Summary
Her presenteres en lett å følge metode for å dyrke primære svin retinale pigmentepitelceller in vitro .
Abstract
Retinalpigmentepitelet (RPE) er et monolag av polariserte pigmenterte epitelceller, lokalisert mellom choroid og neuroretina i netthinnen. Flere funksjoner, inkludert fagocytose, næringsstoff / metabolitttransport, vitamin A-metabolisme, etc., utføres av RPE på daglig basis. RPE-celler er terminalt differensierte epitelceller med liten eller ingen regenerativ kapasitet. Tap av RPE-celler resulterer i flere øyesykdommer som fører til synshemming, for eksempel aldersrelatert makuladegenerasjon. Derfor er etableringen av en in vitro-kulturmodell av primære RPE-celler, som ligner mer på RPE in vivo enn cellelinjer, kritisk for de karakteristiske og mekanistiske studiene av RPE-celler. Tatt i betraktning det faktum at kilden til menneskelige øyeboller er begrenset, lager vi en protokoll for å dyrke primære svin RPE-celler. Ved å bruke denne protokollen kan RPE-celler lett dissosieres fra voksne svin øyeboller. Deretter fester disse dissosierte cellene seg til kulturretter / innsatser, sprer seg for å danne et sammenflytende monolag, og gjenoppretter raskt viktige trekk ved epitelvev in vivo innen 2 wks. Ved qRT-PCR er det demonstrert at primære svin RPE-celler uttrykker flere signaturgener på sammenlignbare nivåer med innfødt RPE-vev, mens uttrykkene til de fleste av disse genene går tapt / sterkt redusert i humane RPE-lignende celler, ARPE-19. Videre viser immunfluorescensfargingen fordelingen av tett kryss, vevspolaritet og cytoskelettproteiner, samt tilstedeværelsen av RPE65, en isomerase som er kritisk for vitamin A-metabolisme, i dyrkede primære celler. Til sammen har vi utviklet en lett-å-følge tilnærming til kultur primære svin RPE celler med høy renhet og innfødte RPE funksjoner, som kan tjene som en god modell for å forstå RPE fysiologi, studere celletoksisitet, og lette narkotika screenings.
Introduction
Retinalpigmentepitelet (RPE) ligger mellom fotoreceptorer og choriocapillaris i det ytre laget av retina1 med flere funksjoner, inkludert dannelse av blod-retinalbarrieren, transport og utveksling av næringsstoffer og retinale metabolitter, resirkulering av vitamin A for å opprettholde en normal visuell syklus, og fagocytose og clearance av skurfotoreceptor ytre segmenter (POS)2,3 . Siden POS-er krever konstant selvfornyelse for å generere syn, må RPE-cellene kontinuerlig oppsluke frittliggende POS-er for å opprettholde retinal homeostase4. Derfor resulterer RPE-dysfunksjon i mange blinde øyesykdommer, som aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD)4, retinitis pigmentosa (RP)5, Leber medfødt amaurose6, diabetisk retinopati7, etc. Til nå er den eksakte patogenesen av de fleste av disse sykdommene fortsatt unnvikende. Som et resultat er RPE-cellekultur etablert for å studere RPE-cellebiologi, patologiske forandringer og underliggende mekanismer.
Som den enkleste modellen for å studere cellebiologi ble kulturen til RPE-celler startet så tidlig som på 1920-tallet8. Selv om ARPE-19 er mye brukt som RPE-celler, gir tap av pigmentering, brosteinsmorfologi, og spesielt barrierefunksjonene i denne cellelinjen mange bekymringer9. Til sammenligning tilbyr kulturen til primære humane RPE-celler et mer realistisk scenario for fysiologiske og patologiske studier9. Den relativt begrensede tilgjengeligheten begrenser imidlertid bruken av dem, og etiske problemer eksisterer alltid. I tillegg brukte flere grupper musemodeller for å dyrke RPE-celler. Imidlertid er størrelsen på museøyet liten, og en enkelt kultur krever vanligvis mange mus, noe som ikke er praktisk9. Nylig har forskere utviklet nye metoder for å bruke menneskelige embryonale stamceller eller induserte pluripotente stamceller for å utlede RPE-celler. Selv om denne teknikken har spesielt potensial for behandling av arvelige RPE-lidelser, er den tidkrevende og krever vanligvis flere måneder å generere modne RPE-celler10. For å overvinne disse problemene, introduserer vi her en lett å følge protokoll for å isolere og dyrke RPE-celler med høy renhet i laboratoriet rutinemessig. Under egnede kulturforhold kan disse cellene vise typiske RPE-funksjoner og vise typiske RPE-morfologier. Derfor kan denne kulturmetoden gi en god modell for å forstå RPE-fysiologi, studere cytotoksisitet, undersøke patologiske mekanismer for relaterte okulære sykdommer og gjennomføre narkotikaundersøkelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bruken av eksperimentelle dyr overholdt forskriftene fra Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) og ble godkjent av Etisk komité for eksperimentell dyreforvaltning ved Xiamen University.
1. Fremstilling av eksperimentelle kirurgiske enheter, vevsfordøyelsesenzym og cellekulturbuffer
- Forbered de eksperimentelle kirurgiske enhetene, ved å rengjøre og autoklavere to par oftalmiske kirurgiske sakser og tang dagen før øyeeplet disseksjon, og deretter tørke boksen med kirurgiske enheter i en generell protokollovn ved 65 ° C over natten.
- Kultur media forberedelse.
- Forbered DMEM / Basismedier supplert med 10% (v / v) føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin og 1% (v / v) penicillin (100 U / ml) og streptomycin (100 U / ml).
- Forbered DMEM / F12 media supplert med 1% (v / v) FBS, og 1% (v / v) penicillin (100 U / ml) og streptomycin (100 U / ml).
- Forbered MEM-Nic 11 ved å supplere MEM alfa med 2 mM L-glutamin, 1% FBS, 1% (v / v) penicillin (100 U / ml) og streptomycin (100 U / ml), 0,1 mM NEAA, 1% (v / v) N1 supplement, taurin (0,25 mg / ml), hydrokortison (20 ng / ml), triiodo-thyronin (0,013 ng / ml) og10 mM nikotinamid.
MERK: For å forbedre cellens levedyktighet og spredning, kan prosentandelen FBS økes til 20% for å nøytralisere fordøyelsesenzymer og frø de dissosierte cellene. For langsiktig cellekultur kan prosentandelen FBS reduseres til så lavt som 1% 12.
- Tine vevsfordøyelsesenzymet aliquot (0,25% (w / v) trypsin / EDTA-løsning supplert med 0,91 mM EDTA, heretter kalt Trypsin / EDTA-løsning) under forsøket.
MERK: Frisk trypsin/EDTA-løsning bør brukes hver gang for å oppnå optimale resultater. Aliquot 10 ml frisk Trypsin/EDTA-oppløsning i hvert 15 ml sterilt sentrifugerør og frys aliquotene ved -20 °C kjøleskap til bruk. - Disseksjon løsning.
- Steriliser 1x fosfatbufret saltvann (PBS) (pH 7,2) supplert med 2 % (v/v) penicillin (100 U/ml) og streptomycin (100 U/ml) ved å filtrere oppløsningen gjennom en 0,22 μm sprøytefilterenhet.
- Belegg kulturplatene og transwell-innsatsene.
- Vask brønnene og transwell-innsatsene med 1x PBS. Fjern PBS fra brønner og transwells med en pipette, og tilsett deretter 1 ml fersk 1x PBS til underkammeret og 600 μL 10 μg / ml lamininoppløsning til forkammeret.
- Inkuber platene/transwellinnsatsene i cellekulturinkubatoren over natten ved 37 °C og 5 % CO2. Fjern lamininoppløsningen fra det øvre kammeret og vask med 1 ml kald 1x PBS to ganger før sådd cellene.
2. Disseksjon av svin øyeeplet RPE celler
- Forberedelse av instrumentene.
- Rengjør den laminære strømningshetten med 75% etanol og UV-lys. Forbered tre 50 ml sterile sentrifugerør som inneholder ~25 ml 75 % etanol, tre 50 ml sterile sentrifugerør som inneholder ~25 ml 1x PBS, og tre 10 cm sterile cellekulturskåler som inneholder ~15 ml 1x PBS.
MERK: Disse innstillingene brukes vanligvis til å dissekere fire svin øyeepler. Vennligst skaler opp når flere øyeepler brukes. For å forbedre cellens levedyktighet, forkjøl 1x PBS-buffer på is i minst 30 minutter. Både 75% etanol og UV-lys er nødvendig for å sikre at eksperimentelle instrumenter og celler ikke er forurenset. Slå på UV-lampen på forhånd for å sterilisere hele operasjonsbordet i minst 15 minutter.
- Rengjør den laminære strømningshetten med 75% etanol og UV-lys. Forbered tre 50 ml sterile sentrifugerør som inneholder ~25 ml 75 % etanol, tre 50 ml sterile sentrifugerør som inneholder ~25 ml 1x PBS, og tre 10 cm sterile cellekulturskåler som inneholder ~15 ml 1x PBS.
- Rengjør svin øyeepler.
- Få friske øyeepler fra et slakteri og hold dem på is til disseksjon. Bløtlegg fire svin øyeepler i ~ 15 ml 75% etanol i en 10 cm petriskål og bruk et par saks og tang for å kutte av alle gjenværende bindevev og muskler.
MERK: Fjern så mye vev som mulig fra utsiden av sclera for å redusere forurensninger. Ikke kutt optisk nerve på dette tidspunktet for å lette overføringen av øyebollene under dekontaminerings- og vasketrinnet. Etter dette trinnet skal alle prosedyrene utføres i en laminær strømningshette.
- Få friske øyeepler fra et slakteri og hold dem på is til disseksjon. Bløtlegg fire svin øyeepler i ~ 15 ml 75% etanol i en 10 cm petriskål og bruk et par saks og tang for å kutte av alle gjenværende bindevev og muskler.
- Dekontaminere svin øyeepler ved soaking og vaske fire svin øyeepler i tre 50 ml sterile sentrifuge rør fylt med 75% etanol i en sekvensiell måte; Hvert øyeboll dyppes i minst 5 minutter i hvert rør. Vask deretter svin øyebollene i tre 50 ml sterile sentrifugerør fylt med 1x PBS på en sekvensiell måte; vask hvert øyeeple i minst 5 minutter i hvert rør (figur 1A). Inverter rørene hvert minutt for å vaske øyebollene grundig.
- Disseksjon av svin øyeepler.
- Flytt de fire svin øyeeplene inn i en 10 cm steril cellekulturskål som inneholder 1x PBS. Trim den ytre overflaten av hvert øyeboll igjen for å fjerne optisk nerve og små rusk (figur 1B). Bruk saks til å lage et lite kutt i krysset mellom limbus og sclera, og fjern deretter hornhinnen, iris, linsen, glasslegemet og nevrale netthinnen (for detaljerte strukturer av disse vevene, se figur 1).
- Overfør RPE-choroid-sclera-komplekset til en ny 10 cm cellekulturskål og gjør fire kutt for å flate øyekoppen i form av en firkløver (figur 1C).
- Utfør Trypsin / EDTA-løsningsfordøyelsen ved å plassere de fire RPE-choroid-sclera-kompleksene i en ny 10 cm tallerken. Hell 20 ml fersk Trypsin / EDTA-løsning for å slå sammen RPE-choroid-sclera-kompleksene og legg parabolen inn i cellekulturinkubatoren ved 37 ° C i ~ 30 minutter.
MERK: Bruk fersk Trypsin / EDTA-løsning for å dissosiere RPE-cellene. Kontroller nøye tiden for fordøyelsen av trypsin/EDTA-oppløsningen, da en lengre inkubasjonstid (mer enn 30 minutter) kan øke kontamineringen av andre typer celler.
3. Isolering og kultur av svin øyeeple RPE celler
- RPE dissosiasjon.
- Ta parabolen ut av inkubatoren etter 30 minutters inkubasjon med Trypsin / EDTA-løsning og tilsett 20 ml forvarmede kulturmedier (med 10% FBS) til parabolen for å nøytralisere Trypsin / EDTA-løsningen.
MERK: På dette trinnet brukes bare DMEM / grunnleggende medier. Når celler når sammenløp, kan tre kulturmedier brukes avhengig av eksperimentelle forhold: DMEM / Basic media, DMEM / F12 media og MEM-Nic media. - Bruk en 5 ml overføringspipette til å dissosiere RPE-cellene ved å pipettere forsiktig flere ganger. Samle cellesuspensjoner i 15 ml sentrifugerør. Bruk ytterligere 10 ml friske kulturmedier (10% FBS) for å vaske RPE-choroid-sclera-kompleksene på fatet ved forsiktig pipettering for å oppnå så mange RPE-celler som mulig.
MERK: Ikke triturate cellene for kraftig. Sørg for å fylle og tømme pipetten med en hastighet på ca. 3 ml/s. Unngå å boble cellesuspensjonen.
- Ta parabolen ut av inkubatoren etter 30 minutters inkubasjon med Trypsin / EDTA-løsning og tilsett 20 ml forvarmede kulturmedier (med 10% FBS) til parabolen for å nøytralisere Trypsin / EDTA-løsningen.
- Samle RPE-celler ved å sentrifugere rørene ved 200 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Aspirer supernatanten ved hjelp av en pipette og tilsett ytterligere 5 ml kulturmedier (10% FBS) for å resuspendere cellene og sentrifugere ved 200 x g i ytterligere 5 minutter. Decant supernatanten og resuspend cellene med 12 ml kulturmedier.
MERK: Når du aspirerer supernatanten, la det være ca. 1 ml media for å unngå brudd på celleklumper. - Såing av RPE-celler.
- Frø ~ 1-2 x 105 celler / godt inn i 12-brønns kulturplater eller transwell innsatser. Vanligvis oppnås ca. 1,5 x 106 RPE-celler fra fire svin øyeboller. Bytt kulturmedium hver 2. dag og reduser serumkonsentrasjonen til 1 % når cellene dekker overflaten av brønnene/innsatsene helt.
MERK: Ikke flytt cellekulturskålen for ofte før celler fester seg til kulturskålen / innsatsene.
- Frø ~ 1-2 x 105 celler / godt inn i 12-brønns kulturplater eller transwell innsatser. Vanligvis oppnås ca. 1,5 x 106 RPE-celler fra fire svin øyeboller. Bytt kulturmedium hver 2. dag og reduser serumkonsentrasjonen til 1 % når cellene dekker overflaten av brønnene/innsatsene helt.
- Bytt kulturmedier hver 2. dag til cellene høstes.
MERK: Konsentrasjonen av FBS kan reduseres etter at celler når sammenløp, og celler kan dyrkes i opptil flere måneder for å tillate full differensiering og modning.
4. Karakterisering av primære svin RPE celler
- Dyrk cellene ved sammenløp for 1 eller 2 wks, og høst deretter cellene for videre analyse.
- Høste celler for kvantitativ sanntids PCR (qRT-PCR) analyse.
- Fjern kulturmediet, vask cellene med 1 ml kald 1x PBS, og tilsett deretter 500 μL RNA-ekstraksjonsløsning i hver brønn for å samle cellelysat fra ca. 1 x 106 celler.
- Utdrag mRNA13; omtrent 4 μg RNA ekstraheres fra hver prøve. Bruk 100 ng mRNA for å utføre revers transkripsjon14; fortynne cDNA 40 ganger for kvantitativ sanntids PCR-analyse. Primere er listet opp i tabell 1.
- Høst celler for immunfluorescensfarging.
- Fjern kulturmediet, vask cellene med 1 ml kald 1x PBS, og tilsett deretter 500 μL 4% (w / v) paraformaldehyd i 1x PBS for å fikse cellene (ca. 1 x 106 celler / brønn) i 30 minutter ved romtemperatur. Vask deretter cellene med 1x PBS to ganger og utfør immunfluorescensfarging med primære antistoffer (1:100 i 1x PBS supplert med 1% (w / v) bovint serumalbumin) ved 4 ° C over natten og sekundære antistoffer (1:200 i 1x PBS supplert med 1% (w / v) bovint serumalbumin) ved romtemperatur i 2 timer i henhold til online protokoller15.
- Immunfluorescensbildene er anskaffet av et konfokalt mikroskop etter den elektroniske håndboken16.
- Høst celler for vestlig blotanalyse.
- Fjern kulturmediet, vask cellene med kald 1x PBS to ganger, og tilsett deretter 80 μL RIPA-buffer (med 1x proteasehemmer) i hver brønn og bruk celleskraper til å skrape ca. 1 x 106 celler av oppvasken/innsatsene.
- Samle cellelysatet fra hver brønn / sett inn i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Kok cellelysatene i 10 minutter og mål deretter proteinkonsentrasjoner ved hjelp av BCA-sett; proteinkonsentrasjonen i hver prøve er ca. 2 mg/ml. Bruk 25 μg proteiner av hver prøve for Western blot-analyse i henhold til online protokoller17.
- For Western blot inkuberer du membranene i 5 ml primær antistoffløsning (1:1 000 fortynning av primære antistoffer i 1x TBST-oppløsning supplert med 5 % (w/v) bovint serumalbumin) ved 4 °C over natten på en roterende multifunksjons shaker.
- Deretter inkuberer membranen med ca. 15 ml anti-kanin eller anti-mus sekundær antistoffløsning (1:5,000 fortynning av sekundære antistoffer i 1x TBST-løsning supplert med 5% (w / v) ikke-fet melk) ved romtemperatur i 2 timer på en orbital shaker, i henhold til kilden til det primære antistoffet som brukes.
- Transepitelial motstand (TER) måling.
- Vask spisepinneelektrodene med 70% etanol og steril 1x PBS på en sekvensiell måte. Plasser deretter den kortere enden av elektroden i det øverste kammeret og den lengre enden i det nederste kammeret til transwellinnsatsene, og klikk på knappen på epitelvoltmeteret for målingene. Registrer TER-målingene for hver brønn i tre eksemplarer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De primære pRPE-cellene (pRPE) hos svin ble dyrket i DMEM/basismedier med 10 % FBS, og cellemorfologi under lysmikroskop ble fotografert etter 2 dager (figur 2A), 6 dager (figur 2B) og 10 dager (figur 2C) etter såing. Etter 1 wk ble det observert et sammenflytende monolag av pigmenterte pRPE-celler med brosteinsmorfologier.
For bedre å karakterisere de primære pRPE-cellene ble primære humane RPE-celler (hRPE) ved passasje 3 (P3) 18 og ARPE-19-celler dyrket i DMEM / Basic-medier med 1% FBS for en annen wk, og deretter ble det totale mRNA og proteinet til de dyrkede cellene, samt svin RPE / choroid vev, høstet. Ekspresjonsnivåene av viktige karakteristiske gener19 og proteinmarkører av moden RPE ble evaluert av qRT-PCR og Western blot. Sammenlignet med ARPE-19-celler beholdt pRPE-celler signifikant høyere ekspresjonsnivåer av gener som fungerte i innfødt RPE-sekresjon (figur 3A (c)), fagocytose (figur 3A (i)), transport (figur 3A (a), (d)), tette kryss (figur 3A (j)), barrieredannelse (figur 3A (b)), samt visuell syklus (figur 3A (e), B). Ekspresjonsnivåene til Krt8 og Krt18, to cytoskelettmarkørgener av RPE, var imidlertid signifikant lavere i primære pRPE-celler sammenlignet med primære hRPE- og ARPE-19-celler (figur 3A (g), (h)). Videre var itgav, som deltar i fagocytose, lavere også i primære pRPE-celler (figur 3A (f)). Siden ekspresjonsnivåene av disse tre genene i pRPE-celler var like med svin RPE / choroid-vevet, kan dette indikere genuttrykksforskjellene mellom artene. Videre var ekspresjonsnivået til Tyr, som er ansvarlig for melaninproduksjonen, sterkt redusert i både primære pRPE- og hRPE-celler (figur 3A (k)), noe som kan forklare tapet av pigmentering i langsiktige dyrkede celler. Ulikhetene i qRT-PCR-resultatene observert i dataene fra humane pRPE- og svin pRPE-celler kan skyldes lengre lagring og høyere passasjenummer (P3) av human pRPE, og indikerer dermed tap av RPE-tegn ved subkulturering. I tillegg viste Western blot at RPE65-protein, som er et nøkkelenzym i den visuelle syklusen med RPE-celler, ble uttrykt i pRPE-celler, mens ekspresjonsnivået ble betydelig redusert i primære hRPE-celler og ARPE-19-celler (figur 3B, C).
For ytterligere å karakterisere polaritets- og barrierefunksjonene til RPE-celler, ble de dyrkede sammenflytende monolagene av pRPE- og ARPE-19-celler dyrket i transwell-innsatser med DMEM / Basic, DMEM / F12 og MEM-Nic-medier for 1 wk (figur 4). Under disse kulturforholdene viste Na+-K+-ATPase (figur 4A-F) og ZO-1 (figur 4G-L) fluorescerende fargeresultater at pRPE-celler hadde høyere ekspresjonsnivåer av både Na+-K+-ATPase og ZO-1 enn ARPE-19-celler. Den like fordelingen av Na+-K+-ATPase på den apikale og basale overflaten av pRPE-celler indikerte at det var nødvendig med lengre kulturtid for å gjenopprette cellepolariteter in vitro.
RPE danner tette kryss nær sin apikale overflate for å regulere utvekslingen av metabolitter mellom den indre netthinnen og choroids20. ZO-1-farging antydet at tette kryssproteiner normalt var lokalisert ved plasmamembranen til primære pRPE-celler med vanlige brosteinsmorfologier, men ikke av ARPE-19-celler. Blant de tre kulturmediene ble de beste ZO-1-fargemønstrene observert i celler dyrket i DMEM / Basic, mens DMEM / F12 ikke klarte å opprettholde brosteinsmorfologien til pRPE-celler. En høyere TER-verdi fungerer som en indikator på tett kryssdannelse og bedre barrierefunksjoner av RPE-celler21. For å bekrefte funksjonen til tette kryss ble det målt transepitelresistens (TER). Det ble imidlertid kun påvist litt høyere TER sammenlignet med tomme transwellinnlegg (figur 4M,N).
I netthinnen eksisterer Bruchs membran mellom RPE og årehinnen. Hovedkomponentene i Bruchs membran er kollagen type IV, proteoglykaner og laminin22. For å simulere den støttende effekten av Bruchs membran på RPE, ble laminin spredt på overflaten av transwellmembranen for å lette modningen av dyrkede RPE-celler. Basert på resultatene hentet fra figur 4, ble de sammenflytende pRPE-cellene dyrket på transwell-innsatser i DMEM / Basic-medier med 1% FBS for 2 wks. Immunfluorescerende fargeresultater viste at RPE-spesifikke proteiner RPE65 ble uttrykt i alle pRPE-celler (figur 5A, B). Na+-K+-ATPase ble fordelt på den apikale overflaten av pRPE-celler, noe som tyder på reetablering av cellepolariteter (figur 5C,D). Både ZO-1-farging og TER-resultater indikerte at tette kryss var godt dannet i primære pRPE-celler når de ble dyrket på laminin (figur 5E, F, H). Figur 5G viser celler farget med Hoechst-fargestoff.
Videre viste Western blot at både pRPE- og ARPE-19-celler produserte vekstfaktorer, inkludert pigmentepitelavledet faktor (PEDF) og vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF) (figur 6A). Etter at sammenflytende monolag av pRPE ble dyrket i transwell-innsatser med DMEM/Basic-, DMEM/F12- og MEM-Nic-medier i 1 wk, ble kulturmedier fra de øverste og nederste kamrene i transwell-innsatsene samlet inn, og den utskilte VEGF ble kvantifisert av ELISA. Når DMEM/Basic- og MEM-Nic-medier ble brukt til cellekultur, utskilte pPRE-celler mer VEGF enn celler i DMEM/F12-medier (figur 6B). Det kunne imidlertid ikke påvises forskjeller i VEGF-mengder mellom de øverste og nederste kamrene i transwellinnsatsene under alle testede forhold (figur 6B). I tillegg, etter at primære pRPE-celler ble dyrket på innsatsene belagt med laminin og i DMEM / Basic-medier for 2 wks, ble media fra topp- og bunnkamrene samlet. Western blot-analyse viste høyere nivåer av PEDF i toppkammeret enn det nederste kammeret, mens proteinnivåene av utskilt VEGF var like ved begge kamrene (figur 6C). Disse resultatene støttet videre reetableringen av cellepolaritet når primære pRPE-celler ble dyrket for ytterligere 2 wks etter at de nådde sammenløp på laminin.
Figur 1: Grunnleggende trinn for pRPE-celleisolasjon . (A) Vask svin øyeepler med 1x PBS i 50 ml sterile sentrifugerør. (B,C) Forbered RPE-choroid-sclera-komplekser for enzymatisk fordøyelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Primære pRPE-cellemorfologier etter cellekultur. Representative bilder av primære pRPE-celler på (A) dag 2, (B) dag 6 og (C) dag 10. Skala bar 250 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Ekspresjonsnivåer av viktige signaturgener og proteiner i dyrkede RPE-celler. (A) qRT-PCR-analyse av mRNA-nivåer av signaturgener i primære pRPE-celler, primære hRPE-celler, ARPE-19-celler og pRPE / choroid-vev. Gapdh ble brukt som husholdergen for qRT-PCR. Fire biologiske replikaer ble brukt til primære pRPE-celler og ARPE-19-celler, mens tre biologiske replikaer ble brukt til primære hRPE-celler og pRPE / choroidvev. Genuttrykksnivåene i ARPE-19-celler ble satt som kontroller. (B) Western blot-analyse av RPE65-proteiner i ARPE-19- og pRPE-celler. Vinculin ble brukt som lastekontroll. (C) Western blot-analyse av RPE65-proteiner i primære hRPE-celler og pRPE/årehinnevev. Vinculin ble brukt som lastekontroll. Til sammenligning ble student t-test brukt, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: En-wk-kultur av primære pRPE- og ARPE-19-celler i DMEM/Basic-, DMEM/F12- og MEM-Nic-medier med 1 % FBS. (A) Na+-K+-ATPase fluorescerende farging (rød) av primære pRPE-celler i DMEM/Basic, (B) DMEM/F12 og (C) MEM-Nic-medier. (D) Na+-K+-ATPase fluorescerende farging (rød) av ARPE-19-celler i DMEM/basismedier, (E) DMEM/F12-medier og (F) MEM-Nic-medier. (G) ZO-1 fluorescerende farging (grønn) av primære pRPE-celler i DMEM / basismedier, (H) DMEM / F12-medier og (I) MEM-Nic-medier. (J) ZO-1 fluorescerende farging (grønn) i ARPE-19-celler i DMEM/basismedier, (K) DMEM/F12-medier og (L) MEM-Nic-medier. TER-målinger etter primære pRPE (M) og ARPE-19 (N) celler ble dyrket i DMEM/Basic, DMEM/F12 og MEM-Nic media for 1 wk. For hver type celler ble data hentet fra minst tre forskjellige brønner. Til sammenligning ble student t-test brukt, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Skala bar 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: To-wk kultur av pRPE-celler i DMEM / Basic-medier med 1% FBS. (A-F) Celler dyrket med eller uten laminin ble farget med RPE65 (A, B, Rød), Na + - K + -ATPase (C, D, Rød), ZO-1 (E, F, Grønn) og (G) Hoechst (Blå). (H) TER-målinger i celleark dyrket med eller uten laminin. For ulike behandlinger ble det innhentet data fra fire ulike brønner. Til sammenligning ble student t-test brukt, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Sekretoriske funksjoner av dyrkede primære pRPE- og ARPE-19-celler. (A) Western blot-analyse av VEGF og PEDF i primære pRPE- og ARPE-19-celler. (B) Utskilt VEGF i det øverste og nederste kammeret av transwell-innsatser med primære pRPE-celler når konfluente celler ble dyrket i DMEM / Basic, DMEM / F12 og MEM-Nic-medier for 1 wk. (C) Utskilt PEDF og VEGF øverst og nederst i transwell-innsatser med primær pRPE i DMEM / Basic-medier for 2 wks. For ulike behandlinger ble det innhentet data fra tre ulike brønner. Til sammenligning ble student t-test brukt, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Menneske | Sus scrofa | |
| Beste1 | F: GAAGGCAAGGACGAGCAAG | F: GGACACCTGTATGCCTACGA |
| R: TCCAACTGCTTGTGTTCTGC | R: GGAACGTGAAGAGGGGTACA | |
| Cldn19 | F: GGTGACCCAGGAGTTCTTCA | F: TCGTGACCCAGGAGTTCTTC |
| R: CTGTTGGGTCTCTCTCTCTCTCTC | R: GCTGCTGTTGGATCGCTC | |
| Itgav | F: CGCAGTCCCATCTCAAATCC | F: GCTTTCTTCAGGACGGAACA |
| R: GGCCCTGTATAAGATAGCTCGA | R: GAAATGAGCTGACCTTGCCA | |
| Krt8 | F: GGAGCAGATCAAGACCCTCA | F: CCCAGGAGAAGGAGCAGATC |
| R: GCCGCCTAAGGTTGTTGATG | R: ATGTGTCGATGTTGCTCCG | |
| Krt18 | F: CTTGGAGAAGAAGGGACCCC | F: GCTGATAATCGGAGGCTGGA |
| R: GGCCAGCTCTGTCTCATACT | R: GAAGTCATCAGCAGCGAGAC | |
| Mertk | F: GTGTGCAGCGTTCAGACAAT | F: GCGGCTATTTCTTGGTGGAA |
| R: AAAATGTTGACGGGCTCAGG | R: ACGTAGATGGGGTCAGACAC | |
| Serpinf1 | F: CAGATGAAAGGGAAGCTCGC | F: AAGACGTCGCTGGAGGATTT |
| R: TTAGGGTCCGACATCATGGG | R: GGTCACTTTCAGAGGCAGGA | |
| Slc16a8 | F: GGGTGTCCTCCATCATGCTA | F: CAGTTCGAGGTGCTCATGG |
| R: GTCAGGTAGAGCTCCAGGAG | R: GACAGCCATGAAGACACCAG | |
| Stra6 | F: CTTTGCAGGAAGAAGCTGGG | F: CTAGCCGTGTGTGTCGATCCT |
| R: TAAATGGCCGTCCCTGTCAG | R: GACCATGAAGACAGCAGCAG | |
| Tjp1 | F: ACAGGAAAATGACCGAGTTGC | F: AAGACTTGTCAGCTCAGCCA |
| R: TGGTTCAGGATCAGGACGAC | R: CCAGCATCTCGAGGTTCACT | |
| Tyr | F: ACTCAGCCCAGCATCATTCT | F: ATCTACTCAGCCCAGCATCC |
| R: ACATCAGCTGAAGAGGGGAG | R: GAGCCTTGGAGTCCTGGATT | |
| Gapdh | F: CAGCCTCAAGATCATCAGCA | F: CATCCTGGGCTACACTGAGG |
| R: ATGATGTTCTGGAGAGCCCC | R: GGGGCTCTTACTCCTTGGAG |
Tabell 1 Primere for qRT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her er det beskrevet en detaljert og optimalisert protokoll for isolering, kultur og karakterisering av RPE-celler fra svin øyeboller, som genererer en god modell for in vitro-karakterisering av RPE-celler og RPE-relaterte lidelsesstudier. Metoder for isolering av RPE fra menneske-, mus- og rotteøyne har tidligere blitt beskrevet23,24,25. Det er imidlertid vanskelig å få tak i menneskelige øyeepler i noen laboratorier, og det reiser vanligvis etiske problemstillinger. RPE-vevene til mus og rotter er relativt små, cellene blir lett skadet under separasjon, og bare noen få celler kan hentes fra hvert dyr. I motsetning til dette er svin øyeboller mye lettere å skaffe og håndtere, noe som stabilt kan generere et relativt stort antall primære celler fra et enkelt øyeboll . I noen studier brukes pinsett til mekanisk separering av RPE, noe som lett kan føre til celledød. Derfor har hyaluronsyre, dispase og Trypsin / EDTA-løsning blitt brukt til å dissosiere RPE-celler tidligere. Tidligere studier har vist at Trypsin / EDTA-løsningen har evnen til å hjelpe RPE med å løsne fra choroid21. Derfor ble Trypsin/EDTA-oppløsning brukt til å fordøye svinevevet, noe som gir optimale resultater. Etter trypsin/EDTA-nevralisering kunne RPE-vev dissosieres til enkeltcellesuspensjon ved forsiktig pipettering med pipettespiss. Et triks er at fersk Trypsin/EDTA-løsning anbefales for hvert eksperiment for å dissosiere RPE-celler fullt ut. På grunn av det store området av RPE-vevene av svineøyeboller, må det halvskålformede RPE-choroid-sclera-komplekset kuttes i form av en firkløver, noe som bidrar til full kontakt mellom RPE-vevet og Trypsin / EDTA-løsningen for å lette separasjonen fra choroid. Fordøyelsestiden bør imidlertid ikke overstige en halv time. Innen denne tiden vil andre vev unntatt RPE ikke bli fordøyd, noe som effektivt kan redusere forurensningene fra andre typer celler.
Laminin ble spredt på overflaten av transwellmembranen for å simulere den støttende effekten av Bruchs membran på RPE. Resultatene viste at laminin var gunstig for veksten av pRPE-celler, noe som stimulerte uttrykket av transportør- og tette kryssproteiner. Resultatene indikerte imidlertid også at en lengre kulturtid, på ca. 2 wks, var nødvendig for primære pRPE-celler for å gjenopprette visse funksjoner i innfødte RPE-vev, inkludert cellepolaritet og tette kryss.
En mangel for primær RPE-kultur er at det er vanskelig å opprettholde visuelle syklusenzymuttrykk in vitro. Derfor er det kritisk å undersøke om dyrkede RPE-celler kan uttrykke RPE-spesifikke proteiner RPE65. Sammenlignet med ARPE-19-celler uttrykte pRPE-celler betydelig mer RPE65-protein. I motsetning til dette ble bare et svakt bånd av RPE65-protein observert i ARPE-19-cellelysater i Western blot. Det er interessant å observere at molekylvekten til RPE65 var litt forskjellig mellom mennesker og griser (figur 3B, C). Tapet av RPE65-uttrykk i dyrkede RPE-celler forblir som et mysterium. Selv i dyrkede primærceller ble RPE65 gradvis tapt med passasjer (data ikke vist). Til nå krever hvordan man opprettholder uttrykket av RPE65 in vitro ytterligere undersøkelser, med tanke på at visuell syklus er en kritisk funksjon for innfødte RPE-vev. For det andre er en stor begrensning av denne protokollen at in vitro-dyrkede RPE-celler ikke kan passeres. Med langvarig kultur har pRPE-celler en tendens til å miste sin sekskantede form og TER samt pigmentering, slik at bare passasje 0-celler kan brukes. En annen begrensning av denne kulturprotokollen er at genetiske mutasjoner, som fører til arvelige retinale sykdommer, er vanskelige å reprodusere i disse cellene. Derfor kan virusmediert genredigering brukes til å studere arvelige RPE-lidelser som Leger medfødt amaurose i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfatterne opplyste at det ikke er noen interessekonflikter.
Alle forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å vise sin takknemlighet og respekt for alle dyr som bidrar med sine celler i denne studien. Denne studien ble delvis støttet av tilskudd fra National Key R&D Program of China (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao og Grant nr. 2018YFA0107301, Wei Li). Forfatterne takker Jingru Huang og Xiang You fra Central Lab, School of Medicine, Xiamen University for teknisk støtte i konfokal bildebehandling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ARPE-19 cells | CCTCC | GDC0323 | |
| Bovine serum albumin | Yeasen | 36101ES60 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM 880 with Airyscan | |
| ChemiDoc Touch | Bio-Rad | 1708370 | |
| Cell scraper | Sangon | F619301 | |
| 10 cm culture dish | NEST | 121621EH01 | |
| 12-well culture plate | NEST | 29821075P | |
| DMEM F12 Medium | Gibco | C11330500BT | |
| DMEM basic Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EVOM2 | World Precision Instruments | EVOM2 | For TER measurement |
| Fetal bovine serum | ExCell Bio | FSP500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 0300-0108P | |
| Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 5196-2504 | |
| hydrocortisone | MCE | HY-N0583/CS-2226 | |
| Hoechst 33342 solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| LightCycler 96 Instrument | Roche | 5815916001 | |
| Liothyronine | MCE | HY-A0070A/CS-4141 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| MEM(1X)+GlutaMAX Medium | Gibco | 10566-016 | |
| MEM NEAA(100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Millex-GP syringe filter unit | Millipore | SLGPR33RB | |
| N1 | Sigma-Aldrich | SLCF4683 | |
| NcmECL Ultra | New Cell&Molecular Biotech | P10300 | |
| Non-fat Powdered Milk | Solarbio | D8340 | |
| Nicotinamide | SparkJade | SJ-MV0061 | |
| Na+-K+ ATPase antibody | Abcam | ab76020 | Recognize both human and porcine proteins |
| PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%) | Epizyme | PG112 | |
| primary Human RPE cells | - | - | Generous gift from Shoubi Wang lab |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Prism | GraphPad by Dotmatics | version 8.0 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | APExBIO | K1024 | |
| PRE65 antibody | Proteintech | 17939-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| PEDF antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-390172 | Recognize both human and porcine proteins |
| 100 x penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-031-1BCS | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | RARBIO | RA-9005 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | Toyobo | FSQ-201 | |
| RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 601052 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 602052 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Taurine | Damas-beta | 107-35-7 | |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | RNA extraction solution |
| TB Green Fast qPCR Mix | Takara | RR430A | |
| 12-well transwell inserts | Labselect | 14212 | |
| VEGF antibody | Proteintech | 19003-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| VEGF ELISA kit | Novusbio | VAL106 | |
| ZO-1 antibody | ABclonal | A0659 | Recognize both human and porcine proteins |
References
- Tan, L. X., Germer, C. J., La Cunza, N., Lakkaraju, A. Complement activation, lipid metabolism, and mitochondrial injury: Converging pathways in age-related macular degeneration. Redox Biology. 37, 101781 (2020).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Ducloyer, J. B., Le Meur, G., Cronin, T., Adjali, O., Weber, M. Gene therapy for retinitis pigmentosa. Medecine Sciences. 36 (6-7), 607-615 (2020).
- den Hollander, A. I., Roepman, R., Koenekoop, R. K., Cremers, F. P. Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 391-419 (2008).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Smith, D. T. Melanin pigment in the pigmented epithelium of the retina of the embryo chick eye studied in vivo and in vino. The Anatomical Record. 18, 260-261 (1920).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- D'Antonio-Chronowska, A., D'Antonio, M., Frazer, K. A. In vitro differentiation of human iPSC-derived retinal pigment epithelium cells (iPSC-RPE). Bio-Protocol. 9 (24), 3469 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- Scientific, T. , Available from: https://www.thermofisher.cn/document-connect/document connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2Ftrizol_reagent.pdf (2022).
- Toyota. , Available from: https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf (2022).
- Abcam. , Available from: https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol (2022).
- Zeiss. , Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals (2022).
- Cell Signal Technology. , Available from: https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western (2022).
- Wang, S., et al. Reversed senescence of retinal pigment epithelial cell by coculture with embryonic stem cell via the TGFbeta and PI3K pathways. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 588050 (2020).
- Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Experimental Eye Research. 126, 1-4 (2014).
- Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Experimental Eye Research. 126, 5-15 (2014).
- Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. Physiology and function of the tight junction. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002584 (2009).
- Nita, M., Strzalka-Mrozik, B., Grzybowski, A., Mazurek, U., Romaniuk, W. Age-related macular degeneration and changes in the extracellular matrix. Medical Science Monitor. 20, 1003-1016 (2014).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Langenfeld, A., Julien, S., Schraermeyer, U. An improved method for the isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult rats. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1493-1502 (2015).
- Sonoda, S. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
