Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Первичная культура пигментных эпителиальных клеток свиньи свиней

Published: September 23, 2022 doi: 10.3791/64244
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Eye Institute of Xiamen University, Fujian Provincial Key Laboratory of Ophthalmology and Visual Science, School of Medicine, Xiamen University, 2Department of Ophthalmology, Xiang'an Hospital of Xiamen University, School of Medicine, Xiamen University, 3Xiamen University Affiliated Xiamen Eye Center, School of Medicine, Xiamen University
* These authors contributed equally

Summary

Здесь представлен простой в применении метод культивирования первичных пигментных эпителиальных клеток свиньи in vitro .

Abstract

Пигментный эпителий сетчатки (RPE) представляет собой монослой поляризованных пигментированных эпителиальных клеток, расположенный между сосудистой оболочкой и нейроретиной в сетчатке. Множественные функции, включая фагоцитоз, транспортировку питательных веществ / метаболитов, метаболизм витамина А и т. Д., Проводятся RPE на ежедневной основе. Клетки RPE представляют собой терминально дифференцированные эпителиальные клетки с небольшой регенеративной способностью или вообще без нее. Потеря клеток RPE приводит к множественным заболеваниям глаз, приводящим к нарушениям зрения, таким как возрастная макулярная дегенерация. Поэтому создание модели культуры in vitro первичных клеток RPE, которая больше напоминает RPE in vivo , чем клеточные линии, имеет решающее значение для характерных и механистических исследований клеток RPE. Учитывая тот факт, что источник глазных яблок человека ограничен, мы создаем протокол для культивирования первичных клеток Свиньи RPE. Используя этот протокол, клетки RPE могут быть легко диссоциированы от глазных яблок взрослых свиней. Впоследствии эти диссоциированные клетки прикрепляются к культуральным чашкам / вставкам, размножаются, образуя сливающийся монослой, и быстро восстанавливают ключевые особенности эпителиальной ткани in vivo в течение 2 недель. С помощью qRT-PCR показано, что первичные клетки RPE свиней экспрессируют несколько сигнатурных генов на сопоставимых уровнях с нативной тканью RPE, в то время как экспрессия большинства этих генов теряется / сильно снижается в человеческих RPE-подобных клетках, ARPE-19. Кроме того, иммунофлуоресцентное окрашивание показывает распределение плотного соединения, полярности тканей и белков цитоскелета, а также присутствие RPE65, изомеразы, критической для метаболизма витамина А, в культивируемых первичных клетках. В целом, мы разработали простой в использовании подход к культивированию первичных клеток RPE свиней с высокой чистотой и нативными характеристиками RPE, который может служить хорошей моделью для понимания физиологии RPE, изучения токсичности клеток и облегчения скрининга лекарств.

Introduction

Пигментный эпителий сетчатки (RPE) расположен между фоторецепторами и хориокапиллярисом во внешнем слое сетчатки1 с несколькими функциями, включая формирование гематорезитарного барьера, транспортировку и обмен питательными веществами и метаболитами сетчатки, рециркуляцию витамина А для поддержания нормального зрительного цикла, а также фагоцитоз и клиренс наружных сегментов фоторецепторов (POSs)2,3 . Поскольку POS требуют постоянного самообновления для генерации зрения, клетки RPE должны непрерывно поглощать отделенные POS для поддержания гомеостаза сетчатки4. Таким образом, дисфункция RPE приводит ко многим ослепляющим заболеваниям глаз, таким как возрастная макулярная дегенерация (AMD)4, пигментный ретинит (RP)5, врожденный амавроз Лебера6, диабетическая ретинопатия7 и т. Д. До сих пор точный патогенез большинства этих заболеваний остается неуловимым. В результате создается клеточная культура RPE для изучения клеточной биологии RPE, патологических изменений и основных механизмов.

Как простейшая модель для изучения клеточной биологии, культура клеток RPE была начата еще в 1920-хгодах 8. Хотя ARPE-19 широко используется в качестве клеток RPE, потеря пигментации, морфология булыжника и, особенно, барьерные функции в этой клеточной линии вызывают много опасений9. Для сравнения, культура первичных клеток RPE человека предлагает более реалистичный сценарий физиологических и патологических исследований9. Однако относительно ограниченная доступность ограничивает их использование, и этические проблемы всегда существуют. Кроме того, несколько групп использовали мышиные модели для культивирования клеток RPE. Однако размер мышиного глаза невелик, и для одной культуры обычно требуется много мышей, что неудобно9. Недавно ученые разработали новые методы использования эмбриональных стволовых клеток человека или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для получения клеток RPE. Хотя этот метод имеет особый потенциал для лечения наследственных нарушений RPE, он занимает много времени и обычно требует нескольких месяцев для создания зрелых клеток RPE10. Чтобы преодолеть эти проблемы, здесь мы вводим простой в использовании протокол для регулярного выделения и культивирования клеток RPE высокой чистоты в лаборатории. При подходящих условиях культивирования эти клетки могут демонстрировать типичные функции RPE и демонстрировать типичные морфологии RPE. Таким образом, этот метод культивирования может обеспечить хорошую модель для понимания физиологии RPE, изучения цитотоксичности, исследования патологических механизмов связанных глазных заболеваний и проведения скринингов лекарств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Использование экспериментальных животных соответствовало правилам Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) и было одобрено Комитетом по этике управления экспериментальными животными Сямыньского университета.

1. Подготовка экспериментальных хирургических устройств, фермента переваривания тканей и буфера клеточной культуры

  1. Подготовьте экспериментальные хирургические устройства, очистив и автоклавировав две пары офтальмологических хирургических ножниц и щипцов за день до рассечения глазного яблока, а затем высушив коробку хирургическими устройствами в общепроцедурной печи при 65 °C в течение ночи.
  2. Подготовка питательных сред.
    1. Препарат DMEM/Basic media с добавлением 10% (v/v) фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина и 1% (v/v) пенициллина (100 Ед/мл) и стрептомицина (100 Ед/мл).
    2. Приготовьте носители DMEM/F12 с добавлением 1% (v/v) FBS и 1% (v/v) пенициллина (100 Ед/мл) и стрептомицина (100 Ед/мл).
    3. Готовят MEM-Nic11, добавляя MEM альфа с 2 мМ L-глутамином, 1% FBS, 1% (v/v) пенициллином (100 Ед/мл) и стрептомицином (100 ЕД/мл), 0,1 мМ NEAA, 1% (v/v) добавкой N1, таурином (0,25 мг/мл), гидрокортизоном (20 нг/мл), трийод-тиронином (0,013 нг/мл) и 10 мМ никотинамида.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для улучшения жизнеспособности и пролиферации клеток процент FBS может быть увеличен до 20%, чтобы нейтрализовать ферменты пищеварения и засеять диссоциированные клетки. Для долгосрочной клеточной культуры процент FBS может быть уменьшен до 1%12.
  3. Размораживание тканевого пищеварительного фермента аликвоты (0,25% (мас./об.) раствора трипсина/ЭДТА, дополненного 0,91 мМ ЭДТА, далее именуемого раствором Трипсина/ЭДТА) во время эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Свежий раствор Трипсина/ЭДТА следует использовать каждый раз для получения оптимальных результатов. Aliquot 10 мл свежего раствора трипсина/ЭДТА в каждую 15 мл стерильной центрифужной трубки и заморозьте аликвоты при -20 °C холодильнике до использования.
  4. Раствор для рассечения.
    1. Стерилизуйте 1x фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) (pH 7,2), дополненный 2% (v/v) пенициллином (100 Ед/мл) и стрептомицином (100 Ед/мл), фильтруя раствор через 0,22 мкм шприцевой фильтрующий блок.
  5. Нанесите покрытие на культуральные пластины и трансвеллентные вставки.
    1. Промывайте колодцы и трансвеллеры с помощью 1x PBS. Удалите PBS из колодцев и трансвеллов пипеткой, а затем добавьте 1 мл свежего 1x PBS в нижнюю камеру и 600 мкл 10 мкг/мл раствора ламинина в верхнюю камеру.
    2. Инкубировать пластины/трансвеллеры в инкубаторе клеточной культуры на ночь при 37 °C и 5% CO2. Удалите раствор ламинина из верхней камеры и дважды промойте 1 мл холодного 1x PBS перед посевом клеток.

2. Рассечение клеток RPE глазного яблока свиней

  1. Подготовка инструментов.
    1. Очистите ламинарную вытяжку с 75% этанолом и ультрафиолетовым светом. Приготовьте три 50 мл стерильных центрифужных пробирок, содержащих ~25 мл 75% этанола, три 50 мл стерильных центрифужных пробирок, содержащих ~25 мл 1x PBS, и три 10 см стерильные чашки для культивирования клеток, содержащие ~15 мл 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти настройки обычно используются для рассечения четырех глазных яблок свиней. Пожалуйста, увеличивайте масштаб, когда используется больше глазных яблок. Чтобы улучшить жизнеспособность клеток, предварительно охладите 1x PBS буфер на льду в течение не менее 30 мин. Как 75% этанола, так и ультрафиолетового излучения необходимы для обеспечения того, чтобы экспериментальные приборы и клетки не были загрязнены. Включите УФ-лампу заранее, чтобы стерилизовать весь рабочий стол в течение не менее 15 минут.
  2. Очистите свиные глазные яблоки.
    1. Получите свежие глазные яблоки со скотобойни и держите их на льду до рассечения. Замочите четыре глазных яблока свиней в ~ 15 мл 75% этанола в чашке Петри 10 см и используйте ножницы и щипцы, чтобы отрезать все остаточные соединительные ткани и мышцы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите как можно больше ткани снаружи склеры, чтобы уменьшить загрязнения. Не перерезайте зрительный нерв в это время, чтобы облегчить перенос глазных яблок во время этапа обеззараживания и промывания. После этого шага все процедуры должны выполняться в ламинарной вытяжке.
  3. Обеззараживать глазные яблоки свиней путем замачивания и промывания четырех глазных яблок свиней в трех стерильных центрифужных трубках по 50 мл, заполненных 75% этанолом последовательно; каждое глазное яблоко опускается не менее чем на 5 минут в каждую трубку. Затем промыть глазные яблоки свиней в трех стерильных центрифужных трубках по 50 мл, заполненных 1x PBS последовательным образом; промыть каждое глазное яблоко не менее 5 мин в каждой трубке (рисунок 1А). Переворачивайте трубки каждую минуту, чтобы тщательно промыть глазные яблоки.
  4. Рассечение глазных яблок свиней.
    1. Переместите четыре глазных яблока свиней в 10-сантиметровую стерильную чашку для культивирования клеток, содержащую 1 PBS. Снова обрежьте внешнюю поверхность каждого глазного яблока, чтобы удалить зрительный нерв и мелкий мусор (рисунок 1B). С помощью ножниц сделайте небольшой разрез на пересечении лимбуса и склеры, а затем удалите роговицу, радужную оболочку, хрусталик, стекловидное тело и нервную сетчатку (подробные структуры этих тканей см. на рисунке 1).
    2. Перенесите комплекс RPE-сосудистой оболочки-склеры в новую чашку для культивирования клеток размером 10 см и сделайте четыре разреза, чтобы плоский наглазник в форме четырехлистного клевера (рисунок 1C).
  5. Выполните переваривание раствора трипсина/ЭДТА, поместив четыре комплекса RPE-сосудистой оболочки-склеры в новую посуду размером 10 см. Налейте 20 мл свежего раствора Трипсина/ЭДТА для слияния комплексов RPE-сосудистой оболочки-склеры и поместите блюдо в инкубатор клеточной культуры при 37 °C в течение ~30 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте свежий раствор Трипсина/ЭДТА для диссоциации клеток RPE. Тщательно контролируйте время переваривания раствора трипсина/ЭДТА, так как более длительное время инкубации (более 30 мин) может увеличить загрязнение других типов клеток.

3. Выделение и культивирование клеток RPE свиного глазного яблока

  1. Диссоциация РПЭ.
    1. Выньте блюдо из инкубатора после 30 мин инкубации с раствором Трипсина/ЭДТА и добавьте в блюдо 20 мл предварительно расплавленной культуральной среды (с 10% FBS) для нейтрализации раствора Трипсина/ЭДТА.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе используется только носитель DMEM/Basic. Когда клетки достигают слияния, в зависимости от условий эксперимента могут использоваться три питательные среды: DMEM/Basic среда, среда DMEM/F12 и среда MEM-Nic.
    2. Используйте передаточную пипетку объемом 5 мл для диссоциации клеток RPE путем осторожной пипетки несколько раз. Соберите клеточные суспензии в трубки центрифуги объемом 15 мл. Используйте еще 10 мл свежих питательных сред (10% FBS) для промывки комплексов RPE-сосудистой оболочки-склеры на посуде путем осторожного пипетирования для получения как можно большего количества клеток RPE.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не разрушайте клетки слишком энергично. Убедитесь, что пипетка заполнена и опорожнена со скоростью около 3 мл/с. Избегайте пузырьков клеточной суспензии.
  2. Собирайте ячейки RPE путем центрифугирования трубок при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирировать супернатант с помощью пипетки и добавить еще 5 мл культуральной среды (10% FBS) для повторного суспендирования клеток и центрифуги при 200 х г еще на 5 мин. Декантировать супернатант и повторно суспендировать клетки 12 мл питательных сред.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При аспирации супернатанта оставьте около 1 мл среды, чтобы избежать разрушения сгустков клеток.
  3. Посев RPE клеток.
    1. Семена ~1-2 х 105 клеток /скважина в 12-луночные культуральные пластины или трансвелл-вкладыши. Обычно из четырех глазных яблок свиней получают около 1,5 х 106 клеток RPE. Меняйте питательные среды каждые 2 дня и снижайте концентрацию сыворотки до 1%, когда клетки полностью покрывают поверхность лунок/вкладышей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не перемещайте чашку для культивирования клеток слишком часто, прежде чем клетки прикрепятся к чашке/вставкам для культивирования.
  4. Меняйте культуральную среду каждые 2 дня, пока клетки не будут собраны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация FBS может быть снижена после того, как клетки достигнут слияния, и клетки могут культивироваться в течение нескольких месяцев, чтобы обеспечить полную дифференцировку и созревание.

4. Характеристика первичных клеток РПЭ свиней

  1. Культивируйте клетки при слиянии в течение 1 или 2 недель, а затем собирайте клетки для дальнейшего анализа.
  2. Собирайте клетки для количественного анализа ПЦР в режиме реального времени (qRT-PCR).
    1. Удалите культуральную среду, промыть клетки 1 мл холодного 1x PBS, а затем добавить 500 мкл экстракционного раствора РНК в каждую лунку для сбора лизата клеток примерно из 1 х 106 клеток.
    2. Экстракт мРНК13; приблизительно 4 мкг РНК извлекается из каждого образца. Используйте 100 нг мРНК для выполнения обратной транскрипции14; разбавляют кДНК в 40 раз для количественного анализа ПЦР в режиме реального времени. Грунтовки приведены в таблице 1.
  3. Сбор клеток для иммунофлуоресцентного окрашивания.
    1. Удалите питательные среды, промыть клетки 1 мл холодного 1x PBS, а затем добавить 500 мкл 4% (мас./об.) параформальдегида в 1x PBS для фиксации клеток (около 1 x 106 клеток/лунка) в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем промыть клетки 1x PBS дважды и выполнить иммунофлуоресцентное окрашивание первичными антителами (1:100 в 1x PBS с добавлением 1% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина) при 4 °C в течение ночи и вторичными антителами (1:200 в 1x PBS, дополненным 1% (мас./об.) бычьим сывороточным альбумином) при комнатной температуре в течение 2 ч в соответствии с онлайн-протоколами15.
    2. Изображения иммунофлуоресценции получены конфокальным микроскопом в соответствии с онлайн-руководством16.
  4. Собирайте клетки для анализа вестерн-блоттинга.
    1. Удалите питательные среды, дважды промойте клетки холодным 1x PBS, а затем добавьте 80 мкл буфера RIPA (с 1x ингибитором протеазы) в каждую лунку и используйте клеточные скребки, чтобы поцарапать около 1 x 106 клеток с посуды / вкладышей.
    2. Соберите лизат клеток из каждой лунки /вставьте в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Кипятите клеточные лизаты в течение 10 минут, а затем измеряйте концентрацию белка с помощью наборов BCA; концентрация белка в каждом образце составляет около 2 мг/мл. Используйте 25 мкг белков каждого образца для анализа вестерн-блоттинга в соответствии с онлайн-протоколами17.
    3. Для вестерн-блоттинга инкубируют мембраны в 5 мл раствора первичных антител (1:1000 разведения первичных антител в 1x растворе TBST, дополненном 5% (мас./об.) бычьим сывороточным альбумином) при 4 °C в течение ночи на вращающемся многоцелевом шейкере.
    4. Затем инкубируют мембрану примерно с 15 мл раствора вторичных анти-кроликов или против мышей (разведение вторичных антител 1:5000 в 1x растворе TBST, дополненном 5% (мас./об.) обезжиренным молоком) при комнатной температуре в течение 2 ч на орбитальном шейкере, согласно источнику используемого первичного антитела.
  5. Измерение трансэпителиального сопротивления (ТЕЖ).
    1. Вымойте электроды палочки для еды с 70% этанолом и стерильным 1x PBS последовательным способом. Затем поместите более короткий конец электрода в верхнюю камеру, а более длинный конец в нижнюю камеру трансвеллерных вставок и нажмите кнопку на эпителиальном вольтметре для измерений. Регистрируйте измерения ТЕЖ каждой скважины в трех экземплярах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Первичные клетки Свиньи RPE (pRPE) культивировали в DMEM/Basic средах с 10% FBS, а морфологию клеток под световым микроскопом фотографировали через 2 дня (Рисунок 2A), 6 дней (Рисунок 2B) и 10 дней (Рисунок 2C) после посева. Через 1 нед наблюдался сливающийся монослой пигментированных pRPE клеток с булыжниковой морфологией.

Чтобы лучше охарактеризовать первичные клетки pRPE, первичные клетки RPE человека (hRPE) в Пассаже 3 (P3)18 и клетки ARPE-19 культивировали в DMEM/Basic средах с 1% FBS для другого wk, а затем собирали общую мРНК и белок культивируемых клеток, а также свиные RPE/сосудисто-сосудистые ткани. Уровни экспрессии ключевых характерных генов19 и белковых маркеров зрелого RPE оценивали с помощью qRT-PCR и вестерн-блоттинга. По сравнению с клетками ARPE-19, клетки pRPE сохраняли значительно более высокие уровни экспрессии генов, функционирующих в нативной секреции RPE (Рисунок 3A(c)), фагоцитозе (Рисунок 3A(i)), транспортировке (Рисунок 3A(a),(d)), плотных соединениях (Рисунок 3A(j)), формировании барьера (Рисунок 3A(b)), а также зрительном цикле (Рисунок 3A(e),B). Однако уровни экспрессии Krt8 и Krt18, двух генов-маркеров цитоскелетов RPE, были значительно ниже в первичных клетках pRPE по сравнению с первичными клетками hRPE и ARPE-19 (рисунок 3A(g),(h)). Кроме того, itgav, который участвует в фагоцитозе, был ниже и в первичных pRPE-клетках (рисунок 3A(f)). Поскольку уровни экспрессии этих трех генов в клетках pRPE были сходны с свиной RPE / сосудистой тканью, это может указывать на различия в экспрессии генов между видами. Кроме того, уровень экспрессии тира, который отвечает за выработку меланина, был сильно снижен как в первичных pRPE, так и в hRPE клетках (рисунок 3A(k)), что может объяснить потерю пигментации в долгосрочных культивируемых клетках. Различия в результатах qRT-PCR, наблюдаемые в данных клеток pRPE человека и свиньи, могут быть вызваны более длительным хранением и более высоким числом прохода (P3) pRPE человека, что указывает на потерю признаков RPE при субкультурировании. Кроме того, вестерн-блот показал, что белок RPE65, который является ключевым ферментом в зрительном цикле с участием клеток RPE, экспрессировался в клетках pRPE, в то время как его уровень экспрессии был значительно снижен в первичных клетках hRPE и клетках ARPE-19 (рисунок 3B, C).

Для дальнейшей характеристики полярности и барьерных функций клеток RPE культивируемые сливающиеся монослои клеток pRPE и ARPE-19 культивировали в трансвелл-вставках с средами DMEM/Basic, DMEM/F12 и MEM-Nic в течение 1 недели (рисунок 4). В этих условиях культивирования результаты флуоресцентного окрашивания Na+-K+-ATPase (рисунок 4A-F) и ZO-1 (Рисунок 4G-L) показали, что клетки pRPE имели более высокие уровни экспрессии как Na+-K+-ATPase, так и ZO-1, чем клетки ARPE-19. Равное распределение Na+-K+-АТФазы на апикальной и базальной поверхности клеток pRPE указывало на то, что для восстановления полярности клеток in vitro требовалось более длительное время культивирования.

RPE образует плотные соединения вблизи своей апикальной поверхности, чтобы плотно регулировать обмен метаболитов между внутренней сетчаткой и сосудистой оболочкой20. Окрашивание ZO-1 показало, что белки плотного соединения обычно локализуются на плазматической мембране первичных клеток pRPE с регулярной морфологией булыжника, но не клеток ARPE-19. Среди трех питательных сред лучшие паттерны окрашивания ZO-1 наблюдались в клетках, культивируемых в DMEM / Basic, в то время как DMEM / F12 не смог сохранить морфологию булыжника клеток pRPE. Более высокое значение TER служит индикатором образования плотного соединения и улучшения барьерных функций клетокRPE 21. Для подтверждения функции плотных соединений измеряли трансэпителиальное сопротивление (ТЕЖ). Однако по сравнению с пустыми трансвелл-вставками было обнаружено лишь несколько более высокое ТЕЖ (рисунок 4M,N).

В сетчатке мембрана Бруха существует между RPE и сосудистой оболочкой. Основными компонентами мембраны Бруха являются коллаген IV типа, протеогликаны и ламинин22. Чтобы смоделировать поддерживающее влияние мембраны Бруха на RPE, ламинин был распределен по поверхности трансвелленной мембраны для облегчения созревания культивируемых клеток RPE. Основываясь на результатах, полученных на рисунке 4, сливающиеся клетки pRPE культивировали на трансвелл-вставках в DMEM/Basic средах с 1% FBS в течение 2 недель. Результаты иммунофлуоресцентного окрашивания показали, что RPE-специфические белки RPE65 экспрессировались во всех клетках pRPE (рисунок 5A,B). Na+-K+-АТФаза была распределена на апикальной поверхности pRPE-клеток, что свидетельствует о восстановлении полярности клеток (рисунок 5C,D). Как окрашивание ZO-1, так и результаты TER показали, что плотные соединения хорошо образовывались в первичных клетках pRPE, когда их культивировали на ламинине (рисунок 5E, F, H). На рисунке 5G изображены клетки, окрашенные красителем Hoechst.

Более того, вестерн-блот продемонстрировал, что как клетки pRPE, так и ARPE-19 продуцируют факторы роста, включая фактор, полученный из пигментного эпителия (PEDF) и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) (рисунок 6A). После того, как сливающиеся монослои pRPE культивировали в трансвеллерных вставках со средами DMEM/Basic, DMEM/F12 и MEM-Nic в течение 1 недели, собирали питательные среды из верхней и нижней камер трансвелл-вставок, а секретируемый VEGF количественно определяли методом ИФА. Когда для клеточной культуры использовались среды DMEM/Basic и MEM-Nic, клетки pPRE секретировали больше VEGF, чем клетки в средах DMEM/F12 (рисунок 6B). Однако не удалось обнаружить различий в количествах VEGF между верхней и нижней камерами трансвеллерных вставок во всех испытанных условиях (рисунок 6B). Кроме того, после того, как первичные pRPE клетки культивировали на вставках, покрытых ламинином, и в средах DMEM/Basic в течение 2 недель, собирали среду из верхней и нижней камер. Анализ вестерн-блоттинга показал более высокие уровни PEDF в верхней камере, чем в нижней камере, в то время как уровни белка секретируемого VEGF были одинаковыми в обеих камерах (рисунок 6C). Эти результаты также подтвердили восстановление полярности клеток, когда первичные клетки pRPE культивировали еще в течение 2 недель после того, как они достигли слияния с ламинином.

Figure 1
Рисунок 1: Основные этапы изоляции клеток pRPE. (A) Промывайте глазные яблоки свиней 1x PBS в 50 мл стерильных центрифужных пробирок. (В,С) Готовят комплексы РПЭ-сосудистой оболочки-склеры для ферментативного пищеварения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Первичная морфология клеток pRPE после клеточной культуры. Репрезентативные изображения первичных клеток pRPE на (A) День 2, (B) День 6 и (C) День 10. Шкала 250 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Уровни экспрессии ключевых сигнатурных генов и белков в культивируемых клетках RPE. (A) qRT-PCR анализ уровней мРНК сигнатурных генов в первичных клетках pRPE, первичных клетках hRPE, клетках ARPE-19 и pRPE/сосудистой ткани. Gapdh использовался в качестве домашнего гена для qRT-PCR. Четыре биологических репликата были использованы для первичных клеток pRPE и клеток ARPE-19, в то время как три биологических репликата были использованы для первичных клеток hRPE и pRPE / сосудистой ткани. Уровни экспрессии генов в клетках ARPE-19 были установлены в качестве контрольных. (B) Вестерн-блоттинг белков RPE65 в клетках ARPE-19 и pRPE. Винкулин использовался в качестве контроля нагрузки. (C) Вестерн-блоттинг белков RPE65 в первичных клетках hRPE и pRPE/сосудистой ткани. Винкулин использовался в качестве контроля нагрузки. Для сравнения использовался студенческий t-тест, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Одноразрядная культура первичных клеток pRPE и ARPE-19 в средах DMEM/Basic, DMEM/F12 и MEM-Nic с 1% FBS. (A) Na+-K+-ATPase флуоресцентное окрашивание (красный) первичных pRPE клеток в DMEM/Basic, (B) DMEM/F12 и (C) MEM-Nic средах. (D) Флуоресцентное окрашивание Na+-K+-ATPase (красное) клеток ARPE-19 в средах DMEM/Basic, (E) DMEM/F12 и (F) MEM-Nic средах. (G) ФЛУОресцентное окрашивание ZO-1 (зеленый) первичных pRPE-клеток в DMEM/основных средах, (H) DMEM/F12 средах и (I) MEM-Nic средах. (J) Флуоресцентное окрашивание ZO-1 (зеленый) в ячейках ARPE-19 в средах DMEM/Basic, (K) DMEM/F12 средах и (L) MEM-Nic средах. Измерения TER после первичных клеток pRPE (M) и ARPE-19 (N) культивировали в средах DMEM/Basic, DMEM/F12 и MEM-Nic в течение 1 недели. Для каждого типа ячеек данные были получены по меньшей мере из трех различных скважин. Для сравнения использовался студенческий t-тест, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Шкала 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Двухнедельная культура pRPE клеток в DMEM/Basic средах с 1% FBS. (A-F) Клетки, культивируемые с ламинином или без него, окрашивали RPE65 (A,B, Red), Na+-K+-ATPase (C,D, Red), ZO-1 (E,F, Green) и (G) Hoechst (синий). H) измерения ТЕЖ в листах клеток, культивируемых с ламинином или без него. Для различных методов лечения данные были получены из четырех различных скважин. Для сравнения использовался студенческий t-тест, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Секреторные функции культивируемых первичных pRPE и ARPE-19 клеток. (A) Вестерн-блотт-анализ VEGF и PEDF в первичных клетках pRPE и ARPE-19. (B) Секретируемый VEGF в верхней и нижней камере трансвеллерных вставок с первичными pRPE-клетками, когда сливающиеся клетки культивировали в средах DMEM/Basic, DMEM/F12 и MEM-Nic в течение 1 недели. (C) Секретировали PEDF и VEGF в верхней и нижней камере трансвеллерных вставок с первичным pRPE в DMEM/Basic средах в течение 2 недель. Для различных методов лечения данные были получены из трех различных скважин. Для сравнения использовался студенческий t-тест, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Человек разумный Sus scrofa
Лучший1 F: GAAGGCAAGGACGAGCAAGCAAG F: GGACACCTTAGTAGGCCTACGA
R: TCCAACTGCTTGTGTTCTGC R: GGAACGTGAAGAGGGGTACA
Cldn19 F: GGTGACCCAGGAGTTCTTCA F: TCGTGACCCAGGAGTTCTTC
R: CTGTTGGGTCTCTCTCTCTCTCTC R: GCTGCTGTTGGATCGCTC
Итгав F: CGCAGTCCCATCTCAAATCC F: GCTTTCTTCAGGACGGAACA
R: GGCCCTGTATAAGATAGCTCGA R: GAAATGAGCTGACCTTGCCA
Крт8 F: GGAGCAGATCAAGACCCTCA F: CCCAGGAGAAGGAGCAGATC
R: GCCGCCTAAGGTTGTTGATG R: ATGTTGTCGATGTTGCTCCG
Крт18 F: CTTGGAGAAGAAGGGACCCC F: GCTGATAATCGGAGGCTGGA
R: GGCCAGCTCTGTCTCATACT R: GAAGTCATCAGCAGCGAGAC
Мертк F: GTGTGCAGCGTTCAGACAAT F: GCGGCTATTTCTTGGTGGAA
R: AAAATGTTGACGGGCTCAGG R: ACGTAGATGGGGTCAGACAC
Серпинф1 F: КАГАТГАААГГГААГКТСКГ F: AAGACGTCGCTGGAGGATTT
R: TTAGGGTCCGACATCATGGG R: GGTCACTTTCAGAGGCAGGA
Slc16a8 F: GGGTGTCCTCCATCATGCTA F: CAGTTCGAGGTGCTCATGG
R: GTCAGGTAGAGCTCCAGGAG R: GACAGCCATGAAGACACCAG
Стра6 F: CTTTGCAGGAAGAAGCTGGG F: CTAGCCGTGTTGTCGATCCT
R: TAAATGGCCGTCCCTGTCAG R: GACCATGAAGACAGCAGCAG
Tjp1 F: ACAGGAAAATGACCGAGTTGC F: AAGACTTGTCAGCTCAGCCAGCCA
R: TGGTTCAGGATCAGGACGAC R: CCAGCATCTCGAGGTTCACT
Тир F: ACTCAGCCCAGCATCATTCTCT F: ATCTACTCAGCCCAGCATCC
R: ACATCAGCTGAAGAGGGGAG R: GAGCCTTGGAGTCCTGGATT
Гапдх F: CAGCCTCAAGATCATCAGCA F: CATCCTGGGCTACACTGAGG
R: ATGATGTTCTGGAGAGCCCC R: GGGGCTCTTACTCCTTGGAG

Таблица 1: Праймеры для qRT-PCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь был описан подробный и оптимизированный протокол для выделения, культивирования и характеристики клеток RPE из глазных яблок свиней, который генерирует хорошую модель для характеристики in vitro клеток RPE и исследований расстройств, связанных с RPE. Методы выделения РПЭ из глаз человека, мыши и крысы были описаны ранее 23,24,25. Тем не менее, трудно получить человеческие глазные яблоки в некоторых лабораториях, и это обычно поднимает этические вопросы. Ткани RPE мышей и крыс относительно невелики, клетки легко повреждаются при разделении, и от каждого животного можно получить всего несколько клеток. Напротив, свиные глазные яблоки гораздо легче получить и обработать, что может стабильно генерировать относительно большое количество первичных клеток из одного глазного яблока. В некоторых исследованиях пинцет используется для механического разделения RPE, что может легко привести к гибели клеток. Поэтому гиалуроновая кислота, диспаза и раствор трипсина / ЭДТА ранее использовались для диссоциации клеток RPE. Предыдущие исследования показали, что раствор Трипсина/ЭДТА обладает способностью помогать RPE отделяться от сосудистой оболочки21. Поэтому раствор Трипсина/ЭДТА использовался для переваривания тканей свиней, которые дают оптимальные результаты. После неврализации трипсина/ЭДТА ткани RPE могут быть диссоциированы на одноклеточную суспензию путем осторожной пипетки кончиком пипетки. Один из трюков заключается в том, что свежий раствор трипсина / ЭДТА рекомендуется для каждого эксперимента для полной диссоциации клеток RPE. Из-за большой площади RPE тканей глазных яблок свиней комплекс RPE-сосудистой оболочки-склеры необходимо разрезать в форме четырехлистного клевера, что способствует полному контакту между тканями RPE и раствором Трипсина/ЭДТА, чтобы облегчить их отделение от сосудистой оболочки. Однако время пищеварения не должно превышать получаса. В течение этого времени другие ткани, кроме RPE, не будут перевариваться, что может эффективно уменьшить загрязнения от других типов клеток.

Ламинин был распространен на поверхности трансвеллентной мембраны, чтобы имитировать поддерживающее влияние мембраны Бруха на RPE. Результаты показали, что ламинин полезен для роста клеток pRPE, что стимулирует экспрессию белков-транспортеров и плотного соединения. Тем не менее, результаты также показали, что для первичных клеток pRPE потребовалось более длительное время культивирования, около 2 недель, чтобы восстановить определенные особенности нативных тканей RPE, включая полярность клеток и плотные соединения.

Одним из недостатков первичной культуры RPE является то, что трудно поддерживать визуальный цикл экспрессии ферментов in vitro. Поэтому крайне важно изучить, могут ли культивируемые клетки RPE экспрессировать RPE-специфические белки RPE65. По сравнению с клетками ARPE-19, клетки pRPE экспрессировали значительно больше белка RPE65. Напротив, только слабая полоса белка RPE65 наблюдалась в лизатах клеток ARPE-19 в вестерн-блотте. Интересно отметить, что молекулярная масса RPE65 немного отличалась между человеком и свиньями (рисунок 3B, C). Потеря экспрессии RPE65 в культивируемых клетках RPE остается загадкой. Даже в культивируемых первичных клетках RPE65 постепенно терялся с пассажами (данные не показаны). До сих пор то, как поддерживать экспрессию RPE65 in vitro , требует дальнейшего изучения, учитывая тот факт, что зрительный цикл является критической функцией для нативных тканей RPE. Во-вторых, основным ограничением этого протокола является то, что культивируемые in vitro клетки RPE не могут быть пройдены. При длительной культуре клетки pRPE, как правило, теряют свою гексагональную форму и TER, а также пигментацию, так что можно использовать только проходные 0 клетки. Другим ограничением этого протокола культивирования является то, что генетические мутации, которые приводят к наследственным заболеваниям сетчатки, трудно воспроизвести в этих клетках. Таким образом, опосредованное вирусом редактирование генов может быть использовано для изучения наследственных RPE-расстройств, таких как врожденный амавроз Леже в будущем.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Все авторы раскрыли, что конфликта интересов нет.

Все авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Авторы хотели бы выразить свою благодарность и уважение всем животным, вносящим свои клетки в это исследование. Это исследование было частично поддержано грантами Национальной ключевой программы исследований и разработок Китая (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao и Grant Nos. 2018YFA0107301, Wei Li). Авторы благодарят Jingru Huang и Xiang You из Центральной лаборатории, Школы медицины, Сямыньского университета за техническую поддержку в конфокальной визуализации.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ARPE-19 cells CCTCC GDC0323
Bovine serum albumin Yeasen 36101ES60
Confocal microscopy Zeiss LSM 880 with Airyscan
ChemiDoc Touch Bio-Rad 1708370
Cell scraper Sangon F619301
10 cm culture dish NEST 121621EH01
12-well culture plate NEST 29821075P
DMEM F12 Medium Gibco C11330500BT
DMEM basic Medium Gibco C11995500BT
EVOM2 World Precision Instruments EVOM2 For TER measurement
Fetal bovine serum ExCell Bio FSP500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific  A-11034
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A-11012
Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP Bio-Rad 0300-0108P
Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP Bio-Rad 5196-2504
hydrocortisone MCE HY-N0583/CS-2226
Hoechst 33342 solution (20 mM) ThermoFisher Scientific 62249
LightCycler 96 Instrument Roche 5815916001
Liothyronine MCE HY-A0070A/CS-4141
laminin Sigma-Aldrich L2020-1MG
MEM(1X)+GlutaMAX Medium Gibco 10566-016
MEM NEAA(100X) Gibco 11140-050
Millex-GP syringe filter unit Millipore SLGPR33RB
N1 Sigma-Aldrich SLCF4683
NcmECL Ultra New Cell&Molecular Biotech P10300
Non-fat Powdered Milk Solarbio D8340
Nicotinamide SparkJade SJ-MV0061
Na+-K+ ATPase antibody Abcam ab76020 Recognize both human and porcine proteins
PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%) Epizyme PG112
primary Human RPE cells  - - Generous gift from Shoubi Wang lab 
Pierce BCA Protein Assay Kit  ThermoFisher Scientific 23225
Prism GraphPad by Dotmatics version 8.0
Protease Inhibitor Cocktails APExBIO K1024
PRE65 antibody Proteintech 17939-1-AP Recognize both human and porcine proteins
PEDF antibody Santa Cruz Biotechnology sc-390172 Recognize both human and porcine proteins
100 x penicillin/streptomycin  Biological Industries 03-031-1BCS
Phosphate buffered saline (PBS) RARBIO RA-9005
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix Toyobo FSQ-201
RIPA buffer ThermoFisher Scientific  89900
15 mL sterile centrifuge tubes NEST 601052
50 mL sterile centrifuge tubes NEST 602052
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-056
Taurine Damas-beta 107-35-7
Trizol Thermo-Fisher  15596026 RNA extraction solution
TB Green Fast qPCR Mix Takara RR430A
12-well transwell inserts Labselect 14212
VEGF antibody Proteintech 19003-1-AP Recognize both human and porcine proteins
VEGF ELISA kit Novusbio VAL106
ZO-1 antibody ABclonal A0659 Recognize both human and porcine proteins

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tan, L. X., Germer, C. J., La Cunza, N., Lakkaraju, A. Complement activation, lipid metabolism, and mitochondrial injury: Converging pathways in age-related macular degeneration. Redox Biology. 37, 101781 (2020).
  2. Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
  3. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
  4. Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
  5. Ducloyer, J. B., Le Meur, G., Cronin, T., Adjali, O., Weber, M. Gene therapy for retinitis pigmentosa. Medecine Sciences. 36 (6-7), 607-615 (2020).
  6. den Hollander, A. I., Roepman, R., Koenekoop, R. K., Cremers, F. P. Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 391-419 (2008).
  7. Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
  8. Smith, D. T. Melanin pigment in the pigmented epithelium of the retina of the embryo chick eye studied in vivo and in vino. The Anatomical Record. 18, 260-261 (1920).
  9. Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
  10. D'Antonio-Chronowska, A., D'Antonio, M., Frazer, K. A. In vitro differentiation of human iPSC-derived retinal pigment epithelium cells (iPSC-RPE). Bio-Protocol. 9 (24), 3469 (2019).
  11. Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
  12. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
  13. Scientific, T. , Available from: https://www.thermofisher.cn/document-connect/document connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2Ftrizol_reagent.pdf (2022).
  14. Toyota. , Available from: https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf (2022).
  15. Abcam. , Available from: https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol (2022).
  16. Zeiss. , Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals (2022).
  17. Cell Signal Technology. , Available from: https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western (2022).
  18. Wang, S., et al. Reversed senescence of retinal pigment epithelial cell by coculture with embryonic stem cell via the TGFbeta and PI3K pathways. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 588050 (2020).
  19. Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Experimental Eye Research. 126, 1-4 (2014).
  20. Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Experimental Eye Research. 126, 5-15 (2014).
  21. Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. Physiology and function of the tight junction. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002584 (2009).
  22. Nita, M., Strzalka-Mrozik, B., Grzybowski, A., Mazurek, U., Romaniuk, W. Age-related macular degeneration and changes in the extracellular matrix. Medical Science Monitor. 20, 1003-1016 (2014).
  23. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  24. Langenfeld, A., Julien, S., Schraermeyer, U. An improved method for the isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult rats. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1493-1502 (2015).
  25. Sonoda, S. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).

Tags

Биология выпуск 187
Первичная культура пигментных эпителиальных клеток свиньи свиней
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wen, F., Wang, Y., He, D., Liao, C., … More

Wen, F., Wang, Y., He, D., Liao, C., Ouyang, W., Liu, Z., Li, W., Liao, Y. Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (187), e64244, doi:10.3791/64244 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter