Summary
Qui viene presentato un metodo facile da seguire per la coltura in vitro di cellule epiteliali primarie del pigmento retinico suino.
Abstract
L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato di cellule epiteliali pigmentate polarizzate, situato tra la coroide e la neuroretina nella retina. Molteplici funzioni, tra cui la fagocitosi, il trasporto di nutrienti / metaboliti, il metabolismo della vitamina A, ecc., Sono condotte dall'RPE su base giornaliera. Le cellule RPE sono cellule epiteliali differenziate terminalmente con poca o nessuna capacità rigenerativa. La perdita di cellule RPE provoca molteplici malattie degli occhi che portano a disabilità visive, come la degenerazione maculare legata all'età. Pertanto, la creazione di un modello di coltura in vitro di cellule RPE primarie, che assomiglia più da vicino all'RPE in vivo rispetto alle linee cellulari, è fondamentale per gli studi caratteristici e meccanicistici delle cellule RPE. Considerando il fatto che la fonte dei bulbi oculari umani è limitata, creiamo un protocollo per la coltura di cellule RPE primarie suine. Utilizzando questo protocollo, le cellule RPE possono essere facilmente dissociate dai bulbi oculari suini adulti. Successivamente, queste cellule dissociate si attaccano a piatti/inserti di coltura, proliferano per formare un monostrato confluente e ristabiliscono rapidamente le caratteristiche chiave del tessuto epiteliale in vivo entro 2 settimane. Con la qRT-PCR, è dimostrato che le cellule RPE primarie suine esprimono più geni firma a livelli comparabili con il tessuto RPE nativo, mentre le espressioni della maggior parte di questi geni sono perse / altamente ridotte nelle cellule umane simili a RPE, ARPE-19. Inoltre, la colorazione con immunofluorescenza mostra la distribuzione delle proteine della giunzione stretta, della polarità tissutale e del citoscheletro, nonché la presenza di RPE65, un'isomerasi fondamentale per il metabolismo della vitamina A, nelle cellule primarie in coltura. Nel complesso, abbiamo sviluppato un approccio facile da seguire alla coltura di cellule RPE primarie suine con elevata purezza e caratteristiche RPE native, che potrebbe servire come un buon modello per comprendere la fisiologia dell'RPE, studiare la tossicità cellulare e facilitare gli screening farmacologici.
Introduction
L'epitelio pigmentato retinico (RPE) si trova tra i fotorecettori e i coriocapillari nello strato esterno della retina1 con molteplici funzioni, tra cui la formazione della barriera emato-retinica, il trasporto e lo scambio di nutrienti e metaboliti della retina, il riciclaggio della vitamina A per mantenere un normale ciclo visivo e la fagocitosi e la clearance dei segmenti esterni dei fotorecettori (POS)2,3 . Poiché i POS richiedono un costante auto-rinnovamento per generare la visione, le cellule RPE devono continuamente inghiottire i POS distaccati per mantenere l'omeostasi retinica4. Pertanto, la disfunzione RPE provoca molte malattie dell'occhio accecante, come la degenerazione maculare legata all'età (AMD)4, la retinite pigmentosa (RP)5, l'amaurosi congenita di Leber6, la retinopatia diabetica7, ecc. Fino ad ora, l'esatta patogenesi della maggior parte di queste malattie rimane elusiva. Di conseguenza, la coltura cellulare RPE viene stabilita per studiare la biologia cellulare RPE, i cambiamenti patologici e i meccanismi sottostanti.
Come modello più semplice per studiare la biologia cellulare, la coltura delle cellule RPE è stata avviata già nel 19208. Sebbene ARPE-19 sia ampiamente utilizzato come cellule RPE, la perdita di pigmentazione, la morfologia del ciottolo e, soprattutto, le funzioni di barriera in questa linea cellulare sollevano molte preoccupazioni9. In confronto, la coltura di cellule RPE umane primarie offre uno scenario più realistico per studi fisiologici e patologici9. Tuttavia, la disponibilità relativamente limitata ne limita l'uso e le questioni etiche esistono sempre. Inoltre, diversi gruppi hanno utilizzato modelli murini per la coltura di celle RPE. Tuttavia, la dimensione dell'occhio del topo è piccola e una singola coltura di solito richiede molti topi, il che non è conveniente9. Recentemente, gli scienziati hanno sviluppato nuovi metodi per utilizzare cellule staminali embrionali umane o cellule staminali pluripotenti indotte per derivare cellule RPE. Sebbene questa tecnica abbia un particolare potenziale per il trattamento dei disturbi ereditari di RPE, richiede molto tempo e di solito richiede diversi mesi per generare cellule RPE mature10. Per superare questi problemi, qui introduciamo un protocollo facile da seguire per isolare e coltivare regolarmente cellule RPE ad alta purezza in laboratorio. In condizioni di coltura adeguate, queste cellule possono mostrare funzioni RPE tipiche e mostrare morfologie RPE tipiche. Pertanto, questo metodo di coltura può fornire un buon modello per comprendere la fisiologia RPE, studiare la citotossicità, indagare sui meccanismi patologici delle malattie oculari correlate e condurre screening farmacologici.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
L'uso di animali da esperimento è conforme ai regolamenti dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) ed è stato approvato dal Comitato etico di gestione animale sperimentale dell'Università di Xiamen.
1. Preparazione di dispositivi chirurgici sperimentali, enzima di digestione tissutale e tampone di coltura cellulare
- Preparare i dispositivi chirurgici sperimentali, pulendo e autoclavando due paia di forbici chirurgiche oftalmiche e pinze il giorno prima della dissezione del bulbo oculare, e successivamente asciugando la scatola con dispositivi chirurgici in un forno di protocollo generale a 65 ° C durante la notte.
- Preparazione dei terreni culturali.
- Preparare DMEM/Terreni di base integrati con siero bovino fetale al 10% (v/v), 2 mM di L-glutammina e 1% (v/v) di penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 U/ml).
- Preparare i terreni DMEM/F12 integrati con 1% (v/v) FBS e 1% (v/v) penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 U/mL).
- Preparare MEM-Nic 11, integrando MEM alfa con 2 mM di L-glutammina, 1% FBS, 1% (v/v) penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 U/mL), 0,1 mM NEAA, 1% (v/v) supplemento di N1, taurina (0,25 mg/ml), idrocortisone (20 ng/mL), triiodo-tironina (0,013 ng/ml) e10 mM di nicotinamide.
NOTA: Per migliorare la vitalità e la proliferazione cellulare, la percentuale di FBS può essere aumentata al 20% per neutralizzare gli enzimi della digestione e seminare le cellule dissociate. Per la coltura cellulare a lungo termine, la percentuale di FBS può essere ridotta fino all'1%12.
- Scongelare l'aliquota dell'enzima di digestione tissutale (soluzione di tripsina/EDTA allo 0,25% (p/v) integrata con 0,91 mM EDTA, di seguito denominata soluzione di tripsina/EDTA) durante l'esperimento.
NOTA: La soluzione fresca di tripsina/EDTA deve essere utilizzata ogni volta per ottenere risultati ottimali. Aliquot 10 mL di soluzione fresca di tripsina/EDTA in ciascuna provetta sterile da centrifuga da 15 mL e congelare le aliquote in frigorifero a -20 °C fino all'uso. - Soluzione di dissezione.
- Sterilizzare 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS) (pH 7,2) integrata con penicillina al 2% (v/v) (100 U/ml) e streptomicina (100 U/ml) filtrando la soluzione attraverso un'unità filtrante a siringa da 0,22 μm.
- Rivestire le piastre di coltura e gli inserti transwell.
- Lavare i pozzetti e gli inserti transwell con 1x PBS. Rimuovere il PBS dai pozzetti e dai pozzetti con una pipetta, quindi aggiungere 1 mL di 1x PBS fresco nella camera inferiore e 600 μL di 10 μg/mL di soluzione di laminina nella camera superiore.
- Incubare le piastre/inserti transwell nell'incubatore di coltura cellulare per una notte a 37 °C e 5% di CO2. Rimuovere la soluzione di laminina dalla camera superiore e lavare con 1 mL di freddo 1x PBS due volte prima di seminare le cellule.
2. Dissezione delle cellule RPE del bulbo oculare suino
- Preparazione degli strumenti.
- Pulire la cappa a flusso laminare con etanolo al 75% e luce UV. Preparare tre provette da centrifuga sterili da 50 ml contenenti ~25 ml di etanolo al 75%, tre provette sterili da centrifuga da 50 ml contenenti ~25 ml di 1x PBS e tre piastre di coltura cellulare sterile da 10 cm contenenti ~15 ml di 1x PBS.
NOTA: queste impostazioni vengono solitamente utilizzate per sezionare quattro bulbi oculari suini. Si prega di aumentare quando vengono utilizzati più bulbi oculari. Per migliorare la vitalità della cella, preraffreddare 1x tampone PBS sul ghiaccio per almeno 30 minuti. Sia l'etanolo al 75% che la luce UV sono necessari per garantire che gli strumenti sperimentali e le cellule non siano contaminati. Accendere la lampada UV in anticipo per sterilizzare l'intero tavolo operatorio per almeno 15 minuti.
- Pulire la cappa a flusso laminare con etanolo al 75% e luce UV. Preparare tre provette da centrifuga sterili da 50 ml contenenti ~25 ml di etanolo al 75%, tre provette sterili da centrifuga da 50 ml contenenti ~25 ml di 1x PBS e tre piastre di coltura cellulare sterile da 10 cm contenenti ~15 ml di 1x PBS.
- Pulire i bulbi oculari suini.
- Procurarsi bulbi oculari freschi da un macello e tenerli sul ghiaccio fino alla dissezione. Immergere quattro bulbi oculari suini in ~ 15 ml di etanolo al 75% in una capsula di Petri da 10 cm e utilizzare un paio di forbici e pinze per tagliare tutti i tessuti connettivi e i muscoli residui.
NOTA: Rimuovere quanto più tessuto possibile dall'esterno della sclera per ridurre le contaminazioni. Non tagliare il nervo ottico in questo momento per facilitare il trasferimento dei bulbi oculari durante la fase di decontaminazione e lavaggio. Dopo questo passaggio, tutte le procedure devono essere eseguite in una cappa a flusso laminare.
- Procurarsi bulbi oculari freschi da un macello e tenerli sul ghiaccio fino alla dissezione. Immergere quattro bulbi oculari suini in ~ 15 ml di etanolo al 75% in una capsula di Petri da 10 cm e utilizzare un paio di forbici e pinze per tagliare tutti i tessuti connettivi e i muscoli residui.
- Decontaminare i bulbi oculari suini immergendo e lavando quattro bulbi oculari suini in tre provette sterili da centrifuga da 50 ml riempite con etanolo al 75% in modo sequenziale; Ogni bulbo oculare è immerso per almeno 5 minuti in ogni tubo. Quindi, lavare i bulbi oculari suini in tre provette da centrifuga sterili da 50 ml riempite con 1x PBS in modo sequenziale; lavare ogni bulbo oculare per almeno 5 minuti in ogni tubo (Figura 1A). Capovolgere i tubi ogni minuto per lavare accuratamente i bulbi oculari.
- Dissezione dei bulbi oculari suini.
- Spostare i quattro bulbi oculari suini in un piatto di coltura cellulare sterile di 10 cm contenente 1x PBS. Tagliare nuovamente la superficie esterna di ciascun bulbo oculare per rimuovere il nervo ottico e i piccoli detriti (Figura 1B). Utilizzare le forbici per eseguire un piccolo taglio all'intersezione del limbus e della sclera, quindi rimuovere la cornea, l'iride, il cristallino, il corpo vitreo e la retina neurale (per le strutture dettagliate di questi tessuti, fare riferimento alla Figura 1).
- Trasferire il complesso RPE-coroide-sclera in un nuovo piatto di coltura cellulare di 10 cm ed effettuare quattro tagli per appiattire la concia oculare a forma di quadrifoglio (Figura 1C).
- Eseguire la digestione della soluzione di tripsina/EDTA posizionando i quattro complessi RPE-coroide-sclera in un nuovo piatto da 10 cm. Versare 20 ml di soluzione fresca di tripsina/EDTA per unire i complessi RPE-coroide-sclera e mettere il piatto nell'incubatore di coltura cellulare a 37 °C per ~30 minuti.
NOTA: Utilizzare una soluzione fresca di tripsina/EDTA per dissociare le cellule RPE. Controllare attentamente il tempo di digestione della soluzione di tripsina/EDTA, poiché un tempo di incubazione più lungo (più di 30 minuti) può aumentare la contaminazione di altri tipi di cellule.
3. Isolamento e coltura di cellule RPE del bulbo oculare suino
- Dissociazione RPE.
- Estrarre il piatto dall'incubatore dopo 30 minuti di incubazione con la soluzione di tripsina/EDTA e aggiungere 20 ml di terreno di coltura preriscaldato (con il 10% di FBS) al piatto per neutralizzare la soluzione di tripsina/EDTA.
NOTA: in questo passaggio, viene utilizzato solo il supporto DMEM/Basic. Quando le cellule raggiungono la confluenza, è possibile utilizzare tre terreni di coltura a seconda delle condizioni sperimentali: DMEM/Basic media, DMEM/F12 e MEM-Nic media. - Utilizzare una pipetta di trasferimento da 5 mL per dissociare le celle RPE pipettando delicatamente più volte. Raccogliere le sospensioni cellulari in provette da centrifuga da 15 ml. Utilizzare altri 10 ml di terreno di coltura fresco (10% FBS) per lavare i complessi RPE-coroide-sclera sul piatto mediante pipettaggio delicato per ottenere il maggior numero possibile di cellule RPE.
NOTA: Non triturare le cellule troppo vigorosamente. Assicurarsi di riempire e svuotare la pipetta ad una velocità di circa 3 ml/s. Evitare di gorgogliare la sospensione cellulare.
- Estrarre il piatto dall'incubatore dopo 30 minuti di incubazione con la soluzione di tripsina/EDTA e aggiungere 20 ml di terreno di coltura preriscaldato (con il 10% di FBS) al piatto per neutralizzare la soluzione di tripsina/EDTA.
- Raccogliere le celle RPE centrifugando i tubi a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante con una pipetta e aggiungere altri 5 ml di terreno di coltura (10% FBS) per risospendere le cellule e centrifugare a 200 x g per altri 5 minuti. Decantare il surnatante e risospendere le cellule con 12 ml di terreno di coltura.
NOTA: Quando si aspira il surnatante, lasciare circa 1 mL di fluido per evitare la rottura dei grumi cellulari. - Semina di celle RPE.
- Seminare ~ 1-2 x 105 cellule / pozzetto in piastre di coltura a 12 pozzetti o inserti transwell. Di solito, circa 1,5 x 106 celle RPE sono ottenute da quattro bulbi oculari suini. Cambiare i terreni di coltura ogni 2 giorni e ridurre la concentrazione sierica all'1% quando le cellule coprono completamente la superficie dei pozzetti/inserti.
NOTA: Non spostare il piatto di coltura cellulare troppo frequentemente prima che le cellule si attacchino al piatto o agli inserti di coltura.
- Seminare ~ 1-2 x 105 cellule / pozzetto in piastre di coltura a 12 pozzetti o inserti transwell. Di solito, circa 1,5 x 106 celle RPE sono ottenute da quattro bulbi oculari suini. Cambiare i terreni di coltura ogni 2 giorni e ridurre la concentrazione sierica all'1% quando le cellule coprono completamente la superficie dei pozzetti/inserti.
- Cambiare i terreni di coltura ogni 2 giorni fino a quando le cellule non vengono raccolte.
NOTA: La concentrazione di FBS può essere ridotta dopo che le cellule raggiungono la confluenza e le cellule possono essere coltivate fino a diversi mesi per consentire la piena differenziazione e maturazione.
4. Caratterizzazione di cellule RPE primarie suine
- Coltivare le cellule alla confluenza per 1 o 2 settimane, quindi raccogliere le cellule per ulteriori analisi.
- Raccogliere cellule per l'analisi quantitativa real-time PCR (qRT-PCR).
- Rimuovere i terreni di coltura, lavare le cellule con 1 ml di 1x PBS freddo, quindi aggiungere 500 μL di soluzione di estrazione dell'RNA in ciascun pozzetto per raccogliere il lisato cellulare da circa 1 x 106 cellule.
- Estrarre mRNA13; da ciascun campione vengono estratti circa 4 μg di RNA. Utilizzare 100 ng di mRNA per eseguire la trascrizione inversa14; diluire il cDNA di 40 volte per l'analisi quantitativa della PCR in tempo reale. I primer sono elencati nella Tabella 1.
- Raccogliere cellule per la colorazione con immunofluorescenza.
- Rimuovere i terreni di coltura, lavare le cellule con 1 mL di 1x PBS freddo, quindi aggiungere 500 μL di paraformaldeide al 4% (p/v) in 1x PBS per fissare le cellule (circa 1 x 106 cellule/pozzetto) per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare le cellule con 1x PBS due volte ed eseguire la colorazione con immunofluorescenza con anticorpi primari (1:100 in 1x PBS integrato con albumina sierica bovina all'1% (p/v) a 4 °C durante la notte e anticorpi secondari (1:200 in 1x PBS integrato con albumina sierica bovina all'1% (p/v) a temperatura ambiente per 2 ore secondo i protocolli online15.
- Le immagini di immunofluorescenza vengono acquisite da un microscopio confocale seguendo il manuale online16.
- Celle di raccolta per l'analisi Western blot.
- Rimuovere i terreni di coltura, lavare le cellule con 1x PBS freddo due volte, quindi aggiungere 80 μL di tampone RIPA (con 1x inibitore della proteasi) in ciascun pozzetto e utilizzare raschietti cellulari per grattare circa 1 x 106 cellule dai piatti / inserti.
- Raccogliere il lisato cellulare da ciascun pozzetto/inserirlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Far bollire i lisati cellulari per 10 minuti e quindi misurare le concentrazioni proteiche utilizzando kit BCA; la concentrazione proteica di ciascun campione è di circa 2 mg/ml. Utilizzare 25 μg di proteine di ciascun campione per l'analisi Western blot secondo i protocolli online17.
- Per Western blot, incubare le membrane in 5 mL di soluzione anticorpale primaria (1:1.000 diluizione di anticorpi primari in 1x soluzione TBST integrata con albumina sierica bovina al 5% (p/v) a 4 °C durante la notte su uno shaker rotante multiuso.
- Quindi, incubare la membrana con circa 15 ml di soluzione anticorpale secondaria anti-coniglio o anti-topo (1:5.000 diluizione di anticorpi secondari in 1x soluzione TBST integrata con latte non grasso al 5% (p/v) a temperatura ambiente per 2 ore su uno shaker orbitale, in base alla fonte di anticorpo primario utilizzato.
- Misurazione della resistenza transepiteliale (TER).
- Lavare gli elettrodi delle bacchette con etanolo al 70% e sterile 1x PBS in modo sequenziale. Quindi posizionare l'estremità più corta dell'elettrodo nella camera superiore e l'estremità più lunga nella camera inferiore degli inserti transwell e fare clic sul pulsante sul voltmetro epiteliale per le misurazioni. Registrare le misurazioni TER di ciascun pozzetto in triplice copia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le cellule RPE primarie suine (pRPE) sono state coltivate in terreni DMEM / Basic con il 10% di FBS e la morfologia cellulare al microscopio ottico è stata fotografata a 2 giorni (Figura 2A), 6 giorni (Figura 2B) e 10 giorni (Figura 2C) dopo la semina. Dopo 1 settimana, è stato osservato un monostrato confluente di cellule pRPE pigmentate con morfologie di ciottoli.
Per caratterizzare meglio le cellule pRPE primarie, le cellule RPE umane primarie (hRPE) al passaggio 3 (P3) 18 e le cellule ARPE-19 sono state coltivate in terreni DMEM / Basic con FBS all'1% per un'altra settimana, e quindi sono stati raccolti l'mRNA totale e la proteina delle cellule coltivate, così come i tessuti RPE / coroidi suini. I livelli di espressione dei geni caratteristici chiave19 e dei marcatori proteici di RPE maturi sono stati valutati mediante qRT-PCR e Western blot. Rispetto alle cellule ARPE-19, le cellule pRPE hanno mantenuto livelli di espressione significativamente più elevati di geni funzionanti nella secrezione nativa di RPE (Figura 3A (c)), nella fagocitosi (Figura 3A (i)), nel trasporto (Figura 3A (a), (d)), nelle giunzioni strette (Figura 3A (j)), nella formazione di barriere (Figura 3A (b)), nonché nel ciclo visivo (Figura 3A (e), B). Tuttavia, i livelli di espressione di Krt8 e Krt18, due geni marcatori del citoscheletro dell'RPE, erano significativamente più bassi nelle cellule pRPE primarie rispetto alle cellule hRPE primarie e ARPE-19 (Figura 3A (g), (h)). Inoltre, itgav, che partecipa alla fagocitosi, era più basso anche nelle cellule pRPE primarie (Figura 3A (f)). Poiché i livelli di espressione di questi tre geni nelle cellule pRPE erano simili con il tessuto RPE/coroide suino, ciò potrebbe indicare le differenze di espressione genica tra le specie. Inoltre, il livello di espressione di Tyr, che è responsabile della produzione di melanina, era altamente ridotto sia nelle cellule primarie pRPE che in quelle hRPE (Figura 3A (k)), il che potrebbe spiegare la perdita di pigmentazione nelle cellule coltivate a lungo termine. Le differenze nei risultati della qRT-PCR osservate nei dati delle cellule pRPE umane e delle cellule pRPE suine potrebbero essere dovute alla maggiore conservazione e al numero di passaggio più elevato (P3) della pRPE umana, indicando così una perdita di caratteri RPE durante la sub-coltura. Inoltre, Western blot ha mostrato che la proteina RPE65, che è un enzima chiave nel ciclo visivo con le cellule RPE, era espressa nelle cellule pRPE, mentre il suo livello di espressione era significativamente ridotto nelle cellule hRPE primarie e nelle cellule ARPE-19 (Figura 3B, C).
Per caratterizzare ulteriormente le funzioni di polarità e barriera delle celle RPE, i monostrati confluenti in coltura di cellule pRPE e ARPE-19 sono stati coltivati in inserti transwell con supporti DMEM/Basic, DMEM/F12 e MEM-Nic per 1 settimana (Figura 4). In queste condizioni di coltura, i risultati della colorazione fluorescente Na+-K+-ATPasi (Figura 4A-F) e ZO-1 (Figura 4G-L) hanno rivelato che le cellule pRPE avevano livelli di espressione più elevati sia di Na+-K+-ATPasi che di ZO-1 rispetto alle cellule ARPE-19. L'equa distribuzione di Na+-K+-ATPasi sulla superficie apicale e basale delle cellule pRPE indicava che era necessario un tempo di coltura più lungo per ripristinare le polarità cellulari in vitro.
L'RPE forma giunzioni strette vicino alla sua superficie apicale per regolare strettamente lo scambio di metaboliti tra la retina interna e le coroidi20. La colorazione di ZO-1 ha suggerito che le proteine a giunzione stretta erano normalmente localizzate sulla membrana plasmatica delle cellule pRPE primarie con morfologie di ciottoli regolari, ma non delle cellule ARPE-19. Tra i tre terreni di coltura, i migliori modelli di colorazione ZO-1 sono stati osservati in cellule coltivate in DMEM / Basic, mentre DMEM / F12 non è riuscito a mantenere la morfologia del ciottolo delle cellule pRPE. Un valore TER più alto funge da indicatore della formazione di giunzioni strette e di migliori funzioni di barriera delle celle RPE21. Per confermare la funzione delle giunzioni strette, è stata misurata la resistenza transepiteliale (TER). Tuttavia, è stato rilevato solo un TER leggermente superiore rispetto agli inserti transwell vuoti (Figura 4M,N).
Nella retina, la membrana di Bruch esiste tra l'RPE e la coroide. I componenti principali della membrana di Bruch sono il collagene di tipo IV, i proteoglicani e la laminina22. Al fine di simulare l'effetto di supporto della membrana di Bruch sulla RPE, la laminina è stata sparsa sulla superficie della membrana transwell per facilitare la maturazione delle cellule RPE in coltura. Sulla base dei risultati ottenuti dalla Figura 4, le celle pRPE confluenti sono state coltivate su inserti transwell in supporti DMEM/Basic con FBS all'1% per 2 settimane. I risultati della colorazione immunofluorescente hanno mostrato che le proteine RPE65 specifiche dell'RPE erano espresse in tutte le cellule pRPE (Figura 5A,B). Na+-K+-ATPasi è stata distribuita sulla superficie apicale delle cellule pRPE, suggerendo il ristabilimento delle polarità cellulari (Figura 5C,D). Sia la colorazione ZO-1 che i risultati TER hanno indicato che le giunzioni strette erano ben formate nelle cellule pRPE primarie quando sono state coltivate con laminina (Figura 5E, F, H). La figura 5G mostra le cellule colorate con il colorante Hoechst.
Inoltre, Western blot ha dimostrato che sia le cellule pRPE che ARPE-19 producono fattori di crescita, tra cui il fattore derivato dall'epitelio pigmentato (PEDF) e il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) (Figura 6A). Dopo che i monostrati confluenti di pRPE sono stati coltivati in inserti transwell con DMEM/Basic, DMEM/F12 e MEM-Nic media per 1 settimana, sono stati raccolti terreni di coltura dalle camere superiore e inferiore degli inserti transwell e il VEGF secreto è stato quantificato mediante ELISA. Quando i terreni DMEM/Basic e MEM-Nic sono stati utilizzati per la coltura cellulare, le cellule pPRE hanno secreto più VEGF rispetto alle cellule nei terreni DMEM/F12 (Figura 6B). Tuttavia, non è stato possibile rilevare differenze nelle quantità di VEGF tra le camere superiore e inferiore degli inserti transwell in tutte le condizioni testate (Figura 6B). Inoltre, dopo che le cellule pRPE primarie sono state coltivate sugli inserti rivestiti con laminina e in terreni DMEM / Basic per 2 settimane, sono stati raccolti i terreni dalle camere superiore e inferiore. L'analisi Western blot ha mostrato livelli più elevati di PEDF nella camera superiore rispetto alla camera inferiore, mentre i livelli proteici di VEGF secreto erano simili in entrambe le camere (Figura 6C). Questi risultati hanno ulteriormente supportato il ristabilimento della polarità cellulare quando le cellule pRPE primarie sono state coltivate per altre 2 settimane dopo aver raggiunto la confluenza sulla laminina.
Figura 1: Fasi fondamentali dell'isolamento delle cellule pRPE . (A) Lavare i bulbi oculari suini con 1x PBS in provette sterili da centrifuga da 50 ml. (B,C) Preparare complessi RPE-coroide-sclera per la digestione enzimatica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Morfologie cellulari pRPE primarie dopo coltura cellulare. Immagini rappresentative delle cellule pRPE primarie al (A) Giorno 2, (B) Giorno 6 e (C) Giorno 10. Barra scala 250 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Livelli di espressione di geni e proteine chiave in cellule RPE in coltura. (A) Analisi qRT-PCR dei livelli di mRNA di geni firma in cellule pRPE primarie, cellule hRPE primarie, cellule ARPE-19 e pRPE/tessuto coroideo. Gapdh è stato usato come gene di mantenimento della casa per la qRT-PCR. Quattro repliche biologiche sono state utilizzate per le cellule pRPE primarie e le cellule ARPE-19, mentre tre repliche biologiche sono state utilizzate per le cellule hRPE primarie e il tessuto pRPE / coroide. I livelli di espressione genica nelle cellule ARPE-19 sono stati impostati come controlli. (B) Analisi Western blot delle proteine RPE65 in cellule ARPE-19 e pRPE. Vinculin è stato utilizzato come controllo del carico. (C) Analisi Western blot delle proteine RPE65 nelle cellule hRPE primarie e nel tessuto pRPE/coroideo. Vinculin è stato utilizzato come controllo del carico. Per confronto, è stato utilizzato il test t degli studenti, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Coltura a una settimana di cellule primarie pRPE e ARPE-19 in supporti DMEM/Basic, DMEM/F12 e MEM-Nic con 1% FBS. (A) Colorazione fluorescente Na+-K+-ATPasi (rosso) di celle pRPE primarie in supporti DMEM/Basic, (B) DMEM/F12 e (C) MEM-Nic. (D) Colorazione fluorescente Na+-K+-ATPasi (rosso) delle cellule ARPE-19 in mezzi DMEM/Basic, (E) supporti DMEM/F12 e (F) supporti MEM-Nic. (G) Colorazione fluorescente ZO-1 (verde) delle celle pRPE primarie in mezzi DMEM/Basic, (H) supporti DMEM/F12 e (I) supporti MEM-Nic. (J) Colorazione fluorescente ZO-1 (verde) nelle cellule ARPE-19 nei mezzi DMEM/Basic, (K) nei supporti DMEM/F12 e (L) nei supporti MEM-Nic. Le misurazioni TER dopo le cellule primarie pRPE (M) e ARPE-19 (N) sono state coltivate in terreni DMEM/Basic, DMEM/F12 e MEM-Nic per 1 settimana. Per ogni tipo di celle, i dati sono stati ottenuti da almeno tre diversi pozzi. Per confronto, è stato utilizzato il test t dello studente, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Barra di scala 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Coltura a due settimane di cellule pRPE in terreni DMEM/Basic con FBS all'1%. (A-F) Le cellule coltivate con o senza laminina sono state colorate con RPE65 (A, B, rosso), Na+-K+-ATPasi (C, D, rosso), ZO-1 (E, F, verde) e (G) Hoechst (blu). (H) Misurazioni di TER in fogli cellulari coltivati con o senza laminina. Per diversi trattamenti, i dati sono stati ottenuti da quattro diversi pozzi. Per confronto, è stato utilizzato il test t dello studente, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Funzioni secretorie delle cellule primarie in coltura di pRPE e ARPE-19. (A) Analisi Western blot di VEGF e PEDF in cellule primarie pRPE e ARPE-19. (B) VEGF secreto nella camera superiore e inferiore degli inserti transwell con celle pRPE primarie quando le celle confluenti sono state coltivate in supporti DMEM/Basic, DMEM/F12 e MEM-Nic per 1 wk. (C) PEDF secreto e VEGF nella camera superiore e inferiore degli inserti transwell con pRPE primario in supporti DMEM/Basic per 2 settimane. Per diversi trattamenti, i dati sono stati ottenuti da tre diversi pozzi. Per confronto, è stato utilizzato il test t dello studente, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Homo sapiens | Sus scrofa | |
| Migliore1 | F: GAAGGCAAGGACGAGCAAG | F: GGACACCTGTATGCCTACGA |
| R: TCCAACTGCTTGTGTTCTGC | R: GGAACGTGAAGAGGGGTACA | |
| Cldn19 | F: GGTGACCCAGGAGTTCTTCA | F: TCGTGACCCAGGAGTTCTTC |
| R: CTGTTGGGTCTCTCTGGCTCTC | R: GCTGCTGTTGGATCGCTC | |
| Itgav · | F: CGCAGTCCCATCTCAAATCC | F: GCTTTCTTCAGGACGGAACA |
| R: GGCCCTGTATAAGATAGCTCGA | R: GAAATGAGCTGACCTTGCCA | |
| Krt8 | F: GGAGCAGATCAAGACCCTCA | F: CCCAGGAGAAGGAGCAGATC |
| R: GCCGCCTAAGGTTGTTGATG | R: ATGTTGTCGATGTTGCTCCG | |
| Krt18 | F: CTTGGAGAAGAAGGGACCCC | F: GCTGATAATCGGAGGCTGGA |
| R: GGCCAGCTGTCTCATACT | R: GAAGTCATCAGCAGCGAGAC | |
| Mertk · | F: GTGTGCAGCGTTCAGACAAT | F: GCGGCTATTTCTTGGTGGAA |
| R: AAAATGTTGACGGGCTCAGG | R: ACGTAGATGGGGTCAGACAC | |
| Serpinf1 | F: CAGATGAAAGGGAAGCTCGC | F: AAGACGTCGCTGGAGGATTT |
| R: TTAGGGTCCGACATCATGGG | R: GGTCACTTTCAGAGGCAGGA | |
| SLC16A8 | F: GGGTGTCCTCCATCATGCTA | F: CAGTTCGAGGTGCTCATGG |
| R: GTCAGGTAGAGCTCCAGGAG | R: GACAGCCATGAAGACACCAG | |
| Stra6 | F: CTTTGCAGGAAGAAGCTGGG | F: CTAGCCGTGTTGTCGATCCT |
| R: TAAATGGCCGTCCCTGTCAG | R: GACCATGAAGACAGCAGCAG | |
| Tjp1 | F: ACAGGAAAATGACCGAGTTGC | F: AAGACTTGTCAGCTCAGCCA |
| R: TGGTTCAGGATCAGGACGAC | R: CCAGCATCTCGAGGTTCACT | |
| Tyr | F: ACTCAGCCCAGCATCATTCT | F: ATCTACTCAGCCCAGCATCC |
| R: ACATCAGCTGAAGAGGAG | R: GAGCCTTGGAGTCCTGGATT | |
| Gapdh | F: CAGCCTCAAGATCATCAGCA | F: CATCCTGGGCTACACTGAGG |
| R: ATGATGTTCTGGAGAGCCCC | R: GGGGCTCTTACTCCTTGGAG |
Tabella 1: Primer per qRT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Qui, è stato descritto un protocollo dettagliato e ottimizzato per l'isolamento, la coltura e la caratterizzazione di cellule RPE da bulbi oculari suini, che genera un buon modello per la caratterizzazione in vitro delle cellule RPE e studi sui disturbi correlati a RPE. I metodi per l'isolamento dell'RPE dagli occhi umani, di topo e di ratto sono stati descritti in precedenza23,24,25. Tuttavia, è difficile ottenere bulbi oculari umani in alcuni laboratori e di solito solleva questioni etiche. I tessuti RPE di topi e ratti sono relativamente piccoli, le cellule sono facilmente danneggiate durante la separazione e solo poche cellule possono essere ottenute da ciascun animale. Al contrario, i bulbi oculari suini sono molto più facili da ottenere e maneggiare, il che potrebbe generare stabilmente un numero relativamente elevato di cellule primarie da un singolo bulbo oculare. In alcuni studi, le pinzette vengono utilizzate per separare meccanicamente l'RPE, che può facilmente portare alla morte cellulare. Pertanto, l'acido ialuronico, la dispasi e la soluzione di tripsina / EDTA sono stati impiegati in precedenza per dissociare le cellule RPE. Studi precedenti hanno dimostrato che la soluzione Tripsina/EDTA ha la capacità di aiutare RPE a staccarsi dalla coroide21. Pertanto, la soluzione di tripsina/EDTA è stata utilizzata per digerire i tessuti suini, che generano risultati ottimali. Dopo la neuralizzazione della tripsina/EDTA, i tessuti RPE potrebbero essere dissociati in sospensione monocellulare mediante pipettaggio delicato con una punta di pipetta. Un trucco è che la soluzione fresca di tripsina / EDTA è raccomandata per ogni esperimento per dissociare completamente le cellule RPE. A causa dell'ampia area dei tessuti RPE dei bulbi oculari suini, il complesso RPE-coroide-sclera a forma di mezza ciotola deve essere tagliato nella forma di un quadrifoglio, che favorisce il pieno contatto tra i tessuti RPE e la soluzione Tripsina / EDTA in modo da facilitare la loro separazione dalla coroide. Tuttavia, il tempo di digestione non deve superare mezz'ora. Entro questo tempo, altri tessuti tranne RPE non saranno digeriti, il che potrebbe ridurre efficacemente le contaminazioni da altri tipi di cellule.
La laminina è stata sparsa sulla superficie della membrana transwell per simulare l'effetto di supporto della membrana di Bruch sull'RPE. I risultati hanno mostrato che la laminina era benefica per la crescita delle cellule pRPE, che stimolavano l'espressione delle proteine trasportatrici e di giunzione stretta. Tuttavia, i risultati hanno anche indicato che era necessario un tempo di coltura più lungo, di circa 2 settimane, per le cellule pRPE primarie per ripristinare alcune caratteristiche dei tessuti RPE nativi, tra cui la polarità cellulare e le giunzioni strette.
Un difetto della coltura primaria di RPE è che è difficile mantenere le espressioni enzimatiche del ciclo visivo in vitro. Pertanto, è fondamentale esaminare se le cellule RPE in coltura possano esprimere proteine RPE-specifiche RPE65. Rispetto alle cellule ARPE-19, le cellule pRPE esprimevano significativamente più proteina RPE65. Al contrario, solo una banda debole della proteina RPE65 è stata osservata nei lisati cellulari ARPE-19 nel Western blot. È interessante osservare che il peso molecolare di RPE65 era leggermente diverso tra l'uomo e i suini (Figura 3B, C). La perdita dell'espressione di RPE65 nelle cellule RPE in coltura rimane un mistero. Anche nelle cellule primarie in coltura, RPE65 è stato gradualmente perso con passaggi (dati non mostrati). Fino ad ora, come mantenere l'espressione di RPE65 in vitro richiede ulteriori indagini, considerando il fatto che il ciclo visivo è una funzione critica per i tessuti RPE nativi. In secondo luogo, una delle principali limitazioni di questo protocollo è che le cellule RPE in coltura in vitro non possono essere attraversate. Con la coltura prolungata, le cellule pRPE tendono a perdere la loro forma esagonale e TER e la pigmentazione, in modo che possano essere utilizzate solo cellule di passaggio 0. Un'altra limitazione di questo protocollo di coltura è che le mutazioni genetiche, che portano a malattie ereditarie della retina, sono difficili da riprodurre in queste cellule. Pertanto, l'editing genetico mediato da virus può essere impiegato per studiare in futuro disturbi ereditari di RPE come l'amaurosi congenita di Leger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tutti gli autori hanno rivelato che non ci sono conflitti di interesse.
Tutti gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori vorrebbero mostrare la loro gratitudine e rispetto a tutti gli animali che contribuiscono con le loro cellule in questo studio. Questo studio è stato sostenuto in parte da sovvenzioni del National Key R&D Program of China (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao e Grant nos. 2018YFA0107301, Wei Li). Gli autori ringraziano Jingru Huang e Xiang You del Central Lab, School of Medicine, Xiamen University per il supporto tecnico nell'imaging confocale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ARPE-19 cells | CCTCC | GDC0323 | |
| Bovine serum albumin | Yeasen | 36101ES60 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM 880 with Airyscan | |
| ChemiDoc Touch | Bio-Rad | 1708370 | |
| Cell scraper | Sangon | F619301 | |
| 10 cm culture dish | NEST | 121621EH01 | |
| 12-well culture plate | NEST | 29821075P | |
| DMEM F12 Medium | Gibco | C11330500BT | |
| DMEM basic Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EVOM2 | World Precision Instruments | EVOM2 | For TER measurement |
| Fetal bovine serum | ExCell Bio | FSP500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 0300-0108P | |
| Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 5196-2504 | |
| hydrocortisone | MCE | HY-N0583/CS-2226 | |
| Hoechst 33342 solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| LightCycler 96 Instrument | Roche | 5815916001 | |
| Liothyronine | MCE | HY-A0070A/CS-4141 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| MEM(1X)+GlutaMAX Medium | Gibco | 10566-016 | |
| MEM NEAA(100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Millex-GP syringe filter unit | Millipore | SLGPR33RB | |
| N1 | Sigma-Aldrich | SLCF4683 | |
| NcmECL Ultra | New Cell&Molecular Biotech | P10300 | |
| Non-fat Powdered Milk | Solarbio | D8340 | |
| Nicotinamide | SparkJade | SJ-MV0061 | |
| Na+-K+ ATPase antibody | Abcam | ab76020 | Recognize both human and porcine proteins |
| PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%) | Epizyme | PG112 | |
| primary Human RPE cells | - | - | Generous gift from Shoubi Wang lab |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Prism | GraphPad by Dotmatics | version 8.0 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | APExBIO | K1024 | |
| PRE65 antibody | Proteintech | 17939-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| PEDF antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-390172 | Recognize both human and porcine proteins |
| 100 x penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-031-1BCS | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | RARBIO | RA-9005 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | Toyobo | FSQ-201 | |
| RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 601052 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 602052 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Taurine | Damas-beta | 107-35-7 | |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | RNA extraction solution |
| TB Green Fast qPCR Mix | Takara | RR430A | |
| 12-well transwell inserts | Labselect | 14212 | |
| VEGF antibody | Proteintech | 19003-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| VEGF ELISA kit | Novusbio | VAL106 | |
| ZO-1 antibody | ABclonal | A0659 | Recognize both human and porcine proteins |
References
- Tan, L. X., Germer, C. J., La Cunza, N., Lakkaraju, A. Complement activation, lipid metabolism, and mitochondrial injury: Converging pathways in age-related macular degeneration. Redox Biology. 37, 101781 (2020).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Ducloyer, J. B., Le Meur, G., Cronin, T., Adjali, O., Weber, M. Gene therapy for retinitis pigmentosa. Medecine Sciences. 36 (6-7), 607-615 (2020).
- den Hollander, A. I., Roepman, R., Koenekoop, R. K., Cremers, F. P. Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 391-419 (2008).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Smith, D. T. Melanin pigment in the pigmented epithelium of the retina of the embryo chick eye studied in vivo and in vino. The Anatomical Record. 18, 260-261 (1920).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- D'Antonio-Chronowska, A., D'Antonio, M., Frazer, K. A. In vitro differentiation of human iPSC-derived retinal pigment epithelium cells (iPSC-RPE). Bio-Protocol. 9 (24), 3469 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- Scientific, T. , Available from: https://www.thermofisher.cn/document-connect/document connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2Ftrizol_reagent.pdf (2022).
- Toyota. , Available from: https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf (2022).
- Abcam. , Available from: https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol (2022).
- Zeiss. , Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals (2022).
- Cell Signal Technology. , Available from: https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western (2022).
- Wang, S., et al. Reversed senescence of retinal pigment epithelial cell by coculture with embryonic stem cell via the TGFbeta and PI3K pathways. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 588050 (2020).
- Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Experimental Eye Research. 126, 1-4 (2014).
- Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Experimental Eye Research. 126, 5-15 (2014).
- Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. Physiology and function of the tight junction. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002584 (2009).
- Nita, M., Strzalka-Mrozik, B., Grzybowski, A., Mazurek, U., Romaniuk, W. Age-related macular degeneration and changes in the extracellular matrix. Medical Science Monitor. 20, 1003-1016 (2014).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Langenfeld, A., Julien, S., Schraermeyer, U. An improved method for the isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult rats. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1493-1502 (2015).
- Sonoda, S. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
