Summary
Här presenteras en lätt att följa metod för att odla primära svinretinala pigmentepitelceller in vitro .
Abstract
Retinal pigmentepitel (RPE) är ett monolager av polariserade pigmenterade epitelceller, belägna mellan choroid och neuroretina i näthinnan. Flera funktioner, inklusive fagocytos, närings- / metabolittransport, vitamin A-metabolism, etc., utförs av RPE dagligen. RPE-celler är terminalt differentierade epitelceller med liten eller ingen regenerativ kapacitet. Förlust av RPE-celler resulterar i flera ögonsjukdomar som leder till synnedsättning, såsom åldersrelaterad makuladegeneration. Därför är upprättandet av en in vitro-odlingsmodell av primära RPE-celler, som mer liknar RPE in vivo än cellinjer, avgörande för de karakteristiska och mekanistiska studierna av RPE-celler. Med tanke på att källan till mänskliga ögonbollar är begränsad skapar vi ett protokoll för att odla primära RPE-celler från svin. Genom att använda detta protokoll kan RPE-celler enkelt dissocieras från vuxna ögonbollar från svin. Därefter fäster dessa dissocierade celler till odlingsskålar / insatser, sprider sig för att bilda ett sammanflytande monolager och återupprättar snabbt viktiga egenskaper hos epitelvävnad in vivo inom 2 wks. Genom qRT-PCR visas det att primära RPE-celler hos svin uttrycker flera signaturgener på jämförbara nivåer med inbyggd RPE-vävnad, medan uttrycken för de flesta av dessa gener förloras/reduceras kraftigt i humana RPE-liknande celler, ARPE-19. Dessutom visar immunofluorescensfärgningen fördelningen av tät korsning, vävnadspolaritet och cytoskelettproteiner, liksom närvaron av RPE65, ett isomeras som är kritiskt för vitamin A-metabolism, i odlade primära celler. Sammantaget har vi utvecklat en lätt att följa metod för att odla primära RPE-celler hos svin med hög renhet och inbyggda RPE-funktioner, vilket kan fungera som en bra modell för att förstå RPE-fysiologi, studera celltoxiciteter och underlätta läkemedelsundersökningar.
Introduction
Retinalpigmentepitelet (RPE) är beläget mellan fotoreceptorer och choriokapillaris i det yttre skiktet av näthinnan1 med flera funktioner, inklusive att bilda blod-retinalbarriären, transportera och utbyta näringsämnen och retinala metaboliter, återvinna vitamin A för att upprätthålla en normal visuell cykel och fagocytos och clearance av shed-fotoreceptor yttre segment (POS)2,3 . Eftersom POS kräver konstant självförnyelse för att generera syn, måste RPE-cellerna kontinuerligt uppsluka fristående POS för att upprätthålla retinal homeostas4. Därför resulterar RPE-dysfunktion i många bländande ögonsjukdomar, såsom åldersrelaterad makuladegeneration (AMD)4, retinitis pigmentosa (RP)5, Leber medfödd amauros6, diabetisk retinopati7, etc. Hittills är den exakta patogenesen av de flesta av dessa sjukdomar fortfarande svårfångad. Som ett resultat etableras RPE-cellodling för att studera RPE-cellbiologi, patologiska förändringar och underliggande mekanismer.
Som den enklaste modellen för att studera cellbiologi startades odlingen av RPE-celler redan på 1920-talet8. Även om ARPE-19 används i stor utsträckning som RPE-celler, ger förlust av pigmentering, kullerstensmorfologi och särskilt barriärfunktionerna i denna cellinje upphov till många problem9. I jämförelse erbjuder kulturen av primära mänskliga RPE-celler ett mer realistiskt scenario för fysiologiska och patologiska studier9. Den relativt begränsade tillgängligheten begränsar dock deras användning och etiska problem finns alltid. Dessutom använde flera grupper musmodeller för att odla RPE-celler. Musögats storlek är dock liten, och en enda kultur kräver vanligtvis många möss, vilket inte är bekvämt9. Nyligen har forskare utvecklat nya metoder för att använda mänskliga embryonala stamceller eller inducerade pluripotenta stamceller för att härleda RPE-celler. Även om denna teknik har särskild potential för behandling av ärftliga RPE-störningar, är det tidskrävande och kräver vanligtvis flera månader för att generera mogna RPE-celler10. För att övervinna dessa problem introducerar vi här ett lätt att följa protokoll för att rutinmässigt isolera och odla RPE-celler med hög renhet i laboratoriet. Under lämpliga odlingsförhållanden kan dessa celler visa typiska RPE-funktioner och uppvisa typiska RPE-morfologier. Därför kan denna odlingsmetod ge en bra modell för att förstå RPE-fysiologi, studera cytotoxicitet, undersöka patologiska mekanismer för relaterade ögonsjukdomar och genomföra läkemedelsundersökningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Användningen av försöksdjur följde bestämmelserna från Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) och godkändes av etikkommittén för experimentell djurhantering vid Xiamen University.
1. Beredning av experimentella kirurgiska anordningar, vävnadsuppslutningsenzym och cellodlingsbuffert
- Förbered de experimentella kirurgiska apparaterna genom att rengöra och autoklavera två par oftalmiska kirurgiska saxar och pincett dagen före ögonglobsdissektionen, och därefter torka lådan med kirurgiska apparater i en allmän protokollugn vid 65 ° C över natten.
- Förberedelse av kulturmedier.
- Förbered DMEM/Basmedia kompletterat med 10% (v/v) fetalt bovint serum, 2 mM L-glutamin och 1% (v/v) penicillin (100 U/ml) och streptomycin (100 U/ml).
- Förbered DMEM/F12-media kompletterat med 1% (v/v) FBS och 1% (v/v) penicillin (100 U/ml) och streptomycin (100 U/ml).
- Förbered MEM-Nic 11, genom att komplettera MEM alfa med 2 mM L-glutamin, 1% FBS, 1% (v / v) penicillin (100 U / ml) och streptomycin (100 U / ml), 0,1 mM NEAA, 1% (v / v)N1-tillskott, taurin (0,25 mg / ml), hydrokortison (20 ng / ml), trijod-tyronin (0,013 ng / ml) och 10 mM nikotinamid.
OBS: För att förbättra cellviabiliteten och spridningen kan andelen FBS ökas till 20% för att neutralisera matsmältningsenzymer och fröa de dissocierade cellerna. För långvarig cellodling kan andelen FBS minskas till så lågt som 1%12.
- Tina vävnadsuppslutningsenzymet alikvot (0,25% (w/v) Trypsin/EDTA-lösning kompletterad med 0,91 mM EDTA, nedan kallad Trypsin/EDTA-lösning) under experimentet.
OBS: Färsk trypsin / EDTA-lösning bör användas varje gång för att uppnå optimala resultat. Alikvotera 10 ml färsk trypsin/EDTA-lösning i varje 15 ml sterilt centrifugrör och frys alikvoterna i kylskåp -20 °C tills det används. - Dissektion lösning.
- Sterilisera 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (pH 7.2) kompletterat med 2% (v / v) penicillin (100 U / ml) och streptomycin (100 U / ml) genom att filtrera lösningen genom en 0,22 μm sprutfilterenhet.
- Täck odlingsplattorna och transwellinsatserna.
- Tvätta brunnarna och transwellinsatserna med 1x PBS. Ta bort PBS från brunnar och transwells med en pipett och tillsätt sedan 1 ml färsk 1x PBS till den nedre kammaren och 600 μL 10 μg / ml lamininlösning till den övre kammaren.
- Inkubera plattorna/transwellinsatserna i cellodlingsinkubatorn över natten vid 37 °C och 5 %CO2. Ta bort lamininlösningen från den övre kammaren och tvätta med 1 ml kall 1x PBS två gånger innan cellerna sår dem.
2. Dissektion av RPE-celler från svinögon
- Förberedelse av instrumenten.
- Rengör den laminära flödeshuven med 75% etanol och UV-ljus. Förbered tre 50 ml sterila centrifugrör innehållande ~ 25 ml 75% etanol, tre 50 ml sterila centrifugrör innehållande ~ 25 ml 1x PBS och tre 10 cm sterila cellodlingsskålar innehållande ~ 15 ml 1x PBS.
OBS: Dessa inställningar används vanligtvis för att dissekera fyra ögonbollar från svin. Skala upp när fler ögonglober används. För att förbättra cellens livskraft, förkyl 1x PBS-buffert på is i minst 30 minuter. Både 75% etanol och UV-ljus är nödvändiga för att säkerställa att experimentella instrument och celler inte är förorenade. Slå på UV-lampan i förväg för att sterilisera hela operationsbordet i minst 15 minuter.
- Rengör den laminära flödeshuven med 75% etanol och UV-ljus. Förbered tre 50 ml sterila centrifugrör innehållande ~ 25 ml 75% etanol, tre 50 ml sterila centrifugrör innehållande ~ 25 ml 1x PBS och tre 10 cm sterila cellodlingsskålar innehållande ~ 15 ml 1x PBS.
- Rengör svinögonbollarna.
- Få färska ögonbollar från ett slakteri och håll dem på is tills dissektion. Blötlägg fyra ögonbollar från svin i ~ 15 ml 75% etanol i en 10 cm petriskål och använd en sax och pincett för att skära av alla kvarvarande bindväv och muskler.
OBS: Ta bort så mycket vävnad som möjligt från utsidan av sclera för att minska föroreningarna. Skär inte synnerven vid denna tidpunkt för att underlätta överföringen av ögonbollar under dekontaminerings- och tvättsteget. Efter detta steg bör alla procedurer utföras i en laminär flödeshuv.
- Få färska ögonbollar från ett slakteri och håll dem på is tills dissektion. Blötlägg fyra ögonbollar från svin i ~ 15 ml 75% etanol i en 10 cm petriskål och använd en sax och pincett för att skära av alla kvarvarande bindväv och muskler.
- Dekontaminera ögongloberna för svin genom att blötlägga och tvätta fyra ögonbollar för svin i tre 50 ml sterila centrifugrör fyllda med 75% etanol på ett sekventiellt sätt; Varje ögonglob doppas i minst 5 minuter i varje rör. Tvätta sedan ögongloberna för svin i tre 50 ml sterila centrifugrör fyllda med 1x PBS på ett sekventiellt sätt; Tvätta varje ögonglob i minst 5 minuter i varje rör (figur 1A). Vänd rören varje minut för att tvätta ögonbollarna noggrant.
- Dissektion av svinögonbollar.
- Flytta de fyra ögonbollarna för svin till en 10 cm steril cellodlingsskål som innehåller 1x PBS. Trimma den yttre ytan på varje ögonglob igen för att ta bort synnerven och små skräp (figur 1B). Använd sax för att göra ett litet snitt i skärningspunkten mellan limbus och sclera och ta sedan bort hornhinnan, iris, linsen, glaskroppen och neural näthinnan (för detaljerade strukturer av dessa vävnader, se figur 1).
- Överför RPE-choroid-sclera-komplexet till en ny 10 cm cellodlingsskål och gör fyra snitt för att platta ögonmusslan i form av en fyrklöver (figur 1C).
- Utför trypsin/EDTA-lösningssmältningen genom att placera de fyra RPE-choroid-sclera-komplexen i en ny 10 cm skål. Häll 20 ml färsk trypsin / EDTA-lösning för att slå samman RPE-choroid-sclera-komplexen och lägg skålen i cellodlingsinkubatorn vid 37 ° C i ~ 30 minuter.
OBS: Använd färsk trypsin / EDTA-lösning för att dissociera RPE-cellerna. Kontrollera noggrant tiden för uppslutningen av trypsin/EDTA-lösningen, eftersom en längre inkubationstid (mer än 30 min) kan öka kontamineringen av andra typer av celler.
3. Isolering och odling av RPE-celler från svinögonglober
- RPE-dissociation.
- Ta ut skålen ur inkubatorn efter 30 minuters inkubation med Trypsin / EDTA-lösning och tillsätt 20 ml förvärmda odlingsmedier (med 10% FBS) till skålen för att neutralisera trypsin / EDTA-lösningen.
I det här steget används endast DMEM/Basic-media. När celler når sammanflöde kan tre odlingsmedier användas beroende på de experimentella förhållandena: DMEM/Basic media, DMEM/F12 media och MEM-Nic media. - Använd en 5 ml överföringspipett för att dissociera RPE-cellerna genom att försiktigt pipettera flera gånger. Samla cellsuspensioner i 15 ml centrifugrör. Använd ytterligare 10 ml färskodlingsmedia (10% FBS) för att tvätta RPE-choroid-sclera-komplexen på skålen genom att försiktigt pipettera för att få så många RPE-celler som möjligt.
OBS: Triturate inte cellerna för kraftigt. Se till att fylla och tömma pipetten med en hastighet av cirka 3 ml/s. Undvik att bubbla cellsuspensionen.
- Ta ut skålen ur inkubatorn efter 30 minuters inkubation med Trypsin / EDTA-lösning och tillsätt 20 ml förvärmda odlingsmedier (med 10% FBS) till skålen för att neutralisera trypsin / EDTA-lösningen.
- Samla RPE-celler genom att centrifugera rören vid 200 x g i 5 minuter vid rumstemperatur. Aspirera supernatanten med en pipett och tillsätt ytterligare 5 ml odlingsmedia (10% FBS) för att återsuspendera cellerna och centrifugera vid 200 x g i ytterligare 5 minuter. Dekantera supernatanten och återsuspendera cellerna med 12 ml odlingsmedier.
OBS: När du aspirerar supernatanten, lämna cirka 1 ml media för att undvika att cellklumpar går sönder. - Såning av RPE-celler.
- Frö ~ 1-2 x 105 celler / brunn i 12-brunnsodlingsplattor eller transwellinsatser. Vanligtvis erhålls cirka 1,5 x 106 RPE-celler från fyra ögonbollar från svin. Byt odlingsmediet var 2: e dag och minska serumkoncentrationen till 1% när cellerna helt täcker ytan på brunnarna / insatserna.
OBS: Flytta inte cellodlingsskålen för ofta innan cellerna fäster på odlingsskålen / insatserna.
- Frö ~ 1-2 x 105 celler / brunn i 12-brunnsodlingsplattor eller transwellinsatser. Vanligtvis erhålls cirka 1,5 x 106 RPE-celler från fyra ögonbollar från svin. Byt odlingsmediet var 2: e dag och minska serumkoncentrationen till 1% när cellerna helt täcker ytan på brunnarna / insatserna.
- Byt odlingsmediet var 2: e dag tills cellerna skördas.
OBS: Koncentrationen av FBS kan minskas efter att cellerna når sammanflöde, och celler kan odlas i upp till flera månader för att möjliggöra full differentiering och mognad.
4. Karakterisering av primära RPE-celler från svin
- Odla cellerna vid sammanflöde i 1 eller 2 wks och skörda sedan cellerna för vidare analys.
- Skörda celler för kvantitativ realtids-PCR-analys (qRT-PCR).
- Ta bort odlingsmediet, tvätta cellerna med 1 ml kall 1x PBS och tillsätt sedan 500 μL RNA-extraktionslösning i varje brunn för att samla celllysat från cirka 1 x 106 celler.
- Extrahera mRNA13; cirka 4 μg RNA extraheras från varje prov. Använd 100 ng mRNA för att utföra omvänd transkription14; späd cDNA 40-faldigt för kvantitativ PCR-analys i realtid. Primers listas i tabell 1.
- Skörda celler för immunofluorescensfärgning.
- Ta bort odlingsmediet, tvätta cellerna med 1 ml kall 1x PBS och tillsätt sedan 500 μL 4% (w / v) paraformaldehyd i 1x PBS för att fixera cellerna (cirka 1 x 106 celler / brunn) i 30 min vid rumstemperatur. Tvätta sedan cellerna med 1x PBS två gånger och utför immunofluorescensfärgning med primära antikroppar (1:100 i 1x PBS kompletterat med 1% (w/v) bovint serumalbumin) vid 4 °C över natten och sekundära antikroppar (1:200 i 1x PBS kompletterat med 1% (w/v) bovint serumalbumin) vid rumstemperatur i 2 timmar enligt onlineprotokoll15.
- Immunofluorescensbilderna förvärvas av ett konfokalmikroskop enligt onlinehandboken16.
- Skörda celler för Western blot-analys.
- Ta bort odlingsmediet, tvätta cellerna med kall 1x PBS två gånger och tillsätt sedan 80 μL RIPA-buffert (med 1x proteashämmare) i varje brunn och använd cellskrapor för att repa cirka 1 x 106 celler från diskarna / insatserna.
- Samla celllysatet från varje brunn/sätt in i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Koka celllysaterna i 10 minuter och mät sedan proteinkoncentrationer med BCA-kit; proteinkoncentrationen i varje prov är ca 2 mg/ml. Använd 25 μg proteiner i varje prov för Western blot-analys enligt onlineprotokoll17.
- För Western blot, inkubera membranen i 5 ml primär antikroppslösning (1:1 000 spädning av primära antikroppar i 1x TBST-lösning kompletterad med 5 % (w/v) bovint serumalbumin) vid 4 °C över natten på en roterande multifunktionsskakare.
- Inkubera sedan membranet med cirka 15 ml anti-kanin eller anti-mus sekundär antikroppslösning (1:5 000 utspädning av sekundära antikroppar i 1x TBST-lösning kompletterad med 5% (w/v) fettfri mjölk) vid rumstemperatur i 2 timmar på en orbitalskakare, enligt källan till primär antikropp som används.
- Mätning av transepitelresistans (TER).
- Tvätta ätpinnarnas elektroder med 70% etanol och steril 1x PBS på ett sekventiellt sätt. Placera sedan den kortare änden av elektroden i den övre kammaren och den längre änden i den nedre kammaren på transwellinsatserna och klicka på knappen på epitelvoltmetern för mätningarna. Registrera TER-mätningarna för varje brunn i tre exemplar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De primära RPE-cellerna (pRPE) odlades i DMEM/Basic media med 10% FBS, och cellmorfologi under ljusmikroskop fotograferades vid 2 dagar (figur 2A), 6 dagar (figur 2B) och 10 dagar (figur 2C) efter sådd. Efter 1 wk observerades ett sammanflytande monolager av pigmenterade pRPE-celler med kullerstensmorfologier.
För att bättre karakterisera de primära pRPE-cellerna odlades primära humana RPE-celler (hRPE) vid passage 3 (P3) 18 och ARPE-19-celler i DMEM / Basic-media med 1% FBS för en annan wk, och sedan skördades det totala mRNA och proteinet i de odlade cellerna, liksom rpe/choroidvävnader från svin. Uttrycksnivåerna för viktiga karakteristiska gener19 och proteinmarkörer för mogen RPE utvärderades av qRT-PCR och Western blot. Jämfört med ARPE-19-celler behöll pRPE-celler signifikant högre uttrycksnivåer av gener som fungerar i inbyggd RPE-utsöndring (figur 3A(c)), fagocytos (figur 3A(i)), transport (figur 3A(a),(d)), täta korsningar (figur 3A(j)), barriärbildning (figur 3A(b)) samt visuell cykel (figur 3A(e),B). Uttrycksnivåerna för Krt8 och Krt18, två cytoskelettmarkörgener i RPE, var dock signifikant lägre i primära pRPE-celler jämfört med primära hRPE- och ARPE-19-celler (figur 3A(g),(h)). Dessutom var itgav, som deltar i fagocytos, lägre i primära pRPE-celler också (figur 3A (f)). Eftersom uttrycksnivåerna för dessa tre gener i pRPE-celler liknade rpe/koroidvävnaden hos svin kan detta indikera skillnaderna i genuttryck mellan arterna. Dessutom reducerades uttrycksnivån för Tyr, som är ansvarig för melaninproduktionen, kraftigt i både primära pRPE- och hRPE-celler (figur 3A(k)), vilket kan förklara förlusten av pigmentering i långvariga odlade celler. Skillnaderna i qRT-PCR-resultaten som observerats i data från humana pRPE- och svin-pRPE-celler kan bero på längre lagring och högre passagenummer (P3) för humant pRPE, vilket indikerar en förlust av RPE-tecken vid subodling. Dessutom visade Western blot att RPE65-protein, som är ett nyckelenzym i den visuella cykeln med RPE-celler, uttrycktes i pRPE-celler, medan dess uttrycksnivå minskade signifikant i primära hRPE-celler och ARPE-19-celler (figur 3B,C).
För att ytterligare karakterisera polaritets- och barriärfunktionerna hos RPE-celler odlades de odlade sammanflytande monolagren av pRPE- och ARPE-19-celler i transwellinsatser med DMEM / Basic, DMEM / F12 och MEM-Nic-media för 1 wk (Figur 4). Under dessa odlingsförhållanden avslöjade Na +-K +-ATPase (figur 4A-F) och ZO-1 (figur 4G-L) fluorescerande färgningsresultat att pRPE-celler hade högre uttrycksnivåer av både Na + - K + -ATPas och ZO-1 än ARPE-19-celler. Den lika fördelningen av Na+-K+-ATPas vid den apikala och basala ytan av pRPE-celler indikerade att en längre odlingstid krävdes för att återställa cellpolariteter in vitro.
RPE bildar täta korsningar nära sin apikala yta för att tätt reglera utbytet av metaboliter mellan den inre näthinnan och koroider20. ZO-1-färgning föreslog att täta korsningsproteiner normalt lokaliserades vid plasmamembranet hos primära pRPE-celler med regelbundna kullerstensmorfologier, men inte av ARPE-19-celler. Bland de tre odlingsmedierna observerades de bästa ZO-1-färgningsmönstren i celler odlade i DMEM / Basic, medan DMEM / F12 misslyckades med att upprätthålla kullerstensmorfologin hos pRPE-celler. Ett högre TER-värde fungerar som en indikator på tät korsningsbildning och bättre barriärfunktioner hos RPE-celler21. För att bekräfta funktionen hos täta korsningar mättes transepitelmotstånd (TER). Endast något högre TER upptäcktes dock jämfört med tomma transwellinsatser (figur 4M,N).
I näthinnan finns Bruchs membran mellan RPE och choroid. Huvudkomponenterna i Bruchs membran är kollagen typ IV, proteoglykaner och laminin22. För att simulera den stödjande effekten av Bruchs membran på RPE spreds laminin på ytan av transwellmembranet för att underlätta mognaden av odlade RPE-celler. Baserat på resultaten från figur 4 odlades de sammanflytande pRPE-cellerna på transwellinsatser i DMEM/Basic-media med 1% FBS för 2 wks. Immunofluorescerande färgningsresultat visade att RPE-specifika proteiner RPE65 uttrycktes i alla pRPE-celler (figur 5A,B). Na+-K+-ATPas distribuerades på den apikala ytan av pRPE-celler, vilket tyder på återupprättande av cellpolariteter (figur 5C,D). Både ZO-1-färgning och TER-resultat indikerade att täta korsningar var välformade i primära pRPE-celler när de odlades på laminin (figur 5E, F, H). Figur 5G visar celler färgade med Hoechst-färgämne.
Dessutom visade Western blot att både pRPE- och ARPE-19-celler producerade tillväxtfaktorer, inklusive pigmentepitel-härledd faktor (PEDF) och vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF) (figur 6A). Efter att sammanflytande monolager av pRPE odlats i transwellinsatser med DMEM/Basic, DMEM/F12 och MEM-Nic-media i 1 wk, samlades odlingsmedier från de övre och nedre kamrarna i transwellinsatserna in och den utsöndrade VEGF kvantifierades av ELISA. När DMEM/Basic och MEM-Nic-medier användes för cellodling utsöndrade pPRE-celler mer VEGF än celler i DMEM/F12-media (figur 6B). Inga skillnader kunde dock upptäckas i VEGF-mängder mellan de övre och nedre kamrarna i transwellinsatserna under alla testade förhållanden (figur 6B). Dessutom, efter att primära pRPE-celler odlats på skären belagda med laminin och i DMEM / Basic-media i 2 wks, samlades media från de övre och nedre kamrarna. Western blot-analys visade högre nivåer av PEDF i den övre kammaren än den nedre kammaren, medan proteinnivåerna för utsöndrad VEGF var likartade vid båda kamrarna (figur 6C). Dessa resultat stödde ytterligare återupprättandet av cellpolaritet när primära pRPE-celler odlades i ytterligare 2 wks efter att de nått sammanflöde på laminin.
Figur 1: Grundläggande steg för pRPE-cellisolering . (A) Tvätta ögonglober för svin med 1x PBS i 50 ml sterila centrifugrör. (B,C) Förbered RPE-choroid-sclera-komplex för enzymatisk matsmältning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Primära pRPE-cellmorfologier efter cellodling. Representativa bilder av primära pRPE-celler vid (A) dag 2, (B) dag 6 och (C) dag 10. Skala bar 250 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Uttrycksnivåer för viktiga signaturgener och proteiner i odlade RPE-celler. (A) qRT-PCR-analys av mRNA-nivåer av signaturgener i primära pRPE-celler, primära hRPE-celler, ARPE-19-celler och pRPE / choroidvävnad. Gapdh användes som hushållningsgen för qRT-PCR. Fyra biologiska replikat användes för primära pRPE-celler och ARPE-19-celler, medan tre biologiska replikat användes för primära hRPE-celler och pRPE/choroidvävnad. Genuttrycksnivåerna i ARPE-19-celler sattes som kontroller. (B) Western blot-analys av RPE65-proteiner i ARPE-19- och pRPE-celler. Vinculin användes som lastkontroll. (C) Western blot-analys av RPE65-proteiner i primära hRPE-celler och pRPE/choroidvävnad. Vinculin användes som lastkontroll. Som jämförelse användes student t-test, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: En-wk-odling av primära pRPE- och ARPE-19-celler i DMEM/Basic-, DMEM/F12- och MEM-Nic-media med 1 % FBS. (A) Na+-K+-ATPas-fluorescerande färgning (röd) av primära pRPE-celler i DMEM/Basic, (B) DMEM/F12 och (C) MEM-Nic-medier. (D) Na+-K+-ATPas-fluorescerande färgning (röd) av ARPE-19-celler i DMEM/Basic-media, (E) DMEM/F12-media och (F) MEM-Nic-media. (G) ZO-1 fluorescerande färgning (grön) av primära pRPE-celler i DMEM/Basic media, (H) DMEM/F12-media och (I) MEM-Nic-media. (J) ZO-1 fluorescerande färgning (grön) i ARPE-19-celler i DMEM / Basic-media, (K) DMEM / F12-media och (L) MEM-Nic-media. TER-mätningar efter primära pRPE (M) och ARPE-19 (N) celler odlades i DMEM / Basic, DMEM / F12 och MEM-Nic-media för 1 wk. För varje typ av celler erhölls data från minst tre olika brunnar. Som jämförelse användes student t-test, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Skala bar 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Två-wk-odling av pRPE-celler i DMEM/Basic media med 1% FBS. (A-F) Celler odlade med eller utan laminin färgades med RPE65 (A,B, Röd), Na+-K+-ATPas (C,D, Röd), ZO-1 (E,F, Grön) och (G) Hoechst (Blå) . (H) TER-mätningar i cellblad odlade med eller utan laminin. För olika behandlingar erhölls data från fyra olika brunnar. Som jämförelse användes student t-test, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Sekretoriska funktioner hos odlade primära pRPE- och ARPE-19-celler. (A) Western blot-analys av VEGF och PEDF i primära pRPE- och ARPE-19-celler. (B) Utsöndrad VEGF i den övre och nedre kammaren i transwellinsatser med primära pRPE-celler när konfluenta celler odlades i DMEM/Basic-, DMEM/F12- och MEM-Nic-media i 1 wk. (C) Utsöndrad PEDF och VEGF i den övre och nedre kammaren i transwellinsatser med primär pRPE i DMEM/Basic-media i 2 wks. För olika behandlingar erhölls data från tre olika brunnar. Som jämförelse användes student t-test, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Mänsklighet | Sus scrofa | |
| Bäst1 | F: GAAGGCAAGGACGAGCAAG | F: GGACACCTGTATGCCTACGA |
| R: TCCAACTGCTTGTGTTCTGC | R: GGAACGTGAAGAGGGGTACA | |
| Cldn19 | F: GGTGACCCAGGAGTTCTTCA | F: TCGTGACCCAGGAGTTCTTC |
| R: CTGTTGGGTCTCTCTCTCTCTC | R: GCTGCTGTTGGATCGCTC | |
| Itgav | F: CGCAGTCCCATCTCAAATCC | F: GCTTTCTTCAGGACGGAACA |
| R: GGCCCTGTATAAGATAGCTCGA | R: GAAATGAGCTGACCTTGCCA | |
| Krt8 | F: GGAGCAGATCAAGACCCTCA | F: CCCAGGAGAAGGAGCAGATC |
| R: GCCGCCTAAGGTTGTTGATG | R: ATGTTGTCGATGTTGCTCCG | |
| Krt18 | F: CTTGGAGAAGAAGGGACCCC | F: GCTGATAATCGGAGGCTGGA |
| R: GGCCAGCTCTGTCTCATACT | R: GAAGTCATCAGCAGCGAGAC | |
| Mertk | F: GTGTGCAGCGTTCAGACAAT | F: GCGGCTATTTCTTGGTGGAA |
| R: AAAATGTTGACGGGCTCAGG | R: ACGTAGATGGGGTCAGACAC | |
| Serpinf1 | F: CAGATGAAAGGGAAGCTCGC | F: AAGACGTCGCTGGAGGATTT |
| R: TTAGGGTCCGACATCATGGG | R: GGTCACTTTCAGAGGCAGGA | |
| Slc16a8 | F: GGGTGTCCTCCATCATGCTA | F: CAGTTCGAGGTGCTCATGG |
| R: GTCAGGTAGAGCTCCAGGAG | R: GACAGCCATGAAGACACCAG | |
| Stra6 | F: CTTTGCAGGAAGAAGCTGGG | F: CTAGCCGTGTTGTCGATCCT |
| R: TAAATGGCCGTCCCTGTCAG | R: GACCATGAAGACAGCAGCAGCAG | |
| Tjp1 | F: ACAGGAAAATGACCGAGTTGC | F: AAGACTTGTCAGCTCAGCCA |
| R: TGGTTCAGGATCAGGACGAC | R: CCAGCATCTCGAGGTTCACT | |
| Tyr | F: ACTCAGCCCAGCATCATTCT | F: ATCTACTCAGCCCAGCATCC |
| R: ACATCAGCTGAAGAGGGGAG | R: GAGCCTTGGAGTCCTGGATT | |
| Gapdh | F: CAGCCTCAAGATCATCAGCA | F: CATCCTGGGCTACACTGAGG |
| R: ATGATGTTCTGGAGAGCCCC | R: GGGGCTCTTACTCCTTGGAG |
Tabell 1: Primers för qRT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här har ett detaljerat och optimerat protokoll för isolering, odling och karakterisering av RPE-celler från svinögonbollar, vilket genererar en bra modell för in vitro-karakterisering av RPE-celler och RPE-relaterade sjukdomsstudier beskrivits. Metoder för isolering av RPE från mänskliga, mus- och råttögon har beskrivits tidigare23,24,25. Det är dock svårt att få mänskliga ögonbollar i vissa laboratorier, och det väcker vanligtvis etiska frågor. RPE-vävnaderna hos möss och råttor är relativt små, cellerna skadas lätt under separationen och endast ett fåtal celler kan erhållas från varje djur. Däremot är ögonbollar från svin mycket lättare att få och hantera, vilket stabilt kan generera ett relativt stort antal primära celler från en enda ögonglob. I vissa studier används pincett för att mekaniskt separera RPE, vilket lätt kan leda till celldöd. Därför har hyaluronsyra, dispas och trypsin/EDTA-lösning använts för att dissociera RPE-celler tidigare. Tidigare studier har visat att Trypsin/EDTA-lösningen har förmågan att hjälpa RPE att lossna från choroid21. Därför användes trypsin/EDTA-lösning för att smälta svinvävnaderna, vilket ger optimala resultat. Efter trypsin/EDTA-neuralisering kan RPE-vävnader dissocieras till encellssuspension genom att försiktigt pipettera med en pipettspets. Ett knep är att färsk trypsin/EDTA-lösning rekommenderas för varje experiment för att helt dissociera RPE-celler. På grund av det stora området av RPE-vävnaderna hos svinögonbollar måste det halvskålformade RPE-choroid-sclera-komplexet skäras i form av en fyrklöver, vilket bidrar till full kontakt mellan RPE-vävnaderna och Trypsin / EDTA-lösningen för att underlätta deras separation från choroiden. Matsmältningstiden bör dock inte överstiga en halvtimme. Inom denna tid kommer andra vävnader utom RPE inte att smälta, vilket effektivt kan minska föroreningarna från andra typer av celler.
Laminin spreds på ytan av transwellmembranet för att simulera den stödjande effekten av Bruchs membran på RPE. Resultaten visade att laminin var fördelaktigt för tillväxten av pRPE-celler, vilket stimulerade uttrycket av transportör- och tätkorsningsproteiner. Resultaten indikerade emellertid också att en längre odlingstid, på cirka 2 wks, krävdes för primära pRPE-celler för att återställa vissa egenskaper hos inhemska RPE-vävnader, inklusive cellpolaritet och täta korsningar.
En brist för primär RPE-kultur är att det är svårt att upprätthålla visuella cykelenzymuttryck in vitro. Därför är det viktigt att undersöka om odlade RPE-celler kan uttrycka RPE-specifika proteiner RPE65. Jämfört med ARPE-19-celler uttryckte pRPE-celler signifikant mer RPE65-protein. Däremot observerades endast ett svagt band av RPE65-protein i ARPE-19-celllysater i Western blot. Det är intressant att observera att molekylvikten för RPE65 var något annorlunda mellan människa och gris (figur 3B,C). Förlusten av RPE65-uttryck i odlade RPE-celler kvarstår som ett mysterium. Även i odlade primära celler förlorades RPE65 gradvis med passager (data visas inte). Hittills kräver hur man upprätthåller uttrycket av RPE65 in vitro ytterligare undersökning, med tanke på att visuell cykel är en kritisk funktion för infödda RPE-vävnader. För det andra är en viktig begränsning av detta protokoll att in vitro-odlade RPE-celler inte kan passeras. Med långvarig odling tenderar pRPE-celler att förlora sin sexkantiga form och TER samt pigmentering, så att endast passage 0-celler kan användas. En annan begränsning av detta odlingsprotokoll är att genetiska mutationer, som leder till ärftliga näthinnesjukdomar, är svåra att reproducera i dessa celler. Därför kan virusmedierad genredigering användas för att studera ärftliga RPE-störningar som Leger medfödd amauros i framtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare avslöjade att det inte finns några intressekonflikter.
Alla författare förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill visa sin tacksamhet och respekt för alla djur som bidrar med sina celler i denna studie. Denna studie stöddes delvis av bidrag från National Key R&D Program of China (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao och Grant nr 2018YFA0107301, Wei Li). Författarna tackar Jingru Huang och Xiang You från Central Lab, School of Medicine, Xiamen University för tekniskt stöd inom konfokal avbildning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ARPE-19 cells | CCTCC | GDC0323 | |
| Bovine serum albumin | Yeasen | 36101ES60 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM 880 with Airyscan | |
| ChemiDoc Touch | Bio-Rad | 1708370 | |
| Cell scraper | Sangon | F619301 | |
| 10 cm culture dish | NEST | 121621EH01 | |
| 12-well culture plate | NEST | 29821075P | |
| DMEM F12 Medium | Gibco | C11330500BT | |
| DMEM basic Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EVOM2 | World Precision Instruments | EVOM2 | For TER measurement |
| Fetal bovine serum | ExCell Bio | FSP500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 0300-0108P | |
| Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 5196-2504 | |
| hydrocortisone | MCE | HY-N0583/CS-2226 | |
| Hoechst 33342 solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| LightCycler 96 Instrument | Roche | 5815916001 | |
| Liothyronine | MCE | HY-A0070A/CS-4141 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| MEM(1X)+GlutaMAX Medium | Gibco | 10566-016 | |
| MEM NEAA(100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Millex-GP syringe filter unit | Millipore | SLGPR33RB | |
| N1 | Sigma-Aldrich | SLCF4683 | |
| NcmECL Ultra | New Cell&Molecular Biotech | P10300 | |
| Non-fat Powdered Milk | Solarbio | D8340 | |
| Nicotinamide | SparkJade | SJ-MV0061 | |
| Na+-K+ ATPase antibody | Abcam | ab76020 | Recognize both human and porcine proteins |
| PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%) | Epizyme | PG112 | |
| primary Human RPE cells | - | - | Generous gift from Shoubi Wang lab |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Prism | GraphPad by Dotmatics | version 8.0 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | APExBIO | K1024 | |
| PRE65 antibody | Proteintech | 17939-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| PEDF antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-390172 | Recognize both human and porcine proteins |
| 100 x penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-031-1BCS | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | RARBIO | RA-9005 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | Toyobo | FSQ-201 | |
| RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 601052 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 602052 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Taurine | Damas-beta | 107-35-7 | |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | RNA extraction solution |
| TB Green Fast qPCR Mix | Takara | RR430A | |
| 12-well transwell inserts | Labselect | 14212 | |
| VEGF antibody | Proteintech | 19003-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| VEGF ELISA kit | Novusbio | VAL106 | |
| ZO-1 antibody | ABclonal | A0659 | Recognize both human and porcine proteins |
References
- Tan, L. X., Germer, C. J., La Cunza, N., Lakkaraju, A. Complement activation, lipid metabolism, and mitochondrial injury: Converging pathways in age-related macular degeneration. Redox Biology. 37, 101781 (2020).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Ducloyer, J. B., Le Meur, G., Cronin, T., Adjali, O., Weber, M. Gene therapy for retinitis pigmentosa. Medecine Sciences. 36 (6-7), 607-615 (2020).
- den Hollander, A. I., Roepman, R., Koenekoop, R. K., Cremers, F. P. Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 391-419 (2008).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Smith, D. T. Melanin pigment in the pigmented epithelium of the retina of the embryo chick eye studied in vivo and in vino. The Anatomical Record. 18, 260-261 (1920).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- D'Antonio-Chronowska, A., D'Antonio, M., Frazer, K. A. In vitro differentiation of human iPSC-derived retinal pigment epithelium cells (iPSC-RPE). Bio-Protocol. 9 (24), 3469 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- Scientific, T. , Available from: https://www.thermofisher.cn/document-connect/document connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2Ftrizol_reagent.pdf (2022).
- Toyota. , Available from: https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf (2022).
- Abcam. , Available from: https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol (2022).
- Zeiss. , Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals (2022).
- Cell Signal Technology. , Available from: https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western (2022).
- Wang, S., et al. Reversed senescence of retinal pigment epithelial cell by coculture with embryonic stem cell via the TGFbeta and PI3K pathways. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 588050 (2020).
- Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Experimental Eye Research. 126, 1-4 (2014).
- Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Experimental Eye Research. 126, 5-15 (2014).
- Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. Physiology and function of the tight junction. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002584 (2009).
- Nita, M., Strzalka-Mrozik, B., Grzybowski, A., Mazurek, U., Romaniuk, W. Age-related macular degeneration and changes in the extracellular matrix. Medical Science Monitor. 20, 1003-1016 (2014).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Langenfeld, A., Julien, S., Schraermeyer, U. An improved method for the isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult rats. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1493-1502 (2015).
- Sonoda, S. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
