Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Domuz Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Primer Kültürü

Published: September 23, 2022 doi: 10.3791/64244
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Eye Institute of Xiamen University, Fujian Provincial Key Laboratory of Ophthalmology and Visual Science, School of Medicine, Xiamen University, 2Department of Ophthalmology, Xiang'an Hospital of Xiamen University, School of Medicine, Xiamen University, 3Xiamen University Affiliated Xiamen Eye Center, School of Medicine, Xiamen University
* These authors contributed equally

Summary

Burada, primer domuz retinal pigment epitel hücrelerinin in vitro olarak kültürlenmesi için takip edilmesi kolay bir yöntem sunulmaktadır.

Abstract

Retina pigment epiteli (RPE), retinadaki koroid ve nöroretina arasında yer alan polarize pigmentli epitel hücrelerinin tek katmanıdır. Fagositoz, besin / metabolit taşınması, A vitamini metabolizması vb. dahil olmak üzere birçok fonksiyon RPE tarafından günlük olarak gerçekleştirilir. RPE hücreleri, rejeneratif kapasitesi çok az olan veya hiç olmayan terminal olarak farklılaşmış epitel hücreleridir. RPE hücrelerinin kaybı, yaşa bağlı makula dejenerasyonu gibi görme bozukluğuna yol açan çoklu göz hastalıklarına neden olur. Bu nedenle, RPE'ye hücre hatlarından daha çok benzeyen primer RPE hücrelerinin in vitro kültür modelinin oluşturulması, RPE hücrelerinin karakteristik ve mekanik çalışmaları için kritik öneme sahiptir. İnsan gözbebeklerinin kaynağının sınırlı olduğu gerçeğini göz önünde bulundurarak, birincil domuz RPE hücrelerini kültürlemek için bir protokol oluşturuyoruz. Bu protokolü kullanarak, RPE hücreleri yetişkin domuz gözbebeklerinden kolayca ayrılabilir. Daha sonra, bu ayrışmış hücreler kültür tabaklarına / eklerine bağlanır, akıcı bir tek katman oluşturmak için çoğalır ve epitel dokusunun temel özelliklerini in vivo olarak 2 wks içinde hızla yeniden oluşturur. qRT-PCR ile, birincil domuz RPE hücrelerinin doğal RPE dokusu ile karşılaştırılabilir seviyelerde çoklu imza genleri eksprese ettiği, bu genlerin çoğunun ekspresyonlarının insan RPE benzeri hücrelerde, ARPE-19'da kaybolduğu / yüksek oranda azaldığı gösterilmiştir. Ayrıca, immünofloresan boyama, sıkı birleşme, doku polaritesi ve sitoiskelet proteinlerinin dağılımını ve ayrıca kültürlenmiş primer hücrelerde A vitamini metabolizması için kritik bir izomeraz olan RPE65'in varlığını gösterir. Toplamda, RPE fizyolojisini anlamak, hücre toksisitelerini incelemek ve ilaç taramalarını kolaylaştırmak için iyi bir model olarak hizmet edebilecek yüksek saflıkta ve doğal RPE özelliklerine sahip birincil domuz RPE hücrelerinin kültürüne takip edilmesi kolay bir yaklaşım geliştirdik.

Introduction

Retinal pigment epiteli (RPE), retina1'in dış tabakasındaki fotoreseptörler ve koryokapillaris arasında bulunur ve kan-retinal bariyerin oluşturulması, besin maddelerinin ve retinal metabolitlerin taşınması ve değişimi, normal bir görme döngüsünü sürdürmek için A vitamininin geri dönüşümü ve fagositoz ve dökülen fotoreseptör dış segmentlerinin (POS'lar) temizlenmesi gibi birçok fonksiyona sahiptir2,3 . POS'lar görme üretmek için sürekli kendini yenilemeyi gerektirdiğinden, RPE hücrelerinin retinal homeostazı korumak için sürekli olarak ayrılmış POS'ları yutması gerekir4. Bu nedenle, RPE disfonksiyonu, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD)4, retinitis pigmentosa (RP)5, Leber konjenital amaurozus6, diyabetik retinopati7 gibi birçok kör edici göz hastalığına neden olur. Şimdiye kadar, bu hastalıkların çoğunun kesin patogenezi belirsizliğini korumaktadır. Sonuç olarak, RPE hücre biyolojisini, patolojik değişiklikleri ve altta yatan mekanizmaları incelemek için RPE hücre kültürü kurulmuştur.

Hücre biyolojisini incelemek için en basit model olarak, RPE hücrelerinin kültürü 1920'lerin8'i kadar erken bir tarihte başlatıldı. ARPE-19, RPE hücreleri olarak yaygın olarak kullanılmasına rağmen, pigmentasyon kaybı, parke taşı morfolojisi ve özellikle bu hücre hattındaki bariyer fonksiyonları birçok endişeyi gündeme getirmektedir9. Buna karşılık, birincil insan RPE hücrelerinin kültürü, fizyolojik ve patolojik çalışmalar için daha gerçekçi bir senaryo sunmaktadır9. Bununla birlikte, nispeten sınırlı kullanılabilirlik kullanımlarını kısıtlar ve etik sorunlar her zaman mevcuttur. Ek olarak, birkaç grup RPE hücrelerini kültürlemek için fare modellerini kullandı. Bununla birlikte, fare gözünün boyutu küçüktür ve tek bir kültür genellikle uygun olmayan birçok fare gerektirir9. Son zamanlarda, bilim adamları insan embriyonik kök hücrelerini kullanmak için yeni yöntemler geliştirdiler veya RPE hücrelerini türetmek için pluripotent kök hücreleri indüklediler. Bu teknik kalıtsal RPE bozukluklarının tedavisi için özel bir potansiyele sahip olmasına rağmen, zaman alıcıdır ve olgun RPE hücrelerinin üretilmesi genellikle birkaç ay gerektirir10. Bu sorunların üstesinden gelmek için, burada laboratuvarda rutin olarak yüksek saflıkta RPE hücrelerini izole etmek ve kültürlemek için takip edilmesi kolay bir protokol sunuyoruz. Uygun kültür koşulları altında, bu hücreler tipik RPE fonksiyonları gösterebilir ve tipik RPE morfolojileri sergileyebilir. Bu nedenle, bu kültür yöntemi RPE fizyolojisini anlamak, sitotoksisiteyi incelemek, ilgili oküler hastalıkların patolojik mekanizmalarını araştırmak ve ilaç taramaları yapmak için iyi bir model sağlayabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Deney hayvanlarının kullanımı, Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği'nin (ARVO) düzenlemelerine uygun ve Xiamen Üniversitesi Deneysel Hayvan Yönetimi Etik Kurulu tarafından onaylandı.

1. Deneysel cerrahi cihazların, doku sindirim enziminin ve hücre kültürü tamponunun hazırlanması

  1. Göz küresi diseksiyonundan bir gün önce iki çift oftalmik cerrahi makas ve forseps temizleyerek ve otoklavlayarak ve daha sonra kutuyu gece boyunca 65 ° C'de genel protokollü bir fırında cerrahi cihazlarla kurutarak deneysel cerrahi cihazları hazırlayın.
  2. Kültür medyası hazırlama.
    1. % 10 (v / v) fetal sığır serumu, 2 mM L-glutamin ve% 1 (v / v) penisilin (100 U / mL) ve streptomisin (100 U / mL) ile desteklenmiş DMEM / Temel ortam hazırlayın.
    2. % 1 (v / v) FBS ve% 1 (v / v) penisilin (100 U / mL) ve streptomisin (100 U / mL) ile desteklenmiş DMEM / F12 ortamını hazırlayın.
    3. MEM alfayı 2 mM L-glutamin,% 1 FBS,% 1 (v / v) penisilin (100 U / mL) ve streptomisin (100 U / mL), 0.1 mM NEAA,%1 (v / v) N1 takviyesi, taurin (0.25 mg / mL), hidrokortizon (20 ng / mL), triiodo-tironin (0.013 ng / mL) ve 10 mM nikotinamid ile destekleyerek MEM-Nic 11'i hazırlayın.
      NOT: Hücre canlılığını ve çoğalmasını iyileştirmek için, sindirim enzimlerini nötralize etmek ve ayrışmış hücreleri tohumlamak için FBS yüzdesi% 20'ye yükseltilebilir. Uzun süreli hücre kültürü için, FBS yüzdesi% 1 kadar düşük bir seviyeye düşürülebilir12.
  3. Deney sırasında doku sindirim enzimi aliquot'u (0.91 mM EDTA ile desteklenmiş% 0.25 (w / v) Tripsin / EDTA çözeltisi, bundan böyle Tripsin / EDTA çözeltisi olarak anılacaktır) çözün.
    NOT: Optimum sonuçlar elde etmek için her seferinde taze Tripsin/EDTA çözeltisi kullanılmalıdır. Her 15 mL steril santrifüj tüpüne 10 mL taze Tripsin/EDTA çözeltisi verin ve alikotları -20 °C buzdolabında kullanıma kadar dondurun.
  4. Diseksiyon çözümü.
    1. %2 (v/v) penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (100 U/mL) ile desteklenmiş 1x Fosfat Tamponlu Tuzlu Sürün (PBS) (pH 7.2) çözeltiyi 0,22 μm şırınga filtre ünitesinden filtreleyerek sterilize edin.
  5. Kültür plakalarını ve transwell eklerini kaplayın.
    1. Kuyucukları ve transwell uçlarını 1x PBS ile yıkayın. PBS'yi bir pipetle kuyucuklardan ve transwelllerden çıkarın ve ardından alt odaya 1 mL taze 1x PBS ve üst odaya 600 μL 10 μg / mL laminin çözeltisi ekleyin.
    2. Hücre kültürü inkübatöründeki plakaları/transwell eklerini gece boyunca 37 °C ve %5 CO2'de inkübe edin. Laminin çözeltisini üst odadan çıkarın ve hücreleri tohumlamadan önce iki kez 1 mL soğuk 1x PBS ile yıkayın.

2. Domuz göz küresi RPE hücrelerinin diseksiyonu

  1. Aletlerin hazırlanması.
    1. Laminer davlumbaz %75 etanol ve UV ışığı ile temizleyin. ~25 mL %75 etanol içeren üç adet 50 mL steril santrifüj tüpü, ~25 mL 1x PBS içeren üç adet 50 mL steril santrifüj tüpü ve ~15 mL 1x PBS içeren üç adet 10 cm'lik steril hücre kültürü kabı hazırlayın.
      NOT: Bu ayarlar genellikle dört domuz gözbebeğini diseke etmek için kullanılır. Lütfen daha fazla göz küresi kullanıldığında ölçeği artırın. Hücre canlılığını artırmak için, buz üzerinde 1x PBS tamponunu en az 30 dakika önceden soğutun. Deneysel aletlerin ve hücrelerin kirlenmemesini sağlamak için hem %75 etanol hem de UV ışığı gereklidir. Tüm ameliyat masasını en az 15 dakika sterilize etmek için UV lambasını önceden açın.
  2. Domuz gözbebeklerini temizleyin.
    1. Bir mezbahadan taze göz küreleri alın ve diseksiyona kadar buz üzerinde tutun. Dört domuz gözküresini 10 cm'lik bir Petri kabında ~ 15 mL% 75 etanol içine batırın ve tüm artık bağ dokularını ve kaslarını kesmek için bir çift makas ve forseps kullanın.
      NOT: Kontaminasyonları azaltmak için skleranın dışından mümkün olduğunca fazla doku çıkarın. Dekontaminasyon ve yıkama adımı sırasında göz kürelerinin transferini kolaylaştırmak için optik siniri şu anda kesmeyin. Bu adımdan sonra, tüm prosedürler laminer bir akış başlığında yapılmalıdır.
  3. Domuz göz kürelerini, dört domuz gözbebeğini% 75 etanol ile doldurulmuş üç adet 50 mL steril santrifüj tüpünde sıralı bir şekilde ıslatarak ve yıkayarak dekontamine edin; Her göz küresi, her tüpte en az 5 dakika boyunca daldırılır. Daha sonra, domuz gözbebeklerini 1x PBS ile doldurulmuş üç adet 50 mL steril santrifüj tüpünde sıralı bir şekilde yıkayın; Her bir göz küresini her tüpte en az 5 dakika yıkayın (Şekil 1A). Göz kürelerini iyice yıkamak için tüpleri her dakika ters çevirin.
  4. Domuz gözbebeklerinin diseksiyonu.
    1. Dört domuz gözbebeğini 1x PBS içeren 10 cm'lik steril bir hücre kültürü kabına taşıyın. Optik siniri ve küçük kalıntıları çıkarmak için her bir göz küresinin dış yüzeyini tekrar kesin (Şekil 1B). Limbus ve skleranın kesiştiği noktada küçük bir kesim yapmak için makas kullanın ve ardından kornea, iris, lens, vitreus gövdesi ve nöral retinayı çıkarın (bu dokuların ayrıntılı yapıları için lütfen Şekil 1'e bakın).
    2. RPE-choroid-sklera kompleksini yeni bir 10 cm'lik hücre kültürü kabına aktarın ve vizör kapağını dört yapraklı yonca şeklinde düzleştirmek için dört kesim yapın (Şekil 1C).
  5. Dört RPE-koroid-sklera kompleksini 10 cm'lik yeni bir kaba yerleştirerek Tripsin/EDTA çözeltisi sindirimini gerçekleştirin. RPE-koroid-sklera komplekslerini birleştirmek için 20 mL taze Tripsin / EDTA çözeltisi dökün ve çanağı ~ 30 dakika boyunca 37 ° C'de hücre kültürü inkübatörüne koyun.
    NOT: RPE hücrelerini ayırmak için taze Tripsin/EDTA çözeltisi kullanın. Tripsin / EDTA çözeltisinin sindirim süresini dikkatlice kontrol edin, çünkü daha uzun bir inkübasyon süresi (30 dakikadan fazla) diğer hücre türlerinin kontaminasyonunu artırabilir.

3. Domuz göz küresi RPE hücrelerinin izolasyonu ve kültürü

  1. RPE ayrışması.
    1. Tripsin / EDTA çözeltisi ile 30 dakikalık inkübasyondan sonra kabı inkübatörden çıkarın ve Tripsin / EDTA çözeltisini nötralize etmek için kaba 20 mL önceden ısıtılmış kültür ortamı (% 10 FBS ile) ekleyin.
      NOT: Bu adımda, yalnızca DMEM/Basic ortamı kullanılır. Hücreler akıcılığa ulaştığında, deneysel koşullara bağlı olarak üç kültür ortamı kullanılabilir: DMEM / Temel ortam, DMEM / F12 ortamı ve MEM-Nic ortamı.
    2. RPE hücrelerini birkaç kez hafifçe pipetle çekerek ayırmak için 5 mL'lik bir aktarım pipeti kullanın. Hücre süspansiyonlarını 15 mL santrifüj tüplerine toplayın. Mümkün olduğunca çok RPE hücresi elde etmek için hafifçe pipetleme yaparak çanak üzerindeki RPE-koroid-sklera komplekslerini yıkamak için başka bir 10 mL taze kültür ortamı (%10 FBS) kullanın.
      NOT: Hücreleri çok kuvvetli bir şekilde tritüre etmeyin. Pipetin yaklaşık 3 mL/s oranında doldurulup boşaltıldığından emin olun. Hücre süspansiyonunu köpürtmekten kaçının.
  2. Tüpleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj ederek RPE hücrelerini toplayın. Bir pipet kullanarak süpernatantı aspire edin ve hücreleri yeniden askıya almak ve 5 dakika daha 200 x g'de santrifüj yapmak için 5 mL kültür ortamı (% 10 FBS) ekleyin. Süpernatantı boşaltın ve hücreleri 12 mL kültür ortamı ile yeniden askıya alın.
    NOT: Süpernatanı aspire ederken, hücre kümelerinin kırılmasını önlemek için yaklaşık 1 mL ortam bırakın.
  3. RPE hücrelerinin tohumlanması.
    1. Tohum ~ 1-2 x 105 hücre / kuyu 12 delikli kültür plakalarına veya transwell eklerine. Genellikle, dört domuz göz küresinden yaklaşık 1.5 x 106 RPE hücresi elde edilir. Kültür ortamını her 2 günde bir değiştirin ve hücreler kuyucukların / eklerin yüzeyini tamamen kapladığında serum konsantrasyonunu% 1'e düşürün.
      NOT: Hücreler kültür kabına/eklerine yapışmadan önce hücre kültürü çanağını çok sık hareket ettirmeyin.
  4. Hücreler toplanana kadar kültür ortamını her 2 günde bir değiştirin.
    NOT: FBS konsantrasyonu, hücreler akıcılığa ulaştıktan sonra azaltılabilir ve hücreler tam farklılaşma ve olgunlaşmaya izin vermek için birkaç aya kadar kültürlenebilir.

4. Primer domuz RPE hücrelerinin karakterizasyonu

  1. Hücreleri 1 veya 2 wks için akıcılıkta kültürleyin ve daha sonra daha fazla analiz için hücreleri toplayın.
  2. Kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) analizi için hücreleri toplayın.
    1. Kültür ortamını çıkarın, hücreleri 1 mL soğuk 1x PBS ile yıkayın ve ardından yaklaşık 1 x 106 hücreden hücre lizatı toplamak için her bir oyuğa 500 μL RNA ekstraksiyon çözeltisi ekleyin.
    2. mRNA13'ü ekstrakte edin; Her numuneden yaklaşık 4 μg RNA ekstrakte edilir. Ters transkripsiyon14 gerçekleştirmek için 100 ng mRNA kullanın; kantitatif gerçek zamanlı PCR analizi için cDNA'yı 40 kat seyreltin. Astarlar Tablo 1'de listelenmiştir.
  3. İmmünofloresan boyama için hasat hücreleri.
    1. Kültür ortamını çıkarın, hücreleri 1 mL soğuk 1x PBS ile yıkayın ve daha sonra hücreleri (yaklaşık 1 x 106 hücre / kuyu) oda sıcaklığında 30 dakika sabitlemek için 1x PBS'ye 500 μL% 4 (w / v) paraformaldehit ekleyin. Daha sonra, hücreleri iki kez 1x PBS ile yıkayın ve gece boyunca 4 ° C'de birincil antikorlarla (% 1 (w / v) sığır serum albümini ile desteklenmiş 1x PBS'de 1: 100) ve ikincil antikorlarla (% 1 (w / v) sığır serum albümini ile desteklenmiş 1x PBS'de 1: 200) immünofloresan boyama işlemini gerçekleştirin ve çevrimiçi protokollere göre 2 saat oda sıcaklığında 2 saat boyunca ikincil antikorlar (1: 200 % (w / v) sığır serum albümini ile desteklenmiştir).
    2. İmmünofloresan görüntüler, çevrimiçi kılavuz16'yı takip eden bir konfokal mikroskop ile elde edilir.
  4. Batı leke analizi için hasat hücreleri.
    1. Kültür ortamını çıkarın, hücreleri iki kez soğuk 1x PBS ile yıkayın ve ardından her bir oyuğa 80 μL RIPA tamponu (1x Proteaz inhibitörü ile) ekleyin ve bulaşıklardan / eklerden yaklaşık 1 x 106 hücre çizmek için hücre kazıyıcıları kullanın.
    2. Hücre lizatını her bir kuyucuktan / ekten 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne toplayın. Hücre lizatlarını 10 dakika kaynatın ve ardından BCA kitlerini kullanarak protein konsantrasyonlarını ölçün; Her numunenin protein konsantrasyonu yaklaşık 2 mg / mL'dir. Çevrimiçi protokoller17'ye göre Western leke analizi için her numunenin 25 μg proteinini kullanın.
    3. Western blot için, membranları dönen çok amaçlı bir çalkalayıcıda gece boyunca 4 °C'de 5 mL birincil antikor çözeltisinde (1x TBST çözeltisinde 1:1.000 primer antikorların seyreltilmesi,% 5 (w / v) sığır serum albümini ile desteklenmiş) inkübe edin.
    4. Daha sonra, membranı, kullanılan birincil antikor kaynağına göre, bir orbital çalkalayıcıda 2 saat boyunca oda sıcaklığında% 5 (w / v) yağsız süt ile desteklenmiş 1x TBST çözeltisinde 1: 5.000 ikincil antikor çözeltisinde yaklaşık 15 mL anti-tavşan veya fare karşıtı ikincil antikor çözeltisi (1: 5.000 seyreltilmesi) ile inkübe edin.
  5. Transepitelyal direnç (TER) ölçümü.
    1. Çubuk elektrotları %70 etanol ve steril 1x PBS ile sıralı bir şekilde yıkayın. Daha sonra elektrotun kısa ucunu üst bölmeye ve daha uzun ucunu transwell eklerinin alt odasına yerleştirin ve ölçümler için epitel voltmetresindeki düğmeye tıklayın. Her bir kuyucuğun TER ölçümlerini üçlü olarak kaydedin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Primer porsin RPE (pRPE) hücreleri DMEM/Basic ortamında %10 FBS ile kültürlendi ve ışık mikroskobu altında hücre morfolojisi tohumlamadan sonra 2 gün (Şekil 2A), 6 gün (Şekil 2B) ve 10 günde (Şekil 2C) fotoğraflandı. 1 wk'dan sonra, parke taşı morfolojileri olan pigmentli pRPE hücrelerinin birleşik bir tek katmanı gözlendi.

Primer pRPE hücrelerini daha iyi karakterize etmek için, Pasaj 3 (P3)18'deki primer insan RPE hücreleri (hRPE) ve ARPE-19 hücreleri, DMEM / Basic ortamında, başka bir wk için% 1 FBS ile kültürlendi ve daha sonra kültürlenmiş hücrelerin toplam mRNA ve proteininin yanı sıra domuz RPE / koroid dokuları toplandı. Anahtar karakteristik genler19'un ekspresyon düzeyleri ve olgun RPE'nin protein belirteçleri qRT-PCR ve Western blot ile değerlendirildi. ARPE-19 hücreleri ile karşılaştırıldığında, pRPE hücreleri, doğal RPE sekresyonunda (Şekil 3A (c)), fagositoz (Şekil 3A (i)), ulaşım (Şekil 3A (a), (d)), sıkı kavşaklar (Şekil 3A (j)), bariyer oluşumu (Şekil 3A (b)) ve görsel döngüde (Şekil 3A (e) B) işlev gören genlerin anlamlı derecede daha yüksek ekspresyon seviyelerini korumuştur. Bununla birlikte, RPE'nin iki sitoiskelet belirteç geni olan Krt8 ve Krt18'in ekspresyon seviyeleri, primer hRPE ve ARPE-19 hücrelerine kıyasla primer pRPE hücrelerinde anlamlı derecede düşüktü (Şekil 3A (g),(h)). Ayrıca, fagositoza katılan itgav, primer pRPE hücrelerinde de daha düşüktü (Şekil 3A (f)). Bu üç genin pRPE hücrelerindeki ekspresyon seviyeleri domuz RPE / koroid dokusu ile benzer olduğundan, bu türler arasındaki gen ekspresyon farklılıklarını gösterebilir. Ayrıca, melanin üretiminden sorumlu olan Tyr'ın ekspresyon seviyesi, hem birincil pRPE hem de hRPE hücrelerinde (Şekil 3A (k)), uzun süreli kültürlenmiş hücrelerde pigmentasyon kaybını açıklayabilir. İnsan pRPE ve domuz pRPE hücrelerinin verilerinde gözlenen qRT-PCR sonuçlarındaki farklılıklar, insan pRPE'sinin daha uzun depolanması ve daha yüksek geçiş sayısından (P3) kaynaklanıyor olabilir, bu nedenle alt kültürlemede RPE karakterlerinin kaybına işaret eder. Ek olarak, Western blot, RPE hücrelerini içeren görme döngüsünde anahtar bir enzim olan RPE65 proteininin pRPE hücrelerinde eksprese edildiğini, ekspresyon seviyesinin ise primer hRPE hücrelerinde ve ARPE-19 hücrelerinde önemli ölçüde azaldığını göstermiştir (Şekil 3B, C).

RPE hücrelerinin polarite ve bariyer fonksiyonlarını daha da karakterize etmek için, pRPE ve ARPE-19 hücrelerinin kültürlenmiş akıtılmış monokatmanları, 1 wk için DMEM / Basic, DMEM / F12 ve MEM-Nic ortamı ile transwell eklerde kültürlendi (Şekil 4). Bu kültür koşulları altında, Na + -K + -ATPaz (Şekil 4A-F) ve ZO-1 (Şekil 4G-L) floresan boyama sonuçları, pRPE hücrelerinin hem Na + -K + -ATPaz hem de ZO-1'in ARPE-19 hücrelerinden daha yüksek ekspresyon seviyelerine sahip olduğunu ortaya koymuştur. Na+-K+-ATPaz'ın pRPE hücrelerinin apikal ve bazal yüzeyindeki eşit dağılımı, in vitro hücre polaritelerini geri yüklemek için daha uzun bir kültür süresinin gerekli olduğunu göstermiştir.

RPE, iç retina ve koroidler arasındaki metabolitlerin değişimini sıkı bir şekilde düzenlemek için apikal yüzeyinin yakınında sıkı bağlantılar oluşturur20. ZO-1 boyaması, sıkı bağlantı proteinlerinin normalde düzenli parke taşı morfolojilerine sahip primer pRPE hücrelerinin plazma zarında lokalize olduğunu, ancak ARPE-19 hücrelerinin lokalize olmadığını ileri sürdü. Üç kültür ortamı arasında, DMEM / Basic'te kültürlenen hücrelerde en iyi ZO-1 boyama paternleri gözlenirken, DMEM / F12, pRPE hücrelerinin parke taşı morfolojisini koruyamamıştır. Daha yüksek bir TER değeri, RPE hücrelerinin sıkı bağlantı oluşumunun ve daha iyi bariyer fonksiyonlarının bir göstergesi olarak işlev görür21. Sıkı bağlantıların işlevini doğrulamak için, transepitelyal direnç (TER) ölçüldü. Bununla birlikte, boş transwell uçlarına kıyasla sadece biraz daha yüksek TER tespit edildi (Şekil 4M, N).

Retinada, Bruch zarı RPE ve koroid arasında bulunur. Bruch zarının ana bileşenleri kollajen tip IV, proteoglikanlar ve laminin22'dir. Bruch membranının RPE üzerindeki destekleyici etkisini simüle etmek için, laminin, kültürlü RPE hücrelerinin olgunlaşmasını kolaylaştırmak için transwell membranın yüzeyine yayıldı. Şekil 4'ten elde edilen sonuçlara dayanarak, konfluent pRPE hücreleri, DMEM / Basic ortamındaki transwell insertler üzerinde, 2 wks için% 1 FBS ile kültürlendi. İmmünofloresan boyama sonuçları, RPE-spesifik proteinler RPE65'in tüm pRPE hücrelerinde eksprese edildiğini göstermiştir (Şekil 5A,B). Na+-K+-ATPaz, pRPE hücrelerinin apikal yüzeyine dağılmış ve hücre polaritelerinin yeniden kurulmasını düşündürmüştür (Şekil 5C,D). Hem ZO-1 boyama hem de TER sonuçları, laminin üzerinde kültürlendiğinde primer pRPE hücrelerinde sıkı kavşakların iyi oluştuğunu göstermiştir (Şekil 5E, F, H). Şekil 5G, Hoechst boyası ile boyanmış hücreleri göstermektedir.

Ayrıca, Western blot, hem pRPE hem de ARPE-19 hücrelerinin, pigment epitel kaynaklı faktör (PEDF) ve vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) dahil olmak üzere büyüme faktörleri ürettiğini göstermiştir (Şekil 6A). 1 wk için DMEM/Basic, DMEM/F12 ve MEM-Nic ortam içeren transwell uçlarda birleştirilmiş pRPE monokatmanları kültürlendikten sonra, transwell uçlarının üst ve alt odacıklarından kültür ortamı toplandı ve salgılanan VEGF ELISA tarafından ölçüldü. Hücre kültürü için DMEM / Basic ve MEM-Nic ortamı kullanıldığında, pPRE hücreleri DMEM / F12 ortamındaki hücrelerden daha fazla VEGF salgıladı (Şekil 6B). Bununla birlikte, test edilen tüm koşullarda transwell eklerin üst ve alt odaları arasında VEGF miktarlarında herhangi bir fark tespit edilememiştir (Şekil 6B). Ayrıca laminin ile kaplanmış kesici uçlarda ve DMEM/Basic ortamlarında 2 wk için primer pRPE hücreleri kültürlendikten sonra üst ve alt odalardan gelen ortamlar toplanmıştır. Batı leke analizi, üst odada alt odacıktan daha yüksek PEDF seviyeleri gösterirken, salgılanan VEGF'nin protein seviyeleri her iki odada da benzerdi (Şekil 6C). Bu sonuçlar, primer pRPE hücreleri laminin üzerinde akıcılığa ulaştıktan sonra 2 wk daha kültürlendiğinde hücre polaritesinin yeniden kurulmasını destekledi.

Figure 1
Şekil 1: pRPE hücre izolasyonunun temel adımları . (A) Domuz gözbebeklerini 50 mL steril santrifüj tüplerinde 1x PBS ile yıkayın. (B,C) Enzimatik sindirim için RPE-koroid-sklera kompleksleri hazırlayın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Hücre kültürü sonrası primer pRPE hücre morfolojileri. Birincil pRPE hücrelerinin (A) Gün 2, (B) Gün 6 ve (C) Gün 10'daki temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu 250 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Kültürlenmiş RPE hücrelerinde anahtar imza genlerinin ve proteinlerinin ekspresyon seviyeleri. (A) primer pRPE hücrelerinde, primer hRPE hücrelerinde, ARPE-19 hücrelerinde ve pRPE / koroid dokuda imza genlerinin mRNA seviyelerinin qRT-PCR analizi. Gapdh, qRT-PCR için ev tutma geni olarak kullanıldı. Primer pRPE hücreleri ve ARPE-19 hücreleri için dört biyolojik replikasyon kullanılırken, primer hRPE hücreleri ve pRPE / koroid doku için üç biyolojik replikasyon kullanıldı. ARPE-19 hücrelerindeki gen ekspresyon seviyeleri kontrol olarak ayarlandı. (B) ARPE-19 ve pRPE hücrelerinde RPE65 proteinlerinin Western blot analizi. Vinculin yükleme kontrolü olarak kullanıldı. (C) Primer hRPE hücrelerinde ve pRPE/koroid dokuda RPE65 proteinlerinin Western blot analizi. Vinculin yükleme kontrolü olarak kullanıldı. Karşılaştırma için öğrenci t-testi, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 kullanıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: DMEM/Basic, DMEM/F12 ve MEM-Nic ortamlarındaki primer pRPE ve ARPE-19 hücrelerinin %1 FBS ile tek wk kültürü. (A) DMEM/Basic'teki primer pRPE hücrelerinin Na+-K+-ATPaz floresan boyama (Kırmızı), (B) DMEM/F12 ve (C) MEM-Nic ortamı. (D) DEM/Basic ortamındaki ARPE-19 hücrelerinin Na+-K+-ATPaz floresan boyaması (Kırmızı), (E) DMEM/F12 ortamı ve (F) MEM-Nic ortamı. (G) DMEM/Basic ortamdaki primer pRPE hücrelerinin ZO-1 floresan boyaması (Yeşil), (H) DMEM/F12 ortamı ve (I) MEM-Nic ortamı. (J) DMEM/Basic ortamdaki ARPE-19 hücrelerinde ZO-1 floresan boyama (Yeşil), (K) DMEM/F12 ortamı ve (L) MEM-Nic ortam. Primer pRPE (M) ve ARPE-19 (N) hücrelerinden sonra TER ölçümleri DMEM/Basic, DMEM/F12 ve MEM-Nic ortamlarında 1 wk süreyle kültürlendi. Her hücre tipi için en az üç farklı kuyudan veri elde edildi. Karşılaştırma için öğrenci t-testi kullanıldı, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Ölçek çubuğu 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: DMEM/Basic ortamdaki pRPE hücrelerinin %1 FBS'li iki wk kültürü. (A-F) LAMININLI VEYA LAMININSIZ KÜLTÜRLENEN hücreler RPE65 (A,B, Kırmızı), Na+-K+-ATPaz (C,D, Kırmızı), ZO-1 (E,F, Yeşil) ve (G) Hoechst (Mavi) ile boyandı. (H) Lamininli veya lamininsiz kültürlenmiş hücre tabakalarında TER ölçümleri. Farklı tedaviler için dört farklı kuyudan veri elde edildi. Karşılaştırma için öğrenci t-testi, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 kullanıldı. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Kültürlenmiş primer pRPE ve ARPE-19 hücrelerinin salgı fonksiyonları. (A) Primer pRPE ve ARPE-19 hücrelerinde VEGF ve PEDF'nin Western blot analizi. (B) Birleştirilmiş hücreler DMEM/Basic, DMEM/F12 ve MEM-Nic ortamında 1 wk için kültürlendiğinde primer pRPE hücreli transwell eklerin üst ve alt haznesinde salgılanan VEGF. (C) 2 wk için DMEM/Basic ortamında birincil pRPE ile transwell uçlarının üst ve alt odasında salgılanan PEDF ve VEGF. Farklı tedaviler için üç farklı kuyudan veri elde edildi. Karşılaştırma için öğrenci t-testi kullanıldı, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Homo sapiens Sus scrofa
En İyi1 F: GAAGGCAAGGACGAGCAAG F: GGACACCTGTATGCCTACGA
R: TCCAACTGCTTGTGTTCTGC R: GGAACGTGAAGAGGGGTACA
Cldn19 · F: GGTGACCCAGGAGTTCTTCA F: TCGTGACCCAGGAGTTCTTC
R: CTGTTGGGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT R: GCTGCTGTTGGATCGCTC
İtgav F: CGCAGTCCCATCTCAAATCC F: GCTTTCTTCAGGACGGAACA
R: GGCCCTGTATAAGATAGCTCGA R: GAAATGAGCTGACCTTGCCA
Krt8 F: GGAGCAGATCAAGACCCTCA F: CCCAGGAGAAGGAGCAGATC
R: GCCGCCTAAGGTTGTTGATG R: ATGTTGTCGATGTTGCTCCG
Krt18 · F: CTTGGAGAAGAAGGGACCCC F: GCTGATAATCGGAGGCTGGA
R: GGCCAGCTCTGTCTCATACT R: GAAGTCATCAGCAGCGAGAC
Mertk F: GTGTGCAGCGTTCAGACAAT F: GCGGCTATTTCTTGGTGGAA
R: AAAATGTTGACGGGCTCAGG R: ACGTAGATGGGGTCAGACAC
Serpinf1 F: CAGATGAAAGGGAAGCTCGC F: AAGACGTCGCTGGAGGATTT
R: TTAGGGTCCGACATGGG R: GGTCACTTTCAGAGGCAGGA
Slc16a8 göster F: GGGTGTCCTCCATGCTA F: CAGTTCGAGGTGCTCATGG
R: GTCAGGTAGAGCTCCAGGAG R: GACAGCCATGAAGACACCAG
Stra6 F: CTTTGCAGGAAGAAGCTGGG F: CTAGCCGTGTTGTCGATCCT
R: TAAATGGCCGTCCCTGTCAG R: GACCATGAAGACAGCAGCAG
Tjp1 F: ACAGGAAAATGACCGAGTTGC F: AAGACTTGTCAGCTCAGCCA
R: TGGTTCAGGATCAGGACGAC R: CCAGCATCTCGAGGTTCACT
Tyr F: ACTCAGCCCAGCATTCT F: ATCTACTCAGCCCAGCATCC
R: ACATCAGCTGAAGAGGGGAG R: GAGCCTTGGAGTCCTGGATT
Arjantin F: CAGCCTCAAGATCATCAGCA F: CATCCTGGGCTACACTGAGG
R: ATGATGTTCTGGAGAGCCCC R: GGGGCTCTTACTCCTTGGAG

Tablo 1: qRT-PCR için astarlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, RPE hücrelerinin domuz gözbebeklerinden izolasyonu, kültürü ve karakterizasyonu için ayrıntılı ve optimize edilmiş bir protokol, RPE hücrelerinin in vitro karakterizasyonu ve RPE ile ilişkili bozukluk çalışmaları için iyi bir model oluşturmaktadır. RPE'nin insan, fare ve sıçan gözlerinden izole edilmesi için yöntemler daha önce 23,24,25 olarak tanımlanmıştır. Bununla birlikte, bazı laboratuvarlarda insan gözbebekleri elde etmek zordur ve genellikle etik sorunları gündeme getirir. Farelerin ve sıçanların RPE dokuları nispeten küçüktür, hücreler ayrılma sırasında kolayca zarar görür ve her hayvandan sadece birkaç hücre elde edilebilir. Buna karşılık, domuz göz kürelerinin elde edilmesi ve ele alınması çok daha kolaydır, bu da tek bir göz küresinden nispeten çok sayıda birincil hücre üretebilir. Bazı çalışmalarda, cımbız, RPE'yi mekanik olarak ayırmak için kullanılır ve bu da kolayca hücre ölümüne yol açabilir. Bu nedenle, RPE hücrelerini ayrıştırmak için daha önce hyaluronik asit, dispaz ve Tripsin / EDTA çözeltisi kullanılmıştır. Önceki çalışmalar, Tripsin / EDTA çözeltisinin RPE'nin koroid21'den ayrılmasına yardımcı olma yeteneğine sahip olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, optimum sonuçlar veren domuz dokularını sindirmek için tripsin / EDTA çözeltisi kullanıldı. Tripsin / EDTA nöralizasyonundan sonra, RPE dokuları bir pipet ucu ile hafifçe pipetlenerek tek hücreli süspansiyona ayrılabilir. Bir püf noktası, RPE hücrelerini tamamen ayrıştırmak için her deney için taze Tripsin / EDTA çözeltisinin önerilmesidir. Domuz gözbebeklerinin RPE dokularının geniş alanı nedeniyle, yarım kase şeklindeki RPE-koroid-sklera kompleksinin, koroidden ayrılmalarını kolaylaştırmak için RPE dokuları ile Tripsin / EDTA çözeltisi arasındaki tam temasa elverişli olan dört yapraklı bir yonca şeklinde kesilmesi gerekir. Bununla birlikte, sindirim süresi yarım saati geçmemelidir. Bu süre zarfında, RPE dışındaki diğer dokular sindirilmeyecek ve bu da diğer hücre türlerinden gelen kontaminasyonları etkili bir şekilde azaltabilir.

Laminin, Bruch membranının RPE üzerindeki destekleyici etkisini simüle etmek için transwell membranın yüzeyine yayıldı. Sonuçlar, lamininin, taşıyıcı ve sıkı bağlantı proteinlerinin ekspresyonunu uyaran pRPE hücrelerinin büyümesi için faydalı olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, sonuçlar ayrıca, birincil pRPE hücrelerinin, hücre polaritesi ve sıkı kavşaklar da dahil olmak üzere doğal RPE dokularının belirli özelliklerini geri kazanması için yaklaşık 2 wks'lik daha uzun bir kültür süresinin gerekli olduğunu göstermiştir.

Primer RPE kültürü için bir eksiklik, görsel döngü enzim ekspresyonlarını in vitro olarak sürdürmenin zor olmasıdır. Bu nedenle, kültürlenmiş RPE hücrelerinin RPE-spesifik proteinler RPE65'i eksprese edip edemeyeceğini incelemek çok önemlidir. ARPE-19 hücreleri ile karşılaştırıldığında, pRPE hücreleri önemli ölçüde daha fazla RPE65 proteini eksprese etti. Buna karşılık, Western lekesindeki ARPE-19 hücre lizatlarında sadece zayıf bir RPE65 protein bandı gözlenmiştir. RPE65'in moleküler ağırlığının insan ve domuzlar arasında biraz farklı olduğunu gözlemlemek ilginçtir (Şekil 3B, C). Kültürlü RPE hücrelerinde RPE65 ekspresyonunun kaybı bir gizem olarak kalmaktadır. Kültürlenmiş primer hücrelerde bile, RPE65 pasajlarla yavaş yavaş kaybedildi (veriler gösterilmedi). Şimdiye kadar, RPE65'in in vitro ekspresyonunun nasıl korunacağı, görme döngüsünün doğal RPE dokuları için kritik bir işlev olduğu gerçeği göz önüne alındığında, daha fazla araştırma gerektirmektedir. İkincisi, bu protokolün önemli bir sınırlaması, in vitro kültürlü RPE hücrelerinin geçememesidir. Uzun süreli kültürde, pRPE hücreleri altıgen şekillerini ve TER'lerini ve pigmentasyonlarını kaybetme eğilimindedir, böylece sadece geçiş 0 hücreleri kullanılabilir. Bu kültür protokolünün bir diğer sınırlaması da kalıtsal retina hastalıklarına yol açan genetik mutasyonların bu hücrelerde çoğalmasının zor olmasıdır. Bu nedenle, gelecekte Leger konjenital amaurozu gibi kalıtsal RPE bozukluklarını incelemek için virüs aracılı gen düzenleme kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını açıkladı.

Tüm yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Yazarlar, bu çalışmada hücrelerine katkıda bulunan tüm hayvanlara şükranlarını ve saygılarını göstermek istemektedir. Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı'ndan (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao ve Hibe no. 2018YFA0107301, Wei Li) gelen hibelerle desteklenmiştir. Yazarlar, konfokal görüntülemede teknik destek için Xiamen Üniversitesi Central Lab, Tıp Fakültesi'nden Jingru Huang ve Xiang You'ya teşekkür ediyor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ARPE-19 cells CCTCC GDC0323
Bovine serum albumin Yeasen 36101ES60
Confocal microscopy Zeiss LSM 880 with Airyscan
ChemiDoc Touch Bio-Rad 1708370
Cell scraper Sangon F619301
10 cm culture dish NEST 121621EH01
12-well culture plate NEST 29821075P
DMEM F12 Medium Gibco C11330500BT
DMEM basic Medium Gibco C11995500BT
EVOM2 World Precision Instruments EVOM2 For TER measurement
Fetal bovine serum ExCell Bio FSP500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific  A-11034
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A-11012
Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP Bio-Rad 0300-0108P
Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP Bio-Rad 5196-2504
hydrocortisone MCE HY-N0583/CS-2226
Hoechst 33342 solution (20 mM) ThermoFisher Scientific 62249
LightCycler 96 Instrument Roche 5815916001
Liothyronine MCE HY-A0070A/CS-4141
laminin Sigma-Aldrich L2020-1MG
MEM(1X)+GlutaMAX Medium Gibco 10566-016
MEM NEAA(100X) Gibco 11140-050
Millex-GP syringe filter unit Millipore SLGPR33RB
N1 Sigma-Aldrich SLCF4683
NcmECL Ultra New Cell&Molecular Biotech P10300
Non-fat Powdered Milk Solarbio D8340
Nicotinamide SparkJade SJ-MV0061
Na+-K+ ATPase antibody Abcam ab76020 Recognize both human and porcine proteins
PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%) Epizyme PG112
primary Human RPE cells  - - Generous gift from Shoubi Wang lab 
Pierce BCA Protein Assay Kit  ThermoFisher Scientific 23225
Prism GraphPad by Dotmatics version 8.0
Protease Inhibitor Cocktails APExBIO K1024
PRE65 antibody Proteintech 17939-1-AP Recognize both human and porcine proteins
PEDF antibody Santa Cruz Biotechnology sc-390172 Recognize both human and porcine proteins
100 x penicillin/streptomycin  Biological Industries 03-031-1BCS
Phosphate buffered saline (PBS) RARBIO RA-9005
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix Toyobo FSQ-201
RIPA buffer ThermoFisher Scientific  89900
15 mL sterile centrifuge tubes NEST 601052
50 mL sterile centrifuge tubes NEST 602052
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-056
Taurine Damas-beta 107-35-7
Trizol Thermo-Fisher  15596026 RNA extraction solution
TB Green Fast qPCR Mix Takara RR430A
12-well transwell inserts Labselect 14212
VEGF antibody Proteintech 19003-1-AP Recognize both human and porcine proteins
VEGF ELISA kit Novusbio VAL106
ZO-1 antibody ABclonal A0659 Recognize both human and porcine proteins

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tan, L. X., Germer, C. J., La Cunza, N., Lakkaraju, A. Complement activation, lipid metabolism, and mitochondrial injury: Converging pathways in age-related macular degeneration. Redox Biology. 37, 101781 (2020).
  2. Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
  3. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
  4. Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
  5. Ducloyer, J. B., Le Meur, G., Cronin, T., Adjali, O., Weber, M. Gene therapy for retinitis pigmentosa. Medecine Sciences. 36 (6-7), 607-615 (2020).
  6. den Hollander, A. I., Roepman, R., Koenekoop, R. K., Cremers, F. P. Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 391-419 (2008).
  7. Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
  8. Smith, D. T. Melanin pigment in the pigmented epithelium of the retina of the embryo chick eye studied in vivo and in vino. The Anatomical Record. 18, 260-261 (1920).
  9. Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
  10. D'Antonio-Chronowska, A., D'Antonio, M., Frazer, K. A. In vitro differentiation of human iPSC-derived retinal pigment epithelium cells (iPSC-RPE). Bio-Protocol. 9 (24), 3469 (2019).
  11. Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
  12. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
  13. Scientific, T. , Available from: https://www.thermofisher.cn/document-connect/document connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2Ftrizol_reagent.pdf (2022).
  14. Toyota. , Available from: https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf (2022).
  15. Abcam. , Available from: https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol (2022).
  16. Zeiss. , Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals (2022).
  17. Cell Signal Technology. , Available from: https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western (2022).
  18. Wang, S., et al. Reversed senescence of retinal pigment epithelial cell by coculture with embryonic stem cell via the TGFbeta and PI3K pathways. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 588050 (2020).
  19. Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Experimental Eye Research. 126, 1-4 (2014).
  20. Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Experimental Eye Research. 126, 5-15 (2014).
  21. Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. Physiology and function of the tight junction. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002584 (2009).
  22. Nita, M., Strzalka-Mrozik, B., Grzybowski, A., Mazurek, U., Romaniuk, W. Age-related macular degeneration and changes in the extracellular matrix. Medical Science Monitor. 20, 1003-1016 (2014).
  23. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  24. Langenfeld, A., Julien, S., Schraermeyer, U. An improved method for the isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult rats. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1493-1502 (2015).
  25. Sonoda, S. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).

Tags

Biyoloji Sayı 187
Domuz Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Primer Kültürü
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wen, F., Wang, Y., He, D., Liao, C., … More

Wen, F., Wang, Y., He, D., Liao, C., Ouyang, W., Liu, Z., Li, W., Liao, Y. Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (187), e64244, doi:10.3791/64244 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter