Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Automatiseret analyse af intracellulære fænotyper af salmonella ved hjælp af ImageJ

Published: August 9, 2022 doi: 10.3791/64263
Automatic Translation
1, 1, 1
1Risk Analysis and Genomic Epidemiology Unit, Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia-Romagna (IZSLER)

Summary

Salmonella invaderer og replikerer inde i tarmepitelceller både i salmonellaspecifikke vakuoler og fri i cytosolen (hyperreplikation). En høj-gennemstrømning fluorescens mikroskopi-baseret protokol er beskrevet her for at kvantificere de intracellulære fænotyper af Salmonella ved to komplementære billedanalyser gennem ImageJ, der når enkeltcelleopløsning og scoring.

Abstract

Salmonella er et enterisk patogen, der er i stand til at invadere tarmepitelet og replikere i enterocytter, både inde i salmonellaspecifikke vakuoler og fri i cytosolen (cytosolisk hyperreplikation). Disse forskellige fænotyper af intracellulær replikation driver til forskellige veje for patogenese, dvs. cytosolisk hyperreplikation inducerer inflammatorisk celledød og ekstrudering i tarmens lumen, mens vakuolær replikation fører til transepitelpenetration og systemisk spredning. Der blev gjort en betydelig indsats for at skabe mikroskopiværktøjer til at studere salmonellas opførsel inde i invaderede celler, såsom pCHAR-Duo fluorescensreporterplasmid, der tillader diskrimination mellem vakuolære og cytosoliske bakterier ved differentiel ekspression af mCherry og GFP. Imidlertid scores intracellulære fænotyper ofte manuelt, en tidskrævende procedure, der begrænser analysen til et lille antal prøver og celler. For at overvinde disse begrænsninger blev der udviklet to komplementære og automatiserede billedanalyser ved hjælp af ImageJ, en frit tilgængelig billedanalysesoftware. I protokollen med høj kapacitet blev epitelceller inficeret med Salmonella, der bar pCHAR-Duo ved hjælp af 96-brøndplader. Billeddannelse blev udført ved hjælp af et automatiseret fluorescensmikroskop. Derefter blev to billedanalysemetoder anvendt til at måle salmonellas intracellulære opførsel på forskellige detaljeringsniveauer. Den første metode måler den samlede intracellulære bakteriebelastning og omfanget af cytosolisk hyperreplikation. Det er hurtigt og tillader scoring af et stort antal celler og prøver, hvilket gør det velegnet til assays med høj kapacitet såsom screeningseksperimenter. Den anden metode udfører enkeltcelleanalyse for at bestemme procentdelen af inficerede celler, den gennemsnitlige vakuolære belastning af Salmonella og den cytosoliske hyperreplikationshastighed, der giver større detaljer om Salmonella-adfærd inde i epitelceller. Protokollerne kan udføres af specielt designede ImageJ-scripts til automatisk at køre batchanalyser af de vigtigste trin i Salmonella-enterocyt-interaktion.

Introduction

Salmonella er det hyppigst rapporterede bakteriemiddel, der forårsager udbrud af fødevarebårne sygdomme i Den Europæiske Union1. Den primære patologiske manifestation af Salmonella-infektion er enteritis, som er resultatet af patogenadfærden i tarmen efter indtagelse og den deraf følgende lokale inflammatoriske respons2. Salmonella kan dog også spredes til ekstra-tarmsteder og forårsage systemisk infektion, især hos immunkompromitterede individer. Typen af interaktion mellem Salmonella og tarmepitelet betinger resultatet af infektionen. En gang i tarmens lumen invaderer og replikerer Salmonella inde i tarmepitelceller. På intracellulært niveau kan Salmonella præsentere to forskellige replikationsfænotyper, den cytosoliske hyperreplikation og den intravacuolære langsomme replikation inden for salmonellaholdige vakuoler (SCV'er). Den cytosoliske hyperreplikation inducerer inflammatorisk værtscelledød og Salmonella-ekstrudering i tarmens lumen3; den vakuolære replikation fører til en transepitelpenetration og systemisk spredning4. Derfor påvirker omfanget af invasion og vakuolær vs. cytosolisk replikation infektionsforløbet.

Slægten Salmonella er meget forskelligartet, herunder tusindvis af serotyper med forskellige værtsområder og evner til at forårsage sygdom. For eksempel S. Typhimurium er defineret som en generalist serovar, fordi det inficerer flere uafhængige værter, og repræsenterer en af hovedårsagerne til human salmonellose. Anderledes, S. Derby betragtes som en svinetilpasset serovar, da den for det meste er isoleret fra svinet, men det rapporteres også i top fem af serovarerne, der er ansvarlige for human infektion1. Imidlertid er viden om den bakterielle adfærd inde i epitelcellerne i det væsentlige begrænset til undersøgelsen af nogle få referencestammer, som S. Typhimurium SL1344, der ikke repræsenterer den store naturlige mangfoldighed af Salmonella patogenicitet. Karakterisering af samspillet mellem forskellige stammer af Salmonella med epitelceller ville bidrage til at forstå deres forskellige patogenicitet. Af denne grund blev der udviklet en mikroskopibaseret protokol med høj kapacitet til at analysere den intracellulære opførsel af et stort antal stammer på en hurtig og stort set automatiseret måde. I denne protokol blev infektion af epitelceller udført i 96-brønds billeddannelsesplader, og billedoptagelse blev foretaget ved hjælp af et automatiseret fluorescensmikroskop. pCHAR-Duo-plasmidet blev brugt til at observere invasions- og replikationsfænotyperne af Salmonella inde i epitelceller gennem fluorescerende mikroskopi5. Dette plasmid bærer genet, der koder for den røde fluorescerende reporter mCherry, konstitutivt udtrykt af alle de transformerede bakterieceller, og genet, der koder for den grønne fluorescerende reporter GFP, hvis ekspression aktiveres af glucose-6-phosphat, der udelukkende er til stede i cytosolen af eukaryote celler og fraværende i SCV'er. Derfor tillader plasmidet diskrimination mellem vakuolære og cytosoliske bakterier ved differentiel ekspression af mCherry- og GFP-journalister.

De vakuolære og cytosoliske bakterier på mikroskopibilleder kvantificeres almindeligvis ved manuel scoring6, men dette er en tidskrævende metode, der begrænser analysen til et lille antal prøver. Derfor blev to komplementære og automatiserede billedanalyser udviklet områdeanalyse og enkeltcelleanalyse ved hjælp af ImageJ7, en frit tilgængelig billedanalysesoftware. Områdeanalysen måler den samlede intracellulære bakteriebelastning og omfanget af cytosolisk hyperreplikation ved hjælp af data fra områder optaget af epitelceller, røde og grønne salmonellaer i hvert erhvervet mikroskopibillede. Denne metode kan anvendes på billeder erhvervet ved lav forstørrelse; Derfor giver det mulighed for at score et stort antal epitelceller med få billeder, hvilket forkorter erhvervelsestiden. Enkeltcelleanalysen bruger cellesegmentering til at bestemme procentdelen af inficerede celler, den gennemsnitlige vakuolære belastning og procentdelen af inficerede celler, der gennemgår cytosolisk hyperreplikation med enkeltcelleopløsning.

I denne protokol er alle trin i billedanalysen beskrevet detaljeret, der skal udføres manuelt, men den samme analyse kan automatiseres af vores specielt designede ImageJ-scripts. Disse scripts giver også mulighed for at køre batchanalyser for automatisk at analysere flere billeder og dermed fremskynde udførelsen af metoden.

Protocol

1. Infektion af epitelceller med Salmonella , der bærer pCHAR-Duo reporter plasmid

BEMÆRK: En flerkanalspipette anbefales.

  1. Coat 96-brønd billedplader med sorte vægge og flad glasbund med kollagen lige før brug.
    1. Fortynd iseddike (17. 4 M) i sterilt demineraliseret vand under en kemisk hætte for at opnå en 20 mM eddikesyreopløsning. Under sterile forhold filtreres opløsningen gennem et sprøjtefilter med 0,2 μm porestørrelse. Lad opløsningen stå i en 0-4 °C rist i 5 min.
    2. 3 mg/ml kollagenbestand fortyndes til 50 μg/ml i forkølet 20 mM eddikesyreopløsning. Bland ved at vende 10 gange, og dispenser derefter 30 μL kollagenopløsning pr. brønd (5 μg kollagen/cm2), og opbevar opløsningen i et 0-4 °C stativ for at undgå kollagengelering.
    3. Sørg for, at brøndbunden er helt dækket af kollagen, og lad derefter pladen være under laminær strømning i 1 time ved stuetemperatur (RT).
    4. Fjern forsigtigt opløsningen og udfør tre vaske med 30 μL fosfatbufferet saltvand (PBS). Brug en flerkanals 100 μL eller 50 μL pipette for at undgå kollagenløsrivelse.
  2. Kultur INT407 epitelceller i kollagenbelagte billeddannelsesplader 20-24 timer før infektion.
    1. Rutinemæssigt dyrkes INT407-celler i 25 cm 2-kolber i Minimum Essential Medium med 10% føtalt bovint serum (FBS), herefter defineret kulturmedium (CM), suppleret med penicillin 100 U / ml og streptomycin 100 μg / ml (pen / strep).
    2. Der vaskes to gange INT407-kolber med 5 ml PBS, og cellerne afmonteres derefter med 1 ml trypsin-EDTA-opløsning i 3-5 minutter ved 37 °C i befugtet 5 % CO2 -atmosfære 20-24 timer før infektion. Tæl cellerne og forbered en 3 x 105 celler / ml suspension i CM.
    3. Dispenser 100 μL cellesuspension/brønd i kollagenbelagte billeddannelsesplader for at opnå 100% sammenløb. Der inkuberes ved 37 °C i befugtet 5 % CO2 -atmosfære i 1 time for at lette celleadhæsionen. Derefter tilsættes 100 μL CM og inkuberes ved 37 °C i befugtet 5% CO2 -atmosfære i 20-24 timer indtil infektionen (trin 1.4).
      BEMÆRK: For at afbilde intracellulære bakterier transformeres salmonellastammer med pCHAR-Duo reporterplasmid, der blev venligt leveret af Dr. Olivia Steele-Mortimer. De testede stammer her blev udvalgt til at repræsentere fænotypediversiteten, der er omfattet af protokollen, og validere billedanalyserne i afsnit 4. Se de repræsentative resultater for flere detaljer om de stammer, der anvendes i denne undersøgelse.
  3. Forbered stationære fasekulturer af Salmonella-stammer , der bærer pCHAR-Duo reporterplasmidet.
    1. Prøve Salmonella glycerolbestanden med spidsen af en 10 μL pipette og poder den i 1 ml Luria Bertani bouillon (10 g tryptone, 5 g gærekstrakt og 10 g natriumchlorid pr. Liter) suppleret med ampicillin 100 μg / ml.
    2. Inokulummet inkuberes statisk ved 37 °C i 20 timer før infektion for at nå den stationære vækstfase, svarende til ~1 x 109 kolonidannende enheder (CFU)/ml8.
  4. Inficere INT407 epitelceller med Salmonella.
    BEMÆRK: Infektioner udføres i tre eksemplarer.
    1. Int407-celler vaskes forsigtigt med 200 μL PBS/brønd.
    2. Forbered Salmonella inokulum ved at fortynde bakterier natten over kultur i CM for at opnå det ønskede antal CFU'er pr. epitelcelle, defineret som infektionsmultiplikation (MOI). Her blev MOI 100 brugt.
    3. Der podes 200 μL/brønd, og pladen dækkes derefter med en åndbar tætningsmembran, og der inkuberes ved 37 °C i befugtet 5 % CO2 -atmosfære i 1 time. Podning betragtes som tid nul af infektionen.
    4. Inokulummet fjernes og vaskes forsigtigt med 200 μL PBS/brønd, og tilsæt derefter 200 μL CM med gentamicin 100 μg/ml pr. brønd. Pladen dækkes med en åndbar tætningsmembran, og derefter inkuberes ved 37 °C i befugtet 5 % CO2 -atmosfære i 1 time.
    5. Fjern CM med gentamicin 100 μg/ml og vask forsigtigt med 200 μL PBS/brønd. Der tilsættes 200 μL CM med gentamicin 10 μg/ml pr. brønd, pladen dækkes med en åndbar tætningsmembran, og derefter inkuberes ved 37 °C i befugtet 5 % CO2 -atmosfære i 8 timer.

2. Prøvefiksering og epitelcellefarvning

BEMÆRK: Hold prøverne beskyttet mod direkte lyseksponering. Volumener er angivet for brønde af en 96-brøndplade. Volumenoptimering er påkrævet for forskellige cellekulturplader eller understøtninger.

  1. Ved 8 timer efter infektion fjernes CM og vaskes forsigtigt tre gange med 200 μL/brønd PBS. PBS fjernes ved at vende pladen på absorberende papir; undgå aspirering.
  2. Fix de inficerede monolag med 100 μL/brønd paraformaldehyd (PFA) 4% i PBS i 20 minutter ved RT. Fjern PFA 4% og vask tre gange med 200 μL/brønd PBS. Pladen kan opbevares i højst 16-24 timer ved 4 °C. Fortsæt med næste trin.
  3. Pletteepitelceller.
    BEMÆRK: DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindol) DNA-plet (trin 2.3.1) bruges til områdeanalysen til kun at plette kerner, og High Content Screening (HCS) plet (trin 2.3.2) bruges til enkeltcelleanalysen til at plette hele epitelcellen. Andre cellulære pletter kan bruges, men optimering af billedoptagelse og analyse er påkrævet.
    1. Arealanalyse: Der udleveres 100 μL/brønd DAPI (300 nM opløsning i PBS) og inkuberes 5 minutter ved RT beskyttet mod lys.
    2. Enkeltcelleanalyse: permeabiliseres med 100 μL/brønd triton 0,1x i PBS i 15 minutter ved RT. Vask tre gange med PBS og dispenser 100 μL/brønd HCS-plet fortyndet 1:2000 i PBS. Inkuberes i 30 minutter ved RT beskyttet mod lys.
  4. Farvningsopløsningen fjernes, og der vaskes tre gange med 200 μL/brønd PBS. Tilføj 50 μL/brønd PBS til automatisk billedoptagelse.

3. Billedoptagelse med et automatiseret fluorescensmikroskop

BEMÆRK: Her anvendes lav forstørrelse (10x/0,3 NA, 1 μm/pixelmålsætning) i trin 3.1.1 til arealanalyse og høj forstørrelse (40x/0,75 NA, 0,255 μm/pixelmålsætning) i trin 3.1.2 til enkeltcelleanalysen i anskaffelsesprotokollen. Andre forstørrelser kan bruges, men optimering af billedoptagelse og analyse er påkrævet. Hvis det er tilladt af det tilgængelige mikroskop, skal du hente billeder som fliseområder (TR'er), en "mosaik" af sammenhængende felter kaldet fliser, for at optage store prøveområder. Indstil autofokus i midten af en TR i stedet for at indstille en for hver flise for at reducere prøveeksponeringen under autofokusproceduren.

  1. Brug software autofokus i cellefarvningskanalen (blå kanal til HCS-plet og DAPI-nuklear plet) som reference z-position. Anskaf billeder i cellefarvningskanal (465 nm, celler eller kerner) og i pCHAR-Duo reporterkanaler mCherry (610 nm, intracellulære salmonella) og GFP (509 nm, cytosolisk hyperreplikerende salmonella).
    1. Områdeanalyse: Billede ≥104 celler/teknisk replikat (dvs. mindst tre TR'er med fire fliser/brønd svarende til en teknisk replikat anbefales) ved 10x forstørrelse.
      BEMÆRK: Et enkelt z-plan er tilstrækkeligt til at afbilde både celler, der indeholder vakuolære og celler, der indeholder cytosoliske hyperreplikerende salmonellaer ved 10x forstørrelse.
    2. Enkeltcelleanalyse: Billede ≥1.000 celler/teknisk replikat (dvs. mindst to TR'er med 16 fliser/brønd svarende til en teknisk replikat anbefales) ved 40x forstørrelse. Flere z-planer er nødvendige for at afbilde både celler, der indeholder vakuolære celler, og celler, der indeholder cytosolisk hyperreplikerende salmonella. Definer den optimale z-stak (3,85 μm z-stak med 0,55 μm interval for at opnå otte z-planer er indiceret til billede af INT407-celler inficeret med cytosolisk hyperreplikerende Salmonella ved 40x). Hvert z-plan identificeres herefter som n/8, med n mellem 1 (svarende til det nederste z-plan) og 8 (svarende til det øverste z-plan).
  2. Outputtet af hver anskaffelse er en fil med navnet Acquisition.czi, der indeholder billeder af alle felter, kanaler og z-planer. Hvis TR'er blev erhvervet, skal du smelte fliserne sammen for at få et samlet billede af hver TR ved at bruge en enkelt Acquisition.czi-fil som input til Stitching-metoden.

4. Billedanalyse ved hjælp af ImageJ

BEMÆRK: Trin 4.1 og trin 4.2 er specielt designet til eksperimentet og erhvervelsen beskrevet ovenfor. Andre eksperimentelle indstillinger kan kræve optimering af analysen. Analysen af en enkelt Acquisition.czi-fil er beskrevet. I forbindelse med batchanalysen finder du enkeltcelleanalysescriptet og områdeanalysescriptet som supplerende filer (supplerende fil 1 og supplerende fil 2). Etiketter, der bruges i scripts og ImageJ-kommandoer, er med fed skrift i afsnittene nedenfor.

  1. Arealanalyse
    1. Åbn filen Acquisition.czi i ImageJ, der er navngivet som AcquisitionTitle i scriptet: File > Open > AcquisitionTitle.czi. Et vindue, der viser alle kanalerne, åbnes. Kanalerne er angivet som c: 1-3/3 afhængigt af erhvervelsesordren. Her svarer c: 1/3 til blå (DAPI), c: 2/3 til mCherry (intracellulære salmonella ) og c: 3/3 til GFP (cytosolisk hyperreplikerende salmonella).
    2. Reducer tilfældig støj for at forberede billeder til arealmåling i trin 4.1.6 og 4.1.7.
      1. Dupliker vinduet AcquisitionTitle ved hjælp af Image > Duplicate > OK for at hente vinduet AcquisitionTitle1 .
      2. Anvend gaussisk sløring på AcquisitionTitle1 gennem Process > Filter > Gaussian Blur. Lad standard Sigma-værdien være 2, og klik på OK. Et processtak? -vindue åbnes, klik på Ja for at behandle alle kanalerne.
      3. Træk den gaussisk filtrerede AcquisitionTitle1 fra den oprindelige fil AcquisitionTitle by Process > Image Calculator: Vælg AcquisitionTitle som Image1, vælg handlingen Subtraher på rullelisten, og vælg derefter AcquisitionTitle1 som Image2. Klik på OK. Et processtak?-vindue åbnes. Klik på Ja for at behandle alle tre billeder (kanaler) for at få vinduet ResultsOfAcquisitionTitle.
    3. Opdel kanaler gennem Image > Color > Split Channels. Hvert kanalbillede vises nu i et separat vindue, automatisk navngivet af ImageJ som C-ResultsOfAcquisitionTitle. Her svarer C1-ResultsOfAcquisitionTitle til DAPI, C2-ResultsOfAcquisitionTitle til mCherry (intracellulære salmonella) og C3-ResultsOfAcquisitionTitle til GFP (cytosolisk hyperreplikerende Salmonella).
    4. Behandl C1-ResultsOfAcquisitionTitle-billedet for at måle det område, der er optaget af epitelcellekerner.
      1. Naviger til Process > Smooth for at homogenisere kernen, der vises som huller inde i kerneområdet.
      2. Tærskel C1-ResultsOfAcquisitionTitle-billedet for at ekskludere baggrunden ved hjælp af Image > Juster > tærskel: Marker Mørk baggrund , og vælg Rød på rullelisten. Indstil trekantens automatiske tærskel, og brug derefter den øverste skyder til at indstille minimumstærskelværdien, når kernerne vises røde, og baggrunden ser sort ud (Tærskel = 100, anvendt i denne protokol).
        BEMÆRK: De automatiske tærskler, der er beskrevet i trin 4.1.4.2, 4.1.7, 4.2.3.6.1 og 4.2.4.3, foreslås som en vejledning for brugeren til at definere den bedst passende tærskel for henholdsvis kerner / epitelceller og bakterier manuelt. Værdien af den automatiske tærskel tilsidesættes i scriptet af den definerede manuelle tærskel. Den definerede manuelle tærskel vil blive anvendt på hele batchanalysen.
    5. Vælg de målinger,der er af interesse, ved hjælp af Analysér > Indstil måling: Marker grænse til tærskel for at begrænse målingen til pixel med tærsklen. Kontrolområde, svarende til det samlede areal optaget af tærskelpixel (dvs. kerner i C1-ResultsOfAcquisitionTitle, intracellulære salmonellaer i C2-ResultsOfAcquisitionTitle, cytosolisk hyperreplikerende salmonella i C3- ResultsOfAcquisitionTitle). Marker Vis etiket for at registrere anskaffelsestitlen og kanalen for hvert billede i resultattabellen.
    6. Mål det område, der er optaget af kernerne, ved hjælp af Analyser > mål. Målinger registreres i resultattabellen, der åbnes automatisk.
    7. Process C2-ResultsOfAcquisitionTitle og C3-ResultsOfAcquisitionTitle til måling af det areal, der er optaget af henholdsvis intracellulære Salmonella og cytosolisk hyperreplikerende Salmonella. Følg trin 4.1.4-4.1.6 med nogle ændringer: Spring udjævningstrinnet over i trin 4.1.4.1, og brug Otsu-auto-tærskelværdien i stedet for trekanten i trin 4.1.4.2 som vejledning til at indstille minimumstærskelværdien (øverste skyder), når Salmonella ser rød ud, og baggrunden ser sort ud (Tærskel = 200 foreslået).
    8. Gem resultattabellen ved hjælp af fil> gem som > alle filer.
    9. Åbn resultattabellen i et regneark for at beregne arealforhold for hver analyseret AcquisitionTitle-fil :
      1. Beregn infektionsforholdet: divider det areal, der er optaget af total intracellulær salmonella (her rød kanal, C2-) med det område, der er optaget af epitelcellekerner (her DAPI, C1-).
      2. Beregn hyperreplikationsforholdet: divider det område, der er optaget af cytosolisk hyperreplikerende Salmonella (grøn kanal, C3-) med det område, der er optaget af total intracellulær Salmonella (rød kanal, C2-).
  2. Enkeltcelleanalyse
    1. Åbn filen Acquisition.czi i ImageJ, navngivet som AcquisitionTitle i scriptet: Menuen Filer > Åbn > Acquisition.czi. Et vindue, der viser billederne af alle kanaler og alle z-planer, åbnes.
    2. Opdel kanalerne efter billede > farve > opdelte kanaler. Kanalerne vises nu i adskilte vinduer, automatisk navngivet af ImageJ som C-AcquisitionTitle. Her svarer C1-AcquisitionTitle-vinduet til epitelceller (blå), C2-AcquisitionTitle-vinduet til intracellulære Salmonellae (mCherry) og C3-AcquisitionTitle-vinduet til cytosolisk hyperreplikerende Salmonellae-kanal (GFP). Hvert C-AcquisitionTitle-vindue indeholder alle de erhvervede z-fly.
    3. Behandle C1-ErhvervelseTitel vindue, svarende til epitelceller, for at segmentere celler.
      1. Vælg det z-plane-billede, der skal bruges til cellesegmentering. Vælg vinduet C1-AcquisitionTitle , og brug Image > Duplicate: Skriv nummeret på det valgte z-plan (dvs. 1 for at vælge z 1/8), skriv C1Zplane i feltet Titel, fjern markeringen af Duplicate Stack, og klik derefter på OK for kun at duplikere det valgte z-plane-billede. Et vindue kaldet C1Zplane, der viser det valgte z-plane-billede, åbnes.
      2. Behandl det opnåede C1Zplane-billede for at forbedre billedkontrasten. Åbn proces > forbedre kontrast: juster de mættede pixels (dvs. her bruges 1% og marker Normaliser. Klik derefter på OK for at anvende kontrastforbedringsteknikken for at opnå et kontrastnormaliseret C1Zplane-billede .
      3. Behandl det kontrastnormaliserede C1Zplane-billede for at segmentere epitelcellerne. Brug Process > Find Maxima til at åbne FindMaxima-menuen : Marker først Preview Point Selection for at indstille støjtolerance for kun at tildele et maksimumspunkt til hver enkelt epitelcelle. Flag ekskluder Edge Maxima. Vælg outputtypen Segmenterede partikler , og klik på OK for at få C1ZplaneSegmented, et nyt binært maskelignende billede, der viser hver segmenteret partikel pr. markeret maksimumpunkt.
        BEMÆRK: Find Maxima ImageJ-algoritmen bruges til at segmentere celler. Maksimumpoint (pixelintensitetstoppe) registreres på tværs af billedet, hvilket potentielt svarer til celler. En støjtærskel (støjtolerance) indstilles, og det sammenhængende område omkring maksimapunkter analyseres for at skabe et binært maskelignende billede, der definerer hver segmenteret partikel pr. Maxima-punkt, derfor hver celle.
      4. Behandl C1ZplaneSegmented-billede for at oprette en maske af segmenterede celler. Brug Analysér > Analysér partikler: Vælg indstillingen Vis masker og Ekskluder på kanter. Juster arealområdet for segmenterede partikler, der skal medtages i masken, svarende til parameteren Størrelse , for at udelukke forkert segmenterede objekter såsom celleklynger og cellefraktioner. Hvis du vil score området for fejlagtigt segmenterede objekter, skal du bruge værktøjet Sporing af tryllestave på værktøjslinjen: Vælg partikel med staven, og åbn derefter Analysér > Mål for at måle arealet af fejlagtige objekter. Indstil størrelsesintervallet (foreslået område 250-1700 pixel2), og klik på OK for at få MaskofC1ZplaneSegmented binær maske.
      5. Som standard har MaskOfC1ZplaneSegmented binær maske en inverterende LUT. Brug LUT > Inverter LUT på værktøjslinjen.
      6. Behandl MaskOfC1ZplaneSegmented binær maske for at korrigere cellesegmentering:
        1. Tærskelkontrastnormaliseret C1Zplane-billede opnået i trin 4.2.3.2. Brug Billede > Juster > tærskel: Marker Mørk baggrund. Indstil indstillingen Standard automatisk tærskel. Vælg indstillingen Rød , og juster minimumsafskæringsværdien (øverste bjælke), indtil cellerne vises helt røde, hvilket efterlader mørk baggrund (Tærskel = 8.000 anvendt i denne protokol). Klik derefter på Anvend for at konvertere det kontrastnormaliserede C1Zplane-billede til et binært billede med celler i hvidt og baggrunden i sort.
        2. Korrekt cellesegmentering i MaskOfC1ZplaneSegmented binær maske. Brug Process > Image Calculator: Vælg MaskOfC1ZplaneSegmented som Image1, vælg handlingen OG på rullelisten, og vælg derefter den tærskel kontrastnormaliserede C1Zplane som Image2. Klik på OK. Outputbilledet navngives automatisk af ImageJ som Resultater af maske af C1Zplane segmenteret.
      7. Procesresultater af maske af C1Zplane segmenteret for at mærke hver enkelt segmenteret celle som en interesseregion (ROI). Brug Analysér > analyser partikler. Juster størrelse som i trin 4.2.3.4, og vælg derefter indstillingen Vis ingenting. Markér Føj til Manager for at føje alle partiklerne (segmenterede celler) til ROI Manager-værktøjet. Marker også Ekskluder på kanter. Klik på OK. ROI Manager-menuen viser en liste over alle partikler (segmenterede celler), defineret som ROI'er, unikt mærket med deres respektive y- og x-koordinater.
      8. Gem ROI-data som ROI-cells-AcquisitionTitle.zip via ROI Manager-menuen ved at klikke på Mere > Gem. ROI-cells-AcquisitionTitle.zip åbnes i trin 4.2.4.6 for enkeltcelleanalysen.
    4. Behandle C2-ErhvervelseTitel vindue (her rød kanal), svarende til intracellulær Salmonellaefor at måle antallet af inficerede celler og den intracellulære vakuolære belastning.
      1. Træk den grønne kanal (C3-) fra den røde kanal (C2-) for at fjerne pixels, der er ude af fokus, af den cytosoliske hyperreplikerende salmonella.
        1. Brug proces- > billedberegner. Vælg C2-Acquisitiontitle som Image1, vælg handlingen Subtraher på rullelisten, og vælg derefter C3-Acquisitiontitle som Image2. Marker Opret nyt vindue, og klik på OK.
        2. Anvend subtraktion på hele z-stakken ved at klikke på Ja i processtakken? vindue. Outputvinduet hedder ResultsOfC2AcquisitionTitle i scriptet.
      2. Process ResultsOfC2AcquisitionTitle for at reducere tilfældig støj.
        1. Dupliker vinduet ResultsOfC2AcquisitionTitle ved at klikke på billedmenuen > duplikere. Marker Duplicate Stack , og tryk på OK for at få vist vinduet ResultsOfC2AcquisitionTitle1 .
        2. Anvend Gaussian Blur på vinduet ResultsOfC2AcquisitionTitle1 gennem Process > Filter > Gaussian Blur. Lad Sigma-værdien være 2 eller tilpas den (dvs. her blev Sigma: 4 brugt). Klik på OK og anvende Gaussian Blur på hele z-stack ved at klikke på Ja i vinduet Process Stack? .
        3. Træk de gaussiske filtrerede resultaterOfC2AcquisitionTitle1 til ResultsOfC2AcquisitionTitle ved at klikke på Process > billedberegner. Vælg ResultsOfC2AcquisitionTitle som Image1, vælg handlingen Subtraher på rullelisten, og vælg derefter ResultsOfC2AcquisitionTitle1 som Image2. Klik på OK. Anvend subtraktion på hele z-stakken ved at klikke på Ja i processtakken? vindue for at få et vindue, der automatisk navngives af ImageJ som Resultater af resultater af C2-AcquisitionTitle.
      3. Behandl resultaterne af resultaterne af C2-AcquisitionTitle for at adskille Salmonella fra baggrunden. Brug Image > Juster > tærskel: Marker Mørk baggrund , og indstil Otsu automatisk tærskel. Juster minimumsafskæringsværdien (øverste bjælke), indtil Salmonella ser helt rød ud og efterlader mørk baggrund (tærskel = 100 anvendt i denne protokol). Klik på Anvend , og vinduet Konverter til binær åbnes: Marker Sort baggrund, og klik derefter på OK. Den fulde z-stak er nu konverteret til binære billeder.
      4. Vælg det midterste Z-plan, der svarer til det vakuolære Salmonellae-fokusplan, i resultaterne af Resultater af C2-AcquisitionTitle binært vindue fra trin 4.2.4.3: Billede > Stakke > Indstil skive, og skriv nummeret på det valgte z-plan (f.eks. her bruges z: 4/8). Klik på OK.
      5. Indstil de målinger, der skal registreres for hvert investeringsafkast (celle). Brug Analysér > sæt måling: marker Område, svarende til det samlede areal af hvert investeringsafkast. Kontroller Områdefraktion og Begræns til tærskel for kun at registrere den områdefraktion, der er optaget af tærskelpixel (intracellulære Salmonellae) for hvert investeringsafkast. Kontroller Display Label for at mærke hvert enkelt investeringsafkast med billedtitel-, kanal-, z-plane- og x-y-koordinaterne i resultattabellen.
      6. Behandl det valgte z-plan for intracellulære Salmonellae til pladeselskaber, Område og %Område optaget af Salmonellae for hver enkelt celle (ROI): Åbn filen ROI-cells-AcquisitionTitle.zip, gemt i trin 4.2.3.8, efter File > Open og klik på Measure i ROI Manager Menu. Outputtet er en tabel, der rapporterer de valgte målinger.
      7. Gem resultattabellen ved hjælp af Filer > Gem som i resultatvinduet.
      8. Åbn resultattabel i et regneark: etiket Område og % Område optaget af intracellulære Salmonellae er angivet for hver ROI, svarende til en kontureret celle, der er entydigt identificeret med x- og y-koordinater.
      9. Mål antallet af inficerede celler svarende til ROI'er, der viser et % område > 0 optaget af tærskelpixel svarende til salmonella (dvs. her anses et % område > 0,2% for at identificere inficerede celler). Beregn derefter procentdelen af inficerede celler på de samlede celler.
      10. Salmonella/celles vakuolære belastning måles ved at beregne gennemsnittet% Areal optaget af vakuolære salmonellaer for alle inficerede celler.
    5. Behandle grøn kanal (C3-AcquisitionTitle) for at måle antallet af celler, der viser cytosolisk hyperreplikerende Salmonella. Følg trin 4.2.4.2 til 4.2.4.9, men med nogle ændringer.
      1. Arbejde på de øvre z-planer (her z: 7/8), da celler, der viser cytosolisk hyperreplikerende Salmonellae , stikker ud fra monolaget; derfor er de i fokus på et andet plan sammenlignet med celler uden hyperreplikerende salmonella.
      2. Mål antallet af celler, der indeholder cytosolisk hyperreplikerende salmonella (grøn) ved at score celler (ROI'er), der viser høj% Areal optaget af salmonella (f.eks. En% Område > 20% anses for at identificere celler, der indeholder cytosoliske hyperreplikerende salmonella). Beregn derefter procentdelen af celler, der indeholder cytosolisk hyperreplikerende salmonella, på det samlede antal inficerede celler scoret i trin 4.2.4.9.

Representative Results

Infektion af epitelceller med Salmonella-stammer
Denne protokol blev udviklet til at analysere den cellulære invasion og den cytosoliske replikation (figur 1A) vs vakuolær belastning (figur 1B) af salmonella inde i epitelceller. Protokollen blev valideret ved hjælp af de tre følgende Salmonella-stammer, S. Typhimurium SL1344 referencestamme (S. Tm), S. Derby ER1175 vildtype (S. Derby wt) og den isogene mutant af S. Derby ER1175 uden sipA gen (S. Derby ΔsipA). S. Derby ER1175 stamme blev isoleret fra svin og tilhører IZSLER overvågningssamling af Salmonella isolater. Stammerne blev udvalgt for at repræsentere den fænotypediversitet, der er omfattet af protokollen. Især blev disse stammer valgt, fordi deres adfærd inde i epitelceller allerede var kendt for at afvige med hensyn til invasion eller replikation9; derfor var de værdifulde kontroller for at teste, om protokollen tillod kvantitativt at skelne forskelle i intracellulære Salmonella-fænotyper. Især S. Tm og S. Derby wt blev inkluderet, fordi vi tidligere havde demonstreret, at S. Tm har højere invasions- og intracellulær replikationseffektivitet end S. Derbywt 9 mens S. Derby Δ sipA blev tilføjet som en hyperreplikationsnedsat stamme, da virulenseffektorenSipA spiller en afgørende rolle i begyndelsen af hyperreplikation10,11. Det har tidligere været meldt for S. Tm at cytosolisk replikation starter 4 timer efter invasion, og derefter hyperreplikerer den cytosoliske population hurtigt for at fylde epitelcellen med 8 h11,12. Konsekvent var 8 timers lang infektion egnet til at observere og kvantificere den cytosoliske hyperreplikationsfænotype også i S. Derby wt og S. Derby ΔsipA.

Arealanalyse
Områdeanalysen i trin 4.1 giver en måling af den samlede kolonisering af epitelceller ved Salmonella (infektionsforhold) sammen med en måling af hyperreplikationen (hyperreplikationsforhold). I den områdeanalysearbejdsgang, der er beskrevet i figur 2, reduceres den tilfældige støj, og derefter opdeles kanaler og behandles uafhængigt. Der indstilles en tærskel for hver kanal for at udelukke baggrunden fra arealmålingen. Derefter måles det område, der er optaget af tærskelpixel, for hver kanal. Outputtet af områdeanalyse er en tabel, der for hver anskaffelsesfil rapporterer udvidelsen af de områder, der er optaget af epitelcellekerner (blå kanal), intracellulære mCherry-ekspressive Salmonellae (rød kanal) og cytosolisk hyperreplikerende Salmonellae, der udtrykker GFP (grøn kanal) sammen med mCherry. Infektionsforholdet beregnes ved at dividere det areal, der er optaget af mCherry-ekspressive salmonella, med det område, der er optaget af værtscellekerner. Resultaterne af de testede stammer viste, at S. Tm viser et betydeligt højere infektionsforhold sammenlignet med begge S. Derbystammer, som forventet (figur 3A). Derfor viser disse resultater effektiviteten af områdeanalyse til påvisning af forskelle i salmonellastammernes evne til at kolonisere epitelceller. Salmonella hyperreplikationsforhold måles ved at dividere det område, der er optaget af GFP-ekspressive Salmonellae, med det område, der er optaget af intracellulære mCherry-ekspressive Salmonellae. I overensstemmelse med SipA's rolle i bestemmelsen af hyperreplikation, et signifikant reduceret hyperreplikationsforhold for S. Derby ΔsipA-stammen blev målt sammenlignet med S. Derby wt, (figur 3B). Der blev ikke observeret nogen hyperreplikationsforskel mellem S. Tm og S. Derby wt. Samlet set afslørede områdeanalyse effektivt forskellige hyperreplikationsniveauer blandt de analyserede stammer.

Enkeltcelleanalyse
Enkeltcelleanalysen gør det muligt at kvantificere Salmonella-invasion og vakuolær belastning vs. cytosolisk replikation inde i epitelceller med enkeltcelleopløsning. Som beskrevet i trin 4.2 blev blå, røde og grønne kanaler behandlet uafhængigt for hver anskaffelsesfil (figur 4). Specifikt blev den blå kanal, svarende til epitelceller, behandlet i trin 4.2.3 for at opnå cellesegmentering. Derefter blev segmenterede celler føjet til ROI-manageren (Region of Interest) for at få en liste over ROI'er, der svarer til alle segmenterede celler, der er entydigt mærket med y-x-koordinater. For at fjerne pixels, der er ude af fokus, af GFP- der udtrykker hyperreplikerende salmonella, blev pixels i den grønne kanal trukket fra den røde kanal. Outputtabellen over enkeltcelleanalyse rapporterer for hver ROI området og procentdelen af ROI's område besat af Salmonellae, der kun udtrykker mCherry-konstituerende reporter eller GFP-cytosol-responsiv reporter. Den procentdel af cellens areal, der kun er optaget af mCherry-ekspressive salmonella, blev behandlet i trin 4.2.4 for at beregne procentdelen af inficerede celler og den gennemsnitlige vakuolære belastning (figur 5A). Analyse af den vakuolære belastning viste, at S. Derbystammer genererer en gennemsnitlig vakuolær belastning, der er betydeligt lavere end S. Tm (figur 5B). Omvendt blev der kun observeret en lille og ikke signifikant reduktion af procentdelen af inficerede celler i S. Derby stammer i forhold til S. Tm (figur 5A). Procentdelen af cellens areal optaget af GFP-ekspressive salmonellaer blev behandlet i trin 4.2.5 for at opnå hyperreplikationshastigheden. Der blev ikke observeret nogen forskel mellem S. Tm og S. Derby wt, mens S. Derby Δ sipA viste et signifikant fald i hyperreplikation, i overensstemmelse med resultatet af områdeanalysen (figur 5C) ogSipA's rolle i at inducere hyperreplikation.

Figure 1
Figur 1: Salmonella cytosolisk hyperreplikation og vakuolær belastning. Repræsentative billeder af (A) Salmonella hyperreplikationen og (B) den vakuolære belastning erhvervet ved høj forstørrelse (40x) vises. Panel B viser de forskellige fokusplaner for celler, der indeholder hyperreplikerende salmonella (z: 7/8) sammenlignet med ikke-hyperreplikerende salmonella (z : 4/8). Hvide skalabjælker er 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Arbejdsgang for områdeanalysen. Arbejdsgangen for områdeanalysen er vist for en repræsentativ lav forstørrelse (10x) erhvervelse af INT407-celler inficeret i 8 timer med Salmonella, der bærer pCHAR-Duo-plasmidet (MOI 100). Først reduceres den tilfældige støj, og derefter opdeles kanalerne i C1, C2 og C3 og behandles uafhængigt. Der er fastsat en tærskel for hver kanal for at udelukke baggrunden fra måleområdet. Derefter måles det område, der kun er optaget af de tærskelpixel - svarende til cellekerner i C1, alle intracellulære salmoneller i C2 og cytosoliske salmoneller i C3 - for hver kanal. Billederne analyseret her er resultaterne af fire fliser erhvervet ved 10x forstørrelse smeltet sammen ved syning. Hvide skalastænger er 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Resultater af områdeanalysen. Resultaterne af områdeanalysen er vist. (A) Infektionsforholdet beregnes ved at dividere det areal, der er optaget af mCherry-ekspressive Salmonella (C2-kanal), der repræsenterer alle de intracellulære bakterier, med det område, der er optaget af værtscellekerner (C1-kanal). (B) Hyperreplikationsforholdet blev målt ved at dividere det areal, der var optaget af GFP-ekspressive salmonellae (C3-kanal), der kun repræsenterer cytosoliske hyperreplikerende bakterier, med det område, der er optaget af alle intracellulære mCherry-ekspressive salmonella. Hver prik repræsenterer en replika. Analysen blev udført på tre biologiske replikater, hver testet i tre eksemplarer. De sorte linjer angiver middelværdierne. Signifikansen blev beregnet ved hjælp af en to-tailed t-test, og p-værdier rapporteres. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Arbejdsgang for enkeltcelleanalysen. Arbejdsgangen for enkeltcelleanalysen er vist for en repræsentativ høj forstørrelsesoptagelse (40x) af INT407-celler inficeret i 8 timer med Salmonella , der bærer pCHAR-Duo-plasmidet (MOI 100). For det første opdeles kanaler i C1, C2 og C3 og behandles uafhængigt. Blå kanal (C1), svarende til epitelceller, behandles for at opnå cellesegmentering, og derefter defineres hver segmenteret celle som et interesseområde (ROI), der er unikt mærket med y-x-koordinater. Den røde kanal (C2) behandles ved at trække den grønne kanal (C3) fra for at fjerne cytosolisk hyperreplikerende salmonella, så alle vakuolære salmonellaer kun udtrykker mCherry, og derefter blev tilfældig støj reduceret, og tærsklen er indstillet til at udelukke baggrunden fra målinger. Endelig måles det areal, der er besat af vakuolære salmonellaer for hver ROI. Den grønne kanal (C3), der svarer til total cytosolisk GFP-ekspressive salmonella, behandles på samme måde. Billederne analyseret her er resultaterne af 16 fliser smeltet sammen ved syning. Hvide skalastænger er 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Resultater af enkeltcelleanalysen. Resultaterne af enkeltcelleanalysen vises. (A) Procentdelen af inficerede celler opnås ved at dividere antallet af celler med en procentdel af det areal, der er optaget af mCherry-only, der udtrykker Salmonella> 0,2 med det samlede antal celler. (B) Den gennemsnitlige vakuolære belastning blev opnået ved at beregne det gennemsnitlige procentvise areal, der er optaget af mCherry-only, der udtrykker Salmonella i de inficerede celler. (C) Hyperreplikationshastigheden blev beregnet ved at dividere antallet af celler med en procentdel af arealet optaget af GFP-ekspressive salmonella≥20% med det samlede antal inficerede celler. Data fra tre til fire biologiske replikater testet i tre eksemplarer rapporteres. Søjlerne angiver standardfejlen ved måling. Signifikansen blev beregnet ved hjælp af en to-tailed t-test, og p-værdier rapporteres. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil 1: Områdeanalysescript. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: Enkeltcelleanalysescript. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Den måde, hvorpå Salmonella koloniserer tarmepitelceller, påvirker infektionsresultatet. Ved invasion inducerer den cytosoliske hyperreplikation betændelse i tarmen3, mens vakuolær replikation kan føre til systemisk spredning4. Salmonellastammer kan variere i deres evne til at invadere og replikere inde i tarmepitelceller9. Faktisk er Salmonella en ekstremt forskelligartet slægt, der omfatter mere end 2.500 serovarer, som har forskellige evner til at forårsage sygdom. Desuden er salmonella den hyppigst rapporterede årsag til fødevarebårne udbrud i EU, hvilket tyder på en stor spredning i den menneskelige befolkning1. Derfor er tilgængeligheden af pålidelige metoder med høj kapacitet til kvantificering af de intracellulære fænotyper af Salmonella af stor betydning for at evaluere forskelle i virulens blandt et stort antal Salmonella-stammer og i sidste ende muliggøre en nøjagtig og belastningsspecifik risikovurdering af dette patogen.

Protokollen beskrevet her måler salmonellaens opførsel inde i epitelceller på en hurtig og automatiseret måde. Infektionen af epitelceller udføres i 96-brønds billeddannende mikroplader, og et automatiseret fluorescensmikroskop bruges til billedoptagelse, hvilket gør protokollen velegnet til applikationer med høj kapacitet. Denne protokol udnytter pCHAR-Duo-plasmidet, som gør det muligt at skelne vakuolær fra cytosolisk salmonella gennem differentialekspressionen af to fluorescerende journalister5. De intracellulære fænotyper af Salmonella analyseres ofte ved manuel scoring, en tidskrævende procedure, der er uegnet til analyse af et stort antal stammer og cellekulturer pr. stamme og tilbøjelig til operatørfejl og variation mellem operatører. For at overvinde disse begrænsninger blev der udviklet to komplementære og automatiserede billedanalyser, områdeanalysen og enkeltcelleanalysen. ImageJ, en frit tilgængelig software, blev brugt til at udvikle de to analyser. For at fremskynde protokoludførelsen leveres ImageJ-scripts til batchanalyse af flere anskaffelsesfiler uden operatørintervention som supplerende filer.

Områdeanalysen var designet til i nogle få trin at kvantificere den samlede kolonisering af epitelceller (infektionsforhold) og hyperreplikationsniveauet (hyperreplikationsforhold) gennem måling af de områder, der specifikt er optaget af kernerne i epitelceller og ved salmonella, der udtrykker enten mCherry eller mCherry sammen med GFP. Områdeanalysen anvendes på billeder erhvervet ved lav forstørrelse, hvor både vakuolære og hyperreplikerende salmonellaer er i fokus i samme z-plan, og et stort antal epitelceller vises pr. mikroskopisk felt, hvilket reducerer størrelsen og antallet af anskaffelsesfiler. Områdeanalysen giver mulighed for en automatiseret, hurtig og beregningsmæssig lysanalyse af et stort antal prøver, hvilket gør den velegnet til assays med høj kapacitet såsom screeningseksperimenter.

Enkeltcelleanalysen blev designet til at kvantificere Salmonella-fænotyper inde i epitelceller med enkeltcelleopløsning, opnået gennem cellesegmentering og måling af det cellulære område og procentdelen af arealet optaget af vakuolær og cytosolisk hyperreplikerende Salmonellae. Den samlede kolonisering af epitelceller, der er karakteriseret gennem områdeanalysen, er her opdelt i tre kvantitative parametre, procentdelen af inficerede celler, den gennemsnitlige vakuolære belastning og hyperreplikationshastigheden, hvilket gør det muligt at evaluere og kvantificere hver fænotypes bidrag til den samlede kolonisering og supplerer derfor resultaterne af områdeanalysen. De større detaljer, der tilbydes af enkeltcelleanalysen, kommer på bekostning af langsommere billedoptagelse og analyse. For at opnå enkeltcelleopløsning udføres billedoptagelse faktisk ved høj forstørrelse. Dette indebærer, at der er behov for flere z-planer for at observere både vakuolære og cytosoliske salmonellaer i fokus, og at erhvervelsen af et stort antal felter pr. prøve er nødvendig for at score et stort antal epitelceller og dermed forlænge erhvervelsestiden i sammenligning med områdeanalyse. Desuden er analysen af flere store anskaffelsesfiler beregningskrævende og kræver derfor en passende arbejdsstation (en 6-core, 32 GB RAM-arbejdsstation blev brugt). Derfor kan enkeltcelleanalyse bruges som en selvstændig i begrænsede gennemstrømningsforhold eller som en anden niveau metode koblet til områdeanalysen for at få en dybere forståelse af Salmonella-fænotyperne inde i epitelceller.

De to komplementære analyser blev valideret ved hjælp af S. Tm, S. Derby wt, og S. Derby ΔsipA, valgt, fordi deres adfærd inde i epitelceller allerede var kendt for at afvige med hensyn til invasion eller replikation 9,10. Resultaterne af område- og enkeltcelleanalyserne viser, at protokollen tillod kvantitativt at skelne forskelle i intracellulære Salmonella-fænotyper i overensstemmelse med de testede stammers egenskaber. Desuden viser disse resultater, at enkeltcelleanalysen muliggør kvantificering af bidraget fra hver intracellulær fænotype (invasion, vakuolær belastning og cytosolisk replikation) til den samlede kolonisering scoret ved hjælp af områdeanalysen.

Denne protokol blev anvendt her til at studere in vitro patogenicitet af forskellige stammer af Salmonella, men den kan have andre anvendelser såsom undersøgelse af tilfældige mutanter til at identificere gener involveret i invasionen og / eller replikationen inde i epitelceller. Derudover kan protokollen tilpasses til at analysere salmonellas opførsel inde i andre cellelinjer end INT407-celler. Det kan også bruges som udgangspunkt for at udvikle lignende metoder til at studere cellepatogeninteraktion mellem andre intracellulære mikroorganismer.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Dr. Olivia Steele-Mortimer for at dele pCHAR-Duo plasmid. Dette arbejde blev finansieret af det italienske sundhedsministerium, tilskud PRC2019014 og PRC2021004.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well imaging microplate Eppendorf 30741030 Cell culture and infection
Ampicillin Sigma-Aldrich 59349 Bacteria culture
Axio observer inverted microscope ZEISS Automated fluorescence microscope
Axiocam 305 Mono ZEISS Microscope Camera
Breathable sealing membrane Sigma-Aldrich Z380059 Infection assay
Colibrì 5/7 ZEISS Led light source
Collagen I rat tail Life Technologies A1048301 Collagen coating
DAPI Invitrogen D3571 Cell staining
Fetal bovine serum Gibco 10099-141 Cell culture and infection
Gentamicin Sigma-Aldrich G12664 Infection assay
Glacial acetic acid Carlo Erba 401391 Collagen coating
HCS CellMask Blue Invitrogen H32720 Cell staining
ImageJ National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) Image processing software
Minimum Essential Eagle's Medium Sigma-Aldrich M5650-500ML Cell culture and infection
Paraformaldehyde 4% Invitrogen FB002 Cell fixation
Potassium chloride PanReac AppliChem 131494.1211 PBS preparation
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 60220 PBS preparation
Sodium Chloride PanReac AppliChem 131659.1214 Bacteria culture and PBS preparation
Sodium phosphate Dibasic Sigma-Aldrich 71640 PBS preparation
Tissue Culture Flask 25 cm2 plug seal screw cap Euroclone ET7025 Cell culture
Triton X-100 Biorad 1610407 Cell staining
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200056 Cell culture and infection
Tryptone Oxoid LP0042B Bacteria culture
Yeast extract Biolife 4122202 Bacteria culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. European Food Safety Authority & European Centre for Disease Prevention and Control. The European Union One Health 2020 Zoonoses Report. EFSA Journal. 19 (12), 6971 (2021).
  2. Fattinger, S. A., Sellin, M. E., Hardt, W. D. Salmonella effector driven invasion of the gut epithelium: breaking in and setting the house on fire. Current Opinion in Microbiology. 64, 9-18 (2021).
  3. Knodler, L. A., et al. Dissemination of invasive Salmonella via bacterial-induced extrusion of mucosal epithelia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17733-17738 (2010).
  4. Fulde, M., et al. Salmonella SPI2 T3SS mediates transcytosis in polarized enterocytes in vivo. Cell Host & Microbe. , (2019).
  5. Cooper, K. G., Chong, A., Starr, T., Finn, C. E., Steele-Mortimer, O. Predictable, tunable protein production in Salmonella for studying host-pathogen interactions. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 475 (2017).
  6. Klein, J. A., Grenz, J. R., Slauch, J. M., Knodler, L. A. Controlled activity of the Salmonella invasion-associated injectisome reveals its intracellular role in the cytosolic population. mBio. 8 (6), 01931 (2017).
  7. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  8. Ibarra, J. A., et al. Induction of Salmonella pathogenicity island 1 under different growth conditions can affect Salmonella-host cell interactions in vitro. Microbiology. 156 (4), 1120-1133 (2010).
  9. Tambassi, M., et al. Mutation of hilD in a Salmonella Derby lineage linked to swine adaptation and reduced risk to human health. Scientific Reports. 10 (1), 21539 (2020).
  10. Finn, C. E., Chong, A., Cooper, K. G., Starr, T., Steele-Mortimer, O. A second wave of Salmonella T3SS1 activity prolongs the lifespan of infected epithelial cells. PLoS Pathogens. 13 (4), 1006354 (2017).
  11. Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells. PLoS One. 9 (1), 84681 (2014).
  12. Chong, A., Starr, T., Finn, C. E., Steele-Mortimer, O. A role for the Salmonella Type III Secretion System 1 in bacterial adaptation to the cytosol of epithelial cells. Molecular Microbiology. 112 (4), 1270-1283 (2019).

Tags

Immunologi og infektion udgave 186 Salmonella intracellulære fænotyper vakuolær replikation cytosolisk hyperreplikation protokol med høj kapacitet automatiseret billedanalyse fluorescensmikroskopi ImageJ-scripts
Automatiseret analyse af intracellulære fænotyper af <em>salmonella</em> ved hjælp af ImageJ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berni, M., Pongolini, S., Tambassi,… More

Berni, M., Pongolini, S., Tambassi, M. Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ. J. Vis. Exp. (186), e64263, doi:10.3791/64263 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter