Summary
沙门氏菌在沙门氏菌特异性液泡中和细胞质中游离（超复制）侵入并复制肠上皮细胞内。这里描述了一种基于高通量荧光显微镜的方案，通过 ImageJ 进行两次互补图像分析来量化沙门氏菌的细胞内表型，达到单细胞分辨率和评分。
Abstract
沙门氏菌是一种肠道病原体，能够侵入肠上皮并在肠细胞中复制，既在沙门氏菌特异性液泡内，又在细胞质中游离（胞质超复制）。这些不同的细胞内复制表型驱动不同的发病途径，即胞质过度复制诱导炎性细胞死亡并挤出到肠腔，而空泡复制导致跨上皮渗透和全身扩散。人们努力创建显微镜工具来研究侵袭细胞内沙门氏菌的行为，例如pCHAR-Duo荧光报告质粒，该质粒允许通过mCherry和GFP的差异表达来区分空泡和胞质细菌。然而，细胞内表型通常是手动评分的，这是一个耗时的过程，将分析限制在少量样品和细胞上。为了克服这些限制，使用免费提供的图像分析软件ImageJ开发了两种互补的自动图像分析。在高通量方案中，使用96孔板感染携带pCHAR-Duo的沙门氏菌上皮细胞。使用自动荧光显微镜进行成像。然后，应用两种图像分析方法测量沙门氏菌在不同细节水平下的细胞内行为。第一种方法测量整体细胞内细菌负荷和胞质超复制的程度。它速度快，可以对大量细胞和样品进行评分，使其适用于高通量测定，例如筛选实验。第二种方法进行单细胞分析以确定感染细胞的百分比，沙门氏菌的平均空泡负荷和胞质超复制率，从而提供有关上皮细胞内沙门氏菌行为的更多详细信息。这些实验方案可以通过专门设计的 ImageJ 脚本来执行，以自动运行沙门氏菌-肠细胞相互作用主要步骤的批量分析。
Introduction
沙门氏菌是欧盟最常报告的引起食源性疾病暴发的细菌病原体1。沙门氏菌感染的主要病理表现是肠炎，这是摄入后肠道中的病原体行为以及随之而来的局部炎症反应的结果2。然而，沙门氏菌也可以播散到肠外部位并引起全身感染，特别是在免疫功能低下的个体中。沙门氏菌和肠上皮之间的相互作用类型决定了感染的结果。一旦进入肠腔，沙门氏菌就会侵入并在肠上皮细胞内复制。在细胞内水平，沙门氏菌可以呈现两种不同的复制表型，即胞质超复制和含沙门氏菌液泡（SCV）内的液泡内缓慢复制。 胞质超复制诱导炎性宿主细胞死亡和沙门氏菌挤出到肠腔3;液泡复制导致跨上皮渗透和全身扩散4.因此，侵袭程度和液泡与胞质复制影响感染过程。
沙门氏菌属非常多样化，包括数千种具有不同宿主范围和引起疾病能力的血清型。例如，S.鼠伤寒被定义为多面手血清型，因为它感染多种不相关的宿主，并且是人类沙门氏菌病的主要原因之一。不同的是，S.德比被认为是一种适应猪的血清型，因为它主要是从猪中分离出来的，但它也被报道在负责人类感染的前五名血清型中1。然而，关于上皮细胞内细菌行为的知识基本上仅限于研究一些参考菌株，如S。鼠伤寒SL1344，不代表沙门氏菌致病性的巨大自然多样性。表征不同沙门氏菌菌株与上皮细胞的相互作用将有助于了解它们不同的致病性。出于这个原因，开发了一种基于高通量荧光显微镜的方案，以快速且在很大程度上自动化的方式分析大量菌株的细胞内行为。在该协议中，在96孔成像板中进行上皮细胞感染，并使用自动荧光显微镜进行图像采集。使用pCHAR-Duo质粒通过荧光显微镜观察上皮细胞内沙门氏菌的侵袭和复制表型5。该质粒携带编码红色荧光报告基因mCherry的基因，由所有转化的细菌细胞组成表达，以及编码绿色荧光报告基因GFP的基因，其表达被仅存在于真核细胞细胞胞质中的葡萄糖-6-磷酸激活，在SCV中不存在。因此，质粒允许通过mCherry和GFP报告基因的差异表达来区分液泡和胞质细菌。
显微镜图像上的液泡和胞质细菌通常通过手动评分6进行定量，但这是一种耗时的方法，将分析限制在少量样品上。因此，使用免费提供的图像分析软件ImageJ7进行了两种互补的自动图像分析-区域分析和单细胞分析。面积分析通过使用每个获取的显微镜图像中上皮细胞、红色和绿色 沙门氏菌 所占区域的数据来测量总体细胞内细菌负荷和胞质超复制的程度。该方法可应用于以低倍率采集的图像;因此，它允许用很少的图像对大量上皮细胞进行评分，从而缩短采集时间。单细胞分析使用细胞分割来确定感染细胞的百分比、平均液泡负荷以及经历单细胞分辨率的胞质超复制的感染细胞的百分比。
在此协议中，详细描述了图像分析的所有步骤以手动执行，但相同的分析可以通过我们专门设计的 ImageJ 脚本自动执行。这些脚本还允许运行批量分析以自动分析多个图像，从而加快方法的执行速度。
Protocol
1. 携带pCHAR-Duo报告质粒的沙门氏菌 感染上皮细胞
注意：建议使用多通道移液器。
- 使用前，在 96 孔成像板上涂上黑色壁和平坦的玻璃底部胶原蛋白。
- 在化学罩下的无菌软化水中稀释冰醋酸（17. 4 M），得到20 mM乙酸溶液。在无菌条件下，通过孔径为0.2μm的注射器过滤器过滤溶液。将溶液在0-4°C架中放置5分钟。
- 在预冷的 20 mM 乙酸溶液中将 3 mg/mL 胶原蛋白原液稀释至 50 μg/mL。通过倒置 10 次混合，然后每孔分配 30 μL 胶原蛋白溶液（5 μg 胶原蛋白/cm 2），将溶液保持在 0-4 °C 架中以避免胶原蛋白凝胶。
- 确保孔底完全被胶原蛋白覆盖，然后在室温（RT）下将板置于层流下1小时。
- 轻轻取出溶液，用 30 μL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤三次。使用多通道 100 μL 或 50 μL 移液器以避免胶原蛋白脱离。
- 感染前20-24小时在胶原包被的成像板中培养INT407上皮细胞。
- 在含有10%胎牛血清（FBS）的最低必需培养基（以下简称培养基（CM））的25cm2 烧瓶中常规培养INT407细胞，并补充有青霉素100U / mL和链霉素100μg/ mL（笔/链球菌）。
- 用5mL PBS洗涤两次INT407烧瓶，然后在感染前20-24小时在37°C下在潮湿的5%CO2气氛中分离细胞3-5分钟。计数细胞并在CM中制备3 x 105 细胞/ mL悬浮液。
- 在胶原蛋白包被的成像板中分配 100 μL 细胞悬液/孔以获得 100% 汇合。在37°C下在加湿的5%CO2 气氛中孵育1小时以促进细胞粘附。然后，加入100μLCM，并在37°C下在加湿的5%CO2 气氛中孵育20-24小时，直到感染（步骤1.4）。
注意：为了对细胞内细菌进行成像， 沙门氏菌 菌株用Olivia Steele-Mortimer博士提供的pCHAR-Duo报告质粒进行转化。此处选择测试的菌株来代表协议涵盖的表型多样性，并验证第4节中的图像分析。有关本研究中使用的菌株的更多详细信息，请参阅代表性结果。
- 制备携带pCHAR-Duo报告质粒的 沙门氏菌 菌株的固定期培养物。
- 用 10 μL 移液管的尖端对沙 门 氏菌甘油原液进行采样，并将其接种到 1 mL Luria Bertani 肉汤（每升 10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物和 10 g 氯化钠）中，并补充有氨苄西林 100 μg/mL。
- 在感染前将接种物在37°C下静态孵育20小时以达到固定的生长阶段，对应于~1 x 109 菌落形成单位（CFU）/ mL8。
- 用 沙门氏菌感染INT407上皮细胞。
注意：感染一式三份进行。- 用 200 μL PBS/孔轻轻洗涤 INT407 细胞。
- 通过在CM中稀释细菌过夜培养来制备 沙门氏 菌接种物，以获得每个上皮细胞所需数量的CFU，定义为感染多重性（MOI）。这里使用了MOI 100。
- 接种200μL /孔，然后用透气密封膜覆盖板，并在37°C下在加湿的5%CO2 气氛中孵育1小时。接种被认为是感染的零时间。
- 取出接种物并用 200 μL PBS/孔轻轻洗涤，然后加入 200 μL CM 和庆大霉素，每孔 100 μg/mL。用透气密封膜覆盖板，然后在37°C下在加湿的5%CO2 气氛中孵育1小时。
- 用庆大霉素 100 μg/mL 取出 CM，并用 200 μL PBS/孔轻轻洗涤。每孔加入200μLCM和庆大霉素10μg/ mL，用透气密封膜覆盖板，然后在37°C下在加湿的5%CO2 气氛中孵育8小时。
2.样本固定和上皮细胞染色
注意：保持样品免受光线直射。指示 96 孔板孔的体积。不同的细胞培养板或载体需要优化体积。
- 在感染后8小时，取出CM并用200μL /孔的PBS轻轻洗涤三次。通过在吸水纸上倒置板来去除PBS;避免吸气。
- 在室温下用 100 μL/孔的多聚甲醛 （PFA） 4% 在 PBS 中固定感染的单层 20 分钟。 去除 PFA 4%，并用 200 μL/孔的 PBS 洗涤三次。该板可在4°C下最多储存16-24小时。 继续执行下一步。
- 染色上皮细胞。
注意：DAPI（4′，6-二脒基-2-苯基吲哚）DNA染色（步骤2.3.1）仅用于区域分析以染色细胞核，高内涵筛选（HCS）染色（步骤2.3.2）用于单细胞分析以染色整个上皮细胞。可以使用其他细胞染色剂，但需要优化图像采集和分析。- 面积分析：分配 100 μL/孔的 DAPI（PBS 中的 300 nM 溶液），并在室温避光下孵育 5 分钟。
- 单细胞分析：在室温下用 100 μL/孔的 Triton 0.1x 在 PBS 中透化 15 分钟。 用 PBS 洗涤 3 次，并分配 100 μL/孔的 HCS 染色剂，在 PBS 中以 1：2000 稀释。在室温避光下孵育30分钟。
- 除去染色溶液，用 200 μL/孔的 PBS 洗涤 3 次。加入 50 μL/孔的 PBS 用于自动图像采集。
3. 使用自动荧光显微镜采集图像
注意：在这里，步骤3.1.1中用于面积分析的低放大倍率（10x / 0.3 NA，1μm /像素物镜）和步骤3.1.2中用于单细胞分析的高放大倍率（40x / 0.75 NA，0.255μm /像素物镜）用于采集协议。可以使用其他放大倍率，但需要优化图像采集和分析。如果可用的显微镜允许，将图像采集为平铺区域（TRs），即称为平铺的连续区域的“马赛克”，以记录大样本区域。将自动对焦设置在TR的中心，而不是为每个拼贴设置一个，以减少自动对焦过程中的样品曝光。
- 使用细胞染色通道中的软件自动对焦（HCS 染色和 DAPI 核染色的蓝色通道）作为参考 z 位置。在细胞染色通道（465 nm，细胞或细胞核）和pCHAR-Duo报告基因通道mCherry（610 nm，细胞内沙门氏菌）和GFP（509 nm，胞质超复制沙门氏菌）中采集图像。
- 面积分析：在10倍放大倍率下进行图像≥104 个细胞/技术重复（即，推荐至少三个TR，四个瓷砖/孔对应于一个技术重复）。
注意：单个z平面足以在10倍放大镜下对含有空泡的细胞和含有胞质超复制 沙门氏菌 的细胞进行成像。 - 单细胞分析：在40倍放大倍率下图像≥1，000个细胞/技术重复（即，建议至少两个TR，每个16个切片/孔对应于技术重复）。需要多个z平面来对含有液泡的细胞和含有胞质超复制 沙门氏菌的细胞进行成像。定义最佳 z 堆栈（3.85 μm z 堆栈，间隔为 0.55 μm 以获得八个 z 平面，以 40x 对感染细胞质超复制 沙门氏菌 的 INT407 细胞进行成像）。每个 z 平面在下文中标识为 n/8，n 介于 1（对应于底部 z 平面）和 8（对应于顶部 z 平面）之间。
- 面积分析：在10倍放大倍率下进行图像≥104 个细胞/技术重复（即，推荐至少三个TR，四个瓷砖/孔对应于一个技术重复）。
- 每次采集的输出都是一个名为 Acquisition .czi 的文件，其中包含所有场、通道和 z 平面的图像。如果获取了 TR，则使用单个 Acquisition .czi 文件作为拼接方法的输入，将图块融合在一起以获得每个 TR 的整体图像。
4. 使用ImageJ进行图像分析
注意：步骤4.1和步骤4.2是专门为上述实验和采集而设计的。其他实验设置可能需要优化分析。描述了单个 Acquisition.czi 文件的分析。对于批量分析，查找单细胞分析脚本和区域分析脚本作为补充文件（补充文件 1 和 补充文件 2）。脚本和 ImageJ 命令中使用的标签在以下部分中以粗体显示。
- 面积分析
- 在 ImageJ 中打开 Acquisition .czi 文件，在脚本中命名为 AcquisitionTitle：File > Open > AcquisitionTitle.czi。将打开一个显示所有频道的窗口。通道表示为 c：1-3/3，具体取决于采集顺序。在这里，c：1/3对应于蓝色（DAPI），c：2/3对应于mCherry（细胞内沙门氏菌），c：3/3对应于GFP（胞质超复制沙门氏菌）。
- 减少随机噪声以准备步骤4.1.6和4.1.7中的面积测量图像。
- 使用“图像复制”>“确定”复制“>”复制“获取”标题“窗口。
- 将高斯模糊应用于采集标题 1 >通过处理>高斯模糊过滤器。将默认的 Sigma 值保留为 2，然后单击确定。将打开“处理堆栈”窗口，单击“是”处理所有通道。
- 从原始文件“按进程>图像计算器”中减去高斯滤波的 Acquisition Title1：选择“采集标题”作为“图像 1”，在下拉列表中选择“减去”操作，然后选择“采集标题 1”作为“图像 2”。单击确定。将打开“进程堆栈”窗口。单击“是”处理所有三个图像（通道）以获取“采集结果标题”窗口。
- 通过图像>颜色>拆分通道拆分通道。现在，每个通道图像都显示在一个单独的窗口中，由ImageJ自动命名为C-ResultsOfAcquisitionTitle。这里C1-ResultsOfAcquisition Title对应于DAPI，C2-ResultsOfAcquisition Title对应于mCherry（细胞内沙门氏菌），C3-ResultsOfAcquisition Title对应于GFP（胞质超复制沙门氏菌）。
- 处理C1-采集结果标题图像以测量上皮细胞核所占据的面积。
- 导航到“ 处理>平滑 ”以均质化在核区域内显示为孔洞的核仁。
- 使用图像对 C1-采集结果标题图像进行阈值设置阈值以排除背景 > 调整>阈值：选中 深色背景 并在下拉列表中选择红色。设置 三角形 自动阈值，然后使用上方滑块设置当细胞核显示为红色且背景显示为黑色时的最小阈值（阈值= 100，在此协议中应用）。
注意：建议使用步骤4.1.4.2、4.1.7、4.2.3.6.1和4.2.4.3中描述的自动阈值，指导用户分别手动定义细胞核/上皮细胞和细菌的最佳拟合阈值。自动阈值的值将在脚本中被定义的手动阈值覆盖。定义的手动阈值将应用于整个批次分析。
- 使用分析>设置测量值：选中阈值限制以将测量值限制为阈值像素来选择感兴趣的测量值。 检查区域，对应于阈值像素占据的总面积（即C1-ResultsOfAcquisition Title中的细胞核，C2-ResultsOfAcquisition Title中的细胞内沙门氏菌，C3-ResultsOfAcquisition Title中的细胞溶质超复制沙门氏菌）。选中显示标签以记录结果表中每个图像的采集标题和通道。
- 使用 分析>测量测量细胞核占用的面积。测量值将记录到自动打开的结果表中。
- 处理C2-ResultsOfAcquisition Title和C3-ResultsOfAcquisition Title，分别测量整体细胞内沙门氏菌和胞质超复制沙门氏菌所占据的面积。按照步骤 4.1.4-4.1.6 进行一些修改：跳过步骤 4.1.4.1 中的平滑步骤，并使用 Otsu 自动阈值而不是步骤 4.1.4.2 中的三角形作为指南，以设置沙门氏菌显示为红色且背景显示为黑色时的最小阈值（上滑块）（建议阈值 = 200）。
- 使用 “文件>另存为所有文件另存为>”保存结果表。
- 在电子表格中打开结果表，以计算每个分析的 Acquisition Title 文件的面积比：
- 计算感染率：将总细胞内 沙门氏菌 （此处为红色通道，C2-）所占面积除以上皮细胞核（此处为DAPI，C1-）所占面积。
- 计算超复制率：将胞质超复制沙门氏菌（绿色通道，C3-）占据的面积除以总细胞内沙门氏菌（红色通道，C2-）所占据的面积。
- 单细胞分析
- 在 ImageJ 中打开 Acquisition .czi 文件，在脚本中命名为 AcquisitionTitle：File Menu > Open > Acquisition.czi。 将打开一个窗口，显示所有通道和所有 z 平面的图像。
- 按图像>颜色>拆分通道拆分通道。通道现在显示在单独的窗口中，由ImageJ自动命名为C-Acquisition Title。在这里，C1-Acquisition Title窗口对应于上皮细胞（蓝色），C2-Acquisition Title窗口对应于细胞内沙门氏菌（mCherry），C3-Acquisition Title窗口对应于胞质超复制沙门氏菌通道（GFP）。每个 C 获取标题窗口都包含所有采集的 z 平面。
- 处理 C1-收购标题 窗口，对应于上皮细胞，以分割细胞。
- 选择要用于细胞分割的 z 平面图像。选择“C1-Acquisition Title”窗口并使用“图像>复制”：写入所选z平面的编号（即，1选择z 1/8），在“标题”框中写入C1Zplane，取消选中“复制堆栈”，然后单击“确定”仅复制选定的z平面图像。将打开一个名为 C1Zplane 的窗口，显示选定的 z 平面图像。
- 处理得到的 C1Z平面 图像以增强图像对比度。打开 进程>增强对比度：调整饱和像素（即此处使用 1%）并选中 归一化。然后，单击 “确定 ”应用对比度增强技术以获得对比度归一化的 C1Z平面 图像。
- 处理对比归一化的C1Z平面图像以分割上皮细胞。使用“过程>查找最大值”打开“查找最大值”菜单：首先，标记“预览点选择”以设置噪声容限，以便每个上皮细胞仅将一个最大值点归因于。标志排除边最大值。选择输出类型分割粒子，然后单击确定以获取C1Z平面分割，一个新的二进制掩码状图像，显示每个标记的最大点的每个分割粒子。
注意： 查找千里马 图像J算法用于分割单元格。在整个图像中检测到最大值点（像素强度峰值），可能对应于单元格。设置噪声阈值（噪声容限），并分析最大值点周围的连续区域以创建二进制掩模状图像，定义每个最大值点的每个分割粒子，从而定义每个单元。 - 处理 C1Z 平面分割图像以创建分割单元格的掩码。使用 “分析”>“分析粒子”：选择“显示 蒙版 ”和 “在边缘上排除”选项。调整要包含在掩罩中的分割粒子的面积范围（对应于 大小 参数），以排除错误分割的对象，例如细胞簇和细胞分数。要对错误分割对象的区域进行评分，请使用工具栏中的魔杖追踪工具：使用魔 杖 选择粒子，然后打开 “分析> 测量”以测量错误对象的区域。设置 大小 间隔（建议范围 250-1700 像素2），然后单击 确定 以获取 MaskofC1Zplane分段二进制 掩码。
- 默认情况下， MaskOfC1ZplaneSegmented 二进制掩码具有反相LUT。使用 LUT > 反相工具栏中的 LUT 。
- 处理 MaskOfC1Zplane分段二进制 掩码以纠正细胞分割：
- 在步骤4.2.3.2中获得的阈值对比归一化 C1Z平面 图像。使用 图像>调整>阈值：选中 深色背景。设置 默认 自动阈值设置。选择红色选项并调整最小截止值（上部栏），直到单元格完全显示为 红色 ，留下深色背景（此协议中应用的阈值= 8，000）。然后，单击“ 应用 ”将对比度归一化的 C1Zplane 图像转换为二进制图像，其中单元格为白色，背景为黑色。
- 在 MaskOfC1ZplaneSegmented 二进制掩码中更正单元格分割。使用 过程>图像计算器：选择 MaskOfC1Zplane分割 为图像 1，在下拉列表中选择操作 AND ，然后选择阈值对比度归一化 C1Z平面 作为 图像2。单击 确定。输出图像由 ImageJ 自动命名为 C1Zplane 分割掩码的结果。
- C1Z平面掩模的处理结果 分割以将每个单段单元格标记为感兴趣区域 （ROI）。使用 “分析”>“分析粒子”。按照步骤 4.2.3.4 调整 大小 ，然后选择选项不 显示任何内容。选中 添加到 管理器以将所有粒子（分割单元格）添加到 ROI 管理器工具。此外，选中在 边缘上排除。单击 确定。ROI 管理器菜单 将显示所有粒子（分段单元格）的列表，定义为 ROI，并用其各自的 y 和 x 坐标唯一标记。
- 通过ROI管理器菜单将ROI数据另存为ROI-单元格-获取标题.zip方法是单击更多>保存。ROI-cells-Acquisition Title.zip将在步骤4.2.4.6中打开以进行单细胞分析。
- 处理 C2-收购标题 窗口（此处为红色通道），对应于细胞内 Salmonellae，以测量感染细胞的数量和细胞内液泡负荷。
- 从红色通道（C2-）中减去绿色通道（C3-），以去除胞质超复制沙门氏菌的失焦像素。
- 使用进程>图像计算器。选择“C2-获取标题”作为“图像1”，在下拉列表中选择“减去”操作，然后选择“C3-获取标题”作为“图像2”。检查创建新窗口，然后单击确定。
- 通过单击“过程堆栈”中的“是”对整个 z 堆栈应用减法？窗。输出窗口在脚本中名为 ResultsOfC2Acquisition Title。
- 处理 结果C2采集 标题以减少随机噪声。
- 通过单击“复制”图像菜单>复制来复制“C2Acquisition Title”窗口的结果。选中“重复堆栈”，然后按“确定”以获取“C2Acquisition Title1”窗口的结果。
- 通过“处理>高斯模糊过滤器”将高斯模糊应用于“C2Acquisition Title1”窗口的结果>。将 Sigma 值保留为 2 或对其进行自定义（即，此处使用了 Sigma：4）。单击“确定”，并通过单击“处理堆栈”窗口中的“是”，将高斯模糊应用于整个 z 堆栈。
- 通过单击“过程>图像计算器”，将高斯滤波结果C2Acquisition Title1减去结果C2Acquisition Title。 选择“结果C2Acquisition Title”作为“图像1”，在下拉列表中选择“运算减去”，然后选择“结果C2Acquisition Title1”作为“图像2”。单击确定。通过单击“处理堆栈？”窗口中的“是”，对整个z堆栈应用减法，以获得由ImageJ自动命名为C2-Acquisition Title结果结果的窗口。
- 处理 C2-获取标题的结果，以将 沙门氏菌 与背景分开。使用 图像>调整>阈值：选中 深色背景 并设置 Otsu 自动阈值。调整最小截止值（上条），直到 沙门氏菌 完全显示为红色，留下深色背景（此协议中应用的阈值= 100）。单击“ 应用 ”，将打开“ 转换为二进制 ”窗口：选中 “黑色背景”，然后单击“ 确定”。完整的 z 堆栈现在已转换为二进制图像。
- 在步骤 4.2.4.3 的 C2-Acquisition Title 二进制窗口的结果中选择与空泡沙门氏 菌焦点平面对应的中间 Z 平面：图像> 堆叠>设置切片 并写入所选 z 平面的编号（例如，此处使用 z：4/8）。单击 确定。
- 设置要记录的每个ROI（单元格）的测量值。使用分析>设置测量：选中面积，对应于每个ROI的总面积。选中面积分数和限制为阈值以仅记录每个ROI的阈值像素（细胞内沙门氏菌）所占据的面积分数。选中“显示标签”，在结果表中使用图像标题、通道、z 平面和 x-y 坐标标记每个 ROI。
- 处理细胞内沙门氏菌的选定z平面，以记录每个细胞（ROI）的标签，面积和沙门氏菌占据的面积百分比：打开ROI-cells-Acquisition Title.zip文件，保存在步骤4.2.3.8中，按文件>打开并单击ROI管理器菜单中的测量。输出是一个报告所选测量值的表格。
- 使用结果窗口中的文件 >另存为 保存结果表。
- 在电子表格中打开 结果表 ：每个ROI指示标签面积和细胞内 沙门氏菌 占据的面积百分比，对应于用x和y坐标唯一标识的轮廓细胞。
- 测量对应于ROI的感染细胞数量，显示阈值像素占据的%面积>0，对应于 沙门氏菌 （即，此处认为%面积>0.2%来识别受感染的细胞）。然后，计算感染细胞占总细胞的百分比。
- 通过计算所有感染细胞的空泡沙门氏菌占据的平均面积百分比来测量沙门氏菌/细胞的液泡负荷。
- 从红色通道（C2-）中减去绿色通道（C3-），以去除胞质超复制沙门氏菌的失焦像素。
- 处理绿色通道（C3-Acquisition Title）以测量显示胞质超复制 沙门氏菌的细胞数量。按照步骤 4.2.4.2 到 4.2.4.9 进行操作，但进行了一些修改。
- 在上部z平面上工作（此处为z：7 / 8），因为显示胞质超复制 沙门氏菌 的细胞从单层突出;因此，与没有超复制 沙门氏菌的细胞相比，它们专注于不同的平面。
- 通过评分细胞 （ROI） 测量含有胞质超复制沙门氏菌（绿色）的细胞数量，这些细胞 （ROI） 显示沙门氏菌占据的面积百分比（例如，被认为> 20% 的 %面积用于识别含有胞质超复制沙门氏菌的细胞）。然后，计算含有胞质超复制沙门氏菌的细胞在步骤4.2.4.9中评分的感染细胞总数的百分比。
Representative Results
沙门氏菌菌株感染上皮细胞
该协议旨在分析上皮细胞内沙门氏菌的细胞侵袭和胞质复制（图1A）与液泡负荷（图1B）。该方案通过使用以下三种沙门氏菌菌株S进行了验证。鼠伤寒 SL1344 参考菌株（S.Tm），S.德比ER1175野生型（S.德比wt）和S的同基因突变体。德比ER1175没有sipA基因（S.德比 ΔsipA）。S. Derby ER1175菌株是从猪中分离出来的，属于IZSLER沙门氏菌分离株监测收集。选择菌株是为了代表协议涵盖的表型多样性。特别是，选择这些菌株是因为已知它们在上皮细胞内的行为在侵袭或复制方面存在差异9;因此，它们是测试该方案是否允许定量区分细胞内沙门氏菌表型差异的有价值的对照。特别是，S.Tm 和 S.德比 wt 被包括在内，因为我们之前已经证明 S.Tm比S具有更高的侵袭和细胞内复制效率。德比郡wt 9 而 S.Derby ΔsipA作为超复制受损菌株被添加，因为毒力效应子SipA在超复制10，11的发作中起着至关重要的作用。之前曾报道过 S.Tm，胞质复制在侵袭后4小时开始，然后胞质群体迅速超复制以在8小时11，12充满上皮细胞。始终如一地，8 h长感染也适合观察和量化S的胞质超复制表型。德比 wt 和 s.德比 ΔsipA.
面积分析
步骤4.1中的面积分析提供了沙门氏菌上皮细胞总体定植的测量（感染率），以及超复制（超复制率）的测量。在图2所示的面积分析工作流程中，减少了随机噪声，然后独立分割和处理通道。为每个通道设置一个阈值，以便从区域测量中排除背景。然后，测量每个通道的阈值像素所占用的面积。面积分析的输出是一个表格，报告每个采集文件，上皮细胞核（蓝色通道）、表达细胞内 mCherry 的沙门氏菌（红色通道）和表达 GFP（绿色通道）的胞质超复制沙门氏菌所占据区域的扩展以及 mCherry 一起。感染率的计算方法是将表达mCherry的沙门氏菌所占面积除以宿主细胞核所占面积。试验菌株的结果表明，S.与两种S相比，Tm显示出显着更高的感染率。德比菌株，正如预期的那样（图3A）。因此，这些结果证明了面积分析在检测沙门氏菌菌株定植上皮细胞的能力差异方面的功效。沙门氏菌超复制率是通过将表达GFP的沙门氏菌所占据的面积除以表达mCherry的细胞内沙门氏菌所占据的面积来测量的。与 SipA 在确定超复制方面的作用一致，S 的超复制率显著降低。与S相比，测量了德比ΔsipA应变。德比wt，（图3B）。S之间未观察到超复制差异。Tm 和 S.德比 wt.总体而言，面积分析有效地揭示了所测定菌株中不同的超复制水平。
单细胞分析
单细胞分析允许以单细胞分辨率量化 沙门氏菌 侵袭和液泡负荷与上皮细胞内的胞质复制。如步骤4.2所述，对于每个采集文件，蓝色、红色和绿色通道被独立处理（图4）。具体地，在步骤4.2.3中处理对应于上皮细胞的蓝色通道以获得细胞分割。然后，将分割的像元添加到感兴趣区域 （ROI） 管理器中，以获得 ROI 列表，对应于所有唯一标记有 y-x 坐标的分割像元。为了去除表达GFP-的超复制 沙门氏菌的失焦像素，从红色通道的像素中减去绿色通道的像素。单细胞分析报告的输出表，对于每个ROI，仅表达mCherry组成型报告基因或GFP细胞质反应报告基因的 沙门氏菌 所占ROI面积的面积和百分比。在步骤4.2.4中处理仅表达mCherry的 沙门氏菌 所占据的细胞面积的百分比，以计算感染细胞的百分比和平均液泡负荷（图5A）。对液泡负荷的分析表明， S.德比应变产生的平均液泡负荷明显低于 S。Tm（图5B）。相反，在 S中仅观察到感染细胞百分比的轻微且不显着的降低。德比菌株与 S相比。Tm（图5A）。在步骤4.2.5中处理表达GFP的 沙门氏菌 所占据的细胞面积百分比，以获得超复制率。 S之间没有观察到差异。Tm 和 S.德比郡，而 S.Derby ΔsipA 显示出超复制的显着降低，这与面积分析的结果（图5C）和SipA在诱导超复制中的作用一致。
图1：沙门氏菌胞质超复制和空泡负荷。显示了（A）沙门氏菌超复制和（B）在高放大倍率（40x）下获得的液泡负荷的代表性图像。图B显示了含有超复制沙门氏菌（z：7/8）的细胞与非超复制沙门氏菌（z：4/8）的细胞的不同焦点平面。白色比例尺为 10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：区域分析的工作流程。显示了代表性的低放大倍率（10x）采集INT407细胞的工作流程，该细胞感染了携带pCHAR-Duo质粒（MOI 100）的沙门氏菌8小时。首先，减少随机噪声，然后将通道分成C1、C2和C3并独立处理。为每个通道设置一个阈值，以便从测量区域中排除背景。然后，测量每个通道仅对应于C1中的细胞核，C2中的所有细胞内沙门氏菌和C3中的细胞溶质沙门氏菌的阈值像素所占据的面积。这里分析的图像是在10倍放大镜下通过拼接融合在一起的四块瓷砖的结果。白色比例尺为 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：面积分析的结果。 显示了面积分析的结果。（A）感染率的计算方法是将代表所有细胞内细菌的表达mCherry的 沙门氏 菌（C2通道）所占据的面积除以宿主细胞核（C1通道）所占据的面积。（B）通过将表达GFP的 沙门氏菌 （C3通道）所占据的面积（仅代表胞质超复制细菌）除以所有表达细胞内mCherry的 沙门氏菌所占据的面积来测量超复制率。每个点代表一个复制品。该分析在三个生物学重复上进行，每个重复一式三份进行测试。黑线表示平均值。使用双尾 t检验计算显著性，并报告 p 值。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：单细胞分析的工作流程。 显示了用携带pCHAR-Duo质粒（MOI 100）的 沙门氏菌 感染8小时的INT407细胞的代表性高倍率采集（40x）的单细胞分析工作流程。首先，通道被分成C1、C2和C3并独立处理。处理对应于上皮细胞的蓝色通道（C1）以获得细胞分割，然后将每个分割的细胞定义为用y-x坐标唯一标记的感兴趣区域（ROI）。红色通道（C2）通过减去绿色通道（C3）去除离焦细胞质超复制 沙门氏菌进行处理，留下所有仅表达mCherry的液泡沙 门氏 菌，然后减少随机噪声，并将阈值设置为从测量中排除背景。最后，测量每个ROI的空泡 沙门氏菌 所占面积。绿色通道（C3）对应于表达总胞质GFP的 沙门氏菌，处理方式类似。这里分析的图像是通过拼接将 16 块瓷砖融合在一起的结果。白色比例尺为 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图5：单细胞分析的结果。 显示了单细胞分析的结果。（A）感染细胞的百分比是通过将仅表达mCherry的 沙门氏菌所占面积百分比的细胞数量除以0.2>乘以细胞总数而获得的。（B）通过计算感染细胞中仅表达mCherry的 沙门氏菌 所占的平均面积百分比获得平均液泡负荷。（C）超复制率的计算方法是将表达GFP的 沙门氏菌所占面积百分比的细胞数量≥20%除以感染细胞的总数。报告了三份一式三份测试的三到四个生物学重复的数据。条形表示测量的标准误差。使用双尾 t检验计算显著性，并报告 p 值。 请点击此处查看此图的大图。
补充文件 1：面积分析脚本。请点击此处下载此文件。
补充文件2：单细胞分析脚本。请点击此处下载此文件。
Discussion
沙门氏菌定植在肠上皮细胞中的方式会影响感染结果。侵袭后，胞质过度复制诱导肠道炎症3，而空泡复制可导致全身扩散4。沙门氏菌菌株在肠道上皮细胞内侵入和复制的能力可能有所不同9.事实上，沙门氏菌是一种极其多样化的属，由 2，500 多种血清型组成，它们具有不同的致病能力。此外，沙门氏菌是欧盟最常报告的食源性暴发原因，表明在人群中大量传播1。因此，提供可靠的高通量方法来定量沙门氏菌的细胞内表型对于评估大量沙门氏菌菌株之间的毒力差异并最终允许对该病原体进行准确和菌株特异性的风险评估非常重要。
这里描述的协议以快速和自动化的方式测量上皮细胞内沙门氏菌的行为。上皮细胞的感染在96孔成像微孔板中进行，并使用自动荧光显微镜进行图像采集，使该方案适用于高通量应用。该协议利用了pCHAR-Duo质粒，它允许通过两个荧光报告基因的差异表达来区分液泡和胞质沙门氏菌5。沙门氏菌的细胞内表型通常通过手动评分进行分析，这是一个耗时的过程，不适合分析大量菌株和每种菌株的细胞培养物，并且容易出现操作员错误和操作员间差异。为了克服这些限制，开发了两种互补和自动图像分析，即面积分析和单细胞分析。ImageJ是一个免费提供的软件，用于开发这两种分析。为了加快协议执行，提供了用于批量分析多个采集文件的 ImageJ 脚本，无需操作员干预。
面积分析旨在通过测量上皮细胞核和表达mCherry或mCherry与GFP一起的 沙门氏菌 特异性占据的区域，在几个步骤中量化上皮细胞的总体定植（感染率）和超复制水平（超复制率）。 面积分析应用于在低放大倍率下采集的图像，其中空泡和超复制 沙门氏菌 在同一z平面上聚焦，并且每个微观视野显示大量上皮细胞，从而减小了采集文件的大小和数量。面积分析允许对大量样品进行自动化、快速和计算轻量级的分析，使其适用于筛选实验等高通量分析。
单细胞分析旨在以单细胞分辨率量化上皮细胞内的沙门氏菌表型，通过细胞分割和测量细胞面积以及液泡和胞质超复制沙门氏菌所占面积的百分比获得。通过面积分析表征的上皮细胞的整体定植在这里分为三个定量参数，感染细胞的百分比，平均空泡负荷和超复制率，允许评估和量化每个表型对整体定植的贡献，因此，补充面积分析的结果。单细胞分析提供的更多细节是以较慢的图像采集和分析为代价的。事实上，为了实现单细胞分辨率，图像采集是在高放大倍率下进行的。这意味着需要多个z平面来观察聚焦的液泡和胞质沙门氏菌，并且每个样品需要采集大量场才能对大量上皮细胞进行评分，从而与面积分析相比延长采集时间。此外，对多个大型采集文件的分析对计算要求很高，因此需要合适的工作站（使用了 6 核 32 GB RAM 工作站）。因此，单细胞分析可以在有限的通量条件下单独使用，也可以作为与面积分析耦合的二级方法，以更深入地了解上皮细胞内的沙门氏菌表型。
使用S验证了两种互补分析的有效性。Tm， S.德比·选择Derby ΔsipA是因为已知它们在上皮细胞内的行为在侵袭或复制方面存在差异9，10。面积和单细胞分析的结果表明，该方案允许根据测试菌株的特征定量区分细胞内沙门氏菌表型的差异。此外，这些结果表明，单细胞分析可以量化每种细胞内表型（侵袭、液泡负荷和胞质复制）对使用面积分析评分的总体定植的贡献。
该协议在这里应用于研究不同沙门氏菌菌株的体外致病性，但它可以有其他应用，例如研究随机突变体以鉴定参与上皮细胞内侵袭和/或复制的基因。此外，该方案可以适用于分析沙门氏菌在INT407细胞以外的其他细胞系内的行为。它也可以作为开发类似方法的起点，用于研究其他细胞内微生物的细胞 - 病原体相互作用。
Disclosures
提交人声明他们没有竞争利益。
Acknowledgments
作者要感谢Olivia Steele-Mortimer博士分享pCHAR-Duo质粒。这项工作由意大利卫生部资助，拨款PRC2019014和PRC2021004。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well imaging microplate | Eppendorf | 30741030 | Cell culture and infection |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | 59349 | Bacteria culture |
| Axio observer inverted microscope | ZEISS | Automated fluorescence microscope | |
| Axiocam 305 Mono | ZEISS | Microscope Camera | |
| Breathable sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z380059 | Infection assay |
| Colibrì 5/7 | ZEISS | Led light source | |
| Collagen I rat tail | Life Technologies | A1048301 | Collagen coating |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Cell staining |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10099-141 | Cell culture and infection |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G12664 | Infection assay |
| Glacial acetic acid | Carlo Erba | 401391 | Collagen coating |
| HCS CellMask Blue | Invitrogen | H32720 | Cell staining |
| ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) | Image processing software | |
| Minimum Essential Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | M5650-500ML | Cell culture and infection |
| Paraformaldehyde 4% | Invitrogen | FB002 | Cell fixation |
| Potassium chloride | PanReac AppliChem | 131494.1211 | PBS preparation |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 60220 | PBS preparation |
| Sodium Chloride | PanReac AppliChem | 131659.1214 | Bacteria culture and PBS preparation |
| Sodium phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | PBS preparation |
| Tissue Culture Flask 25 cm2 plug seal screw cap | Euroclone | ET7025 | Cell culture |
| Triton X-100 | Biorad | 1610407 | Cell staining |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Cell culture and infection |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | Bacteria culture |
| Yeast extract | Biolife | 4122202 | Bacteria culture |
References
- European Food Safety Authority & European Centre for Disease Prevention and Control. The European Union One Health 2020 Zoonoses Report. EFSA Journal. 19 (12), 6971 (2021).
- Fattinger, S. A., Sellin, M. E., Hardt, W. D. Salmonella effector driven invasion of the gut epithelium: breaking in and setting the house on fire. Current Opinion in Microbiology. 64, 9-18 (2021).
- Knodler, L. A., et al. Dissemination of invasive Salmonella via bacterial-induced extrusion of mucosal epithelia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17733-17738 (2010).
- Fulde, M., et al. Salmonella SPI2 T3SS mediates transcytosis in polarized enterocytes in vivo. Cell Host & Microbe. , (2019).
- Cooper, K. G., Chong, A., Starr, T., Finn, C. E., Steele-Mortimer, O. Predictable, tunable protein production in Salmonella for studying host-pathogen interactions. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 475 (2017).
- Klein, J. A., Grenz, J. R., Slauch, J. M., Knodler, L. A. Controlled activity of the Salmonella invasion-associated injectisome reveals its intracellular role in the cytosolic population. mBio. 8 (6), 01931 (2017).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ibarra, J. A., et al. Induction of Salmonella pathogenicity island 1 under different growth conditions can affect Salmonella-host cell interactions in vitro. Microbiology. 156 (4), 1120-1133 (2010).
- Tambassi, M., et al. Mutation of hilD in a Salmonella Derby lineage linked to swine adaptation and reduced risk to human health. Scientific Reports. 10 (1), 21539 (2020).
- Finn, C. E., Chong, A., Cooper, K. G., Starr, T., Steele-Mortimer, O. A second wave of Salmonella T3SS1 activity prolongs the lifespan of infected epithelial cells. PLoS Pathogens. 13 (4), 1006354 (2017).
- Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells. PLoS One. 9 (1), 84681 (2014).
- Chong, A., Starr, T., Finn, C. E., Steele-Mortimer, O. A role for the Salmonella Type III Secretion System 1 in bacterial adaptation to the cytosol of epithelial cells. Molecular Microbiology. 112 (4), 1270-1283 (2019).
