Summary
Aquí, se presenta un método fácil de seguir para cultivar células epiteliales pigmentarias primarias de la retina porcina in vitro .
Abstract
El epitelio pigmentario de la retina (EPR) es una monocapa de células epiteliales pigmentadas polarizadas, ubicadas entre la coroides y la neuroretina en la retina. El RPE realiza diariamente múltiples funciones, incluyendo fagocitosis, transporte de nutrientes/metabolitos, metabolismo de la vitamina A, etc. Las células del EPR son células epiteliales terminalmente diferenciadas con poca o ninguna capacidad regenerativa. La pérdida de células del EPR da lugar a múltiples enfermedades oculares que conducen a la discapacidad visual, como la degeneración macular relacionada con la edad. Por lo tanto, el establecimiento de un modelo de cultivo in vitro de células primarias del EPR, que se asemeje más al EPR in vivo que a las líneas celulares, es fundamental para los estudios característicos y mecanicistas de las células del EPR. Teniendo en cuenta el hecho de que la fuente de globos oculares humanos es limitada, creamos un protocolo para cultivar células primarias de EPR porcino. Mediante el uso de este protocolo, las células RPE se pueden disociar fácilmente de los globos oculares porcinos adultos. Posteriormente, estas células disociadas se adhieren a placas / inserciones de cultivo, proliferan para formar una monocapa confluente y restablecen rápidamente las características clave del tejido epitelial in vivo dentro de las 2 semanas. Mediante qRT-PCR, se demuestra que las células primarias del EPR porcino expresan múltiples genes de firma a niveles comparables con el tejido RPE nativo, mientras que las expresiones de la mayoría de estos genes se pierden/se reducen altamente en las células humanas similares al EPR, ARPE-19. Además, la tinción de inmunofluorescencia muestra la distribución de la unión estrecha, la polaridad tisular y las proteínas del citoesqueleto, así como la presencia de RPE65, una isomerasa crítica para el metabolismo de la vitamina A, en células primarias cultivadas. En conjunto, hemos desarrollado un enfoque fácil de seguir para cultivar células primarias de EPR porcino con alta pureza y características nativas de EPR, que podría servir como un buen modelo para comprender la fisiología del EPR, estudiar las toxicidades celulares y facilitar las pruebas de detección de fármacos.
Introduction
El epitelio pigmentario de la retina (EPR) se encuentra entre los fotorreceptores y el coriocapilar en la capa externa de la retina1 con múltiples funciones, incluida la formación de la barrera hematoretiniana, el transporte e intercambio de nutrientes y metabolitos retinianos, el reciclaje de vitamina A para mantener un ciclo visual normal, y la fagocitosis y eliminación de los segmentos externos fotorreceptores (POS) desprendidos2,3 . Dado que los POS requieren una auto-renovación constante para generar visión, las células RPE necesitan engullir continuamente POS separados para mantener la homeostasis retiniana4. Por lo tanto, la disfunción del EPR da lugar a muchas enfermedades oculares cegadoras, como la degeneración macular asociada a la edad (DMAE)4, la retinitis pigmentosa (RP)5, la amaurosis congénita de Leber6, la retinopatía diabética7, etc. Hasta ahora, la patogénesis exacta de la mayoría de estas enfermedades sigue siendo difícil de alcanzar. Como resultado, el cultivo celular de EPR se establece para estudiar la biología celular del EPR, los cambios patológicos y los mecanismos subyacentes.
Como el modelo más simple para estudiar la biología celular, el cultivo de células RPE se inició ya en la década de 19208. Aunque ARPE-19 es ampliamente utilizado como células del EPR, la pérdida de pigmentación, la morfología de los adoquines y, especialmente, las funciones de barrera en esta línea celular plantean muchas preocupaciones9. En comparación, el cultivo de células RPE humanas primarias ofrece un escenario más realista para estudios fisiológicos y patológicos9. Sin embargo, la disponibilidad relativamente limitada restringe su uso y siempre existen problemas éticos. Además, varios grupos utilizaron modelos de ratón para cultivar células de EPR. Sin embargo, el tamaño del ojo del ratón es pequeño, y un solo cultivo generalmente requiere muchos ratones, lo cual no es conveniente9. Recientemente, los científicos han desarrollado nuevos métodos para utilizar células madre embrionarias humanas o células madre pluripotentes inducidas para derivar células RPE. Aunque esta técnica tiene un potencial particular para el tratamiento de trastornos hereditarios del EPR, consume mucho tiempo y generalmente requiere varios meses para generar células maduras del EPR10. Para superar estos problemas, aquí presentamos un protocolo fácil de seguir para aislar y cultivar células RPE de alta pureza en el laboratorio de forma rutinaria. En condiciones de cultivo adecuadas, estas células pueden mostrar funciones típicas del EPR y exhibir morfologías típicas del EPR. Por lo tanto, este método de cultivo puede proporcionar un buen modelo para comprender la fisiología del EPR, estudiar la citotoxicidad, investigar los mecanismos patológicos de las enfermedades oculares relacionadas y realizar exámenes de detección de drogas.
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Protocol
El uso de animales de experimentación cumplió con las regulaciones de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) y fue aprobado por el Comité de Ética de Manejo de Animales Experimentales de la Universidad de Xiamen.
1. Preparación de dispositivos quirúrgicos experimentales, enzima de digestión tisular y tampón de cultivo celular
- Preparar los dispositivos quirúrgicos experimentales, limpiando y esterilizando en autoclave dos pares de tijeras quirúrgicas oftálmicas y fórceps el día antes de la disección del globo ocular, y luego secando la caja con dispositivos quirúrgicos en un horno de protocolo general a 65 °C durante la noche.
- Preparación de medios de cultivo.
- Prepare DMEM/Basic medio suplementado con 10% (v/v) de suero fetal bovino, 2 mM de L-glutamina y 1% (v/v) de penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 U/mL).
- Prepare medios DMEM/F12 suplementados con FBS al 1% (v/v) y 1% (v/v) de penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 U/ml).
- Prepare MEM-Nic 11, complementando MEM alfa con 2 mM de L-glutamina, 1% de FBS, 1% (v/v) de penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 U/mL), 0.1 mM NEAA, 1% (v/v) de suplemento N1, taurina (0.25 mg/mL), hidrocortisona (20 ng/mL), triyodo-tironina (0.013 ng/mL) y nicotinamida de10 mM.
NOTA: Para mejorar la viabilidad celular y la proliferación, el porcentaje de FBS se puede aumentar al 20% para neutralizar las enzimas de digestión y sembrar las células disociadas. Para el cultivo celular a largo plazo, el porcentaje de FBS puede reducirse hasta un 1%12.
- Descongelar la enzima de digestión tisular alícuota (solución de tripsina/EDTA al 0,25% (p/v) suplementada con 0,91 mM de EDTA, en lo sucesivo denominada solución de tripsina/EDTA) durante el experimento.
NOTA: La solución fresca de tripsina/EDTA debe usarse cada vez para obtener resultados óptimos. Alícuota 10 ml de solución fresca de tripsina/EDTA en cada tubo de centrífuga estéril de 15 ml y congelar las alícuotas a -20 °C en nevera hasta su uso. - Solución de disección.
- Esterilice 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) (pH 7.2) suplementada con 2% (v/v) de penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 U/ml) filtrando la solución a través de una unidad de filtro de jeringa de 0,22 μm.
- Cubra las placas de cultivo y los insertos de transwell.
- Lave los pocillos y los insertos transwell con 1x PBS. Retire el PBS de los pocillos y transpozos con una pipeta, y luego agregue 1 ml de 1x PBS fresco a la cámara inferior y 600 μL de 10 μg/ml de solución de laminina a la cámara superior.
- Incubar las placas/insertos de transwell en la incubadora de cultivo celular durante la noche a 37 °C y 5% deCO2. Retire la solución de laminina de la cámara superior y lave con 1 ml de PBS frío 1x dos veces antes de sembrar las células.
2. Disección de células del EPR del globo ocular porcino
- Preparación de los instrumentos.
- Limpie la campana de flujo laminar con 75% de etanol y luz UV. Prepare tres tubos de centrífuga estéril de 50 ml que contengan ~25 ml de etanol al 75%, tres tubos de centrífuga estéril de 50 ml que contengan ~25 ml de 1x PBS y tres placas de cultivo celular estéril de 10 cm que contengan ~15 ml de 1x PBS.
NOTA: Estos ajustes se utilizan generalmente para diseccionar cuatro globos oculares porcinos. Por favor, amplíe cuando se utilicen más globos oculares. Para mejorar la viabilidad celular, preenfríe 1x tampón PBS en hielo durante al menos 30 minutos. Tanto el etanol al 75% como la luz UV son necesarios para garantizar que los instrumentos experimentales y las células no estén contaminados. Encienda la lámpara UV con anticipación para esterilizar toda la mesa de operaciones durante al menos 15 minutos.
- Limpie la campana de flujo laminar con 75% de etanol y luz UV. Prepare tres tubos de centrífuga estéril de 50 ml que contengan ~25 ml de etanol al 75%, tres tubos de centrífuga estéril de 50 ml que contengan ~25 ml de 1x PBS y tres placas de cultivo celular estéril de 10 cm que contengan ~15 ml de 1x PBS.
- Limpie los globos oculares porcinos.
- Obtenga globos oculares frescos de un matadero y manténgalos en hielo hasta la disección. Remoje cuatro globos oculares porcinos en ~ 15 ml de etanol al 75% en una placa de Petri de 10 cm y use un par de tijeras y fórceps para cortar todos los tejidos conectivos y músculos residuales.
NOTA: Retire la mayor cantidad de tejido posible del exterior de la esclerótica para reducir las contaminaciones. No corte el nervio óptico en este momento para facilitar la transferencia de globos oculares durante la etapa de descontaminación y lavado. Después de este paso, todos los procedimientos deben realizarse en una campana de flujo laminar.
- Obtenga globos oculares frescos de un matadero y manténgalos en hielo hasta la disección. Remoje cuatro globos oculares porcinos en ~ 15 ml de etanol al 75% en una placa de Petri de 10 cm y use un par de tijeras y fórceps para cortar todos los tejidos conectivos y músculos residuales.
- Descontaminar los globos oculares porcinos remojando y lavando cuatro globos oculares porcinos en tres tubos centrífugos estériles de 50 ml llenos de etanol al 75% de manera secuencial; Cada globo ocular se sumerge durante al menos 5 minutos en cada tubo. A continuación, lave los globos oculares porcinos en tres tubos centrífugos estériles de 50 ml llenos de 1x PBS de manera secuencial; lave cada globo ocular durante al menos 5 minutos en cada tubo (Figura 1A). Invierta los tubos cada minuto para lavar bien los globos oculares.
- Disección de globos oculares porcinos.
- Mover los cuatro globos oculares porcinos a una placa de cultivo celular estéril de 10 cm que contenga 1x PBS. Recorte la superficie externa de cada globo ocular nuevamente para eliminar el nervio óptico y los pequeños residuos (Figura 1B). Use tijeras para hacer un pequeño corte en la intersección del limbo y la esclerótica, y luego retire la córnea, el iris, el cristalino, el cuerpo vítreo y la retina neural (para obtener información detallada sobre las estructuras de estos tejidos, consulte la Figura 1).
- Transfiera el complejo EPR-coroides-esclerótica a una nueva placa de cultivo celular de 10 cm y haga cuatro cortes para aplanar el ocular en forma de trébol de cuatro hojas (Figura 1C).
- Realice la digestión de la solución de tripsina/EDTA colocando los cuatro complejos RPE-coroides-esclerótica en una nueva placa de 10 cm. Vierta 20 ml de solución fresca de tripsina/EDTA para fusionar los complejos RPE-coroides-esclerótica y coloque el plato en la incubadora de cultivo celular a 37 °C durante ~30 min.
NOTA: Use una solución fresca de tripsina/EDTA para disociar las células del EPR. Controle cuidadosamente el tiempo de digestión de la solución de tripsina/EDTA, ya que un tiempo de incubación más largo (más de 30 min) puede aumentar la contaminación de otros tipos de células.
3. Aislamiento y cultivo de células del EPR del globo ocular porcino
- Disociación del EPR.
- Saque el plato de la incubadora después de 30 minutos de incubación con solución de tripsina/EDTA y agregue 20 ml de medios de cultivo precalentados (con 10% de FBS) al plato para neutralizar la solución de tripsina/EDTA.
NOTA: En este paso, sólo se utiliza DMEM/Basic media. Cuando las células alcanzan la confluencia, se pueden usar tres medios de cultivo dependiendo de las condiciones experimentales: medios DMEM / Basic, medios DMEM / F12 y medios MEM-Nic. - Utilice una pipeta de transferencia de 5 ml para disociar las células del EPR pipeteando suavemente varias veces. Recoja las suspensiones celulares en tubos de centrífuga de 15 ml. Use otros 10 ml de medios de cultivo frescos (10% FBS) para lavar los complejos EPR-coroides-esclerótica en el plato pipeteando suavemente para obtener tantas células de EPR como sea posible.
NOTA: No triture las células demasiado vigorosamente. Asegúrese de llenar y vaciar la pipeta a una velocidad de aproximadamente 3 ml/s. Evite burbujear la suspensión celular.
- Saque el plato de la incubadora después de 30 minutos de incubación con solución de tripsina/EDTA y agregue 20 ml de medios de cultivo precalentados (con 10% de FBS) al plato para neutralizar la solución de tripsina/EDTA.
- Recolectar células RPE centrifugando los tubos a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante con una pipeta y añadir otros 5 ml de medios de cultivo (10% FBS) para resuspender las células y centrifugar a 200 x g durante otros 5 min. Decantar el sobrenadante y resuspender las células con 12 mL de medios de cultivo.
NOTA: Al aspirar el sobrenadante, deje aproximadamente 1 ml de medio para evitar la ruptura de los grupos celulares. - Siembra de células RPE.
- Semilla ~1-2 x 105 células/pocillo en placas de cultivo de 12 pocillos o insertos de transwell. Por lo general, alrededor de 1,5 x 106 células del EPR se obtienen de cuatro globos oculares porcinos. Cambie los medios de cultivo cada 2 días y reduzca la concentración sérica al 1% cuando las células cubran completamente la superficie de los pocillos/insertos.
NOTA: No mueva la placa de cultivo celular con demasiada frecuencia antes de que las células se adhieran a la placa de cultivo/insertos.
- Semilla ~1-2 x 105 células/pocillo en placas de cultivo de 12 pocillos o insertos de transwell. Por lo general, alrededor de 1,5 x 106 células del EPR se obtienen de cuatro globos oculares porcinos. Cambie los medios de cultivo cada 2 días y reduzca la concentración sérica al 1% cuando las células cubran completamente la superficie de los pocillos/insertos.
- Cambie los medios de cultivo cada 2 días hasta que se recolecten las células.
NOTA: La concentración de FBS se puede reducir después de que las células alcanzan la confluencia, y las células se pueden cultivar hasta por varios meses para permitir la diferenciación y maduración completas.
4. Caracterización de células primarias del EPR porcino
- Cultive las células en confluencia durante 1 o 2 semanas, y luego coseche las células para su posterior análisis.
- Recolección de células para el análisis cuantitativo de PCR en tiempo real (qRT-PCR).
- Retire los medios de cultivo, lave las células con 1 ml de PBS frío 1x y luego agregue 500 μL de solución de extracción de ARN en cada pocillo para recolectar lisado celular de aproximadamente 1 x 106 células.
- Extraer ARNm13; Se extraen aproximadamente 4 μg de ARN de cada muestra. Utilizar 100 ng de ARNm para realizar la transcripción inversa14; diluir el ADNc 40 veces para el análisis cuantitativo de PCR en tiempo real. Los cebadores se enumeran en la Tabla 1.
- Recolectar células para la tinción de inmunofluorescencia.
- Retire los medios de cultivo, lave las células con 1 ml de PBS frío 1x y luego agregue 500 μL de paraformaldehído al 4% (p/v) en 1x PBS para fijar las células (aproximadamente 1 x 106 células/pocillo) durante 30 min a temperatura ambiente. Luego, lavar las células con 1x PBS dos veces y realizar tinción de inmunofluorescencia con anticuerpos primarios (1:100 en 1x PBS suplementado con albúmina sérica bovina al 1% (p/v)) a 4 °C durante la noche y anticuerpos secundarios (1:200 en 1x PBS suplementado con albúmina sérica bovina al 1% (p/v)) a temperatura ambiente durante 2 h de acuerdo con los protocolos en línea15.
- Las imágenes de inmunofluorescencia son adquiridas por un microscopio confocal siguiendo el manual en línea16.
- Células de cosecha para el análisis de Western blot.
- Retire los medios de cultivo, lave las células con 1x PBS frío dos veces y luego agregue 80 μL de tampón RIPA (con 1x inhibidor de proteasa) en cada pocillo y use raspadores celulares para rascar aproximadamente 1 x 106 células de los platos / insertos.
- Recoger el lisado celular de cada pozo/inserto en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Hervir los lisados celulares durante 10 minutos y luego medir las concentraciones de proteínas utilizando kits de BCA; la concentración de proteína de cada muestra es de aproximadamente 2 mg/ml. Utilizar 25 μg de proteínas de cada muestra para el análisis de Western blot según protocolos en línea17.
- Para Western blot, incubar las membranas en 5 ml de solución de anticuerpos primarios (dilución 1:1.000 de anticuerpos primarios en 1x solución TBST suplementada con albúmina sérica bovina al 5% (p/v)) a 4 °C durante la noche en un agitador multipropósito giratorio.
- Luego, incubar la membrana con aproximadamente 15 ml de solución de anticuerpos secundarios anti-conejo o anti-ratón (dilución 1:5,000 de anticuerpos secundarios en 1x solución TBST suplementada con leche descremada al 5% (p/v)) a temperatura ambiente durante 2 h en un agitador orbital, según la fuente del anticuerpo primario utilizado.
- Medición de la resistencia transepitelial (TER).
- Lave los electrodos de palillos con etanol al 70% y 1x PBS estéril de forma secuencial. Luego coloque el extremo más corto del electrodo en la cámara superior y el extremo más largo en la cámara inferior de los insertos de transwell y haga clic en el botón en el voltímetro epitelial para las mediciones. Registre las mediciones TER de cada pocillo por triplicado.
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Representative Results
Las células primarias de EPR porcino (pRPE) se cultivaron en medios DMEM/Basic con 10% de FBS, y la morfología celular bajo microscopio óptico se fotografió a los 2 días (Figura 2A), 6 días (Figura 2B) y 10 días (Figura 2C) después de la siembra. Después de 1 semana, se observó una monocapa confluente de células pRPE pigmentadas con morfologías de adoquines.
Para caracterizar mejor las células pRPE primarias, las células primarias del EPR humano (hRPE) en el Paso 3 (P3)18 y las células ARPE-19 se cultivaron en medios DMEM/Basic con FBS al 1% para otra semana, y luego se recolectaron el ARNm total y la proteína de las células cultivadas, así como los tejidos porcinos del EPR / coroides. Los niveles de expresión de los genes característicos clave19 y los marcadores proteicos del EPR maduro se evaluaron mediante qRT-PCR y Western blot. En comparación con las células ARPE-19, las células pRPE retuvieron niveles de expresión significativamente más altos de genes que funcionan en la secreción nativa de EPR (Figura 3A (c)), fagocitosis (Figura 3A (i)), transporte (Figura 3A (a), (d)), uniones estrechas (Figura 3A (j)), formación de barreras (Figura 3A (b)), así como el ciclo visual (Figura 3A (e), B). Sin embargo, los niveles de expresión de Krt8 y Krt18, dos genes marcadores del citoesqueleto del EPR, fueron significativamente más bajos en las células pRPE primarias en comparación con las células hRPE primarias y ARPE-19 (Figura 3A(g),(h)). Además, itgav, que participa en la fagocitosis, también fue menor en las células pRPE primarias (Figura 3A(f)). Dado que los niveles de expresión de estos tres genes en las células pRPE fueron similares con el RPE porcino / tejido coroideo, esto puede indicar las diferencias de expresión génica entre las especies. Además, el nivel de expresión de Tyr, que es responsable de la producción de melanina, fue muy reducido tanto en las células pRPE primarias como en las células hRPE (Figura 3A (k)), lo que puede explicar la pérdida de pigmentación en células cultivadas a largo plazo. Las diferencias en los resultados de qRT-PCR observadas en los datos de células de EPR humano y EPR porcino podrían deberse al almacenamiento más prolongado y al mayor número de pasaje (P3) del EPR humano, lo que indica una pérdida de caracteres de EPR en el subcultivo. Además, Western blot mostró que la proteína RPE65, que es una enzima clave en el ciclo visual con células RPE, se expresó en células pRPE, mientras que su nivel de expresión se redujo significativamente en células hRPE primarias y células ARPE-19 (Figura 3B, C).
Para caracterizar aún más la polaridad y las funciones de barrera de las células RPE, las monocapas confluentes cultivadas de células pRPE y ARPE-19 se cultivaron en insertos transwell con medios DMEM / Basic, DMEM / F12 y MEM-Nic durante 1 semana (Figura 4). En estas condiciones de cultivo, los resultados de la tinción fluorescente de Na+-K+-ATPasa (Figura 4A-F) y ZO-1 (Figura 4G-L) revelaron que las células pRPE tenían niveles de expresión más altos tanto de Na+-K+-ATPasa como de ZO-1 que las células ARPE-19. La distribución equitativa de Na+-K+-ATPasa en la superficie apical y basal de las células pRPE indicó que se requería un tiempo de cultivo más largo para restaurar las polaridades celulares in vitro.
El EPR forma uniones estrechas cerca de su superficie apical para regular estrechamente el intercambio de metabolitos entre la retina interna y la coroides20. La tinción ZO-1 sugirió que las proteínas de unión estrecha se localizaron normalmente en la membrana plasmática de las células pRPE primarias con morfologías de adoquines regulares, pero no de las células ARPE-19. Entre los tres medios de cultivo, los mejores patrones de tinción ZO-1 se observaron en células cultivadas en DMEM / Basic, mientras que DMEM / F12 no lograron mantener la morfología de adoquines de las células pRPE. Un valor TER más alto sirve como un indicador de la formación de uniones estrechas y mejores funciones de barrera de las células del EPR21. Para confirmar la función de las uniones estrechas, se midió la resistencia transepitelial (TER). Sin embargo, solo se detectó un TER ligeramente más alto en comparación con las inserciones de transwell vacías (Figura 4M, N).
En la retina, la membrana de Bruch existe entre el EPR y la coroides. Los principales componentes de la membrana de Bruch son colágeno tipo IV, proteoglicanos y laminina22. Para simular el efecto de soporte de la membrana de Bruch sobre el EPR, la laminina se extendió sobre la superficie de la membrana transwell para facilitar la maduración de las células de EPR cultivadas. Con base en los resultados obtenidos de la Figura 4, las células pRPE confluentes se cultivaron en insertos transwell en medios DMEM/Basic con FBS al 1% durante 2 semanas. Los resultados de la tinción inmunofluorescente mostraron que las proteínas específicas del EPR RPE65 se expresaron en todas las células del EPR (Figura 5A, B). La Na+-K+-ATPasa se distribuyó en la superficie apical de las células pRPE, lo que sugiere el restablecimiento de las polaridades celulares (Figura 5C, D). Tanto la tinción ZO-1 como los resultados de TER indicaron que las uniones estrechas estaban bien formadas en las células pRPE primarias cuando se cultivaron en laminina (Figura 5E, F, H). La figura 5G muestra células teñidas con tinte Hoechst.
Además, Western blot demostró que tanto las células pRPE como ARPE-19 producían factores de crecimiento, incluido el factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (Figura 6A). Después de que se cultivaron monocapas confluentes de pRPE en insertos transwell con medios DMEM/Basic, DMEM/F12 y MEM-Nic durante 1 semana, se recolectaron medios de cultivo de las cámaras superior e inferior de los insertos transwell, y el VEGF secretado se cuantificó mediante ELISA. Cuando se utilizaron medios DMEM/Basic y MEM-Nic para el cultivo celular, las células pPRE secretaron más VEGF que las células en medios DMEM/F12 (Figura 6B). Sin embargo, no se pudieron detectar diferencias en las cantidades de VEGF entre las cámaras superior e inferior de los insertos de transpozo en todas las condiciones probadas (Figura 6B). Además, después de cultivar células pRPE primarias en los insertos recubiertos con laminina y en medios DMEM / Basic durante 2 semanas, se recolectaron los medios de las cámaras superior e inferior. El análisis de Western blot mostró niveles más altos de PEDF en la cámara superior que en la cámara inferior, mientras que los niveles de proteína de VEGF secretado fueron similares en ambas cámaras (Figura 6C). Estos resultados apoyaron aún más el restablecimiento de la polaridad celular cuando las células pRPE primarias se cultivaron durante otras 2 semanas después de que alcanzaron la confluencia con laminina.
Figura 1: Pasos básicos del aislamiento de células pRPE . (A) Lave los globos oculares porcinos con 1x PBS en tubos centrífugos estériles de 50 ml. (B,C) Preparar complejos RPE-coroides-esclerótica para la digestión enzimática. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Morfologías de células pRPE primarias después del cultivo celular. Imágenes representativas de células pRPE primarias en (A) Día 2, (B) Día 6 y (C) Día 10. Barra de escala 250 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Niveles de expresión de genes y proteínas clave en células RPE cultivadas. (A) Análisis qRT-PCR de los niveles de ARNm de genes de firma en células pRPE primarias, células hRPE primarias, células ARPE-19 y tejido pRPE/coroides. Gapdh se utilizó como el gen de mantenimiento de la casa para qRT-PCR. Se utilizaron cuatro réplicas biológicas para las células pRPE primarias y las células ARPE-19, mientras que tres réplicas biológicas se utilizaron para las células hRPE primarias y el tejido pRPE/coroideo. Los niveles de expresión génica en las células ARPE-19 se establecieron como controles. (B) Análisis Western blot de proteínas RPE65 en células ARPE-19 y pRPE. Vinculin se utilizó como control de carga. (C) Análisis Western blot de proteínas RPE65 en células hRPE primarias y tejido pRPE/coroides. Vinculin se utilizó como control de carga. Para la comparación, se utilizó la prueba t de Student, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cultivo de una semana de células pRPE primarias y ARPE-19 en medios DMEM/Basic, DMEM/F12 y MEM-Nic con FBS al 1%. (A) tinción fluorescente Na+-K+-ATPasa (rojo) de células pRPE primarias en DMEM/Basic, (B) DMEM/F12 y (C) medios MEM-Nic. (D) tinción fluorescente Na+-K+-ATPasa (rojo) de células ARPE-19 en medios DMEM/básicos, (E) medios DMEM/F12 y (F) medios MEM-Nic. (G) tinción fluorescente ZO-1 (verde) de células pRPE primarias en medios DMEM/básicos, (H) medios DMEM/F12 e (I) medios MEM-Nic. (J) tinción fluorescente ZO-1 (verde) en células ARPE-19 en medios DMEM/básicos, (K) medios DMEM/F12 y (L) medios MEM-Nic. Las mediciones de TER después de las células primarias pRPE (M) y ARPE-19 (N) se cultivaron en medios DMEM/Basic, DMEM/F12 y MEM-Nic durante 1 semana. Para cada tipo de células, los datos se obtuvieron de al menos tres pocillos diferentes. Para la comparación, se utilizó la prueba t de Student, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Barra de escala 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Cultivo de dos semanas de células pRPE en medios DMEM/Basic con 1% de FBS. (A-F) Las células cultivadas con o sin laminina se tiñeron con RPE65 (A, B, Rojo), Na+-K+-ATPasa (C,D, Rojo), ZO-1 (E,F, Verde) y (G) Hoechst (Azul). (H) Mediciones de TER en láminas celulares cultivadas con o sin laminina. Para diferentes tratamientos, los datos se obtuvieron de cuatro pozos diferentes. Para la comparación, se utilizó la prueba t de Student, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Funciones secretoras de células pRPE primarias cultivadas y ARPE-19. (A) Análisis de Western blot de VEGF y PEDF en células primarias de pRPE y ARPE-19. (B) VEGF secretado en la cámara superior e inferior de los insertos transwell con células pRPE primarias cuando las células confluentes se cultivaron en medios DMEM/Basic, DMEM/F12 y MEM-Nic durante 1 semana. (C) PEDF y VEGF secretados en la cámara superior e inferior de insertos transwell con pRPE primario en medios DMEM/Basic durante 2 semanas. Para diferentes tratamientos, los datos se obtuvieron de tres pozos diferentes. Para la comparación, se utilizó la prueba t de Student, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Género humano | Sus scrofa | |
| Mejor1 | F: GAAGGCAAGGACGAGCAAG | F: GGACACCTGTATGCCTACGA |
| R: TCCAACTGCTTGTGTTCTGC | R: GGAACGTGAAGAGGGGTACA | |
| Cldn19 | F: GGTGACCCAGGAGTTCTTCA | F: TCGTGACCCAGGAGTTCTTC |
| R: CTGTTGGGTCTCTCTGGCTCTCTCTC | R: GCTGCTGTTGGATCGCTC | |
| Itgav | F: CGCAGTCCCATCTCAAATCC | F: GCTTTCTTCAGGACGGAACA |
| R: GGCCCTGTATAAGATAGCTCGA | R: GAAATGAGCTGACCTTGCCA | |
| Krt8 | F: GGAGCAGATCAAGACCCTCA | F: CCCAGGAGAAGGAGCAGATC |
| R: GCCGCCTAAGGTTGTTGATG | R: ATGTTGTCGATGTTGCTCCG | |
| Krt18 | F: CTTGGAGAAGAAGGGACCCC | F: GCTGATAATCGGAGGCTGGA |
| R: GGCCAGCTCTGTCTCATACT | R: GAAGTCATCAGCAGCGAGAC | |
| Mertk | F: GTGTGCAGCGTTCAGACAAT | F: GCGGCTATTTCTTGGTGGAA |
| R: AAAATGTTGACGGGCTCAGG | R: ACGTAGATGGGGTCAGACAC | |
| Serpinf1 | F: CAGATGAAAGGGAAGCTCGC | F: AAGACGTCGCTGGAGGATTT |
| R: TTAGGGTCCGACATCATGGG | R: GGTCACTTTCAGAGGCAGGA | |
| SLC16A8 | F: GGGTGTCCTCCATCATGCTA | F: CAGTTCGAGGTGCTCATGG |
| R: GTCAGGTAGAGCTCCGAG | R: GACAGCCATGAAGACACCAG | |
| Stra6 | F: CTTTGCAGGAAGAAGCTGGG | F: CTAGCCGTGTTGTCGATCCT |
| R: TAAATGGCCGTCCCTGTCAG | R: GACCATGAAGACAGCAGCAG | |
| Tjp1 | F: ACAGGAAAATGACCGAGTTGC | F: AAGACTTGTCAGCTCAGCCA |
| R: TGGTTCAGGATCAGGACGAC | R: CCAGCATCTCGAGGTTCACT | |
| Tyr | F: ACTCAGCCCAGCATCATTCT | F: ATCTACTCAGCCCAGCATCC |
| R: ACATCAGCTGAAGAGGGGAG | R: GAGCCTTGGAGTCCTGGATT | |
| Gapdh | F: CAGCCTCAAGATCATCAGCA | F: CATCCTGGGCTACACTGAGG |
| R: ATGATGTTCTGGAGAGCCCC | R: GGGGCTCTTACTCCTTGGAG |
Tabla 1: Cartillas para qRT-PCR.
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Discussion
Aquí, se ha descrito un protocolo detallado y optimizado para el aislamiento, cultivo y caracterización de células de EPR de globos oculares porcinos, que genera un buen modelo para la caracterización in vitro de células de EPR y estudios de trastornos relacionados con EPR. Los métodos para el aislamiento del EPR de los ojos humanos, de ratón y de rata se han descrito previamente23,24,25. Sin embargo, es difícil obtener globos oculares humanos en algunos laboratorios, y generalmente plantea cuestiones éticas. Los tejidos del EPR de ratones y ratas son relativamente pequeños, las células se dañan fácilmente durante la separación y solo se pueden obtener unas pocas células de cada animal. En contraste, los globos oculares porcinos son mucho más fáciles de obtener y manejar, lo que podría generar de manera estable un número relativamente grande de células primarias a partir de un solo globo ocular. En algunos estudios, las pinzas se utilizan para separar mecánicamente el EPR, lo que puede conducir fácilmente a la muerte celular. Por lo tanto, el ácido hialurónico, la dispasa y la solución de tripsina / EDTA se han empleado para disociar las células del EPR anteriormente. Estudios previos han demostrado que la solución de tripsina / EDTA tiene la capacidad de ayudar a que el EPR se desprenda de la coroides21. Por lo tanto, se utilizó solución de tripsina/EDTA para digerir los tejidos porcinos, que generan resultados óptimos. Después de la neuralización de tripsina/EDTA, los tejidos del EPR podrían disociarse en suspensión unicelular pipeteando suavemente con la punta de una pipeta. Un truco es que se recomienda una solución fresca de tripsina / EDTA para cada experimento para disociar completamente las células del EPR. Debido a la gran área de los tejidos del EPR de los globos oculares porcinos, el complejo EPR-coroides-esclerótica en forma de medio tazón debe cortarse en forma de trébol de cuatro hojas, lo que favorece el contacto total entre los tejidos del EPR y la solución de tripsina / EDTA para facilitar su separación de la coroides. Sin embargo, el tiempo de digestión no debe exceder la media hora. Dentro de este tiempo, otros tejidos, excepto el EPR, no serán digeridos, lo que podría reducir efectivamente las contaminaciones de otros tipos de células.
La laminina se extendió en la superficie de la membrana transwell para simular el efecto de apoyo de la membrana de Bruch en el EPR. Los resultados mostraron que la laminina fue beneficiosa para el crecimiento de las células pRPE, lo que estimuló la expresión de proteínas transportadoras y de unión estrecha. Sin embargo, los resultados también indicaron que se requería un tiempo de cultivo más largo, de aproximadamente 2 semanas, para que las células pRPE primarias restauraran ciertas características de los tejidos nativos del EPR, incluida la polaridad celular y las uniones estrechas.
Una deficiencia para el cultivo primario de EPR es que es difícil mantener las expresiones enzimáticas del ciclo visual in vitro. Por lo tanto, es fundamental examinar si las células cultivadas del EPR podrían expresar proteínas específicas del EPR RPE65. En comparación con las células ARPE-19, las células pRPE expresaron significativamente más proteína RPE65. En contraste, solo se observó una banda débil de proteína RPE65 en los lisados celulares ARPE-19 en Western blot. Es interesante observar que el peso molecular de RPE65 fue ligeramente diferente entre humanos y cerdos (Figura 3B, C). La pérdida de la expresión de RPE65 en células de RPE cultivadas sigue siendo un misterio. Incluso en células primarias cultivadas, RPE65 se perdió gradualmente con pasajes (datos no mostrados). Hasta ahora, cómo mantener la expresión de RPE65 in vitro requiere más investigación, considerando el hecho de que el ciclo visual es una función crítica para los tejidos nativos de RPE. En segundo lugar, una limitación importante de este protocolo es que las células de EPR cultivadas in vitro no se pueden pasar. Con el cultivo prolongado, las células pRPE tienden a perder su forma hexagonal y TER, así como la pigmentación, de modo que solo se pueden usar células de paso 0. Otra limitación de este protocolo de cultivo es que las mutaciones genéticas, que conducen a enfermedades hereditarias de la retina, son difíciles de reproducir en estas células. Por lo tanto, la edición de genes mediada por virus puede emplearse para estudiar trastornos hereditarios del EPR como la amaurosis congénita de Leger en el futuro.
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Disclosures
Todos los autores revelaron que no hay conflictos de intereses.
Todos los autores declaran que no hay intereses financieros en conflicto.
Acknowledgments
Los autores desean mostrar su gratitud y respeto a todos los animales que contribuyen con sus células en este estudio. Este estudio fue apoyado en parte por subvenciones del Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao y Grant nos. 2018YFA0107301, Wei Li). Los autores agradecen a Jingru Huang y Xiang You del Laboratorio Central, Facultad de Medicina de la Universidad de Xiamen por el apoyo técnico en imágenes confocales.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ARPE-19 cells | CCTCC | GDC0323 | |
| Bovine serum albumin | Yeasen | 36101ES60 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM 880 with Airyscan | |
| ChemiDoc Touch | Bio-Rad | 1708370 | |
| Cell scraper | Sangon | F619301 | |
| 10 cm culture dish | NEST | 121621EH01 | |
| 12-well culture plate | NEST | 29821075P | |
| DMEM F12 Medium | Gibco | C11330500BT | |
| DMEM basic Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EVOM2 | World Precision Instruments | EVOM2 | For TER measurement |
| Fetal bovine serum | ExCell Bio | FSP500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 0300-0108P | |
| Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 5196-2504 | |
| hydrocortisone | MCE | HY-N0583/CS-2226 | |
| Hoechst 33342 solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| LightCycler 96 Instrument | Roche | 5815916001 | |
| Liothyronine | MCE | HY-A0070A/CS-4141 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| MEM(1X)+GlutaMAX Medium | Gibco | 10566-016 | |
| MEM NEAA(100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Millex-GP syringe filter unit | Millipore | SLGPR33RB | |
| N1 | Sigma-Aldrich | SLCF4683 | |
| NcmECL Ultra | New Cell&Molecular Biotech | P10300 | |
| Non-fat Powdered Milk | Solarbio | D8340 | |
| Nicotinamide | SparkJade | SJ-MV0061 | |
| Na+-K+ ATPase antibody | Abcam | ab76020 | Recognize both human and porcine proteins |
| PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%) | Epizyme | PG112 | |
| primary Human RPE cells | - | - | Generous gift from Shoubi Wang lab |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Prism | GraphPad by Dotmatics | version 8.0 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | APExBIO | K1024 | |
| PRE65 antibody | Proteintech | 17939-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| PEDF antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-390172 | Recognize both human and porcine proteins |
| 100 x penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-031-1BCS | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | RARBIO | RA-9005 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | Toyobo | FSQ-201 | |
| RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 601052 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 602052 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Taurine | Damas-beta | 107-35-7 | |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | RNA extraction solution |
| TB Green Fast qPCR Mix | Takara | RR430A | |
| 12-well transwell inserts | Labselect | 14212 | |
| VEGF antibody | Proteintech | 19003-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| VEGF ELISA kit | Novusbio | VAL106 | |
| ZO-1 antibody | ABclonal | A0659 | Recognize both human and porcine proteins |
References
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