्रीन)। प्राथमिक पीआरपीई (एम) और एआरपीई -19 (एन) कोशिकाओं के बाद टीईआर माप को डीएमईएम / बेसिक, डीएमईएम / एफ 12 और एमईएम-एनआईसी मीडिया में 1 डब्ल्यूके के लिए संवर्धित किया गया था। प्रत्येक प्रकार की कोशिकाओं के लिए, डेटा कम से कम तीन अलग-अलग कुओं से प्राप्त किया गया था। तुलना के लिए, छात्र टी-टेस्ट का उपयोग किया गया था, *पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001। स्केल बार 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
(ए-एफ) लैमिनिन के साथ या उसके बिना संवर्धित कोशिकाओं को आरपीई 65 (ए, बी, लाल), एनए + -के + -एटीपीस (सी, डी, लाल), जेडओ -1 (ई, एफ, ग्रीन), और (जी) होचस्ट (ब्लू) के साथ दाग दिया गया था। (एच) लैमिनिन के साथ या बिना संवर्धित सेल शीट में टीईआर माप। विभिन्न उपचारों के लिए, चार अलग-अलग कुओं से डेटा प्राप्त किया गया था। तुलना के लिए, छात्र टी-टेस्ट का उपयोग किया गया था, *पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्र 6: सुसंस्कृत प्राथमिक pRPE और ARPE-19 कोशिकाओं के स्रावी कार्य। (A) प्राथमिक pRPE और ARPE-19 कोशिकाओं में VEGF और PEDF का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। (B) ट्रांसवेल के ऊपरी और निचले कक्ष में स्रावित वीईजीएफ प्राथमिक पीआरपीई कोशिकाओं के साथ प्रवेश करता है जब कॉन्फ्लुएंट कोशिकाओं को डीएमईएम/बेसिक, डीएमईएम/एफ 12 और एमईएम-एनआईसी मीडिया में 1 डब्ल्यूके के लिए संवर्धित किया जाता है। विभिन्न उपचारों के लिए, तीन अलग-अलग कुओं से डेटा प्राप्त किया गया था। तुलना के लिए, छात्र टी-टेस्ट का उपयोग किया गया था, *पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| मानवता | सस स्क्रोफा | |
| Best1 | एफ: GAAGGCAGAGAGCAAG | एफ: GGACACCTGTATGCCTACGA |
| आर: टीसीसीएसीटीजीसीटीजीटीजीटीजीटीसीटीजीसी | R: GGAACGGAGAGGTACA | |
| Cldn19 | च: GGTGACCCAGGTTCTCA | एफ: टीसीजीटीजीएसीसीसीएजीजीटीटीटीसी |
| आर: सीटीजीटीटीजीजीजीजीसीटीसीटीजीजीसीसीटीसी | आर: जीसीटीजीसीटीजीटीजीजीजीटीसीटीसी | |
| Itgav | च: CGCAGTCCCATCAATCC | च: GCTTTCTCAGGACGACACA |
| आर: जीजीसीसीसीटीजीटीएटीएजीएजीएजीटीएजीजीए | आर: GAATGAGCTGACCTTGCCCA | |
| Krt8 | च: GGAGCAGATCAAGACCCCCA | च: CCCAGGAGAGGAGAGATC |
| आर: जीसीसीजीसीसीटीएएजीटीटीजीटीटीजीएटीजी | आर: एटीजीटीटीजीटीसीजीटीजीटीटीसीजी | |
| Krt18 | एफ: सीटीटीजीगेगागजीएसीसीसीसी | F: GCTGATAATCGGAGGCTGGA |
| आर: जीजीसीसीएजीसीटीजीटीसीटीसीएटीसीटीसीटी | आर: GAAGTCATCAGCAGCGACGAC | |
| Mertk | F: GTGTGCAGCTCAGAAT | एफ: GCGGCTATTTTGGAA |
| आर: AAAATGTTGACGGGCTCAGG | आर: ACGTAGATGGGGTCAGACAC | |
| Serpinf1 | F: CAGATGAGAGGGAAGCTCGC | F: AAGACGTCGCTGGGATT |
| R: TTAGGGTCCGACATCATGGG | आर: जीजीटीसीसीटीटीजीएजीसीएजीजीजीए | |
| Slc16a8 | एफ: GGGTGTCCCCATGCTA | F: CAGTTCGAGGTGCTCATGG |
| R: GTCAGGTAGAGCCGAG | आर: GACAGCCATGAAGACACAG | |
| Stra6 | च: CTTTGCAGGAAGAAGCTGGG | एफ: CTAGCCGTGTTGTCGATCCT |
| आर: TAATGGCCGTCCCTGTCAG | R: GACCATGAAGACAGCAGCAG | |
| Tjp1 | एफ: ACAGGAATGACCGAGTTGC | एफ: AAGACTTGTCCTCAGCCA |
| आर: TGGTTCAGGATCAGGACGAC | आर: CCAGCATCGAGGTTCACT | |
| टायर | F: ACTCAGCCCCCAGCATCATTCT | एफ: ATCTACTCAGCCCCCC |
| आर: ACATCAGCTGAGAGGGGGGG | आर: GAGCCTTGGGGTCCTGGATT | |
| Gapdh | च: CAGCCTCAAGATCATCAGCA | च: CATCCTGGGCTACACTGAGG |
| आर: ATGATGTTCTGGAGAGCCCC | आर: जीजीजीजीसीटीसीटीटीजी |
तालिका 1: क्यूआरटी-पीसीआर के लिए प्राइमर।
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Discussion
यहां, पोर्सिन नेत्रगोलक से आरपीई कोशिकाओं के अलगाव, संस्कृति और लक्षण वर्णन के लिए एक विस्तृत और अनुकूलित प्रोटोकॉल, जो आरपीई कोशिकाओं और आरपीई से संबंधित विकार अध्ययनों के इन विट्रो लक्षण वर्णन के लिए एक अच्छा मॉडल उत्पन्न करता है। मानव, माउस और चूहे की आंखों से आरपीई के अलगाव के तरीकों को पहले 23,24,25 वर्णित किया गया है। हालांकि, कुछ प्रयोगशालाओं में मानव नेत्रगोलक प्राप्त करना मुश्किल है, और यह आमतौर पर नैतिक मुद्दों को उठाता है। चूहों और चूहों के आरपीई ऊतक अपेक्षाकृत छोटे होते हैं, कोशिकाएं अलगाव के दौरान आसानी से क्षतिग्रस्त हो जाती हैं, और प्रत्येक जानवर से केवल कुछ कोशिकाएं प्राप्त की जा सकती हैं। इसके विपरीत, पोर्सिन नेत्रगोलक प्राप्त करना और संभालना बहुत आसान है, जो एक नेत्रगोलक से अपेक्षाकृत बड़ी संख्या में प्राथमिक कोशिकाओं को स्थिर रूप से उत्पन्न कर सकता है। कुछ अध्ययनों में, चिमटी का उपयोग यांत्रिक रूप से आरपीई को अलग करने के लिए किया जाता है, जिससे आसानी से कोशिका मृत्यु हो सकती है। इसलिए, आरपीई कोशिकाओं को अलग करने के लिए हाइलूरोनिक एसिड, डिस्पेस और ट्रिप्सिन / ईडीटीए समाधान को नियोजित किया गया है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि ट्रिप्सिन / ईडीटीए समाधान में आरपीई को कोरॉयड21 से अलग करने में मदद करने की क्षमता है। ईडीटीए समाधान का उपयोग पोर्सिन ऊतकों को पचाने के लिए किया गया था, जो इष्टतम परिणाम उत्पन्न करते हैं। ईडीटीए तंत्रिकाकरण के बाद, आरपीई ऊतकों को पिपेट टिप के साथ धीरे-धीरे पाइप करके एकल सेल निलंबन में अलग किया जा सकता है। एक चाल यह है कि आरपीई कोशिकाओं को पूरी तरह से अलग करने के लिए प्रत्येक प्रयोग के लिए ताजा ट्रिप्सिन / ईडीटीए समाधान की सिफारिश की जाती है। पोर्सिन नेत्रगोलक के आरपीई ऊतकों के बड़े क्षेत्र के कारण, आधे कटोरे के आकार के आरपीई-कोरॉयड-स्क्लेरा कॉम्प्लेक्स को चार-पत्ती क्लोवर के आकार में काटने की आवश्यकता होती है, जो आरपीई ऊतकों और ट्रिप्सिन / ईडीटीए समाधान के बीच पूर्ण संपर्क के लिए अनुकूल है ताकि कोरॉइड से उनके अलगाव की सुविधा मिल सके। हालांकि, पाचन का समय आधे घंटे से अधिक नहीं होना चाहिए। इस समय के भीतर, आरपीई को छोड़कर अन्य ऊतक ों को पचाया नहीं जाएगा, जो अन्य प्रकार की कोशिकाओं से संदूषण को प्रभावी ढंग से कम कर सकता है।
आरपीई पर ब्रुच की झिल्ली के सहायक प्रभाव को अनुकरण करने के लिए लेमिनिन को ट्रांसवेल झिल्ली की सतह पर फैलाया गया था। परिणामों से पता चला है कि लेमिनिन पीआरपीई कोशिकाओं के विकास के लिए फायदेमंद था, जिसने ट्रांसपोर्टर और तंग जंक्शन प्रोटीन की अभिव्यक्ति को उत्तेजित किया। हालांकि, परिणामों ने यह भी संकेत दिया कि सेल ध्रुवीयता और तंग जंक्शनों सहित देशी आरपीई ऊतकों की कुछ विशेषताओं को बहाल करने के लिए प्राथमिक पीआरपीई कोशिकाओं के लिए लगभग 2 डब्ल्यूके का एक लंबा संस्कृति समय आवश्यक था।
प्राथमिक आरपीई संस्कृति के लिए एक कमी यह है कि विट्रो में दृश्य चक्र एंजाइम अभिव्यक्तियों को बनाए रखना मुश्किल है। इसलिए, यह जांचना महत्वपूर्ण है कि क्या सुसंस्कृत आरपीई कोशिकाएं आरपीई-विशिष्ट प्रोटीन आरपीई 65 को व्यक्त कर सकती हैं। एआरपीई -19 कोशिकाओं की तुलना में, पीआरपीई कोशिकाओं ने काफी अधिक आरपीई 65 प्रोटीन व्यक्त किया। इसके विपरीत, पश्चिमी धब्बा में एआरपीई -19 सेल लाइसेट में आरपीई 65 प्रोटीन का केवल एक कमजोर बैंड देखा गया था। यह देखना दिलचस्प है कि आरपीई 65 का आणविक भार मानव और सूअरों के बीच थोड़ा अलग था (चित्रा 3 बी, सी)। सुसंस्कृत आरपीई कोशिकाओं में आरपीई 65 अभिव्यक्ति का नुकसान एक रहस्य के रूप में बना हुआ है। यहां तक कि सुसंस्कृत प्राथमिक कोशिकाओं में, आरपीई 65 धीरे-धीरे मार्ग (डेटा नहीं दिखाया गया) के साथ खो गया था। अब तक, विट्रो में आरपीई 65 की अभिव्यक्ति को कैसे बनाए रखा जाए, इस तथ्य को ध्यान में रखते हुए कि दृश्य चक्र देशी आरपीई ऊतकों के लिए एक महत्वपूर्ण कार्य है, आगे की जांच की आवश्यकता है। दूसरे, इस प्रोटोकॉल की एक बड़ी सीमा यह है कि इन विट्रो सुसंस्कृत आरपीई कोशिकाओं को पारित नहीं किया जा सकता है। लंबे समय तक संस्कृति के साथ, पीआरपीई कोशिकाएं अपने हेक्सागोनल आकार और टीईआर के साथ-साथ रंजकता को खो देती हैं, ताकि केवल मार्ग 0 कोशिकाओं का उपयोग किया जा सके। इस संस्कृति प्रोटोकॉल की एक और सीमा यह है कि आनुवंशिक उत्परिवर्तन, जो विरासत में रेटिना रोगों का कारण बनते हैं, इन कोशिकाओं में प्रजनन करना मुश्किल है। इसलिए, वायरस-मध्यस्थता जीन संपादन को भविष्य में लेगर जन्मजात एमौरोसिस जैसे वंशानुगत आरपीई-विकारों का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।
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Disclosures
सभी लेखकों ने खुलासा किया कि हितों का कोई टकराव नहीं है।
सभी लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं करते हैं।
Acknowledgments
लेखक इस अध्ययन में अपनी कोशिकाओं का योगदान करने वाले सभी जानवरों के प्रति अपनी कृतज्ञता और सम्मान दिखाना चाहते हैं। इस अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (2019वाईएफए0111200, यी लियाओ और युआन गाओ और अनुदान संख्या 2018वाईएफए 0107301, वेई ली) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। लेखकों ने कॉन्फोकल इमेजिंग में तकनीकी सहायता के लिए सेंट्रल लैब, स्कूल ऑफ मेडिसिन, ज़ियामेन विश्वविद्यालय से जिंगरू हुआंग और जियांग यू को धन्यवाद दिया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ARPE-19 cells | CCTCC | GDC0323 | |
| Bovine serum albumin | Yeasen | 36101ES60 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM 880 with Airyscan | |
| ChemiDoc Touch | Bio-Rad | 1708370 | |
| Cell scraper | Sangon | F619301 | |
| 10 cm culture dish | NEST | 121621EH01 | |
| 12-well culture plate | NEST | 29821075P | |
| DMEM F12 Medium | Gibco | C11330500BT | |
| DMEM basic Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EVOM2 | World Precision Instruments | EVOM2 | For TER measurement |
| Fetal bovine serum | ExCell Bio | FSP500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 0300-0108P | |
| Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 5196-2504 | |
| hydrocortisone | MCE | HY-N0583/CS-2226 | |
| Hoechst 33342 solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| LightCycler 96 Instrument | Roche | 5815916001 | |
| Liothyronine | MCE | HY-A0070A/CS-4141 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| MEM(1X)+GlutaMAX Medium | Gibco | 10566-016 | |
| MEM NEAA(100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Millex-GP syringe filter unit | Millipore | SLGPR33RB | |
| N1 | Sigma-Aldrich | SLCF4683 | |
| NcmECL Ultra | New Cell&Molecular Biotech | P10300 | |
| Non-fat Powdered Milk | Solarbio | D8340 | |
| Nicotinamide | SparkJade | SJ-MV0061 | |
| Na+-K+ ATPase antibody | Abcam | ab76020 | Recognize both human and porcine proteins |
| PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%) | Epizyme | PG112 | |
| primary Human RPE cells | - | - | Generous gift from Shoubi Wang lab |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Prism | GraphPad by Dotmatics | version 8.0 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | APExBIO | K1024 | |
| PRE65 antibody | Proteintech | 17939-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| PEDF antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-390172 | Recognize both human and porcine proteins |
| 100 x penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-031-1BCS | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | RARBIO | RA-9005 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | Toyobo | FSQ-201 | |
| RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 601052 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 602052 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Taurine | Damas-beta | 107-35-7 | |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | RNA extraction solution |
| TB Green Fast qPCR Mix | Takara | RR430A | |
| 12-well transwell inserts | Labselect | 14212 | |
| VEGF antibody | Proteintech | 19003-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| VEGF ELISA kit | Novusbio | VAL106 | |
| ZO-1 antibody | ABclonal | A0659 | Recognize both human and porcine proteins |
References
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