Summary
여기서, 시험 관 내에서 일차 돼지 망막 색소 상피세포를 배양하는 방법을 제시한다.
Abstract
망막 색소 상피 (RPE)는 망막의 맥락막과 신경 망막 사이에 위치한 편광 색소 상피 세포의 단층입니다. 식균 작용, 영양소/대사 산물 수송, 비타민 A 대사 등을 포함한 여러 기능이 RPE에 의해 매일 수행됩니다. RPE 세포는 재생 능력이 거의 또는 전혀 없는 말기 분화된 상피 세포입니다. RPE 세포의 손실은 연령 관련 황반 변성과 같은 시각 장애로 이어지는 여러 안과 질환을 초래합니다. 따라서 세포주보다 RPE in vivo와 더 유사한 1차 RPE 세포의 시험관 내 배양 모델을 구축하는 것은 RPE 세포의 특성 및 기계론적 연구에 매우 중요합니다. 인간의 안구의 공급원이 제한적이라는 사실을 고려하여 우리는 1 차 돼지 RPE 세포를 배양하기위한 프로토콜을 만듭니다. 이 프로토콜을 사용하면 RPE 세포를 성인 돼지 안구에서 쉽게 분리 할 수 있습니다. 그 후, 이러한 해리된 세포는 배양 접시/삽입물에 부착되고, 증식하여 합류 단층을 형성하고, 2주 이내에 생체 내 상피 조직의 주요 특징을 빠르게 재설정합니다. qRT-PCR에 의해, 1차 돼지 RPE 세포는 천연 RPE 조직과 유사한 수준에서 여러 시그니처 유전자를 발현하는 반면, 이러한 유전자의 대부분은 인간 RPE 유사 세포인 ARPE-19에서 손실/고도로 감소한다는 것이 입증되었습니다. 또한 면역형광 염색은 배양된 일차 세포에서 긴밀한 접합, 조직 극성 및 세포골격 단백질의 분포와 비타민 A 대사에 중요한 이성질화효소인 RPE65의 존재를 보여줍니다. 전체적으로 우리는 고순도 및 천연 RPE 기능을 가진 1차 돼지 RPE 세포 배양에 대한 따라하기 쉬운 접근 방식을 개발했으며, 이는 RPE 생리학을 이해하고 세포 독성을 연구하며 약물 스크리닝을 용이하게 하는 좋은 모델이 될 수 있습니다.
Introduction
망막 색소 상피(RPE)는 망막1 외층의 광수용체와 맥락모세혈관 사이에 위치하며, 혈액-망막 장벽 형성, 영양소 및 망막 대사산물 운반 및 교환, 정상적인 시각 주기를 유지하기 위한 비타민 A 재활용, 식균작용 및 흘린 광수용체 외부 분절(POS)의 제거를 포함한 여러기능을 수행합니다.2,3 . POS는 시력을 생성하기 위해 지속적인자가 갱신이 필요하기 때문에 RPE 세포는 망막 항상성을 유지하기 위해 분리 된 POS를 지속적으로 삼켜야합니다4. 따라서 RPE 기능 장애는 연령 관련 황반 변성(AMD)4, 색소성 망막염(RP)5, Leber 선천성 무균증6, 당뇨병성 망막증7 등과 같은 많은 실명 안과 질환을 유발합니다. 지금까지 이러한 질병의 정확한 발병 기전은 아직 파악하기 어렵습니다. 결과적으로 RPE 세포 생물학, 병리학적 변화 및 기본 메커니즘을 연구하기 위해 RPE 세포 배양이 확립되었습니다.
세포 생물학을 연구하는 가장 간단한 모델로서, RPE 세포의 배양은 이미 1920년대에 시작되었다8. ARPE-19가 RPE 세포로서 널리 사용되고 있지만, 색소 침착, 조약돌 형태, 특히 이 세포주의 장벽 기능의 손실은많은 우려를 불러일으킨다9. 이에 비해, 일차 인간 RPE 세포의 배양은 생리학적 및 병리학적 연구를 위한 보다 현실적인 시나리오를 제공한다9. 그러나 상대적으로 제한된 가용성으로 인해 사용이 제한되고 윤리적 문제가 항상 존재합니다. 또한 여러 그룹이 마우스 모델을 사용하여 RPE 세포를 배양했습니다. 그러나 마우스 눈의 크기가 작고 단일 배양에는 일반적으로 많은 마우스가 필요하므로 편리하지 않습니다9. 최근 과학자들은 인간 배아 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포를 사용하여 RPE 세포를 유도하는 새로운 방법을 개발했습니다. 비록 이 기술이 유전된 RPE 장애의 치료를 위한 특별한 잠재력을 갖지만, 이는 시간이 많이 걸리고 보통 성숙한 RPE 세포(10)를 생성하는데 수개월이 필요하다. 이러한 문제를 극복하기 위해 실험실에서 고순도 RPE 세포를 일상적으로 분리하고 배양하는 따라하기 쉬운 프로토콜을 소개합니다. 적절한 배양 조건 하에서, 이들 세포는 전형적인 RPE 기능을 나타내고 전형적인 RPE 형태를 나타낼 수 있다. 따라서이 배양 방법은 RPE 생리학을 이해하고, 세포 독성을 연구하고, 관련 안구 질환의 병리학 적 메커니즘을 조사하고, 약물 스크리닝을 수행하는 좋은 모델을 제공 할 수 있습니다.
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Protocol
실험 동물의 사용은 시력 및 안과 연구 협회 (ARVO)의 규정을 준수했으며 샤먼 대학교 실험 동물 관리 윤리위원회의 승인을 받았습니다.
1. 실험용 수술기구, 조직소화효소, 세포배양액의 제조
- 안구 해부 전날 두 쌍의 안과 수술 가위와 집게를 세척 및 고압 멸균 한 다음 일반 프로토콜 오븐에서 65 ° C의 밤새 수술 장치로 상자를 건조시켜 실험 수술 장치를 준비합니다.
- 문화 미디어 준비.
- 10%(v/v) 소 태아 혈청, 2mM L-글루타민, 1%(v/v) 페니실린(100U/mL) 및 스트렙토마이신(100U/mL)이 보충된 DMEM/Basic 배지를 준비합니다.
- 1%(v/v) FBS, 1%(v/v) 페니실린(100U/mL) 및 스트렙토마이신(100U/mL)이 보충된 DMEM/F12 배지를 준비합니다.
- MEM 알파에 2 mM L- 글루타민, 1 % FBS, 1 % (v / v) 페니실린 (100 U / mL) 및 스트렙토 마이신 (100 U / mL), 0.1 mM NEAA, 1 % (v / v) N1 보충제, 타우린 (0.25 mg / mL), 하이드로 코르티손 (20 ng / mL), 트리 요오도 - 티로닌 (0.013 ng / mL) 및 10 mM 니코틴 아미드.
참고: 세포 생존력과 증식을 개선하기 위해 FBS의 비율을 20%로 증가시켜 소화 효소를 중화하고 해리된 세포를 시드할 수 있습니다. 장기 세포 배양의 경우 FBS의 비율을 1%12까지 낮출 수 있습니다.
- 실험 중에 조직 소화 효소 분취량(0.91mM EDTA가 보충된 0.25%(w/v) 트립신/EDTA 용액, 이하 트립신/EDTA 용액이라고 함)을 해동합니다.
알림: 최적의 결과를 얻으려면 매번 신선한 트립신 / EDTA 용액을 사용해야합니다. 신선한 트립신/EDTA 용액 10mL를 각 15mL 멸균 원심분리 튜브에 분취하고 사용할 때까지 -20°C 냉장고에서 분취량을 동결합니다. - 해부 솔루션.
- 0.22μm 주사기 필터 장치를 통해 용액을 여과하여 2%(v/v) 페니실린(100U/mL) 및 스트렙토마이신(100U/mL)이 보충된 1x 인산완충식염수(PBS)(pH 7.2)를 멸균합니다.
- 배양 플레이트와 트랜스웰 인서트를 코팅합니다.
- 웰과 트랜스웰 인서트를 1x PBS로 세척합니다. 피펫으로 웰과 트랜스웰에서 PBS를 제거한 다음 하부 챔버에 1mL의 새로운 1x PBS를 추가하고 상부 챔버에 10μg/mL의 라미닌 용액 600μL를 추가합니다.
- 플레이트/트랜스웰 삽입물을 세포 배양 인큐베이터에서 37°C 및 5%CO2에서 밤새 배양합니다. 상부 챔버에서 라미닌 용액을 제거하고 세포를 파종하기 전에 차가운 1x PBS 1mL로 두 번 세척합니다.
2. 돼지 안구 RPE 세포의 해부
- 악기 준비.
- 층류 후드를 75% 에탄올과 자외선으로 청소하십시오. ~25mL의 75% 에탄올을 포함하는 3개의 50mL 멸균 원심분리 튜브, ~25mL의 1x PBS를 포함하는 3개의 50mL 멸균 원심분리 튜브 및 ~15mL의 1x PBS가 포함된 3개의 10cm 멸균 세포 배양 접시를 준비합니다.
알림: 이 설정은 일반적으로 4개의 돼지 안구를 해부하는 데 사용됩니다. 더 많은 안구가 사용될 때 확장하십시오. 세포 생존율을 높이려면 얼음에서 1x PBS 버퍼를 최소 30분 동안 예냉각합니다. 75% 에탄올과 자외선은 실험 기기와 세포가 오염되지 않도록 하는 데 필요합니다. UV 램프를 미리 켜서 전체 작업 테이블을 최소 15분 동안 소독하십시오.
- 층류 후드를 75% 에탄올과 자외선으로 청소하십시오. ~25mL의 75% 에탄올을 포함하는 3개의 50mL 멸균 원심분리 튜브, ~25mL의 1x PBS를 포함하는 3개의 50mL 멸균 원심분리 튜브 및 ~15mL의 1x PBS가 포함된 3개의 10cm 멸균 세포 배양 접시를 준비합니다.
- 돼지 눈알을 청소하십시오.
- 도살장에서 신선한 안구를 얻어 해부 할 때까지 얼음 위에 보관하십시오. 10cm 페트리 접시에 돼지 안구 15 ~ 75mL의 75 mL에 돼지 안구 4 개를 담그고 가위와 집게를 사용하여 모든 잔류 결합 조직과 근육을 잘라냅니다.
알림: 오염을 줄이기 위해 공막 외부에서 가능한 한 많은 조직을 제거하십시오. 오염 제거 및 세척 단계에서 안구의 이동을 용이하게하기 위해이 때 시신경을 절단하지 마십시오. 이 단계 후에 모든 절차는 층류 후드에서 수행해야합니다.
- 도살장에서 신선한 안구를 얻어 해부 할 때까지 얼음 위에 보관하십시오. 10cm 페트리 접시에 돼지 안구 15 ~ 75mL의 75 mL에 돼지 안구 4 개를 담그고 가위와 집게를 사용하여 모든 잔류 결합 조직과 근육을 잘라냅니다.
- 75 % 에탄올로 채워진 3 개의 50mL 멸균 원심 분리 튜브에 4 개의 돼지 안구를 담그고 세척하여 돼지 안구의 오염을 제거합니다. 각 안구는 각 튜브에 최소 5 분 동안 담근다. 다음으로, 1x PBS로 채워진 3 개의 50mL 멸균 원심 분리 튜브에서 돼지 안구를 순차적으로 세척하십시오. 각 튜브에서 최소 5분 동안 각 안구를 세척합니다(그림 1A). 매분마다 튜브를 뒤집어 안구를 철저히 씻으십시오.
- 돼지 안구의 해부.
- 4개의 돼지 안구를 1x PBS가 포함된 10cm 멸균 세포 배양 접시에 옮깁니다. 각 안구의 외부 표면을 다시 다듬어 시신경과 작은 파편을 제거합니다(그림 1B). 가위를 사용하여 윤부와 공막의 교차점에서 작은 절단을 한 다음 각막, 홍채, 수정체, 유리체 및 신경 망막을 제거합니다 (이러한 조직의 자세한 구조는 그림 1 참조).
- RPE-맥락막-공막 복합체를 새로운 10cm 세포 배양 접시에 옮기고 네 잎 클로버 모양의 아이컵을 평평하게 하기 위해 네 번 자릅니다(그림 1C).
- 4개의 RPE-맥락막-공막 복합체를 새로운 10cm 접시에 넣어 트립신/EDTA 용액 분해를 수행합니다. RPE-맥락막-공막 복합체를 병합하기 위해 신선한 트립신/EDTA 용액 20mL를 붓고 접시를 37°C의 세포 배양 인큐베이터에 ~30분 동안 넣습니다.
알림: 새로운 트립신 / EDTA 용액을 사용하여 RPE 세포를 해리하십시오. 배양 시간이 길어지면 (30 분 이상) 다른 유형의 세포의 오염이 증가 할 수 있으므로 트립신 / EDTA 용액 분해 시간을 조심스럽게 제어하십시오.
3. 돼지 안구 RPE 세포의 분리 및 배양
- RPE 해리.
- 트립신/EDTA 용액으로 30분 배양한 후 인큐베이터에서 접시를 꺼내고 20mL의 예열된 배양 배지(10% FBS 포함)를 접시에 추가하여 트립신/EDTA 용액을 중화합니다.
참고: 이 단계에서는 DMEM/기본 미디어만 사용됩니다. 세포가 컨플루언스에 도달하면 실험 조건에 따라 DMEM/기본 배지, DMEM/F12 배지 및 MEM-Nic 배지의 세 가지 배양 배지를 사용할 수 있습니다. - 5mL 이송 피펫을 사용하여 여러 번 부드럽게 피펫팅하여 RPE 세포를 해리합니다. 세포 현탁액을 15mL 원심분리 튜브에 수집합니다. 또 다른 10mL의 신선한 배양 배지(10% FBS)를 사용하여 가능한 한 많은 RPE 세포를 얻기 위해 부드럽게 피펫팅하여 접시에 있는 RPE-맥락막-공막 복합체를 세척합니다.
알림: 세포를 너무 세게 분쇄하지 마십시오. 약 3mL/s의 속도로 피펫을 채우고 비우십시오. 세포 현탁액이 버블링되지 않도록 하십시오.
- 트립신/EDTA 용액으로 30분 배양한 후 인큐베이터에서 접시를 꺼내고 20mL의 예열된 배양 배지(10% FBS 포함)를 접시에 추가하여 트립신/EDTA 용액을 중화합니다.
- 실온에서 5분 동안 튜브를 200 x g 로 원심분리하여 RPE 세포를 수집합니다. 피펫을 사용하여 상청액을 흡입하고 배양 배지 5mL(10% FBS)를 추가로 추가하여 세포를 재현탁하고 200 x g 에서 5분 더 원심분리합니다. 상청액을 따라 내고 12mL의 배양 배지로 세포를 재현탁시킵니다.
알림: 상청액을 흡인할 때 세포 덩어리가 부서지지 않도록 약 1mL의 배지를 남겨 두십시오. - RPE 세포 파종.
- ~1-2 x 105 세포/웰을 12웰 배양 플레이트 또는 트랜스웰 삽입물에 시드합니다. 보통, 약 1.5 x 106 RPE 세포는 4개의 돼지 안구로부터 얻어진다. 2일마다 배양 배지를 교체하고 세포가 웰/삽입물의 표면을 완전히 덮을 때 혈청 농도를 1%로 줄입니다.
알림: 세포가 배양 접시/삽입물에 부착되기 전에 세포 배양 접시를 너무 자주 움직이지 마십시오.
- ~1-2 x 105 세포/웰을 12웰 배양 플레이트 또는 트랜스웰 삽입물에 시드합니다. 보통, 약 1.5 x 106 RPE 세포는 4개의 돼지 안구로부터 얻어진다. 2일마다 배양 배지를 교체하고 세포가 웰/삽입물의 표면을 완전히 덮을 때 혈청 농도를 1%로 줄입니다.
- 세포가 수확 될 때까지 2 일마다 배양 배지를 교체하십시오.
참고: FBS의 농도는 세포가 컨플루언스에 도달한 후 감소될 수 있으며 세포는 완전한 분화 및 성숙을 허용하기 위해 최대 몇 개월 동안 배양될 수 있습니다.
4. 1차 돼지 RPE 세포의 특성 분석
- 세포를 1 또는 2 wks의 컨플루언시에서 배양한 다음, 추가 분석을 위해 세포를 수확한다.
- 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR) 분석을 위해 세포를 수확합니다.
- 배양 배지를 제거하고, 세포를 차가운 1x PBS 1mL로 세척한 다음, 각 웰에 RNA 추출 용액 500μL를 첨가하여 약 1 x 106 세포로부터 세포 용해물을 수집하였다.
- mRNA13 추출; 각 샘플에서 약 4μg의 RNA가 추출됩니다. 100ng의 mRNA를 사용하여 역전사14를 수행하십시오. 정량적 실시간 PCR 분석을 위해 cDNA를 40배 희석합니다. 프라이머는 표 1에 열거되어 있다.
- 면역형광염색을 위한 세포 수확.
- 배양 배지를 제거하고 차가운 1x PBS 1mL로 세포를 세척한 다음 1x PBS에 4%(w/v) 파라포름알데히드 500μL를 추가하여 실온에서 30분 동안 세포(약 1 x 106 세포/웰)를 고정합니다. 그런 다음 세포를 1x PBS로 2회 세척하고 온라인 프로토콜 15에 따라 실온에서 2시간 동안 실온에서 2시간 동안 1차 항체(1%(w/v) 소 혈청 알부민이 보충된 1x PBS에서 1:100) 및 2차 항체(1%(w/v) 소 혈청 알부민이 보충된1x PBS에서 1:200)로 면역형광 염색을 수행합니다.
- 면역형광 이미지는 온라인 매뉴얼16에 따라 컨포칼 현미경으로 획득됩니다.
- 웨스턴 블롯 분석을 위한 세포 수확.
- 배양 배지를 제거하고 차가운 1x PBS로 세포를 두 번 씻은 다음 80μL의 RIPA 완충액(1x 프로테아제 억제제 포함)을 각 웰에 추가하고 세포 스크레이퍼를 사용하여 접시/삽입물에서 약 1 x 106 세포를 긁습니다.
- 각 웰에서 세포 용해물을 수집하거나 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 삽입합니다. 세포 용해물을 10분 동안 끓인 다음 BCA 키트를 사용하여 단백질 농도를 측정합니다. 각 샘플의 단백질 농도는 약 2mg/mL입니다. 온라인 프로토콜17에 따라 웨스턴 블롯 분석을 위해 각 샘플의 단백질 25μg을 사용하십시오.
- 웨스턴 블롯의 경우, 멤브레인을 5mL의 1차 항체 용액(5%(w/v) 소 혈청 알부민이 보충된 1x TBST 용액에 1차 항체를 1:1,000 희석)에 회전하는 다목적 셰이커에서 밤새 4°C에서 배양합니다.
- 그런 다음 사용된 1차 항체의 공급원에 따라 약 15mL의 항토끼 또는 항마우스 2차 항체 용액(5%(w/v) 무지방 우유가 보충된 1x TBST 용액에 2차 항체 희석)으로 멤브레인을 오비탈 셰이커에서 2시간 동안 배양합니다.
- 경상피 저항(TER) 측정.
- 젓가락 전극을 70 % 에탄올과 멸균 된 1x PBS로 순차적으로 씻으십시오. 그런 다음 전극의 짧은 끝을 상단 챔버에 놓고 더 긴 끝을 트랜스웰 인서트의 하단 챔버에 놓고 측정을 위해 상피 전압계의 버튼을 클릭합니다. 각 웰의 TER 측정값을 삼중으로 기록합니다.
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Representative Results
1차 돼지 RPE(pRPE) 세포를 10% FBS가 있는 DMEM/Basic 배지에서 배양하고, 시딩 후 2일(그림 2A), 6일(그림 2B) 및 10일(그림 2C)에 광학 현미경으로 세포 형태를 촬영했습니다. 1주 후, 조약돌 형태를 갖는 착색된 pRPE 세포의 합류 단층이 관찰되었다.
1차 pRPE 세포의 특성을 더 잘 분석하기 위해, Passage 3(P3)18의 1차 인간 RPE 세포(hRPE) 및 ARPE-19 세포를 다른 wk에 대해 1% FBS를 사용하여 DMEM/Basic 배지에서 배양한 다음, 배양된 세포의 총 mRNA 및 단백질과 돼지 RPE/맥락막 조직을 수확했습니다. 주요 특징 유전자19 및 성숙한 RPE의 단백질 마커의 발현 수준을 qRT-PCR 및 웨스턴 블롯으로 평가하였다. ARPE-19 세포와 비교하여 pRPE 세포는 네이티브 RPE 분비(그림 3A(c)), 식균작용(그림 3A(i)), 수송(그림 3A(a),(d)), 단단한 접합(그림 3A(j)), 장벽 형성(그림 3A(b)) 및 시각적 주기(그림 3A(e),B)에서 기능하는 유전자의 발현 수준이 훨씬 더 높게 유지되었습니다. 그러나 RPE의 두 세포골격 마커 유전자인 Krt8 및 Krt18의 발현 수준은 1차 hRPE 및 ARPE-19 세포에 비해 1차 pRPE 세포에서 유의하게 낮았습니다(그림 3A(g),(h)). 또한, 식균작용에 참여하는 itgav는 1차 pRPE 세포에서도 더 낮았습니다(그림 3A(f)). pRPE 세포에서 이 세 유전자의 발현 수준이 돼지 RPE/맥락막 조직과 유사하기 때문에 이는 종 간의 유전자 발현 차이를 나타낼 수 있습니다. 또한, 멜라닌 생성을 담당하는 Tyr의 발현 수준은 일차 pRPE와 hRPE 세포 모두에서 매우 감소했으며(그림 3A(k)), 이는 장기 배양 세포에서 색소 침착의 손실을 설명할 수 있습니다. 인간 pRPE 및 돼지 pRPE 세포의 데이터에서 관찰된 qRT-PCR 결과의 차이점은, 인간 pRPE의 더 긴 저장 및 더 높은 계대 수(P3) 때문일 수 있으며, 따라서 계대 배양 시 RPE 문자의 손실을 나타냅니다. 또한 웨스턴 블롯은 RPE 세포를 특징으로 하는 시각적 주기의 핵심 효소인 RPE65 단백질이 pRPE 세포에서 발현된 반면 1차 hRPE 세포와 ARPE-19 세포에서는 발현 수준이 유의하게 감소한 것으로 나타났습니다(그림 3B,C).
RPE 세포의 극성 및 장벽 기능을 추가로 특성화하기 위해 pRPE 및 ARPE-19 세포의 배양된 합류 단층을 DMEM/기본, DMEM/F12 및 MEM-Nic 배지가 있는 트랜스웰 삽입물에서 1주 동안 배양했습니다(그림 4). 이러한 배양 조건에서 Na+-K+-ATPase(그림 4A-F) 및 ZO-1(그림 4G-L) 형광 염색 결과는 pRPE 세포가 ARPE-19 세포보다 Na+-K+-ATPase 및 ZO-1의 발현 수준이 더 높은 것으로 나타났습니다. pRPE 세포의 정점 및 기저 표면에서 Na+-K+-ATPase의 동일한 분포는 시험관 내에서 세포 극성을 복원하는 데 더 긴 배양 시간이 필요함을 나타냅니다.
RPE는 내부 망막과 맥락막 사이의 대사 산물 교환을 엄격하게 조절하기 위해 정점 표면 근처에 단단한 접합부를 형성합니다(20). ZO-1 염색은 단단한 접합 단백질이 일반적으로 규칙적인 조약돌 형태를 가진 1차 pRPE 세포의 원형질막에 국한되었지만 ARPE-19 세포에서는 국소화되지 않았음을 시사했습니다. 3개의 배양 배지 중 DMEM/Basic에서 배양된 세포에서 최상의 ZO-1 염색 패턴이 관찰된 반면, DMEM/F12는 pRPE 세포의 조약돌 형태를 유지하지 못했습니다. 더 높은 TER 값은 RPE 셀(21)의 단단한 접합 형성 및 더 양호한 장벽 기능의 지표로서 작용한다. 단단한 접합의 기능을 확인하기 위해, 경상피 저항(TER)을 측정하였다. 그러나 빈 트랜스웰 인서트와 비교하여 약간 더 높은 TER만 검출되었습니다(그림 4M,N).
망막에서 Bruch의 막은 RPE와 맥락막 사이에 존재합니다. Bruch의 막의 주성분은 콜라겐 IV 형, 프로테오글리칸 및 라미닌22입니다. RPE에 대한 Bruch의 막의 지지 효과를 시뮬레이션하기 위해 라미닌을 트랜스웰 막의 표면에 뿌려 배양된 RPE 세포의 성숙을 촉진했습니다. 그림 4에서 얻은 결과를 바탕으로, 합류 pRPE 세포를 2주 동안 1% FBS를 사용하여 DMEM/기본 배지의 트랜스웰 삽입물에서 배양했습니다. 면역형광염색 결과는 RPE 특이적 단백질 RPE65가 모든 pRPE 세포에서 발현되었음을 보여주었습니다(그림 5A,B). Na+-K+-ATPase는 pRPE 세포의 정점 표면에 분포하여 세포 극성의 재확립을 시사합니다(그림 5C, D). ZO-1 염색 및 TER 결과는 모두 라미닌에서 배양될 때 1차 pRPE 세포에서 단단한 접합이 잘 형성되었음을 나타냅니다(그림 5E, F, H). 도 5G는 Hoechst 염료로 염색된 세포를 도시한 것이다.
더욱이, 웨스턴 블롯은 pRPE와 ARPE-19 세포 모두 색소 상피 유래 인자(PEDF) 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 포함한 성장 인자를 생성한다는 것을 입증했습니다(그림 6A). pRPE의 합류 단분자층을 DMEM/Basic, DMEM/F12 및 MEM-Nic 배지를 사용하여 트랜스웰 삽입물에서 1주 동안 배양한 후, 트랜스웰 삽입물의 상부 및 하부 챔버로부터 배양 배지를 수집하고, 분비된 VEGF를 ELISA로 정량화하였다. DMEM/Basic 및 MEM-Nic 배지를 세포 배양에 사용했을 때 pPRE 세포는 DMEM/F12 배지의 세포보다 더 많은 VEGF를 분비했습니다(그림 6B). 그러나, 모든 시험된 조건에서 트랜스웰 삽입물의 상부 및 하부 챔버 사이의 VEGF 양에는 차이가 검출되지 않았다(도 6B). 또한, 1차 pRPE 세포를 라미닌으로 코팅된 삽입물 및 DMEM/Basic 배지에서 2주 동안 배양한 후, 상부 및 하부 챔버로부터 배지를 수집하였다. 웨스턴 블롯 분석은 하부 챔버보다 상부 챔버에서 더 높은 수준의 PEDF를 나타냈고, 분비된 VEGF의 단백질 수준은 두 챔버 모두에서 유사하였다(도 6C). 이러한 결과는 1차 pRPE 세포가 라미닌의 컨플루언스에 도달한 후 2주 동안 추가로 배양되었을 때 세포 극성의 재확립을 더욱 뒷받침했습니다.
그림 1: pRPE 세포 분리의 기본 단계 . (A) 50mL 멸균 원심분리 튜브에서 1x PBS로 돼지 안구를 세척합니다. (ᄃ,씨) 효소 소화를 위해 RPE- 맥락막 - 공막 복합체를 준비하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 세포 배양 후 1차 pRPE 세포 형태. (A) 2일째, (B) 6일째 및 (C) 10일째의 1차 pRPE 세포의 대표 이미지. 스케일 바 250 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 배양된 RPE 세포에서 주요 시그니처 유전자 및 단백질의 발현 수준. (A) 일차 pRPE 세포, 일차 hRPE 세포, ARPE-19 세포 및 pRPE/맥락막 조직에서 시그니처 유전자의 mRNA 수준에 대한 qRT-PCR 분석. Gapdh는 qRT-PCR을 위한 하우스 키핑 유전자로서 사용되었다. 4개의 생물학적 복제물이 1차 pRPE 세포 및 ARPE-19 세포에 사용되었고, 3개의 생물학적 복제물이 1차 hRPE 세포 및 pRPE/맥락막 조직에 사용되었습니다. ARPE-19 세포에서의 유전자 발현 수준을 대조군으로 설정하였다. (B) ARPE-19 및 pRPE 세포에서 RPE65 단백질의 웨스턴 블롯 분석. 빈쿨린은 로딩 컨트롤로 사용되었습니다. (C) 일차 hRPE 세포 및 pRPE/맥락막 조직에서 RPE65 단백질의 웨스턴 블롯 분석. 빈쿨린은 로딩 컨트롤로 사용되었습니다. 비교를 위해 학생 t-검정을 사용했으며, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 1% FBS를 사용하는 DMEM/염기성, DMEM/F12 및 MEM-Nic 배지에서 1차 pRPE 및 ARPE-19 세포의 1주 배양. (A) DMEM/염기성, (B) DMEM/F12 및 (C) MEM-Nic 배지에서 1차 pRPE 세포의 Na+-K+-ATPase 형광 염색(빨간색). (D) DMEM / 기본 배지, (E) DMEM / F12 배지 및 (F) MEM-Nic 배지에서 ARPE-19 세포의 Na + -K + -ATPase 형광 염색 (빨간색). (G) DMEM/기본 배지, (H) DMEM/F12 배지 및 (I) MEM-Nic 배지에서 1차 pRPE 세포의 ZO-1 형광 염색(녹색). (J) DMEM / 기본 배지, (K) DMEM / F12 배지 및 (L) MEM-Nic 배지의 ARPE-19 세포에서 ZO-1 형광 염색 (녹색). 1차 pRPE(M) 및 ARPE-19(N) 세포를 1주 동안 DMEM/베이직, DMEM/F12 및 MEM-Nic 배지에서 배양한 후 TER 측정을 수행하였다. 각각의 세포 유형에 대해, 데이터는 적어도 3개의 상이한 웰로부터 얻어졌다. 비교를 위해 학생 t-검정을 사용했으며, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. 스케일 바 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 1% FBS를 갖는 DMEM/염기성 배지에서 pRPE 세포의 2주 배양. (A-F) 라미닌을 포함하거나 포함하지 않고 배양된 세포를 RPE65 (A,B, 적색), Na+-K+-ATPase (C,D, 적색), ZO-1 (E,F, 녹색) 및 (G) 회히스트(청색)로 염색하였다. (H) 라미닌 유무에 관계없이 배양된 세포 시트에서의 TER 측정. 다른 처리의 경우 4 개의 다른 웰에서 데이터를 얻었습니다. 비교를 위해 학생 t-검정을 사용했는데, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 배양된 1차 pRPE 및 ARPE-19 세포의 분비 기능. (A) 1차 pRPE 및 ARPE-19 세포에서 VEGF 및 PEDF의 웨스턴 블롯 분석. (B) 컨플루언트 세포를 DMEM/염기성, DMEM/F12 및 MEM-Nic 배지에서 1주 동안 배양할 때 1차 pRPE 세포가 있는 트랜스웰 삽입물의 상부 및 하부 챔버에서 분비된 VEGF. (C) 2주 동안 DMEM/기본 배지에서 1차 pRPE가 있는 트랜스웰 삽입물의 상단 및 하단 챔버에서 분비된 PEDF 및 VEGF. 다른 처리의 경우 세 개의 다른 우물에서 데이터를 얻었습니다. 비교를 위해 학생 t-검정을 사용했는데, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 인류 | 수스 스크로파 | |
| 베스트1 | F: GAAGGCAAGGAGCAAG | F: GGACACCTGTATGCCTACGA |
| R: TCCAACTGCTTGTGTTCTGC | R: GGAACGTGAAGAGGTACA | |
| 클디엔19 | F: GGTGACCCAGGAGTTCTTCA | F: TCGTGACCCAGGAGTTCTTC |
| R: CTGTTGGGTCTCTCTGGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT | R: GCTGCTGTTGGATCGCTC | |
| 이트가브 | F: CGCAGTCCCATCTCAAATCC | F: GCTTTCTTCAGGACGGAACA |
| R: GGCCCTGTATAAGATAGCTCGA | R: GAAATGAGCTGACCTTGCCA | |
| 크릿8 | F: GGAGCAGATCAAGACCCTCA | F: CCCAGGAGAAGGAGCAGATC |
| R: GCCGCCTAAGGTTGTTGATG | R: ATGTTGTCGATGTTGCTCCG | |
| 크르트18 | F: CTTGGAGAAGAAGGGACCCC | F: GCTGATAATCGGAGGCTGGA |
| R: GGCCAGCTCTGTCTCATACT | R: GAAGTCATCAGCAGCGAGGAC | |
| 메르트크 | F: GTGTGCAGCGTTCAGACAAT | F: GCGGCTATTTCTTGGTGGAA |
| R: AAAATGTTGACGGGCTCAGG | R: ACGTAGATGGGGTCAGACAC | |
| 세르핀프1 | F: CAGATGAAAGGAAGCTCGC | F: AAGACGTCGCTGGAGGATTT |
| R: TTAGGGTCCGACATCATGGG | R: GGTCACTTTCAGAGGCAGGA | |
| SLC16a8 | F: GGGTGTCCTCCATCATGCTA | F: CAGTTCGAGGTGCTCATGG |
| R: GTCAGGTAGAGCTCCAGGAG | R: GACAGCCATGAAGACACCACCAG | |
| 스트라6 | F: CTTTGCAGGAAGAAGCTGGG | F: CTAGCCGTGTGTGTCGATCCT |
| R: TAAATGGCCGTCCCTCAG | R: GACCATGAAGACAGCAGCAG | |
| 티제이피1 | F: ACAGGAAAATGACCGAGTTGC | F: AAGACTTGTCAGCTCAGCCA |
| R: TGGTTCAGGATCAGGACGAC | R: CCAGCATCTCGAGGTTCACT | |
| 티르 | F: ACTCAGCCCAGCATTCT | F: ATCTACTCAGCCCAGCATCC |
| R: ACATCAGCTGAAGGGAG | R: GAGCCTTGGAGTCCTGGATT | |
| 갭드 | F: CAGCCTCAAGATCATCAGCA | F: CATCCTGGGCTACACTGAGG |
| R: ATGATGTTCTGGAGAGCCCC | R: GGGGCTCTTACTCCTTGGAG |
표 1: qRT-PCR용 프라이머.
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Discussion
여기에서는 RPE 세포의 시험관 내 특성화 및 RPE 관련 장애 연구를 위한 좋은 모델을 생성하는 돼지 안구에서 RPE 세포의 분리, 배양 및 특성화를 위한 상세하고 최적화된 프로토콜이 설명되었습니다. 인간, 마우스 및 래트 눈으로부터 RPE를 단리하기 위한 방법은 이전에23,24,25에 기술되었다. 그러나 일부 실험실에서는 사람의 안구를 얻기가 어렵고 일반적으로 윤리적 인 문제가 발생합니다. 마우스와 래트의 RPE 조직은 상대적으로 작고, 세포는 분리 중에 쉽게 손상되며, 각 동물로부터 몇 개의 세포 만 얻을 수 있습니다. 대조적으로, 돼지 안구는 획득하고 다루기가 훨씬 쉽기 때문에 단일 안구에서 비교적 많은 수의 일차 세포를 안정적으로 생성 할 수 있습니다. 일부 연구에서는 핀셋을 사용하여 RPE를 기계적으로 분리하여 쉽게 세포 사멸로 이어질 수 있습니다. 따라서 히알루 론산, 디스 파스 및 트립신 / EDTA 용액은 이전에 RPE 세포를 해리하는 데 사용되었습니다. 이전 연구에 따르면 트립신 / EDTA 용액은 RPE가 맥락막21에서 분리되도록 도와줍니다. 따라서 트립신 / EDTA 용액을 사용하여 돼지 조직을 소화하여 최적의 결과를 생성했습니다. 트립신/EDTA 신경화 후, RPE 조직은 피펫 팁으로 부드럽게 피펫팅하여 단일 세포 현탁액으로 해리될 수 있습니다. 한 가지 트릭은 RPE 세포를 완전히 해리하기 위해 각 실험에 새로운 트립신 / EDTA 용액을 권장한다는 것입니다. 돼지 안구의 RPE 조직의 넓은 영역으로 인해 반 그릇 모양의 RPE-맥락막-공막 복합체는 RPE 조직과 트립신 / EDTA 용액 사이의 완전한 접촉에 도움이되는 4 잎 클로버 모양으로 절단되어 맥락막으로부터의 분리를 용이하게합니다. 그러나 소화 시간은 30 분을 넘지 않아야합니다. 이 시간 내에 RPE를 제외한 다른 조직은 소화되지 않아 다른 유형의 세포로 인한 오염을 효과적으로 줄일 수 있습니다.
라미닌은 RPE에 대한 Bruch의 막의지지 효과를 시뮬레이션하기 위해 트랜스 웰 막의 표면에 퍼졌습니다. 결과는 라미닌이 수송체 및 단단한 접합 단백질의 발현을 자극하는 pRPE 세포의 성장에 유익하다는 것을 보여주었습니다. 그러나 결과는 또한 일차 pRPE 세포가 세포 극성 및 단단한 접합을 포함한 천연 RPE 조직의 특정 특징을 복원하기 위해 약 2wks의 더 긴 배양 시간이 필요함을 나타냅니다.
1차 RPE 배양의 한 가지 단점은 시험관 내에서 시각적 주기 효소 발현을 유지하기가 어렵다는 것입니다. 따라서 배양된 RPE 세포가 RPE 특이적 단백질 RPE65를 발현할 수 있는지 여부를 조사하는 것이 중요합니다. ARPE-19 세포와 비교하여 pRPE 세포는 훨씬 더 많은 RPE65 단백질을 발현했습니다. 대조적으로, RPE65 단백질의 약한 밴드만이 웨스턴 블롯에서 ARPE-19 세포 용해물에서 관찰되었다. RPE65의 분자량이 인간과 돼지 사이에서 약간 다르다는 것을 관찰하는 것은 흥미 롭습니다 (그림 3B, C). 배양된 RPE 세포에서 RPE65 발현의 손실은 미스터리로 남아 있습니다. 배양된 일차 세포에서도, RPE65는 계대배양과 함께 점진적으로 소실되었다 (데이터는 나타내지 않음). 지금까지 시험 관 내에서 RPE65의 발현을 유지하는 방법은 시각 주기가 천연 RPE 조직에 중요한 기능이라는 사실을 고려할 때 추가 조사가 필요합니다. 둘째, 이 프로토콜의 주요 한계는 시험관 내 배양된 RPE 세포를 계대배양할 수 없다는 것입니다. 장기간 배양하면 pRPE 세포는 육각형 모양과 TER 및 색소 침착을 잃는 경향이 있으므로 계대 0 세포만 사용할 수 있습니다. 이 배양 프로토콜의 또 다른 한계는 유전성 망막 질환을 유발하는 유전적 돌연변이가 이러한 세포에서 재현하기 어렵다는 것입니다. 따라서, 바이러스 매개 유전자 편집은 미래에 Leger 선천성 무균증과 같은 유전성 RPE 장애를 연구하기 위해 사용될 수 있다.
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Disclosures
모든 저자는 이해 상충이 없다고 밝혔습니다.
모든 저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
저자는이 연구에서 세포에 기여한 모든 동물에게 감사와 존경을 표하고 싶습니다. 이 연구는 중국 국가 핵심 R & D 프로그램 (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao 및 Grant nos. 2018YFA0107301, Wei Li)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다. 저자는 컨포칼 이미징에 대한 기술 지원에 대해 샤먼 대학교 의과대학 중앙 연구소의 Jingru Huang과 Xiang You에게 감사를 표합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ARPE-19 cells | CCTCC | GDC0323 | |
| Bovine serum albumin | Yeasen | 36101ES60 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM 880 with Airyscan | |
| ChemiDoc Touch | Bio-Rad | 1708370 | |
| Cell scraper | Sangon | F619301 | |
| 10 cm culture dish | NEST | 121621EH01 | |
| 12-well culture plate | NEST | 29821075P | |
| DMEM F12 Medium | Gibco | C11330500BT | |
| DMEM basic Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EVOM2 | World Precision Instruments | EVOM2 | For TER measurement |
| Fetal bovine serum | ExCell Bio | FSP500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 0300-0108P | |
| Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 5196-2504 | |
| hydrocortisone | MCE | HY-N0583/CS-2226 | |
| Hoechst 33342 solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| LightCycler 96 Instrument | Roche | 5815916001 | |
| Liothyronine | MCE | HY-A0070A/CS-4141 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| MEM(1X)+GlutaMAX Medium | Gibco | 10566-016 | |
| MEM NEAA(100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Millex-GP syringe filter unit | Millipore | SLGPR33RB | |
| N1 | Sigma-Aldrich | SLCF4683 | |
| NcmECL Ultra | New Cell&Molecular Biotech | P10300 | |
| Non-fat Powdered Milk | Solarbio | D8340 | |
| Nicotinamide | SparkJade | SJ-MV0061 | |
| Na+-K+ ATPase antibody | Abcam | ab76020 | Recognize both human and porcine proteins |
| PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%) | Epizyme | PG112 | |
| primary Human RPE cells | - | - | Generous gift from Shoubi Wang lab |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Prism | GraphPad by Dotmatics | version 8.0 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | APExBIO | K1024 | |
| PRE65 antibody | Proteintech | 17939-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| PEDF antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-390172 | Recognize both human and porcine proteins |
| 100 x penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-031-1BCS | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | RARBIO | RA-9005 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | Toyobo | FSQ-201 | |
| RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 601052 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 602052 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Taurine | Damas-beta | 107-35-7 | |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | RNA extraction solution |
| TB Green Fast qPCR Mix | Takara | RR430A | |
| 12-well transwell inserts | Labselect | 14212 | |
| VEGF antibody | Proteintech | 19003-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| VEGF ELISA kit | Novusbio | VAL106 | |
| ZO-1 antibody | ABclonal | A0659 | Recognize both human and porcine proteins |
References
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