Summary
Aqui, um método fácil de seguir para a cultura de células epiteliais primárias do pigmento da retina suína in vitro é apresentado.
Abstract
O epitélio pigmentar da retina (EPR) é uma monocamada de células epiteliais pigmentadas polarizadas, localizadas entre a coroide e a neurorretina na retina. Múltiplas funções, incluindo fagocitose, transporte de nutrientes / metabólitos, metabolismo da vitamina A, etc., são conduzidas pelo PSE diariamente. As células PSE são células epiteliais terminalmente diferenciadas com pouca ou nenhuma capacidade regenerativa. A perda de células PSE resulta em múltiplas doenças oculares que levam à deficiência visual, como a degeneração macular relacionada à idade. Portanto, o estabelecimento de um modelo de cultura in vitro de células primárias de EPR, que mais se assemelha ao PSE in vivo do que linhagens celulares, é fundamental para os estudos característicos e mecanicistas de células de EPR. Considerando o fato de que a fonte de globos oculares humanos é limitada, criamos um protocolo para cultivar células primárias de PSE suína. Usando este protocolo, as células RPE podem ser facilmente dissociadas dos globos oculares suínos adultos. Posteriormente, essas células dissociadas se ligam a placas / inserções de cultura, proliferam para formar uma monocamada confluente e restabelecem rapidamente as principais características do tecido epitelial in vivo dentro de 2 semanas. Por qRT-PCR, demonstra-se que as células primárias de PSE suína expressam múltiplos genes de assinatura em níveis comparáveis com o tecido RPE nativo, enquanto as expressões da maioria desses genes são perdidas/altamente reduzidas em células humanas semelhantes a RPE, ARPE-19. Além disso, a coloração por imunofluorescência mostra a distribuição de proteínas de junção apertada, polaridade tecidual e citoesqueleto, bem como a presença de RPE65, uma isomerase crítica para o metabolismo da vitamina A, em células primárias cultivadas. No total, desenvolvemos uma abordagem fácil de seguir para cultivar células primárias de PSE suíno com alta pureza e características nativas de RPE, o que poderia servir como um bom modelo para entender a fisiologia da EPR, estudar toxicidades celulares e facilitar exames de drogas.
Introduction
O epitélio pigmentar da retina (EPR) está localizado entre fotorreceptores e coriocapilares na camada externa da retina1 com múltiplas funções, incluindo a formação da barreira sangue-retina, transporte e troca de nutrientes e metabólitos da retina, reciclagem de vitamina A para manter um ciclo visual normal e fagocitose e depuração dos segmentos externos fotorreceptores (POSs)2,3 . Como os POSs requerem auto-renovação constante para gerar visão, as células RPE precisam engolir continuamente os POSs destacados para manter a homeostase da retina4. Portanto, a disfunção do PSE resulta em muitas doenças oculares cegantes, como degeneração macular relacionada à idade (DMRI)4, retinite pigmentosa (RP)5, amaurose congênita de Leber6, retinopatia diabética7, etc. Até agora, a patogênese exata da maioria dessas doenças permanece indescritível. Como resultado, a cultura de células RPE é estabelecida para estudar a biologia celular RPE, alterações patológicas e mecanismos subjacentes.
Como o modelo mais simples para estudar a biologia celular, a cultura de células RPE foi iniciada já na década de 19208. Embora o ARPE-19 seja amplamente utilizado como células RPE, a perda de pigmentação, a morfologia do paralelepípedo e, especialmente, as funções de barreira nessa linhagem celular levantam muitas preocupações9. Em comparação, a cultura de células primárias de EPR humanas oferece um cenário mais realista para estudos fisiológicos e patológicos9. No entanto, a disponibilidade relativamente limitada restringe seu uso e sempre existem questões éticas. Além disso, vários grupos usaram modelos de camundongos para cultivar células RPE. No entanto, o tamanho do olho do rato é pequeno, e uma única cultura geralmente requer muitos ratos, o que não é conveniente9. Recentemente, os cientistas desenvolveram novos métodos para usar células-tronco embrionárias humanas ou células-tronco pluripotentes induzidas para derivar células RPE. Embora essa técnica tenha um potencial particular para o tratamento de distúrbios hereditários do PSE, é demorada e geralmente requer vários meses para gerar células maduras do PSE10. Para superar esses problemas, aqui apresentamos um protocolo fácil de seguir para isolar e cultivar células RPE de alta pureza em laboratório rotineiramente. Sob condições de cultura adequadas, essas células podem exibir funções RPE típicas e exibir morfologias RPE típicas. Portanto, esse método de cultura pode fornecer um bom modelo para entender a fisiologia do EPR, estudar a citotoxicidade, investigar mecanismos patológicos de doenças oculares relacionadas e realizar exames de drogas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
O uso de animais experimentais cumpriu os regulamentos da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) e foi aprovado pelo Comitê de Ética de Manejo de Animais Experimentais da Universidade de Xiamen.
1. Preparação de dispositivos cirúrgicos experimentais, enzima de digestão tecidual e tampão de cultura celular
- Preparar os dispositivos cirúrgicos experimentais, limpando e autoclavando dois pares de tesouras cirúrgicas oftálmicas e fórceps no dia anterior à dissecção do globo ocular e, posteriormente, secando a caixa com dispositivos cirúrgicos em forno de protocolo geral a 65 °C durante a noite.
- Preparação de meios de cultura.
- Preparar DMEM/Meios básicos suplementados com 10% (v/v) de soro fetal bovino, 2 mM de L-glutamina e 1% (v/v) de penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 U/mL).
- Preparar meios DMEM/F12 suplementados com FBS a 1% (v/v) e penicilina a 1% (v/v) (100 U/mL) e estreptomicina (100 U/mL).
- Preparar MEM-Nic 11, suplementando MEM alfa com 2 mM L-glutamina, 1% FBS, 1% (v/v) de penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 U/mL), 0,1 mM de NEAA, 1% (v/v) de suplemento de N1, taurina (0,25 mg/mL), hidrocortisona (20 ng/mL), triiodo-tironina (0,013 ng/mL) e nicotinamida10 mM.
NOTA: Para melhorar a viabilidade e proliferação celular, a porcentagem de FBS pode ser aumentada para 20% para neutralizar as enzimas de digestão e semear as células dissociadas. Para a cultura celular de longo prazo, a porcentagem de FBS pode ser reduzida para até 1%12.
- Descongelar a alíquota da enzima de digestão tecidual (0,25% (p/v) solução de tripsina/EDTA suplementada com EDTA 0,91 mM, a seguir designada por solução de tripsina/EDTA) durante a experiência.
NOTA: A solução fresca de tripsina/EDTA deve ser usada sempre para obter os melhores resultados. Aliquot 10 ml de solução fresca de tripsina/EDTA em cada tubo centrífugo estéril de 15 ml e congelar as alíquotas a -20 °C do frigorífico até à utilização. - Solução de dissecação.
- Esterilizar 1x Fosfato Tamponado Salino (PBS) (pH 7,2) suplementado com 2% (v/v) de penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 U/mL) filtrando a solução através de uma unidade de filtro de seringa de 0,22 μm.
- Revestir as placas de cultura e as inserções transwell.
- Lave os poços e as inserções transwell com 1x PBS. Remova o PBS dos poços e transpoços com uma pipeta e, em seguida, adicione 1 mL de PBS fresco 1x à câmara inferior e 600 μL de 10 μg/mL de solução de laminina à câmara superior.
- Incubar as placas/inserções transwell na incubadora de cultura celular durante a noite a 37 °C e 5% de CO2. Retire a solução de laminina da câmara superior e lave com 1 mL de PBS 1x frio duas vezes antes de semear as células.
2. Dissecção das células RPE do globo ocular suíno
- Preparação dos instrumentos.
- Limpe o exaustor de fluxo laminar com etanol a 75% e luz UV. Prepare três tubos de centrífuga estéreis de 50 mL contendo ~25 mL de etanol a 75%, três tubos de centrífuga estéril de 50 mL contendo ~25 mL de 1x PBS e três placas de cultura de células estéreis de 10 cm contendo ~15 mL de 1x PBS.
NOTA: Essas configurações geralmente são usadas para dissecar quatro globos oculares suínos. Por favor, aumente a escala quando mais globos oculares forem usados. Para melhorar a viabilidade celular, pré-resfrie 1x tampão PBS no gelo por pelo menos 30 min. Tanto o etanol a 75% quanto a luz UV são necessários para garantir que os instrumentos e células experimentais não sejam contaminados. Ligue a lâmpada UV com antecedência para esterilizar toda a mesa de operação por pelo menos 15 minutos.
- Limpe o exaustor de fluxo laminar com etanol a 75% e luz UV. Prepare três tubos de centrífuga estéreis de 50 mL contendo ~25 mL de etanol a 75%, três tubos de centrífuga estéril de 50 mL contendo ~25 mL de 1x PBS e três placas de cultura de células estéreis de 10 cm contendo ~15 mL de 1x PBS.
- Limpe os globos oculares suínos.
- Obtenha globos oculares frescos de um matadouro e mantenha-os no gelo até a dissecação. Mergulhe quatro globos oculares suínos em ~ 15 mL de etanol a 75% em uma placa de Petri de 10 cm e use um par de tesouras e pinças para cortar todos os tecidos conjuntivos e músculos residuais.
NOTA: Remova o máximo de tecido possível de fora da esclera para reduzir as contaminações. Não corte o nervo óptico neste momento para facilitar a transferência dos globos oculares durante a etapa de descontaminação e lavagem. Após essa etapa, todos os procedimentos devem ser realizados em um exaustor de fluxo laminar.
- Obtenha globos oculares frescos de um matadouro e mantenha-os no gelo até a dissecação. Mergulhe quatro globos oculares suínos em ~ 15 mL de etanol a 75% em uma placa de Petri de 10 cm e use um par de tesouras e pinças para cortar todos os tecidos conjuntivos e músculos residuais.
- Descontaminar os globos oculares suínos por imersão e lavagem de quatro globos oculares suínos em três tubos centrífugos estéreis de 50 mL preenchidos com etanol a 75% de forma sequencial; cada globo ocular é mergulhado por pelo menos 5 minutos em cada tubo. Em seguida, lave os globos oculares suínos em três tubos centrífugos estéreis de 50 mL preenchidos com 1x PBS de forma sequencial; lavar cada globo ocular por pelo menos 5 min em cada tubo (Figura 1A). Inverta os tubos a cada minuto para lavar bem os globos oculares.
- Dissecção de globos oculares suínos.
- Mova os quatro globos oculares suínos para um prato de cultura de células estéreis de 10 cm contendo 1x PBS. Aparar a superfície externa de cada globo ocular novamente para remover o nervo óptico e pequenos detritos (Figura 1B). Use uma tesoura para fazer um pequeno corte na interseção do limbo e da esclera e, em seguida, remova a córnea, a íris, o cristalino, o corpo vítreo e a retina neural (para obter estruturas detalhadas desses tecidos, consulte a Figura 1).
- Transfira o complexo RPE-coróide-esclera para um novo prato de cultura celular de 10 cm e faça quatro cortes para achatar o copo do olho na forma de um trevo de quatro folhas (Figura 1C).
- Execute a digestão da solução de tripsina/EDTA colocando os quatro complexos RPE-coróide-esclera em um novo prato de 10 cm. Deite 20 ml de solução fresca de tripsina/EDTA para fundir os complexos RPE-coróide-esclera e colocar o prato na incubadora de cultura celular a 37 °C durante ~30 min.
NOTA: Use a solução fresca de tripsina/EDTA para dissociar as células RPE. Controle cuidadosamente o tempo de digestão da solução de tripsina/EDTA, pois um tempo de incubação mais longo (mais de 30 min) pode aumentar a contaminação de outros tipos de células.
3. Isolamento e cultura de células PSE do globo ocular suíno
- Dissociação do PSE.
- Retirar o prato da incubadora após 30 min de incubação com solução de tripsina/EDTA e adicionar 20 mL de meio de cultura pré-aquecido (com FBS a 10%) ao prato para neutralizar a solução de tripsina/EDTA.
Observação : nesta etapa, somente mídia DMEM/Basic é usada. Quando as células atingem a confluência, três meios de cultura podem ser usados, dependendo das condições experimentais: DMEM/Meios básicos, meios DMEM/F12 e meios MEM-Nic. - Use uma pipeta de transferência de 5 mL para dissociar as células RPE pipetando suavemente várias vezes. Coletar suspensões celulares em tubos de centrífuga de 15 mL. Use outros 10 mL de meios de cultura frescos (10% FBS) para lavar os complexos RPE-coróide-esclera no prato por pipetagem suave para obter o maior número possível de células RPE.
NOTA: Não triture as células com demasiada vigor. Certifique-se de encher e esvaziar a pipeta a uma taxa de cerca de 3 mL/s. Evite borbulhar a suspensão celular.
- Retirar o prato da incubadora após 30 min de incubação com solução de tripsina/EDTA e adicionar 20 mL de meio de cultura pré-aquecido (com FBS a 10%) ao prato para neutralizar a solução de tripsina/EDTA.
- Recolha de células RPE centrifugando os tubos a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante usando uma pipeta e adicionar mais 5 mL de meio de cultura (10% FBS) para ressuspender as células e centrifugar a 200 x g por mais 5 min. Decante o sobrenadante e ressuspenda as células com 12 mL de meio de cultura.
NOTA: Ao aspirar o sobrenadante, deixe cerca de 1 mL de meio para evitar a quebra de aglomerados celulares. - Semeadura de células RPE.
- Semear ~1-2 x 105 células/poço em placas de cultura de 12 poços ou inserções transwell. Normalmente, cerca de 1,5 x 106 células RPE são obtidas a partir de quatro globos oculares suínos. Altere o meio de cultura a cada 2 dias e reduza a concentração sérica para 1% quando as células cobrirem totalmente a superfície dos poços/pastilhas.
NOTA: Não mova a placa de cultura de células com demasiada frequência antes de as células se ligarem à placa de cultura/pastilhas.
- Semear ~1-2 x 105 células/poço em placas de cultura de 12 poços ou inserções transwell. Normalmente, cerca de 1,5 x 106 células RPE são obtidas a partir de quatro globos oculares suínos. Altere o meio de cultura a cada 2 dias e reduza a concentração sérica para 1% quando as células cobrirem totalmente a superfície dos poços/pastilhas.
- Troque o meio de cultura a cada 2 dias até que as células sejam colhidas.
NOTA: A concentração de FBS pode ser reduzida depois que as células atingem a confluência, e as células podem ser cultivadas por até vários meses para permitir a diferenciação e maturação completas.
4. Caracterização de células primárias de PSE suíno
- Corte as células na confluência por 1 ou 2 semanas e, em seguida, colha as células para uma análise mais aprofundada.
- Células de colheita para análise quantitativa de PCR em tempo real (qRT-PCR).
- Remova o meio de cultura, lave as células com 1 mL de PBS frio 1x e, em seguida, adicione 500 μL de solução de extração de RNA em cada poço para coletar lisado celular de cerca de 1 x 106 células.
- Extrair mRNA13; aproximadamente 4 μg de RNA são extraídos de cada amostra. Utilizar 100 ng de mRNA para realizar a transcrição reversa14; diluir o cDNA 40 vezes para análise quantitativa de PCR em tempo real. Os primers estão listados na Tabela 1.
- Colha células para coloração por imunofluorescência.
- Remova o meio de cultura, lave as células com 1 mL de PBS frio 1x e, em seguida, adicione 500 μL de paraformaldeído a 4% (p/v) em 1x PBS para fixar as células (cerca de 1 x 106 células/poço) por 30 min à temperatura ambiente. Em seguida, lavar as células com 1x PBS duas vezes e realizar coloração por imunofluorescência com anticorpos primários (1:100 em 1x PBS suplementado com albumina sérica bovina a 1% (p/v)) a 4 °C durante a noite e anticorpos secundários (1:200 em 1x PBS suplementado com 1% (p/v) de albumina sérica bovina) à temperatura ambiente por 2 h de acordo com protocolos on-line15.
- As imagens de imunofluorescência são adquiridas por microscópio confocal seguindo o manual on-line16.
- Células de colheita para análise de Western blot.
- Remova o meio de cultura, lave as células com PBS frio 1x duas vezes e, em seguida, adicione 80 μL de tampão RIPA (com 1x inibidor de protease) em cada poço e use raspadores de células para arranhar cerca de 1 x 106 células dos pratos/inserções.
- Recolher o lisado celular de cada poço/inserção num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Ferva os lisados celulares por 10 minutos e, em seguida, meça as concentrações de proteína usando kits de BCA; a concentração de proteína de cada amostra é de cerca de 2 mg/mL. Utilizar 25 μg de proteínas de cada amostra para análise de Western blot de acordo com protocolos on-line17.
- Para Western blot, incubar as membranas em 5 mL de solução primária de anticorpos (diluição 1:1.000 de anticorpos primários em solução 1x TBST suplementada com albumina sérica bovina a 5% (p/v)) a 4 °C durante a noite em um agitador multiuso rotativo.
- Em seguida, incubar a membrana com cerca de 15 mL de solução de anticorpo secundário anticoelho ou antirato (diluição de 1:5.000 de anticorpos secundários em solução de TBST 1x suplementada com leite desnatado a 5% (p/v)) à temperatura ambiente por 2 h em um agitador orbital, de acordo com a fonte de anticorpo primário utilizada.
- Medição da resistência transepitelial (TER).
- Lave os eletrodos de pauzinho com etanol a 70% e PBS 1x estéril de forma sequencial. Em seguida, coloque a extremidade mais curta do eletrodo na câmara superior e a extremidade mais longa na câmara inferior das inserções do transpoço e clique no botão no voltímetro epitelial para as medições. Registre as medições de TER de cada poço em triplicados.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
As células primárias de PSE suíno (pRPE) foram cultivadas em meio DMEM/Basic com 10% de FBS, e a morfologia celular em microscópio de luz foi fotografada aos 2 dias (Figura 2A), 6 dias (Figura 2B) e 10 dias (Figura 2C) após a semeadura. Após 1 semana, observou-se uma monocamada confluente de células de pRPE pigmentadas com morfologias de paralelepípedos.
Para melhor caracterizar as células primárias de pRPE, as células primárias de PSE humana (hRPE) na Passagem 3 (P3)18 e as células ARPE-19 foram cultivadas em meio DMEM/Basic com FBS a 1% para outra p.a. e, em seguida, o mRNA total e a proteína das células cultivadas, bem como os tecidos suínos de PSE/coroide, foram colhidos. Os níveis de expressão dos principais genes característicos19 e os marcadores proteicos de PSE maduro foram avaliados por qRT-PCR e Western blot. Em comparação com as células ARPE-19, as células pRPE mantiveram níveis de expressão significativamente mais elevados de genes que funcionam na secreção nativa de EPR (Figura 3A(c)), fagocitose (Figura 3A(i)), transporte (Figura 3A(a),(d)), junções apertadas (Figura 3A(j)), formação de barreira (Figura 3A(b)), bem como ciclo visual (Figura 3A(e),B). No entanto, os níveis de expressão de Krt8 e Krt18, dois genes marcadores do citoesqueleto do PSE, foram significativamente menores nas células primárias de pRPE em comparação com as células primárias hRPE e ARPE-19 (Figura 3A(g),(h)). Além disso, o itgav, que participa da fagocitose, também foi menor nas células primárias da RPE (Figura 3A(f)). Uma vez que os níveis de expressão desses três genes em células pRPE foram semelhantes com o tecido suíno RPE/coroide, isso pode indicar as diferenças de expressão gênica entre as espécies. Além disso, o nível de expressão de Tyr, que é responsável pela produção de melanina, foi altamente reduzido em células primárias de pRPE e hRPE (Figura 3A(k)), o que pode explicar a perda de pigmentação em células cultivadas a longo prazo. As diferenças nos resultados da qRT-PCR observadas nos dados de pRPE humana e células de pRPE suína podem ser devidas ao armazenamento mais longo e ao maior número de passagem (P3) da pRPE humana, indicando assim uma perda de caracteres RPE na subcultura. Além disso, Western blot mostrou que a proteína RPE65, que é uma enzima chave no ciclo visual com células RPE, foi expressa em células pRPE, enquanto seu nível de expressão foi significativamente reduzido em células hRPE primárias e células ARPE-19 (Figura 3B,C).
Para caracterizar ainda mais as funções de polaridade e barreira das células RPE, as monocamadas confluentes cultivadas de células pRPE e ARPE-19 foram cultivadas em inserções transwell com meios DMEM/Basic, DMEM/F12 e MEM-Nic por 1 semana (Figura 4). Nessas condições de cultura, os resultados da coloração fluorescente Na+-K+-ATPase (Figura 4A-F) e ZO-1 (Figura 4G-L) revelaram que as células pRPE apresentaram níveis de expressão mais elevados de Na+-K+-ATPase e ZO-1 do que as células ARPE-19. A distribuição igualitária de Na+-K+-ATPase na superfície apical e basal das células pRPE indicou que um tempo de cultura mais longo era necessário para restaurar as polaridades celulares in vitro.
O EPR forma junções apertadas próximas à sua superfície apical para regular rigidamente a troca de metabólitos entre a retina interna e as coroides20. A coloração ZO-1 sugeriu que as proteínas de junção apertada estavam normalmente localizadas na membrana plasmática de células primárias de pRPE com morfologias regulares de paralelepípedos, mas não de células ARPE-19. Dentre os três meios de cultura, os melhores padrões de coloração ZO-1 foram observados em células cultivadas em DMEM/Basic, enquanto DMEM/F12 não conseguiram manter a morfologia de paralelepípedos das células de pRPE. Um maior valor de TER serve como um indicador de formação de junção apertada e melhores funções de barreira das células RPE21. Para confirmar a função das junções apertadas, foi medida a resistência transepitelial (TER). No entanto, apenas um TER ligeiramente maior foi detectado em comparação com as inserções transwell vazias (Figura 4M,N).
Na retina, a membrana de Bruch existe entre o PSE e a coroide. Os principais componentes da membrana de Bruch são colágeno tipo IV, proteoglicanos e laminina22. A fim de simular o efeito de suporte da membrana de Bruch sobre a PSE, a laminina foi espalhada na superfície da membrana transwell para facilitar a maturação das células de EPR cultivadas. Com base nos resultados obtidos da Figura 4, as células de pRPE confluentes foram cultivadas em pastilhas transwell em meio DMEM/Basic com FBS a 1% por 2 semanas. Os resultados da coloração imunofluorescente mostraram que as proteínas específicas do PSE65 foram expressas em todas as células da pRPE (Figura 5A,B). A Na+-K+-ATPase foi distribuída na superfície apical das células de pRPE, sugerindo o restabelecimento das polaridades celulares (Figura 5C,D). Tanto a coloração ZO-1 quanto os resultados do TER indicaram que junções apertadas foram bem formadas em células primárias de pRPE quando foram cultivadas com laminina (Figura 5E,F,H). A Figura 5G mostra as células coradas com corante Hoechst.
Além disso, Western blot demonstrou que tanto as células pRPE quanto as ARPE-19 produziram fatores de crescimento, incluindo o fator derivado do epitélio pigmentar (PEDF) e o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (Figura 6A). Após o cultivo de monocamadas confluentes de pRPE em inserções transwell com meios DMEM/Basic, DMEM/F12 e MEM-Nic por 1 semana, os meios de cultura das câmaras superior e inferior das pastilhas transwell foram coletados, e o VEGF secretado foi quantificado por ELISA. Quando os meios DMEM/Basic e MEM-Nic foram utilizados para a cultura celular, as células pPRE secretaram mais VEGF do que as células nos meios DMEM/F12 (Figura 6B). No entanto, não foi possível detectar diferenças nas quantidades de VEGF entre as câmaras superior e inferior das pastilhas transwell em todas as condições testadas (Figura 6B). Além disso, após o cultivo de células primárias de pRPE nas pastilhas revestidas com laminina e em meio DMEM/Basic por 2 semanas, os meios das câmaras superior e inferior foram coletados. A análise de Western blot mostrou níveis mais elevados de PEDF na câmara superior do que na câmara inferior, enquanto os níveis de proteína do VEGF secretado foram semelhantes em ambas as câmaras (Figura 6C). Esses resultados apoiaram ainda mais o restabelecimento da polaridade celular quando as células primárias de pRPE foram cultivadas por mais 2 semanas depois de atingirem a confluência com a laminina.
Figura 1: Etapas básicas do isolamento celular da pRPE . (A) Lave os globos oculares suínos com 1x PBS em tubos centrífugas estéreis de 50 mL. (B,C) Prepare complexos RPE-coróide-esclera para digestão enzimática. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Morfologias celulares primárias de pRPE após cultura celular. Imagens representativas de células primárias de pRPE no (A) Dia 2, (B) Dia 6 e (C) Dia 10. Barra de escala 250 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Níveis de expressão de genes-chave de assinatura e proteínas em células de EPR cultivadas. (A) Análise qRT-PCR dos níveis de mRNA de genes de assinatura em células primárias de pRPE, células hRPE primárias, células ARPE-19 e tecido pRPE/coroide. Gapdh foi usado como o gene de manutenção da casa para qRT-PCR. Quatro replicações biológicas foram usadas para células primárias de pRPE e células ARPE-19, enquanto três replicações biológicas foram usadas para células primárias de hRPE e tecido pRPE/coroide. Os níveis de expressão gênica nas células ARPE-19 foram definidos como controles. (B) Análise de Western blot das proteínas RPE65 em células ARPE-19 e pRPE. A vinculina foi utilizada como controle de carga. (C) Análise de Western blot das proteínas RPE65 em células hRPE primárias e tecido pRPE/coroide. A vinculina foi utilizada como controle de carga. Para comparação, utilizou-se o teste t de Student, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Cultura de uma semana de células primárias de pRPE e ARPE-19 em meios DMEM/Basic, DMEM/F12 e MEM-Nic com 1% de FBS. (A) Coloração fluorescente de Na+-K+-ATPase (Vermelho) de células primárias de pRPE em meios DMEM/Basic, (B) DMEM/F12 e (C) MEM-Nic. (D) Coloração fluorescente de Na+-K+-ATPase (Vermelho) de células ARPE-19 em meios DMEM/Básicos, (E) meios DMEM/F12 e (F) meios MEM-Nic. (G) coloração fluorescente ZO-1 (Verde) de células primárias de pRPE em meios DMEM/Basic, (H) meios DMEM/F12 e (I) meios MEM-Nic. (J) Coloração fluorescente ZO-1 (Verde) em células ARPE-19 em meios DMEM/Básicos, (K) meios DMEM/F12 e (L) meios MEM-Nic. As medidas do TER após células primárias de pRPE (M) e ARPE-19 (N) foram cultivadas em meios DMEM/Basic, DMEM/F12 e MEM-Nic por 1 semana. Para cada tipo de célula, os dados foram obtidos de pelo menos três poços diferentes. Para comparação, utilizou-se o teste t de Student, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Barra de escala de 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Cultura de duas semanas de células pRPE em meio DMEM/Basic com 1% de FBS. (A-F) As células cultivadas com ou sem laminina foram coradas com RPE65 (A,B, Vermelho), Na+-K+-ATPase (C,D, Vermelho), ZO-1 (E,F, Verde) e (G) Hoechst (Azul) . (H) Medidas do TER em folhas celulares cultivadas com ou sem laminina. Para diferentes tratamentos, os dados foram obtidos de quatro poços diferentes. Para comparação, utilizou-se o teste t de Student, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Funções secretoras de células primárias cultivadas de pRPE e ARPE-19. (A) Análise de Western blot de VEGF e PEDF em células primárias de pRPE e ARPE-19. (B) VEGF secretado na câmara superior e inferior das inserções transwell com células primárias de pRPE quando células confluentes foram cultivadas em meios DMEM/Basic, DMEM/F12 e MEM-Nic por 1 semana. (C) PEDF e VEGF secretados na câmara superior e inferior das pastilhas transwell com pRPE primária em meio DMEM/Basic por 2 semanas. Para diferentes tratamentos, os dados foram obtidos de três poços diferentes. Para comparação, utilizou-se o teste t de Student, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Humanidade | Sus scrofa | |
| Melhor1 | F: GAAGGCAAGGACGAGCAAG | F: GGACACCTGTATGCCTACGA |
| R: TCCAACTGCTTGTGTTCTGC | R: GGAACGTGAAGAGGGGTACA | |
| Cldn19 | F: GGTGACCCAGGAGTTCTTCA | F: TCGTGACCCAGGAGTTCTTC |
| R: CTGTTGGGTCTCTCTGGCTC | R: GCTGCTGTTGGATCGCTC | |
| Itgav | F: CGCAGTCCCATCTCAAATCC | F: GCTTTCTTCAGGACGGAACA |
| R: GGCCCTGTATAAGATAGCTCGA | R: GAAATGAGCTGACCTTGCCA | |
| Krt8 | F: GGAGCAGATCAAGACCCTCA | F: CCCAGGAGAAGGAGCAGATC |
| R: GCCGCCTAAGGTTGTTGATG | R: ATGTTGTCGATGTTGCTCCG | |
| Krt18 | F: CTTGGAGAAGAAGGGACCCC | F: GCTGATAATCGGAGGCTGGA |
| R: GGCCAGCTCTGTCTCATACT | R: GAAGTCATCAGCAGCGAGAC | |
| Mertk • | F: GTGTGCAGCGTTCAGACAAT | F: GCGGCTATTTCTTGGTGGAA |
| R: AAAATGTTGACGGGCTCAGG | R: ACGTAGATGGGGTCAGACAC | |
| Serpinf1 | F: CAGATGAAAGGGAAGCTCGC | F: AAGACGTCGCTGGAGGATTT |
| R: TTAGGGTCCGACATCATGGG | R: GGTCACTTTCAGAGGCAGGA | |
| Slc16a8 | F: GGGTGTCCTCCATCATGCTA | F: CAGTTCGAGGTGCTCATGG |
| R: GTCAGGTAGAGCTCCAGGAG | R: GACAGCCATGAAGACACCAG | |
| Estra6 | F: CTTTGCAGGAAGAAGCTGGG | F: CTAGCCGTGTTGTCGATCCT |
| R: TAAATGGCCGTCCCTGTCAG | R: GACCATGAAGACAGCAGCAGCAG | |
| Tjp1 | F: ACAGGAAAATGACCGAGTTGC | F: AAGACTTGTCAGCTCAGCCA |
| R: TGGTTCAGGATCAGGACGAC | R: CCAGCATCTCGAGGTTCACT | |
| Tyr | F: ACTCAGCCCAGCATCATTCT | F: ATCTACTCAGCCCAGCATCC |
| R: ACATCAGCTGAAGAGGAG | R: GAGCCTTGGAGTCCTGGATT | |
| Gapdh • | F: CAGCCTCAAGATCATCAGCA | F: CATCCTGGGCTACACTGAGG |
| R: ATGATGTTCTGGAGAGCCCC | R: GGGGCTCTTACTCCTTGGAG |
Tabela 1: Primers para qRT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aqui, um protocolo detalhado e otimizado para o isolamento, cultura e caracterização de células RPE de globos oculares suínos, o que gera um bom modelo para caracterização in vitro de células RPE e estudos de distúrbios relacionados ao RPE foi descrito. Métodos para o isolamento do PSE de olhos humanos, camundongos e ratos foram descritos anteriormente23,24,25. No entanto, é difícil obter globos oculares humanos em alguns laboratórios e geralmente levanta questões éticas. Os tecidos de EPR de camundongos e ratos são relativamente pequenos, as células são facilmente danificadas durante a separação e apenas algumas células podem ser obtidas de cada animal. Em contraste, os globos oculares suínos são muito mais fáceis de obter e manusear, o que poderia gerar de forma estável um número relativamente grande de células primárias a partir de um único globo ocular. Em alguns estudos, as pinças são usadas para separar mecanicamente a EPR, o que pode facilmente levar à morte celular. Portanto, ácido hialurônico, dispase e solução de tripsina/EDTA foram empregados para dissociar as células RPE anteriormente. Estudos anteriores mostraram que a solução de tripsina/EDTA tem a capacidade de ajudar a PSE a se desprender da coroide21. Portanto, a solução de tripsina/EDTA foi utilizada para digerir os tecidos suínos, que geram ótimos resultados. Após a neuralização da tripsina/EDTA, os tecidos de EPR poderiam ser dissociados em suspensão de célula única por pipetagem suave com uma ponta de pipeta. Um truque é que a solução fresca de tripsina / EDTA é recomendada para cada experimento para dissociar totalmente as células RPE. Devido à grande área dos tecidos de EPR dos globos oculares suínos, o complexo RPE-coróide-esclera em forma de meia tigela precisa ser cortado na forma de um trevo de quatro folhas, que é propício ao contato total entre os tecidos de EPR e a solução de tripsina / EDTA, de modo a facilitar sua separação da coroide. No entanto, o tempo de digestão não deve exceder meia hora. Dentro deste tempo, outros tecidos, exceto RPE, não serão digeridos, o que poderia efetivamente reduzir as contaminações de outros tipos de células.
A laminina foi espalhada na superfície da membrana transwell para simular o efeito de suporte da membrana de Bruch na EPR. Os resultados mostraram que a laminina foi benéfica para o crescimento de células de pRPE, o que estimulou a expressão de proteínas transportadoras e de junção apertada. No entanto, os resultados também indicaram que um tempo de cultura mais longo, de cerca de 2 semanas, foi necessário para que as células primárias de pRPE restaurassem certas características dos tecidos nativos de PSE, incluindo a polaridade celular e as junções apertadas.
Uma deficiência para a cultura primária de PSE é que é difícil manter as expressões enzimáticas do ciclo visual in vitro. Portanto, é fundamental examinar se as células RPE cultivadas poderiam expressar proteínas específicas de RPE65. Em comparação com as células ARPE-19, as células pRPE expressaram significativamente mais proteína RPE65. Em contraste, apenas uma banda fraca de proteína RPE65 foi observada em lisados celulares ARPE-19 em Western blot. É interessante observar que o peso molecular do RPE65 foi ligeiramente diferente entre humanos e suínos (Figura 3B,C). A perda da expressão de RPE65 em células de EPR cultivadas permanece como um mistério. Mesmo em células primárias cultivadas, o RPE65 foi gradualmente perdido com as passagens (dados não mostrados). Até agora, como manter a expressão de RPE65 in vitro requer uma investigação mais aprofundada, considerando o fato de que o ciclo visual é uma função crítica para os tecidos nativos de EPR. Em segundo lugar, uma grande limitação deste protocolo é que as células RPE cultivadas in vitro não podem ser transmitidas. Com a cultura prolongada, as células pRPE tendem a perder sua forma hexagonal e TER, bem como pigmentação, de modo que apenas as células de passagem 0 podem ser usadas. Outra limitação desse protocolo de cultura é que as mutações genéticas, que levam a doenças hereditárias da retina, são difíceis de reproduzir nessas células. Portanto, a edição de genes mediada por vírus pode ser empregada para estudar distúrbios hereditários de PSE, como a amaurose congênita de Leger, no futuro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Todos os autores revelaram que não há conflitos de interesse.
Todos os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores gostariam de mostrar sua gratidão e respeito a todos os animais que contribuem com suas células neste estudo. Este estudo foi apoiado em parte por doações do Programa Nacional de P & D da China (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao e Grant nos. 2018YFA0107301, Wei Li). Os autores agradecem a Jingru Huang e Xiang You do Laboratório Central, Escola de Medicina, Universidade de Xiamen, pelo apoio técnico em imagens confocais.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ARPE-19 cells | CCTCC | GDC0323 | |
| Bovine serum albumin | Yeasen | 36101ES60 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM 880 with Airyscan | |
| ChemiDoc Touch | Bio-Rad | 1708370 | |
| Cell scraper | Sangon | F619301 | |
| 10 cm culture dish | NEST | 121621EH01 | |
| 12-well culture plate | NEST | 29821075P | |
| DMEM F12 Medium | Gibco | C11330500BT | |
| DMEM basic Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EVOM2 | World Precision Instruments | EVOM2 | For TER measurement |
| Fetal bovine serum | ExCell Bio | FSP500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 0300-0108P | |
| Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 5196-2504 | |
| hydrocortisone | MCE | HY-N0583/CS-2226 | |
| Hoechst 33342 solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| LightCycler 96 Instrument | Roche | 5815916001 | |
| Liothyronine | MCE | HY-A0070A/CS-4141 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| MEM(1X)+GlutaMAX Medium | Gibco | 10566-016 | |
| MEM NEAA(100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Millex-GP syringe filter unit | Millipore | SLGPR33RB | |
| N1 | Sigma-Aldrich | SLCF4683 | |
| NcmECL Ultra | New Cell&Molecular Biotech | P10300 | |
| Non-fat Powdered Milk | Solarbio | D8340 | |
| Nicotinamide | SparkJade | SJ-MV0061 | |
| Na+-K+ ATPase antibody | Abcam | ab76020 | Recognize both human and porcine proteins |
| PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%) | Epizyme | PG112 | |
| primary Human RPE cells | - | - | Generous gift from Shoubi Wang lab |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Prism | GraphPad by Dotmatics | version 8.0 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | APExBIO | K1024 | |
| PRE65 antibody | Proteintech | 17939-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| PEDF antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-390172 | Recognize both human and porcine proteins |
| 100 x penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-031-1BCS | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | RARBIO | RA-9005 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | Toyobo | FSQ-201 | |
| RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 601052 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 602052 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Taurine | Damas-beta | 107-35-7 | |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | RNA extraction solution |
| TB Green Fast qPCR Mix | Takara | RR430A | |
| 12-well transwell inserts | Labselect | 14212 | |
| VEGF antibody | Proteintech | 19003-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| VEGF ELISA kit | Novusbio | VAL106 | |
| ZO-1 antibody | ABclonal | A0659 | Recognize both human and porcine proteins |
References
- Tan, L. X., Germer, C. J., La Cunza, N., Lakkaraju, A. Complement activation, lipid metabolism, and mitochondrial injury: Converging pathways in age-related macular degeneration. Redox Biology. 37, 101781 (2020).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Ducloyer, J. B., Le Meur, G., Cronin, T., Adjali, O., Weber, M. Gene therapy for retinitis pigmentosa. Medecine Sciences. 36 (6-7), 607-615 (2020).
- den Hollander, A. I., Roepman, R., Koenekoop, R. K., Cremers, F. P. Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 391-419 (2008).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Smith, D. T. Melanin pigment in the pigmented epithelium of the retina of the embryo chick eye studied in vivo and in vino. The Anatomical Record. 18, 260-261 (1920).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- D'Antonio-Chronowska, A., D'Antonio, M., Frazer, K. A. In vitro differentiation of human iPSC-derived retinal pigment epithelium cells (iPSC-RPE). Bio-Protocol. 9 (24), 3469 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- Scientific, T. , Available from: https://www.thermofisher.cn/document-connect/document connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2Ftrizol_reagent.pdf (2022).
- Toyota. , Available from: https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf (2022).
- Abcam. , Available from: https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol (2022).
- Zeiss. , Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals (2022).
- Cell Signal Technology. , Available from: https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western (2022).
- Wang, S., et al. Reversed senescence of retinal pigment epithelial cell by coculture with embryonic stem cell via the TGFbeta and PI3K pathways. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 588050 (2020).
- Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Experimental Eye Research. 126, 1-4 (2014).
- Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Experimental Eye Research. 126, 5-15 (2014).
- Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. Physiology and function of the tight junction. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002584 (2009).
- Nita, M., Strzalka-Mrozik, B., Grzybowski, A., Mazurek, U., Romaniuk, W. Age-related macular degeneration and changes in the extracellular matrix. Medical Science Monitor. 20, 1003-1016 (2014).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Langenfeld, A., Julien, S., Schraermeyer, U. An improved method for the isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult rats. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1493-1502 (2015).
- Sonoda, S. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
