Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

التحليل الآلي للأنماط الظاهرية داخل الخلايا للسالمونيلا باستخدام ImageJ

Published: August 9, 2022 doi: 10.3791/64263
Automatic Translation
1, 1, 1
1Risk Analysis and Genomic Epidemiology Unit, Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia-Romagna (IZSLER)

Summary

تغزو السالمونيلا وتتكاثر داخل الخلايا الظهارية المعوية في كل من الفجوات العصارية الخاصة بالسالمونيلا والحرة في السيتوسول (فرط التكاثر). يتم وصف بروتوكول قائم على الفحص المجهري الفلوري عالي الإنتاجية هنا لتحديد الأنماط الظاهرية داخل الخلايا للسالمونيلا من خلال تحليلين متكاملين للصور من خلال ImageJ ، للوصول إلى دقة الخلية الواحدة والتسجيل.

Abstract

السالمونيلا هو أحد مسببات الأمراض المعوية القادرة على غزو ظهارة الأمعاء والتكاثر في الخلايا المعوية ، سواء داخل فجوات خاصة بالسالمونيلا أو حرة في السيتوسول (فرط التكاثر الخلوي). هذه الأنماط الظاهرية المختلفة للتكاثر داخل الخلايا تدفع إلى مسارات مختلفة من التسبب في المرض ، أي أن فرط التكاثر الخلوي يؤدي إلى موت الخلايا الالتهابية وقذفها في تجويف الأمعاء ، بينما يؤدي التكرار الفراغي إلى اختراق عبر الظهارة والانتشار الجهازي. تم بذل جهد كبير لإنشاء أدوات الفحص المجهري لدراسة سلوك السالمونيلا داخل الخلايا الغازية ، مثل بلازميد مراسل مضان pCHAR-Duo الذي يسمح بالتمييز بين البكتيريا الفراغية والخلوية عن طريق التعبير التفاضلي ل mCherry و GFP. ومع ذلك ، غالبا ما يتم تسجيل الأنماط الظاهرية داخل الخلايا يدويا ، وهو إجراء يستغرق وقتا طويلا ويقصر التحليل على عدد صغير من العينات والخلايا. للتغلب على هذه القيود ، تم تطوير تحليلين مكملين وآليين للصور باستخدام ImageJ ، وهو برنامج تحليل صور متاح مجانا. في بروتوكول الإنتاجية العالية ، أصيبت الخلايا الظهارية بالسالمونيلا التي تحمل pCHAR-Duo باستخدام 96 لوحة بئر. تم إجراء التصوير باستخدام مجهر مضان آلي. بعد ذلك ، تم تطبيق طريقتين لتحليل الصور لقياس السلوك داخل الخلايا للسالمونيلا على مستويات تفصيلية مختلفة. تقيس الطريقة الأولى الحمل البكتيري الكلي داخل الخلايا ومدى فرط التكاثر الخلوي. إنه سريع ويسمح بتسجيل عدد كبير من الخلايا والعينات ، مما يجعله مناسبا للفحوصات عالية الإنتاجية مثل تجارب الفحص. تقوم الطريقة الثانية بإجراء تحليل الخلية الواحدة لتحديد النسبة المئوية للخلايا المصابة ، ومتوسط الحمل الفراغي للسالمونيلا ، ومعدل التكاثر المفرط للخلايا الخلوية مما يعطي تفاصيل أكبر حول سلوك السالمونيلا داخل الخلايا الظهارية. يمكن تنفيذ البروتوكولات بواسطة نصوص ImageJ المصممة خصيصا لتشغيل تحليلات الدفعات تلقائيا للخطوات الرئيسية لتفاعل السالمونيلا المعوي.

Introduction

السالمونيلا هي العامل البكتيري الأكثر شيوعا الذي يتسبب في تفشي الأمراض المنقولة بالغذاء في الاتحاد الأوروبي1. المظهر المرضي الأساسي لعدوى السالمونيلا هو التهاب الأمعاء ، وهو نتيجة لسلوك الممرض في الأمعاء بعد الابتلاع وما يترتب على ذلك من استجابة التهابية محلية2. ومع ذلك ، يمكن أن تنتشر السالمونيلا أيضا إلى مواقع خارج الأمعاء وتسبب عدوى جهازية ، خاصة في الأفراد الذين يعانون من نقص المناعة. نوع التفاعل بين السالمونيلا وظهارة الأمعاء شروط نتيجة العدوى. بمجرد دخول تجويف الأمعاء ، تغزو السالمونيلا وتتكاثر داخل الخلايا الظهارية المعوية. على المستوى داخل الخلايا ، يمكن أن تقدم السالمونيلا نمطين ظاهريين مختلفين للتكرار ، فرط التكاثر الخلوي والتكرار البطيء داخل الفراغ داخل الفجوات العصارية المحتوية على السالمونيلا (SCVs). يؤدي فرط التكاثر الخلوي إلى موت الخلايا المضيفة الالتهابية وقذف السالمونيلا في تجويف الأمعاء3 ؛ يؤدي التكرار الفراغي إلى اختراق عبر الظهارة والانتشار الجهازي4. لذلك ، فإن مدى الغزو والتكاثر الفراغي مقابل التكاثر الخلوي يؤثر على مسار العدوى.

جنس السالمونيلا متنوع للغاية ، بما في ذلك الآلاف من الأنماط المصلية ذات النطاقات المضيفة المختلفة والقدرات على التسبب في المرض. على سبيل المثال ، S. يعرف التيفيموريوم بأنه مصل عام ، لأنه يصيب العديد من المضيفين غير المرتبطين ، ويمثل أحد الأسباب الرئيسية لداء السلمونيلات البشري. بشكل مختلف ، س. يعتبر ديربي مصليا متكيفا مع الخنازير ، حيث يتم عزله في الغالب عن الخنازير ، ولكن يتم الإبلاغ عنه أيضا في المراكز الخمسة الأولى من المصل المسؤول عن العدوى البشرية1. ومع ذلك ، فإن المعرفة حول السلوك البكتيري داخل الخلايا الظهارية تقتصر بشكل أساسي على دراسة بعض السلالات المرجعية ، مثل S. التيفيموريوم SL1344 ، التي لا تمثل التنوع الطبيعي الشاسع لإمراضية السالمونيلا . إن توصيف تفاعل سلالات مختلفة من السالمونيلا مع الخلايا الظهارية من شأنه أن يساهم في فهم إمراضيتها المختلفة. لهذا السبب ، تم تطوير بروتوكول قائم على الفحص المجهري الفلوري عالي الإنتاجية لتحليل السلوك داخل الخلايا لعدد كبير من السلالات بطريقة سريعة وآلية إلى حد كبير. في هذا البروتوكول ، تم إجراء عدوى الخلايا الظهارية في 96 لوحة تصوير جيدة وتم الحصول على الصور باستخدام مجهر مضان آلي. تم استخدام بلازميد pCHAR-Duo لمراقبة الأنماط الظاهرية للغزو والتكرار للسالمونيلا داخل الخلايا الظهارية من خلال الفحص المجهري الفلوري5. يحمل هذا البلازميد الجين الذي يشفر المراسل الفلوري الأحمر mCherry ، الذي يتم التعبير عنه بشكل أساسي من قبل جميع الخلايا البكتيرية المحولة ، والجين الذي يشفر مراسل الفلورسنت الأخضر GFP ، الذي يتم تنشيط تعبيره بواسطة الجلوكوز 6 فوسفات الموجود حصريا في السيتوسول للخلايا حقيقية النواة والغائب في SCVs. لذلك ، يسمح البلازميد بالتمييز بين البكتيريا الفراغية والخلوية عن طريق التعبير التفاضلي لمراسلي mCherry و GFP.

عادة ما يتم قياس البكتيريا الفراغية والخلوية في صور الفحص المجهري عن طريق التسجيل اليدوي6 ، ولكن هذه طريقة تستغرق وقتا طويلا وتقصر التحليل على عدد صغير من العينات. لذلك ، تم تطوير تحليلين متكاملين وآليين للصور وتحليل المنطقة وتحليل الخلية الواحدة باستخدام ImageJ7 ، وهو برنامج تحليل صور متاح مجانا. يقيس تحليل المنطقة الحمل البكتيري الكلي داخل الخلايا ومدى فرط التكاثر الخلوي باستخدام بيانات المناطق التي تشغلها الخلايا الظهارية والسالمونيلا الحمراء والخضراء في كل صورة مجهرية مكتسبة. يمكن تطبيق هذه الطريقة على الصور التي تم الحصول عليها عند التكبير المنخفض ؛ لذلك ، فإنه يسمح بتسجيل عدد كبير من الخلايا الظهارية مع عدد قليل من الصور ، وتقصير وقت الاستحواذ. يستخدم تحليل الخلية الواحدة تجزئة الخلية لتحديد النسبة المئوية للخلايا المصابة ، ومتوسط الحمل الفراغي ، والنسبة المئوية للخلايا المصابة التي تخضع لفرط التكاثر الخلوي بدقة خلية واحدة.

في هذا البروتوكول ، يتم وصف جميع خطوات تحليل الصور بالتفصيل ليتم إجراؤها يدويا ، ولكن يمكن أتمتة نفس التحليل بواسطة نصوص ImageJ النصية المصممة خصيصا. تسمح هذه البرامج النصية أيضا بتشغيل تحليلات الدفعات لتحليل صور متعددة تلقائيا وبالتالي تسريع تنفيذ الطريقة.

Protocol

1. إصابة الخلايا الظهارية بالسالمونيلا التي تحمل بلازميد مراسل pCHAR-Duo

ملاحظة: يوصى باستخدام ماصة متعددة القنوات.

  1. قم بتغطية 96 لوحة تصوير بجدران سوداء وقاع زجاجي مسطح بالكولاجين قبل الاستخدام مباشرة.
    1. تمييع حمض الخليك الجليدي (17. 4 م) في ماء معقم منزوع المعادن تحت غطاء كيميائي للحصول على محلول حمض الخليك 20 مللي مول. في ظل ظروف معقمة ، قم بتصفية المحلول من خلال مرشح حقنة بحجم مسام 0.2 ميكرومتر. اترك المحلول في رف 0-4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    2. تمييع 3 ملغ / مل من مرق الكولاجين إلى 50 ميكروغرام / مل في محلول حمض الخليك 20 ملي مل المبرد مسبقا. اخلطي عن طريق التقليب 10 مرات ، ثم وزعي 30 ميكرولتر من محلول الكولاجين لكل بئر (5 ميكروغرام من الكولاجين / سم2) ، مع الاحتفاظ بالمحلول في رف 0-4 درجة مئوية لتجنب تبلور الكولاجين.
    3. تأكد من أن قيعان البئر مغطاة بالكامل بالكولاجين ، ثم اترك اللوحة تحت التدفق الصفحي لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    4. قم بإزالة المحلول برفق وقم بإجراء ثلاث غسلات باستخدام 30 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). استخدم ماصة متعددة القنوات 100 ميكرولتر أو 50 ميكرولتر لتجنب انفصال الكولاجين.
  2. الخلايا الظهارية INT407 المستنبتة في لوحات التصوير المغلفة بالكولاجين قبل 20-24 ساعة من الإصابة.
    1. زراعة خلايا INT407 بشكل روتيني في قوارير 25 سم2 في الحد الأدنى من الوسط الأساسي مع 10٪ من مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، الوسط المزروع المحدد فيما يلي (CM) ، مكمل بالبنسلين 100 وحدة / مل والستربتومايسين 100 ميكروغرام / مل (القلم / العقد).
    2. اغسل مرتين قوارير INT407 ب 5 مل من PBS ، ثم افصل الخلايا ب 1 مل من محلول التربسين-EDTA لمدة 3-5 دقائق عند 37 درجة مئوية في جو مرطب 5٪ CO2 قبل 20-24 ساعة من الإصابة. عد الخلايا وقم بإعداد معلق 3 × 105 خلايا / مل في CM.
    3. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية / البئر في لوحات التصوير المطلية بالكولاجين للحصول على التقاء بنسبة 100٪. احتضان عند 37 درجة مئوية في جو مرطب 5٪ CO2 لمدة 1 ساعة لتسهيل التصاق الخلايا. ثم أضف 100 ميكرولتر من سم واحتضان عند 37 درجة مئوية في جو مرطب 5٪ CO2 لمدة 20-24 ساعة حتى الإصابة (الخطوة 1.4).
      ملاحظة: من أجل تصوير البكتيريا داخل الخلايا ، يتم تحويل سلالات السالمونيلا باستخدام بلازميد مراسل pCHAR-Duo الذي قدمته الدكتورة أوليفيا ستيل مورتيمر. تم اختيار السلالات المختبرة هنا لتمثيل تنوع النمط الظاهري الذي يغطيه البروتوكول والتحقق من صحة تحليلات الصور في القسم 4. انظر النتائج التمثيلية لمزيد من التفاصيل حول السلالات المستخدمة في هذه الدراسة.
  3. تحضير مزارع المرحلة الثابتة لسلالات السالمونيلا التي تحمل بلازميد مراسل pCHAR-Duo.
    1. قم بأخذ عينة من مرق السالمونيلا الجلسرين بطرف ماصة سعة 10 ميكرولتر وقم بتلقيحه في 1 مل من مرق لوريا بيرتاني (10 جم تريبتون و 5 جم من خلاصة الخميرة و 10 جم من كلوريد الصوديوم لكل لتر) مكمل بالأمبيسيلين 100 ميكروغرام / مل.
    2. احتضان اللقاح بشكل ثابت عند 37 درجة مئوية لمدة 20 ساعة قبل الإصابة للوصول إلى المرحلة الثابتة للنمو ، المقابلة لوحدات تشكيل مستعمرة ~ 1 × 109 (CFU) / مل8.
  4. تصيب الخلايا الظهارية INT407 بالسالمونيلا.
    ملاحظة: يتم إجراء العدوى في ثلاث نسخ.
    1. اغسل خلايا INT407 برفق باستخدام 200 ميكرولتر من PBS / بئر.
    2. تحضير لقاح السالمونيلا عن طريق تخفيف زراعة البكتيريا بين عشية وضحاها في CM للحصول على العدد المطلوب من CFUs لكل خلية ظهارية ، والتي تعرف بأنها تعدد العدوى (MOI). هنا تم استخدام MOI 100.
    3. قم بتلقيح 200 ميكرولتر / بئر ، ثم قم بتغطية اللوحة بغشاء مانع للتسرب قابل للتنفس واحتضانها عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ CO2 لمدة 1 ساعة. يعتبر التلقيح بمثابة وقت الصفر للعدوى.
    4. قم بإزالة اللقاح واغسله برفق باستخدام 200 ميكرولتر من PBS / بئر ، ثم أضف 200 ميكرولتر من CM مع جنتاميسين 100 ميكروغرام / مل لكل بئر. قم بتغطية اللوحة بغشاء مانع للتسرب مسامي ، ثم احتضنها عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ CO2 لمدة 1 ساعة.
    5. قم بإزالة CM مع جنتاميسين 100 ميكروغرام / مل واغسله برفق مع 200 ميكرولتر من PBS / بئر. أضف 200 ميكرولتر من CM مع جنتاميسين 10 ميكروغرام / مل لكل بئر ، وقم بتغطية اللوحة بغشاء مانع للتسرب قابل للتنفس ، ثم احتضنها عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ CO2 لمدة 8 ساعات.

2. تثبيت العينة وتلطيخ الخلايا الظهارية

ملاحظة: حافظ على العينات محمية من التعرض المباشر للضوء. يشار إلى الأحجام للآبار من لوحة 96 بئر. مطلوب تحسين الحجم للوحات أو دعامات زراعة الخلايا المختلفة.

  1. في 8 ساعات بعد الإصابة ، قم بإزالة CM واغسله برفق ثلاث مرات باستخدام 200 ميكرولتر / بئر من PBS. إزالة PBS عن طريق قلب اللوحة على ورق ماص ؛ تجنب النطق.
  2. قم بإصلاح الطبقات الأحادية المصابة ب 100 ميكرولتر / بئر من بارافورمالدهيد (PFA) 4٪ في PBS لمدة 20 دقيقة في RT. قم بإزالة PFA 4٪ واغسله ثلاث مرات ب 200 ميكرولتر / بئر من PBS. يمكن تخزين اللوحة لمدة أقصاها 16-24 ساعة عند 4 درجات مئوية. تابع الخطوة التالية.
  3. وصمة عار الخلايا الظهارية.
    ملاحظة: يتم استخدام صبغة الحمض النووي DAPI (4 ′ ، 6-diamidino-2-phenylindole) (الخطوة 2.3.1) لتحليل المنطقة لتلطيخ النوى فقط ، ويتم استخدام صبغة فحص المحتوى العالي (HCS) (الخطوة 2.3.2) لتحليل الخلية الواحدة لتلطيخ الخلية الظهارية بأكملها. يمكن استخدام البقع الخلوية الأخرى ، ولكن يلزم تحسين الحصول على الصور وتحليلها.
    1. تحليل المنطقة: توزيع 100 ميكرولتر / بئر من DAPI (محلول 300 نانومتر في PBS) واحتضان 5 دقائق في RT محمي من الضوء.
    2. تحليل الخلية الواحدة: يتخلل مع 100 ميكرولتر / بئر من تريتون 0.1x في PBS لمدة 15 دقيقة في RT. اغسل ثلاث مرات باستخدام PBS ووزع 100 ميكرولتر / بئر من صبغة HCS المخففة 1: 2000 في PBS. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT محمية من الضوء.
  4. قم بإزالة محلول التلوين واغسله ثلاث مرات باستخدام 200 ميكرولتر / بئر من PBS. أضف 50 ميكرولتر / بئر من PBS للحصول على الصور تلقائيا.

3. الحصول على الصور باستخدام مجهر مضان آلي

ملاحظة: هنا ، يتم استخدام التكبير المنخفض (هدف 10x / 0.3 NA ، هدف 1 μm / pixel) في الخطوة 3.1.1 لتحليل المنطقة والتكبير العالي (40x / 0.75 NA ، هدف 0.255 μm / pixel) في الخطوة 3.1.2 لتحليل الخلية الواحدة في بروتوكول الاكتساب. يمكن استخدام تكبيرات أخرى ، ولكن يلزم تحسين الحصول على الصور وتحليلها. إذا سمح المجهر المتاح بذلك ، احصل على صور كمناطق تجانب (TRs) ، "فسيفساء" من الحقول المتجاورة تسمى المربعات ، لتسجيل مناطق عينة كبيرة. قم بتعيين التركيز البؤري التلقائي في مركز TR بدلا من تعيين واحد لكل تجانب، لتقليل تعرض العينة أثناء إجراء التركيز البؤري التلقائي.

  1. استخدم برنامج التركيز البؤري التلقائي في قناة تلطيخ الخلية (القناة الزرقاء لصبغة HCS وصبغة DAPI النووية) كموضع z مرجعي. الحصول على صور في قناة تلطيخ الخلايا (465 نانومتر ، خلايا أو نوى) وفي قنوات مراسل pCHAR-Duo mCherry (610 نانومتر ، السالمونيلا داخل الخلايا) و GFP (509 نانومتر ، السالمونيلا شديدة التكاثر الخلوي).
    1. تحليل المنطقة: الصورة ≥104 خلايا / نسخة تقنية متماثلة (على سبيل المثال ، يوصى باستخدام ثلاثة TRs على الأقل من أربعة مربعات / بئر تتوافق مع نسخة متماثلة تقنية) عند تكبير 10x.
      ملاحظة: يكفي مستوى z واحد لتصوير كل من الخلايا التي تحتوي على فراغ والخلايا التي تحتوي على السالمونيلا شديدة التكاثر الخلوية عند تكبير 10x.
    2. تحليل الخلية الواحدة: الصورة ≥يوصى ب 1000 خلية / نسخة تقنية متماثلة (على سبيل المثال ، يوصى باستخدام اثنين على الأقل من TRs من 16 بلاطة / بئر يتوافق مع نسخة تقنية متماثلة) عند تكبير 40x. مطلوب العديد من مستويات z لتصوير كل من الخلايا التي تحتوي على فراغ والخلايا التي تحتوي على السالمونيلا شديدة التكاثر الخلوي. حدد مكدس z الأمثل (يشار إلى 3.85 ميكرومتر z-stack مع فاصل 0.55 ميكرومتر للحصول على ثمانية مستويات z لتصوير خلايا INT407 المصابة بالسالمونيلا شديدة التكاثر الخلوي عند 40x). يتم تحديد كل مستوى z فيما بعد على أنه n / 8 ، مع n بين 1 (المقابلة للمستوى z السفلي) و 8 (المقابلة لأعلى مستوى z).
  2. ناتج كل عملية اكتساب هو ملف يسمى Acquisition.czi يتضمن صورا لجميع الحقول والقنوات وطائرات z. إذا تم الحصول على TRs ، فقم بدمج المربعات معا للحصول على صورة شاملة لكل TR باستخدام ملف Acquisition.czi واحد كإدخال لطريقة الخياطة.

4. تحليل الصور باستخدام ImageJ

ملاحظة: تم تصميم الخطوة 4.1 والخطوة 4.2 خصيصا للتجربة والاكتساب الموصوفين أعلاه. قد تتطلب الإعدادات التجريبية الأخرى تحسين التحليل. يتم وصف تحليل ملف Acquisition.czi واحد. لتحليل الدفعات، ابحث عن البرنامج النصي لتحليل الخلية الواحدة والبرنامج النصي لتحليل المنطقة كملفات تكميلية (الملف التكميلي 1 والملف التكميلي 2). التسميات المستخدمة في البرامج النصية وأوامر ImageJ مكتوبة بالخط العريض في الأقسام أدناه.

  1. تحليل المنطقة
    1. افتح الملف Acquisition.czi في ImageJ، المسمى AcquisitionTitle في البرنامج النصي: > الملف Open > AcquisitionTitle.czi. سيتم فتح نافذة تعرض جميع القنوات. يشار إلى القنوات على أنها c: 1-3 / 3 اعتمادا على أمر الاستحواذ. هنا ، c: 1/3 يتوافق مع الأزرق (DAPI) ، c: 2/3 إلى mCherry (السالمونيلا داخل الخلايا) ، و c: 3/3 إلى GFP ( السالمونيلا شديدة التكاثر الخلوي).
    2. تقليل الضوضاء العشوائية لإعداد الصور لقياس المساحة في الخطوتين 4.1.6 و 4.1.7.
      1. قم بتكرار نافذة AcquisitionTitle باستخدام Image > Duplicate > موافق للحصول على نافذة AcquisitionTitle1 .
      2. قم بتطبيق التمويه الغاوسي على AcquisitionTitle1 من خلال مرشح > العملية > التمويه الغاوسي. اترك قيمة Sigma الافتراضية ك 2 ، وانقر فوق موافق. سيتم فتح نافذة مكدس العمليات ، انقر فوق نعم لمعالجة جميع القنوات.
      3. اطرح AcquisitionTitle1 الذي تمت تصفيته الغاوسية من الملف الأصلي AcquisitionTitle حسب العملية > حاسبة الصورة: حدد AcquisitionTitle ك Image1 ، واختر العملية طرح في القائمة المنسدلة ، ثم حدد AcquisitionTitle1 ك Image2. انقر فوق موافق. سيتم فتح نافذة مكدس العمليات؟ انقر فوق نعم لمعالجة جميع الصور الثلاث (القنوات) للحصول على نافذة ResultsOfAcquisitionTitle.
    3. تقسيم القنوات من خلال لون > الصورة > قنوات الانقسام. يتم الآن عرض كل صورة قناة في نافذة منفصلة ، يتم تسميتها تلقائيا بواسطة ImageJ باسم C-ResultsOfAcquisitionTitle. هنا C1-ResultsOfAcquisitionTitle يتوافق مع DAPI ، C2-ResultsOfAcquisitionTitle إلى mCherry (السالمونيلا داخل الخلايا) ، و C3-ResultsOfAcquisitionTitle إلى GFP (السالمونيلا شديدة التكاثر الخلوي).
    4. قم بمعالجة صورة C1-ResultsOfAcquisitionTitle لقياس المساحة التي تشغلها نوى الخلايا الظهارية.
      1. انتقل إلى عملية > سلس لتجانس النواة التي تظهر كثقوب داخل منطقة النوى.
      2. ضع عتبة على صورة C1-ResultsOfAcquisitionTitle لاستبعاد الخلفية باستخدام Image > ضبط > العتبة: تحقق خلفية داكنة وحدد أحمر في القائمة المنسدلة. قم بتعيين العتبة التلقائية للمثلث ، ثم استخدم شريط التمرير العلوي لتعيين الحد الأدنى لقيمة العتبة عندما تظهر النوى باللون الأحمر ، وتظهر الخلفية سوداء (العتبة = 100 ، المطبقة في هذا البروتوكول).
        ملاحظة: تقترح العتبات التلقائية الموصوفة في الخطوات 4-1-4-2 و4-1-7 و4-2-3-6-1 و4-2-4-3 كدليل للمستخدم لتحديد أفضل عتبة ملائمة للنوى/الخلايا الطلائية والبكتيريا يدويا، على التوالي. سيتم تجاوز قيمة العتبة التلقائية في البرنامج النصي بواسطة الحد اليدوي المحدد. سيتم تطبيق العتبة اليدوية المحددة على تحليل الدفعات بالكامل.
    5. اختر مقاييسالاهتمام باستخدام تحليل > ضبط القياس: تحقق من الحد إلى العتبة لقصر القياس على وحدات البكسل المحددة. تحقق من المساحة ، المقابلة للمساحة الإجمالية التي تشغلها وحدات البكسل العتبة (أي النوى في C1-ResultsOfAcquisitionTitle ، السالمونيلا داخل الخلايا في C2-ResultsOfAcquisitionTitle ، السالمونيلا شديدة التكاثر الخلوي في C3- ResultsOfAcquisitionTitle). تحقق من تسمية العرض لتسجيل عنوان الاستحواذ والقناة لكل صورة في جدول النتائج.
    6. قم بقياس المساحة التي تشغلها النوى باستخدام تحليل > القياس. يتم تسجيل القياسات في جدول النتائج الذي يفتح تلقائيا.
    7. عملية C2-ResultsOfAcquisitionTitle و C3-ResultsOfAcquisitionTitle لقياس المساحة التي تشغلها السالمونيلا داخل الخلايا والسالمونيلا المتكاثرة بشكل مفرط ، على التوالي. اتبع الخطوات 4.1.4-4.1.6 مع بعض التعديلات: تخطي خطوة التنعيم في الخطوة 4.1.4.1 واستخدم عتبة Otsu التلقائية بدلا من المثلث في الخطوة 4.1.4.2 كدليل لتعيين الحد الأدنى لقيمة العتبة (شريط التمرير العلوي) عندما تظهر السالمونيلا باللون الأحمر وتظهر الخلفية سوداء (العتبة = 200 مقترحة).
    8. احفظ جدول النتائج باستخدام ملف > حفظ باسم > كافة الملفات.
    9. افتح جدول النتائج في جدول بيانات لحساب نسب المساحة لكل ملف AcquisitionTitle تم تحليله:
      1. احسب نسبة الإصابة: قسم المساحة التي تشغلها السالمونيلا الكلية داخل الخلايا (هنا القناة الحمراء ، C2-) على المنطقة التي تشغلها نوى الخلايا الظهارية (هنا DAPI ، C1-).
      2. احسب نسبة التكرار المفرط: قسم المنطقة التي تشغلها السالمونيلا شديدة التكاثر الخلوي (القناة الخضراء ، C3-) على المنطقة التي تشغلها السالمونيلا الكلية داخل الخلايا (القناة الحمراء ، C2-).
  2. تحليل الخلية الواحدة
    1. افتح ملف Acquisition.czi في ImageJ ، المسمى AcquisitionTitle في البرنامج النصي: قائمة الملف > افتح > Acquisition.czi. سيتم فتح نافذة تعرض صور جميع القنوات وجميع طائرات z.
    2. تقسيم القنوات حسب الصورة > اللون > تقسيم القنوات. يتم الآن عرض القنوات في نوافذ منفصلة ، يتم تسميتها تلقائيا بواسطة ImageJ باسم C-AcquisitionTitle. هنا ، تتوافق نافذة C1-AcquisitionTitle مع الخلايا الظهارية (الزرقاء) ، ونافذة C2-AcquisitionTitle مع السالمونيلا داخل الخلايا (mCherry) ، ونافذة C3-AcquisitionTitle مع قناة السالمونيلا شديدة التكاثر الخلوي (GFP). تتضمن كل نافذة C-AcquisitionTitle جميع طائرات z التي تم الحصول عليها.
    3. معالجة C1-عنوان الاستحواذ نافذة ، المقابلة للخلايا الظهارية ، لتقسيم الخلايا.
      1. اختر صورة z-plane لاستخدامها في تجزئة الخلايا. حدد نافذة C1-AcquisitionTitle واستخدم Image > Duplicate: اكتب رقم z-plane المختار (أي 1 لتحديد z 1/8) ، واكتب C1Zplane في مربع العنوان ، وقم بإلغاء تحديد Duplicate Stack ، ثم انقر فوق OK لتكرار صورة z-plane المحددة فقط. سيتم فتح نافذة تسمى C1Zplane تعرض صورة z-plane المحددة.
      2. قم بمعالجة صورة C1Zplane التي تم الحصول عليها لتحسين تباين الصورة. افتح العملية > تحسين التباين: اضبط وحدات البكسل المشبعة (على سبيل المثال ، هنا يتم استخدام 1٪) وتحقق تطبيع. ثم ، انقر فوق "موافق " لتطبيق تقنية تحسين التباين للحصول على صورة C1Zplane طبيعية للتباين.
      3. قم بمعالجة صورة C1Zplane ذات التباين الطبيعي لتقسيم الخلايا الظهارية. استخدم العملية > البحث عن ماكسيما لفتح قائمة FindMaxima : أولا ، ضع علامة على تحديد نقطة المعاينة لتعيين تحمل الضوضاء من أجل إسناد نقطة قصوى واحدة فقط إلى كل خلية ظهارية واحدة. العلم استبعاد حافة ماكسيما. حدد نوع الإخراج الجسيمات المجزأة وانقر فوق موافق للحصول على C1ZplaneSegmented ، وهي صورة ثنائية جديدة تشبه القناع تعرض كل جسيم مجزأ لكل نقطة قصوى محددة.
        ملاحظة: يتم استخدام خوارزمية Find Maxima ImageJ لتقسيم الخلايا. يتم الكشف عن نقاط الحد الأقصى (قمم كثافة البكسل) عبر الصورة ، ومن المحتمل أن تكون مطابقة للخلايا. يتم تعيين عتبة الضوضاء (تحمل الضوضاء) ، ويتم تحليل المنطقة المتجاورة حول نقاط الحد الأقصى لإنشاء صورة ثنائية تشبه القناع تحدد كل جسيم مجزأ لكل نقطة قصوى ، وبالتالي كل خلية.
      4. معالجة C1Zplaneصورة مجزأة لإنشاء قناع من الخلايا المجزأة. استخدم تحليل > تحليل الجسيمات: حدد الخيار إظهار الأقنعة والاستبعاد على الحواف. اضبط نطاق مساحة الجسيمات المجزأة لتضمينها في القناع ، المقابلة لمعلمة الحجم ، من أجل استبعاد الكائنات المجزأة بشكل خاطئ مثل مجموعات الخلايا وكسور الخلايا. لتسجيل مساحة الكائنات المجزأة بشكل خاطئ ، استخدم أداة تتبع العصا في شريط الأدوات: حدد الجسيم باستخدام العصا ، ثم افتح تحليل > قياس لقياس مساحة الكائنات الخاطئة. اضبط الفاصل الزمني للحجم (النطاق المقترح 250-1700 بكسل2) وانقر فوق "موافق " للحصول على القناع الثنائي MaskofC1ZplaneSegmented .
      5. بشكل افتراضي ، يحتوي القناع الثنائي MaskOfC1ZplaneSegmented على جدول بحث مقلوب. استخدم LUT > عكس LUT في شريط الأدوات.
      6. قم بمعالجة القناع الثنائي MaskOfC1ZplaneSegmented لتصحيح تجزئة الخلية:
        1. تم الحصول على صورة C1Zplane ذات التباين العتبوي في الخطوة 4.2.3.2. استخدم Image > ضبط عتبة >: تحقق من خلفية داكنة. اضبط إعداد العتبة التلقائية الافتراضية . اختر الخيار الأحمر واضبط الحد الأدنى لقيمة القطع (الشريط العلوي) حتى تظهر الخلايا باللون الأحمر تماما ، تاركة خلفية داكنة (العتبة = 8000 مطبقة في هذا البروتوكول). ثم ، انقر فوق تطبيق لتحويل صورة C1Zplane التي تم تطبيعها بالتباين إلى صورة ثنائية بها خلايا باللون الأبيض والخلفية باللون الأسود.
        2. تجزئة الخلية الصحيحة في قناع ثنائي MaskOfC1ZplaneSegmented . استخدم العملية > حاسبة الصور: حدد MaskOfC1ZplaneSegmented ك Image1 ، واختر العملية AND في القائمة المنسدلة ، ثم حدد C1Zplane الذي تم تسويته بالتباين كصورة 2. انقر فوق موافق. يتم تسمية صورة الإخراج تلقائيا بواسطة ImageJ كنتائج قناع C1Zplane مجزأة.
      7. نتائج عملية قناع C1Zplane مجزأة لتسمية كل خلية أحادية المقطع كمنطقة اهتمام (ROI). استخدم تحليل > تحليل الجسيمات. اضبط الحجم كما في الخطوة 4.2.3.4 ، ثم حدد الخيار إظهار لا شيء. حدد إضافة إلى المدير لإضافة جميع الجسيمات (الخلايا المجزأة) إلى أداة ROI Manager. تحقق أيضا استبعاد على الحواف. انقر فوق موافق. ستعرض قائمة مدير عائد الاستثمار قائمة بجميع الجسيمات (الخلايا المجزأة) ، المعرفة على أنها عائد استثمار ، مصنفة بشكل فريد مع إحداثيات y و x الخاصة بكل منها.
      8. احفظ بيانات عائد الاستثمار كعائد استثمار-خلايا-AcquisitionTitle.zip من خلال قائمة مدير عائد الاستثمار بالنقر فوق المزيد > حفظ. سيتم فتح ROI-cells-AcquisitionTitle.zip في الخطوة 4.2.4.6 لتحليل الخلية الواحدة.
    4. معالجة C2-عنوان الاستحواذ نافذة (هنا قناة حمراء) ، المقابلة لداخل الخلايا Salmonellae، لقياس عدد الخلايا المصابة والحمل الفراغي داخل الخلايا.
      1. اطرح القناة الخضراء (C3-) من القناة الحمراء (C2-) لإزالة وحدات البكسل خارج نطاق التركيز من السالمونيلا شديدة التكاثر الخلوي.
        1. استخدم حاسبة > للصور. حدد C2-Acquisitiontitle ك Image1 ، واختر العملية طرح في القائمة المنسدلة ، ثم حدد C3-Acquisitiontitle ك Image2. تحقق من إنشاء نافذة جديدة وانقر فوق موافق.
        2. قم بتطبيق الطرح على z-stack بالكامل بالنقر فوق نعم في مكدس العملية؟ نافذة. تسمى نافذة الإخراج ResultsOfC2AcquisitionTitle في البرنامج النصي.
      2. نتائج العمليةC2AcquisitionTitle لتقليل الضوضاء العشوائية.
        1. قم بتكرار نافذة ResultsOfC2AcquisitionTitle بالنقر فوق قائمة الصورة > تكرار. حدد مكدس مكرر واضغط موافق للحصول على نافذة ResultsOfC2AcquisitionTitle1.
        2. قم بتطبيق التمويه الغاوسي على نافذة ResultsOfC2AcquisitionTitle1 من خلال تصفية > العملية > التمويه الغاوسي. اترك قيمة Sigma ك 2 أو قم بتخصيصها (على سبيل المثال ، هنا تم استخدام Sigma: 4). انقر فوق "موافق" وقم بتطبيق Gaussian Blur على z-stack بالكامل بالنقر فوق نعم في نافذة Process Stack؟
        3. اطرح ResultOfC2AcquisitionTitle1 الذي تمت تصفيته من Gaussian إلى ResultsOfC2AcquisitionTitle بالنقر فوق عملية > حاسبة الصورة. حدد ResultsOfC2AcquisitionTitle كصورة1 ، واختر عملية طرح في القائمة المنسدلة ، ثم حدد ResultsOfC2AcquisitionTitle1 كصورة2. انقر فوق موافق. قم بتطبيق الطرح على z-stack بالكامل بالنقر فوق نعم في مكدس العملية؟ نافذة للحصول على نافذة يتم تسميتها تلقائيا بواسطة ImageJ كنتائج نتائج C2-AcquisitionTitle.
      3. معالجة نتائج نتائج C2-AcquisitionTitle لفصل السالمونيلا عن الخلفية. استخدم Image > ضبط عتبة >: تحقق من خلفية داكنة وقم بتعيين عتبة Otsu التلقائية. اضبط الحد الأدنى لقيمة القطع (الشريط العلوي) حتى تظهر السالمونيلا باللون الأحمر تماما ، مع ترك خلفية داكنة (العتبة = 100 المطبقة في هذا البروتوكول). انقر فوق تطبيق وستفتح نافذة التحويل إلى ثنائي : تحقق من الخلفية السوداء ، ثم انقر فوق موافق. يتم الآن تحويل z-stack الكامل إلى صور ثنائية.
      4. حدد المستوى الأوسط Z ، المقابل لمستوى تركيز السالمونيلا الفراغي ، في نتائج النافذة الثنائية نتائج C2-AcquisitionTitle من الخطوة 4.2.4.3: Image > Stacks > Set Slice واكتب رقم المستوى z المفضل (على سبيل المثال ، هنا يتم استخدام z: 4/8). انقر فوق موافق.
      5. اضبط القياسات للتسجيل لكل عائد استثمار (خلية). استخدم تحليل > ضبط القياس: تحقق من المنطقة ، المقابلة للمساحة الإجمالية لكل عائد استثمار. تحقق من كسر المنطقة والحد من العتبة لتسجيل جزء المنطقة الذي تشغله وحدات البكسل العتبة ( السالمونيلا داخل الخلايا) فقط لكل عائد استثمار. تحقق من تسمية العرض لتسمية كل عائد استثمار فردي بعنوان الصورة والقناة ومستوى z وإحداثيات x-y في جدول النتائج.
      6. قم بمعالجة المستوى z المختار من السالمونيلا داخل الخلايا لتسجيل الملصقات والمساحة والنسبة المئوية للمساحة التي تشغلها السالمونيلا لكل خلية (ROI): افتح ملف ROI-cells-AcquisitionTitle.zip ، المحفوظ في الخطوة 4.2.3.8 ، بواسطة File > افتح وانقر على قياس في قائمة ROI Manager. الإخراج عبارة عن جدول يبلغ عن القياسات المحددة.
      7. احفظ جدول النتائج باستخدام ملف > حفظ باسم في نافذة النتائج.
      8. افتح جدول النتائج في جدول بيانات: تتم الإشارة إلى مساحة التسمية والنسبة المئوية للمساحة التي تشغلها السالمونيلا داخل الخلايا لكل عائد استثمار ، يتوافق مع خلية محيطية محددة بشكل فريد بإحداثيات x و y.
      9. قم بقياس عدد الخلايا المصابة المقابلة لعائد الاستثمار الذي يظهر ٪ مساحة > 0 تشغلها وحدات بكسل عتبة، تتوافق مع السالمونيلا (على سبيل المثال، هنا يتم اعتبار ٪ مساحة > 0.2٪ لتحديد الخلايا المصابة). ثم احسب النسبة المئوية للخلايا المصابة في إجمالي الخلايا.
      10. قم بقياس الحمل الفراغي للسالمونيلا / الخلية عن طريق حساب متوسط٪ المساحة التي تشغلها السالمونيلا المفرغة لجميع الخلايا المصابة.
    5. معالجة القناة الخضراء (C3-AcquisitionTitle) لقياس عدد الخلايا التي تظهر السالمونيلا شديدة التكاثر الخلوي. اتبع من الخطوات 4.2.4.2 إلى 4.2.4.9 ، ولكن مع بعض التعديلات.
      1. العمل على المستويات z العلوية (هنا z: 7/8) ، حيث تبرز الخلايا التي تظهر السالمونيلا شديدة التكاثر الخلوي من الطبقة الأحادية ؛ لذلك ، يتم التركيز عليها على مستوى مختلف مقارنة بالخلايا التي لا تتكاثر بشكل مفرط في السالمونيلا.
      2. قم بقياس عدد الخلايا التي تحتوي على السالمونيلا شديدة التكاثر الخلوي (الخضراء) عن طريق تسجيل الخلايا (ROIs) التي تظهر نسبة مئوية عالية من المساحة التي تشغلها السالمونيلا (على سبيل المثال ، تعتبر النسبة المئوية للمساحة > 20٪ لتحديد الخلايا التي تحتوي على السالمونيلا شديدة التكاثر الخلوي). بعد ذلك ، احسب النسبة المئوية للخلايا التي تحتوي على السالمونيلا المتكاثرة بشكل مفرط في الخلايا الخلوية على إجمالي الخلايا المصابة المسجلة في الخطوة 4.2.4.9.

Representative Results

إصابة الخلايا الظهارية بسلالات السالمونيلا
تم تطوير هذا البروتوكول لتحليل الغزو الخلوي والتكرار الخلوي (الشكل 1 أ) مقابل الحمل الفراغي (الشكل 1 ب) للسالمونيلا داخل الخلايا الظهارية. تم التحقق من صحة البروتوكول باستخدام سلالات السالمونيلا الثلاثة التالية ، S. سلالة التيفيموريوم SL1344 المرجعية (S. Tm) ، س. ديربي ER1175 وايلد تايب (S. Derby wt) والمتحولة متساوية المنشأ ل S. ديربي ER1175 بدون جين sipA (S. ديربي ΔsipA). تم عزل سلالة S. Derby ER1175 من الخنازير وتنتمي إلى مجموعة مراقبة IZSLER لعزلات السالمونيلا. تم اختيار السلالات من أجل تمثيل تنوع النمط الظاهري الذي يغطيه البروتوكول. على وجه الخصوص ، تم اختيار هذه السلالات لأن سلوكها داخل الخلايا الظهارية كان معروفا بالفعل أنه يختلف من حيث الغزو أو التكرار9. لذلك ، كانت ضوابط قيمة لاختبار ما إذا كان البروتوكول يسمح بالتمييز الكمي بين الاختلافات في الأنماط الظاهرية للسالمونيلا داخل الخلايا. على وجه الخصوص ، س. Tm و S. تم تضمين Derby wt لأننا أثبتنا سابقا أن S. Tm لديه غزو أعلى وكفاءة النسخ المتماثل داخل الخلايا من S. ديربي بالوزن9 بينما S. تمت إضافة Derby ΔsipA كسلالة ضعيفة التكرار المفرط لأن مستجيب الفوعة SipA يلعب دورا حاسما في بداية فرط النسخ المتماثل10,11. تم الإبلاغ عنه سابقا ل S. Tm أن النسخ المتماثل الخلوي يبدأ بعد 4 ساعات من الغزو ، ثم يتكاثر السكان الخلويون بسرعة مفرطة لملء الخلية الظهارية بمقدار 8 ساعات11,12. باستمرار ، كانت العدوى الطويلة لمدة 8 ساعات مناسبة لمراقبة وتحديد النمط الظاهري لفرط التكاثر الخلوي أيضا في S. ديربي بالوزن و S. ديربي ΔsipA.

تحليل المنطقة
يوفر تحليل المنطقة في الخطوة 4.1 قياسا للاستعمار الكلي للخلايا الظهارية بواسطة السالمونيلا (نسبة العدوى) ، جنبا إلى جنب مع قياس التكاثر المفرط (نسبة التكاثر المفرط). في سير عمل تحليل المنطقة الموضح في الشكل 2 ، يتم تقليل الضوضاء العشوائية ، ثم يتم تقسيم القنوات ومعالجتها بشكل مستقل. يتم تعيين عتبة لكل قناة من أجل استبعاد الخلفية من قياس المنطقة. بعد ذلك ، يتم قياس المساحة التي تشغلها وحدات البكسل العتبة لكل قناة. ناتج تحليل المنطقة هو جدول يبلغ ، لكل ملف اقتناء ، عن امتداد المناطق التي تشغلها نوى الخلايا الظهارية (القناة الزرقاء) ، والسالمونيلا داخل الخلايا المعبرة عن الكرز (القناة الحمراء) ، والسالمونيلا شديدة التكاثر الخلوية التي تعبر عن GFP (القناة الخضراء) جنبا إلى جنب مع mCherry. يتم حساب نسبة العدوى بقسمة المنطقة التي تشغلها السالمونيلا المعبرة عن mCherry على المنطقة التي تشغلها نوى الخلية المضيفة. أظهرت نتائج السلالات المختبرة أن S. يعرض Tm نسبة إصابة أعلى بكثير مقارنة بكل من S. سلالات ديربي ، كما هو متوقع (الشكل 3 أ). لذلك ، توضح هذه النتائج فعالية تحليل المنطقة في اكتشاف الاختلافات في قدرة سلالات السالمونيلا على استعمار الخلايا الظهارية. يتم قياس نسبة فرط تكاثر السالمونيلا بقسمة المنطقة التي تشغلها السالمونيلا المعبرة عن GFP على المنطقة التي تشغلها السالمونيلا المعبرة عن mCherry داخل الخلايا. تمشيا مع دور SipA في تحديد النسخ المتماثل المفرط ، انخفضت نسبة النسخ المتماثل المفرط بشكل كبير ل S. تم قياس سلالة ديربي ΔsipA مقارنة ب S. ديربي بالوزن ، (الشكل 3 ب). لم يلاحظ أي فرق في النسخ المتماثل المفرط بين S. Tm و S. ديربي بالوزن. بشكل عام ، كشف تحليل المنطقة بشكل فعال عن مستويات تكاثر مفرطة مختلفة بين السلالات التي تم فحصها.

تحليل الخلية الواحدة
يسمح تحليل الخلية الواحدة بالقياس الكمي لغزو السالمونيلا والحمل الفراغي مقابل التكرار الخلوي داخل الخلايا الظهارية بدقة خلية واحدة. كما هو موضح في الخطوة 4.2 ، لكل ملف اقتناء ، تمت معالجة القنوات الزرقاء والحمراء والخضراء بشكل مستقل (الشكل 4). على وجه التحديد ، تمت معالجة القناة الزرقاء ، المقابلة للخلايا الظهارية ، في الخطوة 4.2.3 للحصول على تجزئة الخلية. بعد ذلك، تمت إضافة الخلايا المجزأة إلى مدير منطقة الاهتمام (ROI) للحصول على قائمة بعائد الاستثمار، بما يتوافق مع جميع الخلايا المقسمة التي تحمل علامة فريدة بإحداثيات y-x. من أجل إزالة وحدات البكسل خارج التركيز البؤري ل GFP - التي تعبر عن السالمونيلا شديدة التكرار ، تم طرح وحدات البكسل في القناة الخضراء من تلك الموجودة في القناة الحمراء. جدول مخرجات تقارير تحليل الخلية الواحدة ، لكل عائد استثمار ، المنطقة والنسبة المئوية لمساحة عائد الاستثمار التي تشغلها السالمونيلا معبرا عن المراسل التأسيسي mCherry فقط أو المراسل المستجيب لخلايا GFP. تمت معالجة النسبة المئوية لمساحة الخلية التي تشغلها السالمونيلا التي تعبر عن mCherry فقط في الخطوة 4.2.4 لحساب النسبة المئوية للخلايا المصابة ومتوسط الحمل الفراغي (الشكل 5 أ). أظهر تحليل الحمل الفراغي أن S. تولد سلالات ديربي حملا فراغيا متوسطا أقل بكثير من S. Tm (الشكل 5 ب). على العكس من ذلك ، لوحظ انخفاض طفيف وغير كبير في النسبة المئوية للخلايا المصابة في S. سلالات ديربي مقارنة ب S. Tm (الشكل 5 أ). تمت معالجة النسبة المئوية لمساحة الخلية التي تشغلها السالمونيلا المعبرة عن GFP في الخطوة 4.2.5 للحصول على معدل التكاثر المفرط. لم يلاحظ أي فرق بين S. Tm و S. ديربي بالوزن ، في حين S. أظهر Derby ΔsipA انخفاضا كبيرا في التكرار المفرط ، بما يتفق مع نتيجة تحليل المنطقة (الشكل 5C) ودور SipA في إحداث النسخ المتماثل المفرط.

Figure 1
الشكل 1: فرط تكاثر السالمونيلا الخلوي والحمل الفراغي. يتم عرض صور تمثيلية ل (A) فرط تكاثر السالمونيلا و (B) الحمل الفراغي المكتسب عند التكبير العالي (40x). تظهر اللوحة B مستويات التركيز المختلفة للخلايا التي تحتوي على السالمونيلا شديدة التكاثر (z: 7/8) ، مقارنة بالسالمونيلا غير المفرطة التكاثر (z: 4/8). قضبان المقياس الأبيض هي 10 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: سير عمل تحليل المنطقة. يظهر سير عمل تحليل المنطقة للحصول على تكبير منخفض تمثيلي (10x) لخلايا INT407 المصابة لمدة 8 ساعات مع السالمونيلا التي تحمل بلازميد pCHAR-Duo (MOI 100). أولا ، يتم تقليل الضوضاء العشوائية ، ثم يتم تقسيم القنوات إلى C1 و C2 و C3 ومعالجتها بشكل مستقل. يتم تعيين عتبة لكل قناة من أجل استبعاد الخلفية من منطقة القياس. بعد ذلك ، يتم قياس المساحة التي تشغلها وحدات البكسل العتبة فقط - المقابلة لنوى الخلية في C1 ، وجميع السالمونيلات داخل الخلايا في C2 ، والسالمونيلا الخلوية في C3 - لكل قناة. الصور التي تم تحليلها هنا هي نتائج أربعة بلاطات تم الحصول عليها بتكبير 10x تنصهر معا عن طريق خياطة. قضبان المقياس الأبيض هي 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: نتائج تحليل المنطقة. يتم عرض نتائج تحليل المنطقة. (أ) تحسب نسبة العدوى بقسمة المساحة التي تشغلها السالمونيلا المعبرة عن الكرز (قناة C2) ، والتي تمثل جميع البكتيريا داخل الخلايا ، على المنطقة التي تشغلها نوى الخلية المضيفة (قناة C1). (ب) تم قياس نسبة التكاثر المفرط بقسمة المنطقة التي تشغلها السالمونيلا المعبرة عن GFP (قناة C3) ، والتي تمثل البكتيريا المتكاثرة بشكل مفرط فقط ، على المنطقة التي تشغلها جميع السالمونيلا المعبرة عن mCherry داخل الخلايا. تمثل كل نقطة نسخة متماثلة. تم إجراء التحليل على ثلاث نسخ بيولوجية مكررة ، تم اختبار كل منها في ثلاث نسخ. تشير الخطوط السوداء إلى القيم المتوسطة. تم حساب الدلالة باستخدام اختبار t ثنائي الطرف ، وتم الإبلاغ عن قيم p. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: سير عمل تحليل الخلية الواحدة. يظهر سير عمل تحليل الخلية الواحدة للحصول على تكبير عالي تمثيلي (40x) لخلايا INT407 المصابة لمدة 8 ساعات مع السالمونيلا التي تحمل بلازميد pCHAR-Duo (MOI 100). أولا ، يتم تقسيم القنوات إلى C1 و C2 و C3 ومعالجتها بشكل مستقل. تتم معالجة القناة الزرقاء (C1) ، المقابلة للخلايا الظهارية ، للحصول على تجزئة الخلية ، ثم يتم تعريف كل خلية مجزأة على أنها منطقة اهتمام (ROI) مصنفة بشكل فريد بإحداثيات y-x. تتم معالجة القناة الحمراء (C2) عن طريق طرح القناة الخضراء (C3) لإزالة السالمونيلا المتكاثرة خارج التركيز الخلوي ، تاركة جميع السالمونيلا الفراغية تعبر عن mCherry فقط ، ثم تم تقليل الضوضاء العشوائية ، ويتم تعيين العتبة لاستبعاد الخلفية من القياسات. أخيرا ، يتم قياس المساحة التي تشغلها السالمونيلا المفرغة لكل عائد استثمار. تتم معالجة القناة الخضراء (C3) ، المقابلة لإجمالي السالمونيلا المعبرة عن GFP الخلوية ، بالمثل. الصور التي تم تحليلها هنا هي نتائج 16 بلاطة مدمجة معا عن طريق الخياطة. قضبان المقياس الأبيض هي 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: نتائج تحليل الخلية الواحدة. يتم عرض نتائج تحليل الخلية الواحدة. (أ) يتم الحصول على النسبة المئوية للخلايا المصابة بقسمة عدد الخلايا على نسبة مئوية من المساحة التي تشغلها السالمونيلا التي تعبر عن الكرز فقط > 0.2 على إجمالي عدد الخلايا. (ب) تم الحصول على متوسط الحمل الفراغي عن طريق حساب متوسط النسبة المئوية للمساحة التي تشغلها السالمونيلا التي تعبر عن mCherry فقط في الخلايا المصابة. (ج) تم حساب معدل التكاثر المفرط بقسمة عدد الخلايا مع نسبة مئوية من المساحة التي تشغلها السالمونيلا المعبرة عن GFP ≥20٪ على إجمالي عدد الخلايا المصابة. يتم الإبلاغ عن بيانات من ثلاثة إلى أربعة مكررات بيولوجية تم اختبارها في ثلاث نسخ. تشير الأشرطة إلى الخطأ القياسي للقياس. تم حساب الدلالة باستخدام اختبار t ثنائي الطرف ، وتم الإبلاغ عن قيم p . الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الملف التكميلي 1: البرنامج النصي لتحليل المنطقة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: البرنامج النصي لتحليل الخلية الواحدة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

الطريقة التي تستعمر بها السالمونيلا الخلايا الظهارية المعوية ، تؤثر على نتيجة العدوى. عند الغزو ، يؤدي فرط التكاثر الخلوي إلى التهاب الأمعاء3 ، في حين أن التكرار الفراغي يمكن أن يؤدي إلى انتشار جهازي4. يمكن أن تختلف سلالات السالمونيلا في قدرتها على غزو وتكاثر الخلايا الظهارية المعوية9. في الواقع ، السالمونيلا هو جنس متنوع للغاية يضم أكثر من 2500 مصل ، والتي لها قدرات مختلفة على التسبب في المرض. بالإضافة إلى ذلك ، السالمونيلا هي السبب الأكثر شيوعا لتفشي الأمراض المنقولة بالغذاء في الاتحاد الأوروبي ، مما يشير إلى انتشار كبير في السكان البشريين1. لذلك ، فإن توافر طرق موثوقة وعالية الإنتاجية للقياس الكمي للأنماط الظاهرية داخل الخلايا للسالمونيلا له أهمية كبيرة لتقييم الاختلافات في الفوعة بين أعداد كبيرة من سلالات السالمونيلا والسماح في نهاية المطاف بإجراء تقييم دقيق ومحدد للمخاطر الخاصة بالسلالة لهذا العامل الممرض.

يقيس البروتوكول الموصوف هنا سلوك السالمونيلا داخل الخلايا الظهارية بطريقة سريعة وآلية. يتم إجراء عدوى الخلايا الظهارية في 96 لوحة دقيقة للتصوير ويستخدم مجهر مضان آلي للحصول على الصور ، مما يجعل البروتوكول مناسبا للتطبيقات عالية الإنتاجية. يستفيد هذا البروتوكول من بلازميد pCHAR-Duo ، والذي يسمح بالتمييز بين الفراغ والسالمونيلا الخلوية من خلال التعبير التفاضلي لاثنين من مراسلي الفلورسنت5. غالبا ما يتم تحليل الأنماط الظاهرية داخل الخلايا للسالمونيلا عن طريق التسجيل اليدوي ، وهو إجراء يستغرق وقتا طويلا وغير مناسب لتحليل أعداد كبيرة من السلالات ومزارع الخلايا لكل سلالة وعرضة لأخطاء المشغل والاختلاف بين المشغلين. للتغلب على هذه القيود ، تم تطوير تحليلين مكملين وآليين للصور ، تحليل المنطقة وتحليل الخلية الواحدة. تم استخدام ImageJ ، وهو برنامج متاح مجانا ، لتطوير التحليلين. من أجل تسريع تنفيذ البروتوكول ، يتم توفير نصوص ImageJ لتحليل الدفعات لملفات الاستحواذ المتعددة دون تدخل المشغل كملفات تكميلية.

تم تصميم تحليل المنطقة لتحديد ، في بضع خطوات ، الاستعمار الكلي للخلايا الظهارية (نسبة العدوى) ومستوى التكاثر المفرط (نسبة التكاثر المفرط) من خلال قياس المناطق التي تشغلها على وجه التحديد نوى الخلايا الظهارية والسالمونيلا التي تعبر إما عن mCherry أو mCherry مع GFP. يتم تطبيق تحليل المنطقة على الصور التي تم الحصول عليها عند التكبير المنخفض ، حيث يتم التركيز على كل من السالمونيلا الفراغية والمفرطة التكرار في نفس المستوى z ، ويتم عرض عدد كبير من الخلايا الظهارية لكل مجال مجهري ، مما يقلل من حجم وعدد ملفات الاستحواذ. يسمح تحليل المنطقة بإجراء تحليل آلي وسريع وخفيف حسابيا لعدد كبير من العينات ، مما يجعله مناسبا للمقايسات عالية الإنتاجية مثل تجارب الفحص.

تم تصميم تحليل الخلية الواحدة لتحديد الأنماط الظاهرية للسالمونيلا داخل الخلايا الظهارية بدقة خلية واحدة ، والتي تم الحصول عليها من خلال تجزئة الخلية وقياس المنطقة الخلوية والنسبة المئوية للمساحة التي تشغلها السالمونيلا الفراغية والخلوية المفرطة التكاثر. يتم هنا تقسيم الاستعمار الكلي للخلايا الظهارية التي تتميز من خلال تحليل المنطقة إلى ثلاثة معلمات كمية ، النسبة المئوية للخلايا المصابة ، ومتوسط الحمل الفراغي ، ومعدل التكرار المفرط ، مما يسمح بتقييم وقياس مساهمة كل نمط ظاهري في الاستعمار الكلي ، وبالتالي استكمال نتائج تحليل المنطقة. تأتي التفاصيل الأكبر التي يقدمها تحليل الخلية الواحدة على حساب الحصول على الصور وتحليلها بشكل أبطأ. في الواقع ، من أجل تحقيق دقة خلية واحدة ، يتم الحصول على الصورة عند التكبير العالي. هذا يعني أن هناك حاجة إلى مستويات z متعددة لمراقبة كل من السالمونيلا الفراغية والخلوية في التركيز وأن اكتساب عدد كبير من الحقول لكل عينة ضروري لتسجيل عدد كبير من الخلايا الظهارية ، وبالتالي إطالة وقت الاكتساب مقارنة بتحليل المنطقة. علاوة على ذلك ، فإن تحليل العديد من ملفات الاستحواذ الكبيرة يتطلب حسابيا ، وبالتالي يتطلب محطة عمل مناسبة (تم استخدام محطة عمل ذات 6 نواة وذاكرة وصول عشوائي (RAM) بسعة 32 جيجابايت). لذلك ، يمكن استخدام تحليل الخلية الواحدة كمستقل في ظروف الإنتاجية المحدودة أو كطريقة من المستوى الثاني مقترنة بتحليل المنطقة للحصول على فهم أعمق للأنماط الظاهرية للسالمونيلا داخل الخلايا الظهارية.

تم التحقق من صحة التحليلين المتكاملين باستخدام S. تي إم ، س. ديربي الوزن ، و S. Derby ΔsipA ، تم اختياره لأن سلوكهم داخل الخلايا الظهارية كان معروفا بالفعل أنه يختلف من حيث الغزو أو التكرار 9,10. تظهر نتائج تحليلات المنطقة والخلية الواحدة أن البروتوكول سمح بالتمييز الكمي بين الاختلافات في الأنماط الظاهرية للسالمونيلا داخل الخلايا وفقا لخصائص السلالات المختبرة. علاوة على ذلك ، توضح هذه النتائج أن تحليل الخلية الواحدة يسمح بالقياس الكمي لمساهمة كل نمط ظاهري داخل الخلايا (الغزو ، الحمل الفراغي والتكرار الخلوي) في الاستعمار الكلي المسجل باستخدام تحليل المنطقة.

تم تطبيق هذا البروتوكول هنا لدراسة الإمراضية في المختبر لسلالات مختلفة من السالمونيلا ، ولكن يمكن أن يكون لها تطبيقات أخرى مثل دراسة الطفرات العشوائية لتحديد الجينات المشاركة في الغزو و / أو التكاثر داخل الخلايا الظهارية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تكييف البروتوكول لتحليل سلوك السالمونيلا داخل خطوط الخلايا الأخرى غير خلايا INT407. يمكن استخدامه أيضا كنقطة انطلاق لتطوير طرق مماثلة لدراسة تفاعل الخلية الممرضة للكائنات الحية الدقيقة الأخرى داخل الخلايا.

Disclosures

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.

Acknowledgments

يود المؤلفون أن يشكروا الدكتورة أوليفيا ستيل مورتيمر على مشاركة بلازميد pCHAR-Duo. تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة الصحة الإيطالية ، ومنح PRC2019014 و PRC2021004.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well imaging microplate Eppendorf 30741030 Cell culture and infection
Ampicillin Sigma-Aldrich 59349 Bacteria culture
Axio observer inverted microscope ZEISS Automated fluorescence microscope
Axiocam 305 Mono ZEISS Microscope Camera
Breathable sealing membrane Sigma-Aldrich Z380059 Infection assay
Colibrì 5/7 ZEISS Led light source
Collagen I rat tail Life Technologies A1048301 Collagen coating
DAPI Invitrogen D3571 Cell staining
Fetal bovine serum Gibco 10099-141 Cell culture and infection
Gentamicin Sigma-Aldrich G12664 Infection assay
Glacial acetic acid Carlo Erba 401391 Collagen coating
HCS CellMask Blue Invitrogen H32720 Cell staining
ImageJ National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) Image processing software
Minimum Essential Eagle's Medium Sigma-Aldrich M5650-500ML Cell culture and infection
Paraformaldehyde 4% Invitrogen FB002 Cell fixation
Potassium chloride PanReac AppliChem 131494.1211 PBS preparation
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 60220 PBS preparation
Sodium Chloride PanReac AppliChem 131659.1214 Bacteria culture and PBS preparation
Sodium phosphate Dibasic Sigma-Aldrich 71640 PBS preparation
Tissue Culture Flask 25 cm2 plug seal screw cap Euroclone ET7025 Cell culture
Triton X-100 Biorad 1610407 Cell staining
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200056 Cell culture and infection
Tryptone Oxoid LP0042B Bacteria culture
Yeast extract Biolife 4122202 Bacteria culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. European Food Safety Authority & European Centre for Disease Prevention and Control. The European Union One Health 2020 Zoonoses Report. EFSA Journal. 19 (12), 6971 (2021).
  2. Fattinger, S. A., Sellin, M. E., Hardt, W. D. Salmonella effector driven invasion of the gut epithelium: breaking in and setting the house on fire. Current Opinion in Microbiology. 64, 9-18 (2021).
  3. Knodler, L. A., et al. Dissemination of invasive Salmonella via bacterial-induced extrusion of mucosal epithelia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17733-17738 (2010).
  4. Fulde, M., et al. Salmonella SPI2 T3SS mediates transcytosis in polarized enterocytes in vivo. Cell Host & Microbe. , (2019).
  5. Cooper, K. G., Chong, A., Starr, T., Finn, C. E., Steele-Mortimer, O. Predictable, tunable protein production in Salmonella for studying host-pathogen interactions. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 475 (2017).
  6. Klein, J. A., Grenz, J. R., Slauch, J. M., Knodler, L. A. Controlled activity of the Salmonella invasion-associated injectisome reveals its intracellular role in the cytosolic population. mBio. 8 (6), 01931 (2017).
  7. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  8. Ibarra, J. A., et al. Induction of Salmonella pathogenicity island 1 under different growth conditions can affect Salmonella-host cell interactions in vitro. Microbiology. 156 (4), 1120-1133 (2010).
  9. Tambassi, M., et al. Mutation of hilD in a Salmonella Derby lineage linked to swine adaptation and reduced risk to human health. Scientific Reports. 10 (1), 21539 (2020).
  10. Finn, C. E., Chong, A., Cooper, K. G., Starr, T., Steele-Mortimer, O. A second wave of Salmonella T3SS1 activity prolongs the lifespan of infected epithelial cells. PLoS Pathogens. 13 (4), 1006354 (2017).
  11. Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells. PLoS One. 9 (1), 84681 (2014).
  12. Chong, A., Starr, T., Finn, C. E., Steele-Mortimer, O. A role for the Salmonella Type III Secretion System 1 in bacterial adaptation to the cytosol of epithelial cells. Molecular Microbiology. 112 (4), 1270-1283 (2019).

Tags

علم المناعة والعدوى ، العدد 186 ، السالمونيلا ، الأنماط الظاهرية داخل الخلايا ، النسخ المتماثل الفراغي ، فرط التكرار الخلوي ، بروتوكول الإنتاجية العالية ، تحليل الصور الآلي ، الفحص المجهري الفلوري ، نصوص ImageJ
التحليل الآلي للأنماط الظاهرية داخل الخلايا <em>للسالمونيلا</em> باستخدام ImageJ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berni, M., Pongolini, S., Tambassi,… More

Berni, M., Pongolini, S., Tambassi, M. Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ. J. Vis. Exp. (186), e64263, doi:10.3791/64263 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter