Summary
ここでは、初代ブタ網膜色素上皮細胞を 試験管内で 培養するためのわかりやすい方法が提示されている。
Abstract
網膜色素上皮(RPE)は、網膜の脈絡膜と神経網膜の間に位置する偏光色素上皮細胞の単層です。食作用、栄養素/代謝物輸送、ビタミンA代謝などを含む複数の機能がRPEによって日常的に行われています。RPE細胞は、再生能力がほとんどまたはまったくない最終分化上皮細胞です。RPE細胞の喪失は、加齢黄斑変性症などの視覚障害につながる複数の眼疾患をもたらします。したがって、細胞株よりもin vivoのRPEによく似た初代RPE細胞のin vitro培養モデルの確立は、RPE細胞の特徴的かつ機構的な研究にとって重要です。ヒトの眼球の供給源が限られていることを考慮して、我々は初代ブタRPE細胞を培養するためのプロトコルを作成します。このプロトコルを使用することにより、RPE細胞は成体のブタ眼球から容易に解離することができる。その後、これらの解離した細胞は培養皿/インサートに付着し、増殖してコンフルエントな単層を形成し、in vivoで上皮組織の重要な特徴を2週間以内に迅速に再確立します。qRT-PCRにより、初代ブタRPE細胞は、天然RPE組織と同等のレベルで複数のシグネチャ遺伝子を発現する一方で、ヒトRPE様細胞ARPE-19では、これらの遺伝子のほとんどの発現が失われたり、大幅に減少したりすることが実証されています。さらに、免疫蛍光染色は、培養初代細胞におけるタイトジャンクション、組織極性、細胞骨格タンパク質の分布、およびビタミンA代謝に重要なイソメラーゼであるRPE65の存在を示しています。全体として、高純度でネイティブなRPE機能を備えた初代ブタRPE細胞を培養するためのわかりやすいアプローチを開発し、RPE生理学を理解し、細胞毒性を研究し、薬物スクリーニングを容易にするための優れたモデルとして役立つ可能性があります。
Introduction
網膜色素上皮(RPE)は、網膜1の外層の光受容体と脈絡毛細血管の間に位置し、血液網膜関門の形成、栄養素と網膜代謝物の輸送と交換、正常な視覚サイクルを維持するためのビタミンAのリサイクル、脱落した光受容体外側セグメント(POS)の食作用とクリアランスなど、複数の機能を持っています2,3。.POSは視力を生成するために絶え間ない自己複製を必要とするため、RPE細胞は網膜の恒常性を維持するために剥離したPOSを継続的に飲み込む必要があります4。したがって、RPE機能障害は、加齢黄斑変性症(AMD)4、網膜色素変性症(RP)5、レーバー先天性無力症6、糖尿病性網膜症7など、多くの失明性眼疾患を引き起こします。今まで、これらの病気のほとんどの正確な病因はとらえどころのないままです。その結果、RPE細胞生物学、病理学的変化、およびその根底にあるメカニズムを研究するためにRPE細胞培養が確立されます。
細胞生物学を研究するための最も単純なモデルとして、RPE細胞の培養は早くも1920年代に開始されました8。ARPE-19はRPE細胞として広く用いられているが、色素沈着の喪失、石畳の形態、特にこの細胞株におけるバリア機能は、多くの懸念を引き起こす9。それに比べて、初代ヒトRPE細胞の培養は、生理学的および病理学的研究のためのより現実的なシナリオを提供します9。ただし、可用性が比較的限られているため、使用が制限され、倫理的な問題が常に存在します。さらに、いくつかのグループは、RPE細胞を培養するためにマウスモデルを使用しました。しかし、マウスの目のサイズは小さく、1回の培養には通常多くのマウスが必要であり、これは便利ではありません9。最近、科学者は、ヒト胚性幹細胞または人工多能性幹細胞を使用してRPE細胞を誘導する新しい方法を開発しました。この技術は、遺伝性RPE障害の治療に特に可能性を秘めているが、時間がかかり、通常、成熟RPE細胞を生成するのに数ヶ月を要する10。これらの問題を克服するために、ここでは、実験室で高純度RPE細胞を日常的に分離および培養するためのわかりやすいプロトコルを紹介します。適切な培養条件下では、これらの細胞は典型的なRPE機能を示し、典型的なRPE形態を示すことができます。したがって、この培養法は、RPE生理学を理解し、細胞毒性を研究し、関連する眼疾患の病理学的メカニズムを調査し、薬物スクリーニングを実施するための優れたモデルを提供することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
実験動物の使用は、視覚眼科学研究協会(ARVO)の規則に準拠し、厦門大学の実験動物管理の倫理委員会によって承認されました。
1. 実験用手術器具、組織消化酵素、細胞培養バッファーの調製
- 実験用手術器具を準備し、眼球解剖の前日に2組の眼科手術用ハサミ及び鉗子を洗浄及びオートクレーブ処理し、その後、手術器具の入った箱を一般プロトコールオーブン中で65°Cで一晩乾燥させた。
- 培地の調製。
- 10%(v/v)ウシ胎児血清、2 mM L-グルタミン、1%(v/v)ペニシリン(100 U/mL)およびストレプトマイシン(100 U/mL)を添加したDMEM/ベーシック培地を調製します。
- 1%(v/v)FBS、1%(v/v)ペニシリン(100 U/mL)およびストレプトマイシン(100 U/mL)を添加したDMEM/F12培地を調製します。
- MEM アルファに 2 mM L-グルタミン、1% FBS、1% (v/v) ペニシリン (100 U/mL) およびストレプトマイシン (100 U/mL)、0.1 mM NEAA、1% (v/v) N1 サプリメント、タウリン (0.25 mg/mL)、ヒドロコルチゾン (20 ng/mL)、トリヨード-チロニン (0.013 ng/mL)、および 10 mM ニコチンアミドを補給して、MEM-Nic11 を調製します。
注:細胞の生存率と増殖を改善するために、FBSの割合を20%に増やして消化酵素を中和し、解離した細胞に播種することができます。長期間の細胞培養では、FBSの割合を1%まで減らすことができます12。
- 実験中に組織消化酵素アリコート(0.91 mM EDTAを添加した0.25%(w/v)トリプシン/EDTA溶液、以下、トリプシン/EDTA溶液と呼びます)を解凍します。
注意: 最適な結果を得るには、毎回新鮮なトリプシン/ EDTA溶液を使用する必要があります。10 mLの新鮮なトリプシン/ EDTA溶液を各15 mL滅菌遠心チューブに分注し、使用するまで-20°Cの冷蔵庫でアリコートを凍結します。 - 解剖ソリューション。
- 2%(v/v)ペニシリン(100 U/mL)およびストレプトマイシン(100 U/mL)を添加した1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(pH 7.2)を、0.22 μmのシリンジフィルターユニットで溶液をろ過して滅菌します。
- 培養プレートとトランスウェルインサートをコーティングします。
- ウェルとトランスウェルインサートを1x PBSで洗浄します。ピペットでウェルおよびトランスウェルからPBSを取り出し、1 mLの新しい1x PBSを下チャンバーに、600 μLの10 μg/mLラミニン溶液を上部チャンバーに追加します。
- プレート/トランスウェルインサートを細胞培養インキュベーター内で37°C、5%CO2で一晩インキュベートします。ラミニン溶液を上部チャンバーから取り出し、細胞を播種する前に1 mLの冷たい1x PBSで2回洗浄します。
2. ブタ眼球RPE細胞の解剖
- 楽器の準備。
- 層流フードを75%エタノールとUV光で清掃します。~25 mLの75%エタノールを含む50 mL滅菌遠心チューブ3本、1x PBSを~25 mL入った50 mL滅菌遠心チューブ3本、および1x PBSを~15 mL入った10 cm滅菌細胞培養皿3本を準備します。
注:これらの設定は通常、4つのブタの眼球を解剖するために使用されます。より多くの眼球が使用されるとき、スケールアップしてください。細胞の生存率を向上させるには、1x PBSバッファーを氷上で少なくとも30分間予冷します。75%エタノールとUV光の両方が、実験装置と細胞が汚染されていないことを確認するために必要です。事前にUVランプをオンにして、操作テーブル全体を少なくとも15分間滅菌してください。
- 層流フードを75%エタノールとUV光で清掃します。~25 mLの75%エタノールを含む50 mL滅菌遠心チューブ3本、1x PBSを~25 mL入った50 mL滅菌遠心チューブ3本、および1x PBSを~15 mL入った10 cm滅菌細胞培養皿3本を準備します。
- ブタの眼球をきれいにします。
- 食肉処理場から新鮮な眼球を入手し、解剖まで氷の上に置いておきます。10cmのシャーレに4本のブタ眼球を~15mLの75%エタノールに浸し、はさみと鉗子を使って残っている結合組織と筋肉をすべて切り取ります。
注意: 汚染を減らすために、強膜の外側からできるだけ多くの組織を取り除きます。除染および洗浄ステップ中の眼球の移動を容易にするために、この時点で視神経を切断しないでください。このステップの後、すべての手順は層流フードで実行する必要があります。
- 食肉処理場から新鮮な眼球を入手し、解剖まで氷の上に置いておきます。10cmのシャーレに4本のブタ眼球を~15mLの75%エタノールに浸し、はさみと鉗子を使って残っている結合組織と筋肉をすべて切り取ります。
- 75%エタノールで満たされた3つの50 mL滅菌遠心チューブに4つのブタ眼球を順次浸して洗浄することにより、ブタ眼球を除染します。各眼球を各チューブに少なくとも5分間浸します。次に、1x PBSで満たされた3本の50 mL滅菌遠心チューブでブタの眼球を順次洗浄します。各眼球を各チューブで少なくとも5分間洗浄します(図1A)。眼球を完全に洗うために毎分チューブを反転させます。
- ブタ眼球の解剖。
- 4頭のブタ眼球を、1x PBSを含む10cmの滅菌細胞培養皿に移します。各眼球の外面を再度トリミングして、視神経と小さな破片を取り除きます(図1B)。ハサミを使って辺縁と強膜の交点に小さな切り込みを入れ、角膜、虹彩、水晶体、硝子体、神経網膜を取り除きます(これらの組織の詳細な構造については、 図1を参照してください)。
- RPE-脈絡膜-強膜複合体を新しい10 cmの細胞培養皿に移し、4つの切り込みを入れて、四つ葉のクローバーの形にアイカップを平らにします(図1C)。
- 4つのRPE-脈絡膜-強膜複合体を新しい10 cmディッシュに入れて、トリプシン/EDTA溶液消化を実行します。RPE-脈絡膜-強膜複合体を融合させるために20 mLの新しいトリプシン/EDTA溶液を注ぎ、ディッシュを37°Cの細胞培養インキュベーターに~30分間入れます。
注:新鮮なトリプシン/ EDTA溶液を使用して、RPE細胞を解離します。インキュベーション時間が長くなる(30分以上)と、他の種類の細胞の汚染が増加する可能性があるため、トリプシン/EDTA溶液の消化時間を慎重に制御してください。
3. ブタ眼球RPE細胞の単離と培養
- RPE解離。
- トリプシン/EDTA溶液で30分間インキュベートした後、インキュベーターからディッシュを取り出し、20 mLの予熱した培地(10%FBSを含む)をディッシュに加えて、トリプシン/EDTA溶液を中和します。
メモ: このステップでは、DMEM/ベーシックメディアのみが使用されます。細胞がコンフルエントになったら、実験条件に応じて、DMEM/ベーシック培地、DMEM/F12培地、MEM-Nic培地の3つの培地を使用できます。 - 5 mLトランスファーピペットを使用して、数回穏やかにピペッティングしてRPE細胞を解離します。細胞懸濁液を15 mLの遠沈管に集めます。さらに10 mLの新鮮な培地(10%FBS)を使用して、できるだけ多くのRPE細胞を得るために穏やかにピペッティングして皿上のRPE-脈絡膜-強膜複合体を洗浄します。
注意: 細胞を激しく粉砕しすぎないでください。ピペットを約3 mL/sの速度で充填および空にしてください。細胞懸濁液を泡立てないでください。
- トリプシン/EDTA溶液で30分間インキュベートした後、インキュベーターからディッシュを取り出し、20 mLの予熱した培地(10%FBSを含む)をディッシュに加えて、トリプシン/EDTA溶液を中和します。
- チューブを200 x g で室温で5分間遠心分離することにより、RPE細胞を収集します。ピペットを使用して上清を吸引し、さらに5 mLの培養培地(10%FBS)を加えて細胞を再懸濁し、200 x g でさらに5分間遠心分離します。上清をデカントし、12 mLの培地で細胞を再懸濁します。
注:上清を吸引するときは、細胞塊の破壊を避けるために約1mLの培地を残してください。 - RPE細胞の播種。
- ~1-2 x 105 細胞/ウェルを12ウェル培養プレートまたはトランスウェルインサートに播種します。通常、約1.5 x 106 RPE細胞が4つのブタ眼球から得られます。2日ごとに培地を交換し、細胞がウェル/インサートの表面を完全に覆ったら、血清濃度を1%に下げます。
注:細胞が培養皿/インサートに付着する前に、細胞培養皿を頻繁に動かさないでください。
- ~1-2 x 105 細胞/ウェルを12ウェル培養プレートまたはトランスウェルインサートに播種します。通常、約1.5 x 106 RPE細胞が4つのブタ眼球から得られます。2日ごとに培地を交換し、細胞がウェル/インサートの表面を完全に覆ったら、血清濃度を1%に下げます。
- 細胞が回収されるまで、2日ごとに培地を交換してください。
注:細胞がコンフルエントに達した後にFBSの濃度を下げることができ、細胞を最大数ヶ月間培養して完全な分化と成熟を可能にすることができます。
4. 初代ブタRPE細胞のキャラクタリゼーション
- コンフルエントな状態で細胞を1週間または2週間培養し、さらに分析するために細胞を回収します。
- 定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)分析のために細胞を回収します。
- 培養液を取り出し、1 mLの冷たい1x PBSで細胞を洗浄し、次に500 μLのRNA抽出溶液を各ウェルに加えて、約1 x 106 細胞から細胞ライセートを収集します。
- mRNA13を抽出します。各サンプルから約4μgのRNAを抽出します。100 ngのmRNAを使用して逆転写を実行します14;定量的リアルタイムPCR分析のためにcDNAを40倍に希釈します。プライマーを 表1に記載する。
- 免疫蛍光染色のために細胞を回収します。
- 培養液を取り出し、1 mLの冷たい1x PBSで細胞を洗浄し、次に1x PBS中の500 μLの4%(w/v)パラホルムアルデヒドを加えて、室温で30分間細胞を固定します(約1 x 106 細胞/ウェル)。次に、1x PBSで細胞を2回洗浄し、一次抗体(1%(w/v)ウシ血清アルブミンを添加した1x PBSで1:100)を4°Cで一晩、二次抗体(1%(w/v)ウシ血清アルブミンを添加した1x PBSで1:200)で免疫蛍光染色をオンラインプロトコル15に従って室温で2時間行います。
- 免疫蛍光画像は、オンラインマニュアル16に従って共焦点顕微鏡によって取得されます。
- ウェスタンブロット分析のために細胞を回収します。
- 培養液を取り出し、冷たい1x PBSで細胞を2回洗浄した後、80 μLのRIPAバッファー(1x プロテアーゼ阻害剤を含む)を各ウェルに加え、セルスクレーパーを使用して、ディッシュ/インサートから約1 x 106 細胞をスクラッチします。
- 各ウェルから細胞ライセートを回収し、1.5 mLマイクロ遠心チューブに挿入します。細胞溶解物を10分間煮沸し、BCAキットを使用してタンパク質濃度を測定します。各サンプルのタンパク質濃度は約2 mg/mLです。各サンプルのタンパク質25 μgをオンラインプロトコル17に従ったウェスタンブロット分析に使用します。
- ウェスタンブロットの場合は、メンブレンを5 mLの一次抗体溶液(5%(w/v)ウシ血清アルブミンを添加した1x TBST溶液中の一次抗体の1:1,000希釈)中で、回転する多目的シェーカーで4°Cで一晩インキュベートします。
- 次に、使用した一次抗体の供給源に応じて、約15 mLの抗ウサギまたは抗マウス二次抗体溶液(5%(w/v)の無脂肪乳を添加した1x TBST溶液中の二次抗体の1:5,000希釈)で室温で2時間インキュベートします。
- 経上皮抵抗(TER)測定。
- 箸電極を70%エタノールで洗浄し、1x PBSを滅菌します。次に、電極の短い方の端をトランスウェルインサートの上部チャンバーに、長い方の端を下部チャンバーに配置し、上皮電圧計のボタンをクリックして測定します。各ウェルのTER測定値をトリプリケートで記録します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
初代ブタRPE(pRPE)細胞を10%FBSを含むDMEM/ベーシック培地で培養し、播種後2日目(図2A)、6日目(図2B)、および10日目(図2C)に光学顕微鏡下で細胞形態を撮影しました。1週間後、石畳の形態を有する色素性pRPE細胞のコンフルエント単層が観察された。
初代pRPE細胞をよりよく特徴付けるために、継代3(P3)18の初代ヒトRPE細胞(hRPE)およびARPE-19細胞をDMEM/ベーシック培地で1%FBSで別の週で培養し、培養細胞の総mRNAおよびタンパク質、ならびにブタRPE/脈絡膜組織を採取した。成熟RPEの主要な特性遺伝子19およびタンパク質マーカーの発現レベルを、qRT-PCRおよびウェスタンブロットによって評価した。ARPE-19細胞と比較して、pRPE細胞は、天然RPE分泌(図3A(c))、食作用(図3A(i))、輸送(図3A(a)、(d))、タイトジャンクション(図3A(j))、バリア形成(図3A(b))、および視覚周期(図3A(e)、B)で機能する遺伝子の有意に高い発現レベルを保持しました。しかし、RPEの2つの細胞骨格マーカー遺伝子であるKrt8およびKrt18の発現レベルは、初代hRPEおよびARPE-19細胞と比較して、初代pRPE細胞で有意に低かった(図3A(g),(h))。さらに、食作用に関与するitgavは、初代pRPE細胞でも低かった(図3A(f))。pRPE細胞におけるこれら3つの遺伝子の発現レベルはブタRPE/脈絡膜組織と類似していたことから、これは種間の遺伝子発現の違いを示している可能性があります。さらに、メラニン産生に関与するTyrの発現量は、初代pRPE細胞とhRPE細胞の両方で大幅に減少しており(図3A(k))、長期培養細胞での色素沈着の喪失を説明している可能性があります。ヒトpRPE細胞とブタpRPE細胞のデータで観察されたqRT-PCR結果の相違は、ヒトpRPEの保存期間が長く、継代数(P3)が高いためである可能性があり、継代培養でRPE特性が失われることを示しています。さらに、ウェスタンブロットでは、RPE細胞を特徴とする視覚サイクルの重要な酵素であるRPE65タンパク質がpRPE細胞で発現しているのに対し、初代hRPE細胞とARPE-19細胞ではその発現量が大幅に低下していることが示されました(図3B、C)。
RPE細胞の極性とバリア機能をさらに特徴付けるために、pRPE細胞とARPE-19細胞のコンフルエント単層を、DMEM/Basic、DMEM/F12、およびMEM-Nic培地を用いたトランスウェルインサートで1週間培養しました(図4)。これらの培養条件下で、Na+-K+-ATPアーゼ(図4A-F)およびZO-1(図4G-L)の蛍光染色の結果、pRPE細胞はARPE-19細胞よりもNa+-K+-ATPアーゼおよびZO-1の両方の発現レベルが高いことが明らかになりました。pRPE細胞の頂端表面と基底面でのNa+-K+-ATPaseの均等な分布は、in vitroで細胞極性を回復するためにより長い培養時間が必要であることを示しました。
RPEは、その頂端表面近くにタイトジャンクションを形成し、網膜内膜と脈絡膜との間の代謝産物の交換を厳密に調節する20。ZO-1染色は、タイトジャンクションタンパク質は通常、規則的な石畳の形態を持つ初代pRPE細胞の原形質膜に局在するが、ARPE-19細胞には局在しないことを示唆した。3つの培地の中で、DMEM/Basicで培養した細胞では最良のZO-1染色パターンが観察されましたが、DMEM/F12はpRPE細胞の石畳の形態を維持できませんでした。より高いTER値は、RPEセル21のタイトジャンクション形成およびより良いバリア機能の指標として役立つ。タイトジャンクションの機能を確認するために、経上皮抵抗(TER)を測定しました。ただし、空のトランスウェルインサートと比較してわずかに高いTERしか検出されませんでした(図4M、N)。
網膜では、ブルッフ膜はRPEと脈絡膜の間に存在します。ブルッフ膜の主成分は、IV型コラーゲン、プロテオグリカン、およびラミニン22です。RPEに対するブルッフ膜の支持効果をシミュレートするために、ラミニンをトランスウェル膜の表面に広げて、培養RPE細胞の成熟を促進しました。図4から得られた結果に基づいて、コンフルエントなpRPE細胞をDMEM/ベーシック培地のトランスウェルインサート上で1%FBSで2週間培養しました。免疫蛍光染色の結果、RPE特異的タンパク質RPE65がすべてのpRPE細胞で発現していることが示されました(図5A、B)。Na+-K+-ATPaseはpRPE細胞の頂端表面に分布しており、細胞極性の再確立を示唆しています(図5C、D)。ZO-1染色とTERの両方の結果は、ラミニン上で培養した場合、初代pRPE細胞でタイトジャンクションが良好に形成されたことを示しました(図5E、F、H)。図5Gは、ヘキスト色素で染色された細胞を描いている。
さらに、ウェスタンブロットは、pRPE細胞とARPE-19細胞の両方が色素上皮由来因子(PEDF)および血管内皮増殖因子(VEGF)を含む成長因子を産生することを実証しました(図6A)。コンフルエントな単分子膜pRPEをDMEM/Basic、DMEM/F12、およびMEM-Nic培地を含むトランスウェルインサートで1週間培養した後、トランスウェルインサートの上部および下部チャンバーから培養液を回収し、分泌されたVEGFをELISAで定量しました。DMEM/Basic培地およびMEM-Nic培地を細胞培養に用いた場合、pPRE細胞はDMEM/F12培地中の細胞よりも多くのVEGFを分泌しました(図6B)。ただし、すべてのテスト条件で、トランスウェルインサートの上部チャンバーと下部チャンバーの間でVEGF量に差は検出されませんでした(図6B)。さらに、初代pRPE細胞をラミニンでコーティングしたインサートとDMEM/ベーシック培地で2週間培養した後、上部および下部のチャンバーから培地を回収しました。ウェスタンブロット分析では、上部チャンバーの方が下部チャンバーよりも高いレベルのPEDFが示されましたが、分泌されたVEGFのタンパク質レベルは両方のチャンバーで類似していました(図6C)。これらの結果は、初代pRPE細胞がラミニン上でコンフルエントに達した後、さらに2週間培養した場合の細胞極性の再確立をさらに支持した。
図1:pRPE細胞単離の基本ステップ 。 (A)ブタの眼球を50 mL滅菌遠心チューブで1x PBSで洗浄します。(B,C)酵素消化のためにRPE-脈絡膜-強膜複合体を準備します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:細胞培養後の初代pRPE細胞の形態。 (A)2日目、(B)6日目、および(C)10日目における初代pRPE細胞の代表的な画像。スケールバー250μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:培養RPE細胞における重要なシグネチャ遺伝子およびタンパク質の発現レベル。 (A)初代pRPE細胞、初代hRPE細胞、ARPE-19細胞、およびpRPE/脈絡膜組織におけるシグネチャ遺伝子のmRNAレベルのqRT-PCR分析。ギャップドは、qRT-PCRのハウスキーピング遺伝子として使用されました。初代pRPE細胞とARPE-19細胞には4つの生物学的複製を使用し、初代hRPE細胞とpRPE/脈絡膜組織には3つの生物学的複製を使用しました。ARPE−19細胞における遺伝子発現レベルを対照として設定した。(B)ARPE-19およびpRPE細胞におけるRPE65タンパク質のウェスタンブロット解析。ビンキュリンはローディングコントロールとして使用されました。(C)初代hRPE細胞およびpRPE/脈絡膜組織におけるRPE65タンパク質のウェスタンブロット解析。ビンキュリンはローディングコントロールとして使用されました。比較のために、スチューデントt検定、*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001を使用しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:DMEM/Basic、DMEM/F12、およびMEM-Nic培地で1%FBSを用いた初代pRPEおよびARPE-19細胞のワンウィック培養。 (A)DMEM/Basic培地中の初代pRPE細胞のNa+-K+-ATPase蛍光染色(赤色)、(B)DMEM/F12、および(C)MEM-Nic培地。(D)DMEM/ベーシック培地、(E)DMEM/F12培地、および(F)MEM-Nic培地中のARPE-19細胞のNa+-K+-ATPase蛍光染色(赤色)。(G)DMEM/ベーシック培地、(H)DMEM/F12培地、および(I)MEM-Nic培地中の初代pRPE細胞のZO-1蛍光染色(緑色)。(J)DMEM/ベーシック培地中のARPE-19細胞におけるZO-1蛍光染色(緑色)、(K)DMEM/F12培地、および(L)MEM-Nic培地。初代pRPE(M)およびARPE-19(N)細胞をDMEM/Basic、DMEM/F12、およびMEM-Nic培地で1週間培養した後のTER測定。細胞の種類ごとに、少なくとも3つの異なるウェルからデータが得られた。比較のために、学生のt検定、*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001を使用しました。スケールバー50μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:1%FBSを含むDMEM/ベーシック培地でのpRPE細胞の2週間培養。 (A-F)ラミニンの有無にかかわらず培養した細胞をRPE65(A、B、赤)、Na+-K+-ATPアーゼ(C、D、赤)、ZO-1(E、F、緑)、および(G)ヘキスト(青)で染色しました。(h)ラミニンの有無にかかわらず培養した細胞シートにおけるTER測定。異なる処理について、データは4つの異なるウェルから得られた。比較のために、学生のt検定、*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001を使用しました。スケールバー = 50 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:培養初代pRPE細胞およびARPE-19細胞の分泌機能。 (A)初代pRPEおよびARPE-19細胞におけるVEGFおよびPEDFのウェスタンブロット解析。(B)コンフルエント細胞をDMEM/Basic、DMEM/F12、およびMEM-Nic培地で1週間培養した場合、初代pRPE細胞を含むトランスウェルインサートの上部および下部チャンバーにVEGFが分泌されました。 (C)DMEM/ベーシック培地中の一次pRPEを含むトランスウェルインサートの上部および下部チャンバーで2週間分泌されたPEDFおよびVEGF。異なる処理について、データは3つの異なるウェルから得られた。比較のために、スチューデントt検定、*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001を使用しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| ホモサピエンス | サス・スクロファ | |
| ベスト1 | F: ガッガ | F: GGACACCTGTATGCCTACGA |
| R: TCCAACTGCTTGTGTTCTGC | R: GGAACGTGAAGAGGGGTACA | |
| Cldn19 | F: GGTGACCCAGGAGTTCTTCA | F: TCGTGACCCAGGAGTTCTTC |
| R: CTGTTGGGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT | R: GCTGCTGTTGGATCGCTC | |
| イトガブ | F: CGCAGTCCCATCTCAAATCC | F: GCTTTCTTCAGGACGGAACA |
| R: GGCCCTGTATAAGATAGCTCGA | R: GAAATGAGCTGACCTTGCCA | |
| Krt8 | F: GGAGCAGATCAAGACCCA | F: CCCAGGAGAAGGAGCAGGATC |
| R: GCCGCCTAAGGTTGTTGATG | R: ATGTTGTCGATGTTGCTCCG | |
| Krt18 | F: CTTGGAGAAGAAGGGACCCC | F: GCTGATAATCGGAGGGGGA |
| R: GGCCAGCTCTGTCTCATACT | R: GAAGTCATCAGCAGCGGAC | |
| メルトク | F: GTGTGCAGCGTTCGTTCAGACAAT | F: GCGGCTATTTCTTGGTGGAA |
| R: AAAATGTTGACGGCTCAGG | R: ACGTAGATGGGGGGTCAGACAC | |
| セルピンフ1 | F: CAGATGAAAGGGAAGCTCGC | F: AAGACGTCGCTGGAGATTT |
| R: TTAGGGTCCGACATCATGGG | R: GGTCACTTTCAGAGGCAGGA | |
| SLC16a8 | F: GGGTGTCCTCCATGCTA | F: CAGTTCGAGGTGCTCATGG |
| R: GTCAGGTAGAGCTCCAGGAG | R: GACAGCCATGAAGACACCAG | |
| ストラ6 | F: CTTTGCAGGAAGAAGCTGGG | F: CTAGCCGTGTTGTCGATCCT |
| R: TAAATGGCCGTCCCTCTCAG | R: ガッカッガガガカグカグ | |
| Tjp1 | F: ACAGGAAAATGACCGAGTTGC | F: AAGACTTGTCAGCTCAGCCA |
| R: TGGTTCAGGATCAGGACGAC | R: CCAGCATCTCGAGGTTCACT | |
| ティル | F: ACTCAGCCCAGCATTCT | F: ATCTACTCAGCCCAGCATCC |
| R: ACATCAGCTGAAGAGGAG | R: GAGCCTTGGAGTCCTGGATT | |
| ギャップ | F: CAGCCTCAAGATCATCAGCA | F: CATCCTGGGCTACACTGAGG |
| R: ATGATGTTCTGGAGAGCCCC | R: GGGGCTCTTACTCCTTGGAG |
表 1: qRT-PCR用のプライマーです。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここでは、ブタ眼球からのRPE細胞の単離、培養、および特性評価のための詳細で最適化されたプロトコルが、RPE細胞のin vitro特性評価およびRPE関連障害研究のための優れたモデルを生成することが記載されている。ヒト、マウス、およびラットの眼からRPEを単離するための方法は、以前に記載されている23、24、25。しかし、一部の研究室では人間の眼球を入手することは困難であり、それは通常倫理的な問題を提起します。マウスとラットのRPE組織は比較的小さく、細胞は分離中に損傷を受けやすく、各動物から得られる細胞はごくわずかです。対照的に、ブタの眼球は入手と取り扱いがはるかに簡単で、単一の眼球から比較的多数の初代細胞を安定して生成することができます。いくつかの研究では、ピンセットを使用してRPEを機械的に分離し、細胞死に簡単につながる可能性があります。そのため、ヒアルロン酸、ディスパーゼ、トリプシン/EDTA溶液は、RPE細胞を解離させるために以前に使用されてきました。以前の研究では、トリプシン/ EDTA溶液には、RPEが脈絡膜21から分離するのを助ける能力があることが示されています。したがって、トリプシン/ EDTA溶液を使用してブタ組織を消化し、最適な結果を生成しました。トリプシン/EDTA神経化後、RPE組織は、ピペットチップで穏やかにピペッティングすることにより、単一細胞懸濁液に解離することができました。1つのトリックは、RPE細胞を完全に解離させるために、各実験に新鮮なトリプシン/ EDTA溶液を推奨することです。ブタ眼球のRPE組織の面積が大きいため、ハーフボウル型のRPE-脈絡膜-強膜複合体は、脈絡膜からの分離を容易にするために、RPE組織とトリプシン/ EDTA溶液との間の完全な接触を助長する四つ葉のクローバーの形状に切断する必要があります。ただし、消化時間は30分を超えてはいけません。この時間内に、RPE以外の他の組織は消化されないため、他の種類の細胞からの汚染を効果的に減らすことができます。
ラミニンは、RPEに対するブルッフ膜の支持効果をシミュレートするために、トランスウェル膜の表面に広げられました。結果は、ラミニンがトランスポーターとタイトジャンクションタンパク質の発現を刺激するpRPE細胞の増殖に有益であることを示しました。しかし、結果はまた、初代pRPE細胞が細胞の極性やタイトジャンクションを含む天然RPE組織の特定の特徴を回復するために、約2週間のより長い培養時間が必要であることを示しました。
初代RPE培養の欠点の1つは、 in vitroで視覚周期の酵素発現を維持することが困難であることです。したがって、培養RPE細胞がRPE特異的タンパク質RPE65を発現できるかどうかを調べることが重要です。ARPE-19細胞と比較して、pRPE細胞は有意に多くのRPE65タンパク質を発現した。対照的に、ウェスタンブロットのARPE-19細胞ライセートでは、RPE65タンパク質の弱いバンドのみが観察されました。RPE65の分子量がヒトとブタでわずかに異なっていることを観察するのは興味深いことです(図3B、C)。培養RPE細胞におけるRPE65発現の喪失は謎のままです。培養初代細胞においても、RPE65は継代とともに徐々に消失した(データ示さず)。これまで、RPE65の発現を in vitroで 維持する方法は、視覚周期が天然RPE組織にとって重要な機能であるという事実を考慮して、さらなる研究が必要である。第二に、このプロトコルの主な制限は、 in vitro 培養RPE細胞を継代できないことです。長期間の培養では、pRPE細胞は色素沈着だけでなく六角形やTERも失う傾向があり、継代0細胞しか使用できません。この培養プロトコルのもう一つの制限は、遺伝性網膜疾患につながる遺伝子変異がこれらの細胞で再現するのが難しいことです。したがって、ウイルスを介した遺伝子編集は、将来的にLeger先天性無力症などの遺伝性RPE障害を研究するために採用される可能性があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
すべての著者は、利益相反がないことを明らかにしました。
すべての著者は、競合する経済的利益を宣言していません。
Acknowledgments
著者らは、この研究で細胞に貢献しているすべての動物に感謝と敬意を表したいと思います。この研究の一部は、中国の国家重点研究開発プログラム(2019YFA0111200、Yi Liao & Yuan Gao、およびGrant nos. 2018YFA0107301、Wei Li)からの助成金によって支援されました。著者らは、共焦点イメージングの技術サポートを提供してくれた厦門大学医学部中央研究所のJingru HuangとXiang Youに感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ARPE-19 cells | CCTCC | GDC0323 | |
| Bovine serum albumin | Yeasen | 36101ES60 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM 880 with Airyscan | |
| ChemiDoc Touch | Bio-Rad | 1708370 | |
| Cell scraper | Sangon | F619301 | |
| 10 cm culture dish | NEST | 121621EH01 | |
| 12-well culture plate | NEST | 29821075P | |
| DMEM F12 Medium | Gibco | C11330500BT | |
| DMEM basic Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EVOM2 | World Precision Instruments | EVOM2 | For TER measurement |
| Fetal bovine serum | ExCell Bio | FSP500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 0300-0108P | |
| Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 5196-2504 | |
| hydrocortisone | MCE | HY-N0583/CS-2226 | |
| Hoechst 33342 solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| LightCycler 96 Instrument | Roche | 5815916001 | |
| Liothyronine | MCE | HY-A0070A/CS-4141 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| MEM(1X)+GlutaMAX Medium | Gibco | 10566-016 | |
| MEM NEAA(100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Millex-GP syringe filter unit | Millipore | SLGPR33RB | |
| N1 | Sigma-Aldrich | SLCF4683 | |
| NcmECL Ultra | New Cell&Molecular Biotech | P10300 | |
| Non-fat Powdered Milk | Solarbio | D8340 | |
| Nicotinamide | SparkJade | SJ-MV0061 | |
| Na+-K+ ATPase antibody | Abcam | ab76020 | Recognize both human and porcine proteins |
| PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%) | Epizyme | PG112 | |
| primary Human RPE cells | - | - | Generous gift from Shoubi Wang lab |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Prism | GraphPad by Dotmatics | version 8.0 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | APExBIO | K1024 | |
| PRE65 antibody | Proteintech | 17939-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| PEDF antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-390172 | Recognize both human and porcine proteins |
| 100 x penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-031-1BCS | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | RARBIO | RA-9005 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | Toyobo | FSQ-201 | |
| RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 601052 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 602052 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Taurine | Damas-beta | 107-35-7 | |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | RNA extraction solution |
| TB Green Fast qPCR Mix | Takara | RR430A | |
| 12-well transwell inserts | Labselect | 14212 | |
| VEGF antibody | Proteintech | 19003-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| VEGF ELISA kit | Novusbio | VAL106 | |
| ZO-1 antibody | ABclonal | A0659 | Recognize both human and porcine proteins |
References
- Tan, L. X., Germer, C. J., La Cunza, N., Lakkaraju, A. Complement activation, lipid metabolism, and mitochondrial injury: Converging pathways in age-related macular degeneration. Redox Biology. 37, 101781 (2020).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Ducloyer, J. B., Le Meur, G., Cronin, T., Adjali, O., Weber, M. Gene therapy for retinitis pigmentosa. Medecine Sciences. 36 (6-7), 607-615 (2020).
- den Hollander, A. I., Roepman, R., Koenekoop, R. K., Cremers, F. P. Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 391-419 (2008).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Smith, D. T. Melanin pigment in the pigmented epithelium of the retina of the embryo chick eye studied in vivo and in vino. The Anatomical Record. 18, 260-261 (1920).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- D'Antonio-Chronowska, A., D'Antonio, M., Frazer, K. A. In vitro differentiation of human iPSC-derived retinal pigment epithelium cells (iPSC-RPE). Bio-Protocol. 9 (24), 3469 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- Scientific, T. , Available from: https://www.thermofisher.cn/document-connect/document connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2Ftrizol_reagent.pdf (2022).
- Toyota. , Available from: https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf (2022).
- Abcam. , Available from: https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol (2022).
- Zeiss. , Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals (2022).
- Cell Signal Technology. , Available from: https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western (2022).
- Wang, S., et al. Reversed senescence of retinal pigment epithelial cell by coculture with embryonic stem cell via the TGFbeta and PI3K pathways. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 588050 (2020).
- Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Experimental Eye Research. 126, 1-4 (2014).
- Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Experimental Eye Research. 126, 5-15 (2014).
- Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. Physiology and function of the tight junction. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002584 (2009).
- Nita, M., Strzalka-Mrozik, B., Grzybowski, A., Mazurek, U., Romaniuk, W. Age-related macular degeneration and changes in the extracellular matrix. Medical Science Monitor. 20, 1003-1016 (2014).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Langenfeld, A., Julien, S., Schraermeyer, U. An improved method for the isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult rats. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1493-1502 (2015).
- Sonoda, S. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
